Enzyme Immunoassay

Kepada Yth : Rencana Baca : Selasa, 1 Februari 2011

Tugas Pendahuluan

ENZYME IMMUNOASSAY  Patricia M.Tauran, M.Tauran, Nurul H, Tenri Esa Bagian Patologi Klinik FK-UNHAS/BLU RS Wahidin Sudirohusodo Makassar  I. PENDAHULUAN

Imunoasai adalah suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar  antibodi dan antigen dalam cairan tubuh atau serum seseorang. Imunoasai dapat dibagi menjad menjadii 2 kelomp kelompok ok menuru menurutt jenisn jenisnya, ya, yaitu yaitu imunoa imunoasai sai tak berlab berlabel el dan imunoas imunoasai ai  berlabel. Imunoasai tak berlabel terdiri dari beberapa teknik, yaitu : uji presipitasi, uji aglutinasi aglutinasi,, uji hemaglutinasi, hemaglutinasi, lisis lisis imun dan fiksasi fiksasi komplemen, komplemen, serta serta uji netralisas netralisasi. i. Sedangkan imunoasai berlabel juga terdiri dari beberapa teknik yaitu : asai berlabel fluo fluore rese sens ns

Fluorescen scentt (  Fluore

Immunoa Imm unoassay ssay atau atau

FIA) FIA),,

asai asai

ber berlabel abel

radi adiois oisotop otop

( Radioimmunoassay  Radioimmunoassay atau RIA), asai berlabel luminescent ( Luminescent  Luminescent Immunoassay Immunoassay atau

LIA),

asai

berlabel

enzim

Enzyme me (  Enzy

Immu Immuno noass assay ay atau

EIA),

 Immunochromatographic Assay atau ICA dan uji imunoperoksidase.1  Radioimmunoassay assay (RIA) pada tahun Yalow dan Berson mengembangkan metode  Radioimmuno 1959 dengan dengan menggun menggunakan akan label label radioa radioakti ktiff yang yang dapat dapat mengid mengident entifi ifikas kasii kompone komponen n immun pada konsentrasi yang sangat rendah. Pada tahun 1960-an, para peneliti mulai mencari pengganti metode RIA karena kelemahannya menggunakan radioaktif isotop sebagai label.2 Kekurangan penggunaan radioaktif tersebut berkaitan dengan keselamatan   petugas petugas laboratori laboratorium, um, masalah masalah pembuangan pembuangan radioaktif radioaktif,, fasilita fasilitass laboratori laboratorium um khusus dengan persyaratan gedungnya dan mahalnya peralatan yang dibutuhkan.3 Kelemahan dari  Radioimmunoassay mendorong para peneliti untuk mencari suatu label pengganti yang lebih sederhana, lebih murah, dengan reagen yang dapat tahan lebih lama dan dapat dipakai oleh hampir semua laboratorium serta mudah dibuat otomatis. Muncullah kemudian gagasan untuk memakai enzim sebagai label dan lahirlah suatu imunoasai yang baru yaitu Enzyme yaitu Enzyme Immunoassays (EIA).1 Teknik EIA pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh Anton Schuurs sebagai   peneliti utama dan Bauke van Weemen di laboratorium penelitian NV Organon, Oss, Beland Belanda. a. Pada Pada tahun tahun 1976 Organon Organon Teknik Teknikaa kemudi kemudian an sukses sukses mengem mengemban bangkan gkan dan mema memasa sark rkan an sist sistem em EIA EIA beru berupa pa Hepa Hepati titi tiss B surf surfac acee anti antige gen n (Hbs (HbsAg Ag)) deng dengan an

menggunakan plate mikrotiter-96 sumur. Tes ini kemudian menjadi EIA yang pertama kali dikomersilkan dan kemudian diikuti oleh tes diagnostik mikrobiologi dan virologi lain seperti antigen Hepatitis B "e" (HBe), antibodi Rubella, antibodi Toxoplasma dan antibodi Human Immunodeficiency Virus pada tahun 1980-an.3

