Eq4 Practica6 Rev

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN FACULTAD DE QUÍMICA ANÁLISIS DE DROGAS Y MEDICAMENTOS

Práctica 6 “Identificación y cuantificación de Naproxeno por cromatografía de líquidos”

Equipo 4: Manzanilla Rivas Raúl Mijangos Ramos Iván Felipe Rangel Méndez Jorge Aarón Sánchez Yama Jorge

Fecha de entrega:

16-Abril-2010 6to. Semestre

Salón 7

INTRODUCCIÓN El naproxeno es antiinflamatorio no esteroidal derivado del ácido fenilpropiónico que presenta actividad analgésica así como antipirética. Tiene apariencia de polvo blanco cristalino, carece de

olor característico y es prácticamente

insoluble en agua. Es ampliamente empleado en la farmacología y administrado generalmente por vía oral. Por esta vía es absorbido a nivel de las membranas del

tracto

gastrointestinal

para

pasar

a

la

circulación

sanguínea

y

posteriormente se dirige al sitio blanco para ejercer su acción farmacológica 1. Su uso se asocia a una menor incidencia de alteraciones gastrointestinales que la del AAS por lo que se le da un uso muy amplio en el área de la farmacología. Como es el caso de cualquier medicamento de uso generalizado la industria farmacéutica requiere de herramientas y métodos para el monitoreo de la cantidad de principio activo en este tipo de formas farmacéuticas y encuentra en la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) una poderosa herramienta. La CLAR es una técnica de separación constituida por una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida. Las separaciones se logran por partición, 2

adsorción o procesos de intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria empleada. Los compuestos a analizar se disuelven en un líquido orgánico y la mayoría de las separaciones tienen lugar a temperatura ambiente. Por lo tanto, la mayoría de las drogas, sean compuestos no volátiles o térmicamente inestables,

pueden

analizarse

mediante

esta

técnica

sin

riesgo

de

descomposición. El tiempo de elusión de un compuesto puede ser descrito por su factor de capacidad, ya que depende de la naturaleza química del compuesto analizado, la composición y la velocidad de flujo de la fase móvil y la composición y el área superficial de la fase estacionaria. La longitud de la columna es un parámetro determinante de la resolución. Sólo los compuestos que tienen diferentes factores de capacidad pueden ser separados por CLAR 2. Se estima que entre el 80 y el 90 % de las separaciones analíticas son realizadas en la modalidad de

fase inversa. Prácticamente todas las

separaciones en fase inversa son llevadas a cabo con fases estacionarias con superficies hidrofóbicas químicamente modificadas. Pequeñas variaciones en la superficie química y geométrica puede conducir a notables diferencias en la interacción con la superficie, y como resultado de esto, diferencias en la selectividad cromatográfica. La fase móvil por mucho es la mayor herramienta para el control de la retención del analito en el análisis mediante CLAR en fase inversa. Variaciones en la composición del disolvente, tipo de modificador orgánico, pH, y concentración del buffer proveen al cromatógrafo de un valioso conjunto de variables para el desarrollo con éxito de un método de separación 3. El detector de absorbancia de UV/Vis monitorea la absorción de luz ultravioleta o visible en el efluente de CLAR. Son los detectores más comunes ya que la mayoría de los analitos de interés para el área farmacéutica presentan absorbancia UV. El detector de arreglo de fotodiodos, proporciona espectros UV mientras que funciona como un detector de absorbancia multifrecuencia UV/Vis. Facilita la identificación de los picos y es por esto el detector preferido en la elaboración de métodos analíticos. La validación del método analítico es parte integral del sistema de control de calidad, puesto que confiere fiabilidad a los

3

resultados analíticos obtenidos en un análisis, a fin de asegurar que un medicamento cumpla los parámetros de calidad establecidos. La validación del Factor COLUMNA

Descripción Octadecil silano unido químicamente a poros de gel sílice o micropartículas de cerámica

