Equipo 7 Microbiología Prueba de MR - VP

L/O/G/O

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

Ingeniería Farmacéutica Equipo: 7 Grupo: 3FM1 Alumnos: Cortés Javiel Ángeles Jiménez Hernández Oscar  Lugo González Valeria Profesora: Morales Martínez Martha

 Pruebas Bioquímicas  Microbiología Farmacéutica

Prueba de Ureasa •

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El sustrato urea, una diamida de ácido carbónico, a menudo se designa como una carbamida. Todas las amidas son hidrolizadas con facilidad. La urea es hidrolizada por una enzima en específico, la ureasa (o urea amidohidrolasa), para dar dos moléculas de amoníaco. En solución, la urea se hidroliza a carbonato de amonio como producto final.

Prueba de ureasa •

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La ureasa es una importante enzima microbiana relacionada con la descomposición de compuestos orgánicos. Las enzimas bacterianas se clasifican como constitutivas o adaptativas. La ureasa es considerada como constitutiva debido a que es sintetizada por ciertas bacterias sin tomar en consideración la ausencia o presencia de su sustrato, la urea. La ureasa se clasifica como una amidasa, ya que cataliza la hidrólisis de las amidas. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.

Prueba de Ureasa •

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Oppenheimer incluyo entre las amidas a todas las enzimas que pueden romper los puentesentre nitrógeno y carbono por hidrólisis. En el caso de la ureasa, el nitrógeno es disociado con amoniaco (NH 3). La ureasa actúa con los compuestos a nivel de los puentes C-N, excepto aquellos que contienen puentes peptídicos. Al formarse el carbonato de amonio, se produce una alcalinización y un aumento del pH en el medio, virando al color del indicador de pH (rojo de fenol) El pH óptimo para la actividad de la ureasa es de 7. Principales medios empleados: - Caldo con urea de Rustigian y Stuart - Agar con urea de Christensen - Caldo con urea R (Rápida)

Prueba de ureasa Interpretación de resultados.  Caldo con urea de Stuart: POSITIVO: Color rosa-rojo intenso en todo el caldo. NEGATIVO: Sin cambio de color (amarillo-naranja)  Agar con urea de Christensen POSITIVO: Color rosa-rojo intenso en el pico de flauta NEGATIVO: Sin cambio de color (color piel a amarillo palido)  Caldo con urea R: POSITIVO: Color cereza (púrpura rojizo) •

Prueba de Ureasa •

Microorganismos utilizados para el control de Calidad:

a) POSITIVO (+): rápido e intenso Proteus mirabilis Proteus vulgaris

b) POSITIVO (+): débil Klebsiella pneumoniae

c) NEGATIVO (-): Escherichia coli 

Prueba de MR  – VP

Medio de cultivo •

Medio de cultivo : Medio de Clark y Lubs (caldo RM VP)  –

Composición: 1. Polipeptona 2. Dextrosa 3. Fosfato de potasio 4. Agua destilada 5. Indicador: rojo de metilo a) pH inicial = 6.9, medio no inoculado, color rojo. b) Ácido: rojo (pH = 4.4) c) Alcalino: amarillo (pH = 6)

Fundamento de la reacción con Rojo de Metilo (RM) •

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Es una prueba cualitativa de la producción de ácido (determinación de pH). Las bacterias que principalmente siguen la vía de fermentación de ácidos mixtos a menudo producen suficiente ácido para mantener un pH menor de 4.4. La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH para determinar la concentración de iones hidrógeno presentes cuando un organismo fermenta glucosa. Las bacterias RM positivas producen ácidos estables manteniendo una alta concentración de iones hidrógeno hasta alcanzar cierta concentración y entonces cesa toda actividad. Los organismos RM negativo también producen ácidos pero tienen una menor concentración de iones

Fundamento de la reacción de Voges Proskauer (VP) •

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Determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, la acetoína a partir de la fermentación de glucosa. La reacción de VP se basa en la detección de acetoína como producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. Esta es metabolizada en ácido pirúvico, intermediario clave en la glucólisis. A partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir muchas vías. La producción de acetoína (precursor de la producción de 2,3-butanediol) es uno de los ciclos para la degradación de la glucosa en las bacterias.

Test •

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Inocular el caldo RM VP con un cultivo puro de no más de 24 horas del m.o. en estudio.  –

Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador  rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 4 gotas de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos.  –

Resultados •

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La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína.

Ejemplos: Microorganismo

Crecimiento

RM

VP

E. coli ATCC 25922

Bueno

+

-

K. pneumoniae ATCC 700603

Bueno

-

+

P. mirabilis ATCC 43071

Bueno

+

-

S. typhimurium ATCC 14028

Bueno

+

-

Citrobacter freundii

Bueno

+

-

Enterobacter  aerogenes

Bueno

-

+

Esquema general de la prueba