II. DEFINISI

  Enzyme immunoassay (EIA) adalah tes untuk mendeteksi antigen atau antibodi dengan penambahan enzim yang dapat mengkatalisa substrat sehingga terjadi perubahan warna.2,4 Metode EIA menggunakan sifat katalisa dari enzim untuk mendeteksi dan menghitung jumlah reaksi imunologi. Gabungan antibodi berlabel enzim atau antigen   berlabel enzim digunakan pada pemeriksaan imunologi. Enzim dan substratnya mendeteksi keberadaan dan jumlah antigen atau antibodi yang terdapat pada sampel  pasien.2 Untuk dapat digunakan pada EIA, enzim harus memenuhi kriteria : -

Stabilitas tinggi

-

Spesifitas tinggi

-

Tidak mengandung antigen atau antibodi

-

Tidak ada perubahan oleh inhibitor dalam sistem.2 Tabel 1. Enzim-enzim yang Digunakan pada EIA 2 Enzim

Acetylcholinesterase Alkaline phosphatase β-Galactosidase Glucose oxidase Glocose-6-phosphatase dehydrogenase (G6PD) Lysozyme Malate dehydrogenase Peroxidase

Sumber  Electrophorous electicus  Escherichia coli  Escherichia coli  Aspergillus niger   Leuconostoc mesenteroides Putih telur  Jantung babi Lobak 

Enzim berlabel yang sering digunakan yaitu horseradish peroxidase, alkaline  phosphatase, Glocose-6-phosphatase dehydrogenase dan β-galactosidase.2

2

 Enzyme Immunoassay (EIA) memiliki keuntungan dan kerugian, yaitu : A. Keuntungan 1. Tes yang sensitif dapat diperoleh dengan efek penguatan dari enzim. 2. Reagen relatif murah dan jangka waktunya panjang. 3. Dapat menghasilkan tes multiple secara simultan. 4. Dapat menghasilkan konfigurasi tes dengan variasi yang luas.

5. Tidak ada bahaya radiasi selama pemberian label atau pembuangan sampah. B. Kerugian 1. Pengukuran aktivitas enzim dapat lebih kompleks dibandingkan dengan

 pengukuran dengan beberapa tipe radioisotop. 2. Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh konstitusi plasma. 3. Pada saat ini tes homogen memiliki sensitivitas 10-9M dan tidak sesensitif 

radioimmunoassay. 4. EIA homogen untuk protein yang besar dapat dihasilkan tetapi membutuhkan

reagen imunokimia yang kompleks.5

III.METODE

Pada tes EIA, sebuah manik plastik atau plat plastik dilapisi dengan antigen (contoh: virus). Antigen bereaksi dengan antibodi pada serum pasien. Manik atau plat kemudian di inkubasi dengan sebuah gabungan enzim-antibodi berlabel. Jika terdapat antibodi, gabungan tersebut bereaksi dengan kompleks antigen-antibodi pada manik atau plate. Aktivitas

enzim diukur

dengan

spektrofotometer

setelah

penambahan

substrat

kromogenik spesifik. Misalnya, peroksidase mengkatalisa substratnya, o-dianisidine, menyebabkan perubahan warna. Pada beberapa kit , tes EIA dapat dibaca secara langsung (visual). 2,6 Hasil pada tes EIA dapat juga dinilai dengan membandingkan hasil spektofometer  serum pasien dengan referensi serum kontrol. Keunggulan tes secara objektif adalah hasilnya tidak tergantung dari interpretasi teknisi. Pada umumnya prosedur EIA lebih cepat dan pekerjaan laboratorium lebih sedikit dibandingkan dengan metode serupa.2,6

IV. TIPE ENZYME IMMUNOASSAYS

2,4

3

A. Deteksi Antigen

EIA tipe deteksi antigen terdiri atas 4 langkah “ 1. Antibodi yang spesifik terhadap antigen dilekatkan pada suatu permukaan fase

 padat (a solid-phase surface) atau suatu manik-manik plastik. 2. Ditambahkan serum pasien yang mungkin mengandung atau tidak mengandung

antigen. 3. Ditambahkan suatu antibodi yang spesifik terhadap antigen tertentu yang berlabel

enzim (conjugate). 4. Ditambahkan substrat kromogenik, dan terjadi perubahan warna jika terdapat

enzim. Warna yang terbentuk sesuai dengan jumlah antigen yang terdapat pada sampel pasien.2,4

Gambar 1. Langkah-langkah pemeriksaan EIA tipe antigen detection.4 B. Deteksi Antibodi

4

EIA antibody detection terdiri dari 3 tipe yaitu noncompetitive EIA, competitive EIA dan capture EIA. a. Noncompetitive EIA 1.