(water CL-18) DIMENSIONES 4.6 mm x 15 cm PRESIÓN MÁXIMA 248 bar FASE MÓVIL Acetonitrilo-agua (50:50) FLUJO 1.0 mL/min DETECTOR UV-VIS 254 nm método es un proceso dinámico y no debe ser considerado una situación de una sola ocasión. El diseño y validación del método debe ser tal forma que asegure robustez a lo largo de la vida del método. La precisión de los datos es afectada por las variaciones en el proceso de preparación, la preparación de la muestra y el rendimiento del instrumento. Cuando los métodos validados son confiables se generan datos que resultan dignos de confianza.4 Se recomienda separar con doble espacio los párrafos de la introducción

OBJETIVO El alumno aprenderá a usar el cromatógrafo de líquidos para cuantificar una muestra problema de Naproxeno, empleando el método de calibración absoluta. METODOLOGÍA Condiciones de cromatógrafo: Preparación de la fase móvil. Se prepararon 30 mL de una mezcla de metanol (grado HPLC) y agua en proporción 50:50.

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Preparación de la mezcla de disolvente. Se prepararon 20 mL de una mezcla de metanol (grado HPLC) y agua en proporción 90:10. Preparación de la solución de referencia. Se preparó una solución de la sustancia de referencia en mezcla de disolvente con una concentración de 2.5 mg/mL de naproxeno; para lo cual, se pesó 25 mg de naproxeno y se mezcló con la solución de mezcla de disolvente en un matraz volumétrico de 10 mL y se llevó hasta línea de aforo. Posteriormente se prepararon 10 mL de una dilución de 25 µg/mL de de naproxeno en fase móvil; para lo cual, se utilizó 0.1 mL de alícuota de la solución anterior, se adicionó en un matraz volumétrico y se llevó al aforo de 10 mL con fase móvil. Preparación de la solución de la muestra. Se pesaron 5 tabletas de medicamento naproxeno marca GI. Se trituraron las tabletas en un mortero hasta polvo fino y se trasfirió en un vaso de precipitados 31.7 mg (cantidad equivalente a 25 mg de naproxeno); se añadió 1 mL de agua destilada y se agitó vigorosamente hasta completa dispersión. Después se filtró la mezcla directamente a un matraz volumétrico de 10 mL; se llevó a línea de aforo con metanol (grado HPLC), se mezcló y transfirió una alícuota de 0.1 mL en un matraz volumétrico de 10 mL. Posteriormente se aforó con fase móvil y se mezcló perfectamente. Cuantificación de la muestra problema. La cuantificación del naproxeno se llevó a cabo mediante Cromatografía de Líquidos de Alta Eficiencia (CLAE o HPLC por sus siglas en inglés). Se utilizó el equipo Agilent Technologies 1200 series, se ajustaron los parámetros y se inyectó volúmenes iguales de 20 µL de la preparación de referencia y de la muestra problema. Se registraron los cromatogramas y se midieron los tiempos de retención de los picos principales. Se halló el área bajo los picos e informó la cantidad de C14H14O3 que había en la muestra tomada.

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DIAGRAMA DE FLUJO

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Figura 1. Preparación de la fase móvil y la mezcla de disolvente.

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Figura 2. Metodología empleada en la determinación de naproxeno por CLAE.

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RESULTADOS Se pesaron las cinco pastillas de naproxeno requeridas para la determinación. Los pesos se aprecian en la tabla 1.

Tabla 1. Peso de las pastillas de naproxeno. Número de astilla

Peso (mg)

1.

319.3

2.

316.0

3.

316.3

4.

319.3

5.

317.2

Total

1588.1

El marbete de las pastillas indicaba que contenían 250 mg de naproxeno, por tanto, la cantidad pesada de las cinco pastillas trituradas equivalente a 25 mg de naproxeno fue de 31.76 mg. Se procedió con la determinación empleando el cromatógrafo de líquidos. Los cromatogramas obtenidos para la solución de referencia y para la muestra problema se aprecian en las figuras 3 y 4 respectivamente.

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Figura 3. Cromatograma de la solución de referencia.

Figura 4. Cromatograma de la muestra problema.

La información más relevante de cada cromatograma se resume en la tabla 2. Cabe señalar, que el pico de importancia en cada caso es el que aparece a

10

2.29 minutos correspondiente al naproxeno y por tanto se proporciona la información sólo de este pico.

Tabla 2. Parámetros obtenidos de los cromatogramas de la solución de referencia y de la muestra problema. Parámetros

Solución de referencia

Muestra problema

Tiempo

2.293 minutos

2.293

Ancho del tiempo

0.0815 minutos

0.0858

Área

492.74280 mAU*s

498.33398 mAU*s

Altura

90.55084 mAU

88.36023 mAU

Área (%)

93.3743

95.0201

Por último se calculó la cantidad de naproxeno en mg presentes en los 31.76 mg pesados originalmente para la determinación de la siguiente manera: 1. Se empleó la fórmula: DC (Rmp / Rref) D = Factor de dilución de la muestra problema. C = Cantidad de naproxeno en referencia Rmp / Rref = Áreas de los picos obtenidos

2. Sustituyendo la fórmula: (100) (0.025 mg/mL) (498.33/492.74) = 2.52 mg/mL (2.52 mg/mL) (10 mL) = 25.28 mg de naproxeno 11

3. Las cinco pastillas debieron tener 1250 mg de naproxeno teóricamente ya que cada una contenía 250 mg de naproxeno. Sin embargo experimentalmente se obtuvo que: 31.76 mg ------------------------------------ 25.28 mg de naproxeno 1588.1 mg -----------------------------------

X

X = 1264.07 mg de naproxeno. DISCUSIONES Con base en los resultados obtenidos en el análisis de naproxeno para su identificación y cuantificación por CLAE se tiene que: El porcentaje de principio activo presente en las cinco pastillas utilizadas en este análisis está dentro del margen indicado por la FEUM, ya que esta establece un rango de 90-110 % de principio activo y la muestra analizada presentó un porcentaje de 101.12 %. Este valor es muy importante ya que garantiza que el fármaco desarrolle de manera satisfactoria su actividad farmacológica en el organismo. Con respecto a la identificación de naproxeno: Se puede observar que, debido al tempo de retención y al carácter polar del naproxeno, este tuvo una elución relativamente rápida. Esto era de esperarse ya que en este análisis por CLAE de fase inversa los analitos mas polares eluyen de manera más rápida. Se puede apreciar una gran similitud entre los cromatogramas, ya que los picos pertenecientes al naproxeno presentan tiempos de retención idénticos, 2.293 para la referencia y la muestra; en cuanto al área, los valores son similares 12

492.74 y 498.33 mAU*s para la referencia y muestra respectivamente. Es en estos datos donde se puede observar una variación poco significativa la cual ocasionó el aumento en el porcentaje de principio activo, que sin embargo está dentro del rango permitido por la FEUM. Los primeros dos picos que se aprecian en cada uno de los cromatogramas pueden deberse a impurezas presentes en los disolventes y que no son retenidas por la columna. Absorbieron luz Uv a la misma longitud de onda del naproxeno y se puede decir que son especies con una considerable polaridad debido a que sus tiempos de retención son muy bajos y por lo tanto eluyeron con bastante rapidez.

CONCLUSIONES Se cumplió con el objetivo de la práctica de aprender a cuantificar por CLAE una muestra problema empleando el método de calibración absoluta. De acuerdo a la cuantificación de las tabletas de naproxeno de 250 mg realizada por CLAE se obtuvo un porcentaje de principio activo de 101.12 % el cual está dentro del rango establecido por la FEUM. El método utilizado posee una gran eficacia en la separación de los compuestos que conforman una muestra problema en un tiempo bastante corto y con resultados satisfactorios.

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Es de gran importancia que los disolventes utilizados sean de grado HPLC para evitar cualquier dato erróneo en el análisis producido por alguna impureza contenida en el disolvente.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. P.A. Insel, Analgésicos-Antipiréticos y Antiinflamatorios, y Fármacos Antigotosos, En: “Goodman & Gilman. Las bases Farmacológicas de la Terapéutica”,8a edición, Editado por, J.G. Hardman, L.E. Limbird, P.B. Molinoff, R.W. Ruddon y A.G. Gilman, McGraw-Hill Interamericana Editores, S.A., México, 1996, pp. 661-686. 2. Meyer, V; Practical High Performance Liquid Cromatography; 4a edición, John Wiley & Sons. Inc; St. Gallen,Switzerland; 2004; pp.261-265 3. Dong,M; Modern HPLC for Practicing Scientists; 4ª edición; John Wiley & Sons, Inc; Hoboken, New Jersey ;2006; pp.136-143 , 195-201.

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