Antigen yang spesifik dilekatkan pada suatu permukaan fase padat

(manik-manik plastik atau sumur mikrotiter). 2.

Ditambahkan serum pasien yang mungkin mengandung atau tidak 

mengandung antibodi. 3.

Ditambahkan antibodi yang spesifik terhadap antibodi sebelumnya yang

telah dilabel dengan enzim (conjugate). 4.

Ditambahkan substrat kromogenik, dan terjadi perubahan warna jika

terdapat enzim. Warna yang terbentuk sesuai dengan jumlah antibodi yang terdapat pada sampel pasien.2,4

Gambar 2. Langkah-langkah pemeriksaan noncompetitive EIA.4 b. Competitive EIA 1.

Antigen yang spesifik dilekatkan pada suatu permukaan fase padat

(manik-manik plastik atau sumur mikrotiter). 5

2.

Serum pasien yang mungkin mengandung atau tidak mengandung antibodi

ditambahkan ke dalam plate bersama-sama dengan penambahan antibodi berlabel enzim (conjugate) yang akan berkompetisi untuk memperebutkan antigen yang sama. 3.

Ditambahkan substrat kromogenik, dan terjadi perubahan warna jika

terdapat enzim. Jumlah warna yang terjadi berbanding terbalik dengan jumlah antibodi yang terdapat pada sampel pasien.2,4

Gambar 3. Langkah-langkah pemeriksaan competitive EIA.4

c. Capture EIA

Sebuah capture EIA dirancang untuk mendeteksi tipe spesifik dari antibodi, seperti IgG atau IgM.

6

1. Antibodi yang spesifik terhadap IgG atau IgM dilekatkan pada suatu permukaan

fase padat (manik-manik plastik atau sumur mikrotiter). 2. Sampel pasien yang mengandung IgG atau IgM ditambahkan. 3. Ditambahkan antigen yang spesifik. 4. Ditambahkan sebuah antibodi yang spesifik terhadap antigen yang berlabel enzim

(conjugate). 5. Ditambahkan substrat kromogenik, dan terjadi perubahan warna jika terdapat

enzim. Warna yang terbentuk sesuai dengan jumlah antigen yang spesifik  terhadap IgG atau IgM yang terdapat pada sampel pasien.2,4

Gambar 4. Langkah-langkah pemeriksaan capture EIA.4

Tabel 2. Klasifikasi EIA dan Contoh Tes : 2,4 Tipe EIA Tes  Antigen Detection  Hepatitis B surface Antigen  Antibody Detection  Noncompetitive EIA CMV IgG  Hantavirus IgG  Hepatitis A • • • •

7

• • • • • • •

Competitive EIA Capture EIA

• • • • • • •

 Hepatitis C   Hepatitis B surface Antibody  HIV Antibody Measles IgG Mumps IgG  Rubella IgG VZV IgG  Hepatitis B core Antibody  Arbovirus IgM  CMV IgM   Hantavirus IgM  Measles IgM   Rubella IgM  Toxoplasma IgM 

DAFTAR PUSTAKA 1. Handoyo I. Pengantar Imunoasai Dasar. Airlangga University Press, Surabaya :

2003.

8

2. Turgeon ML : Immunology & Serology in Laboratory Medicine. 4th ed. Mosby,

St. Louis ; 2009. p 158-61 3. Lequin RM. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

(ELISA). Washington DC: American Association for Clinical Chemistry, Inc; [cited 2005 September 22]. Available from: http://intl.clinchem.org 4. Laboratory Services Section. Enzyme Immunoassay (EIA). Texas: Texas

Department of State Health Services; [updated 2004 December 1]. Available from: www.dshs.state.tx.us/lab/serology_eia.shtm 5. Henry J.B.MD : Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 21st

ed. WB Saunders Co, Philadelphia ; 2007. p 803-8 6. Turgeon ML : Clinical Laboratory Science, The Basics Routine Techniques. 5th

ed. Mosby, St. Louis; 2007. p 141-2

9