Enzimas Microbianas

ENZIMAS ENZIMAS MICROBIANAS MICROBIANA S Josué Picho, (2016) Microbiología Aplicada, Universidad San Francisco de Quito Breve introducción a las enzimas enzimas micr obianas obianas Las enzimas microbianas, en la última década, han sido empleadas en industrias que van desde alimentos hasta la biología molecular. Debido a que muchos microorganismos son una fuente excelente de producción de enzimas, en la actualidad, esta fuente ha sido una matriz

para

el desarrollo de nuevos productos industriales (Thieman y Palladino, 2010). Las enzimas microbianas son un grupo de proteínas que aceleran las reacciones químicas (Gurung et al., 2013). Las enzimas microbianas han sido probadas en múltiples áreas como la medicina, textiles, biosoluciones, et al. Uno de los primeros procesos fue en la biología molecular en donde se utilizó polimerasas de ADN y enzimas de restricción procedentes de bacterias (Thieman y Palladino, 2010). Aisladas de E. coli, coli, las polimerasas de ADN se usan en técnicas de ADN recombinante (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013). La descomposición de moléculas que realizan las enzimas microbianas determina su función. Por ejemplo, la enzima celulasa, descompone la celulosa, un polisacárido que se encuentra en las plantas. Además, se la utiliza para suavizar y desteñir pantalones, esto gracias a derivados provenientes de Trichoderma reesei y  Aspergillus niger . Esta celulasa degradan parte de los filamentos de algodón que que se quedan en los pantalones dando dando como resultado una tela más suave (Gutiérrez, Pérez y Uribe, 2012). Tambien, el uso de la enzima proteasa subtilisina, proveniente de Bacillus subtilis, detergentes, subtilis, en la actualidad es parte importante de varios detergentes, cuya función es degradar y quitar manchas de origen proteico en prendas de vestir (Martínez y García, 2014). Además, un cierto número de enzimas bacterianas se utilizan tambien para emplear alimentos, tales como las enzimas que descomponen carbohidratos carbohidratos llamadas amilasas, que degradan almidón; proteasas, que degradan otras proteínas; y lipasas, que descomponen grasas (Cavicchioli et al., 2011 y Mganga, Razavi y Kuzyakov, 2015). 1. Ventajas Ventajas del del uso de enzimas enzimas micr obi anas. anas. Las enzimas microbianas poseen ventajas ventajas como especificidad especificidad en las reacciones catalíticas, catalíticas, transformación de una forma de energía a otra, manejo moderado de concentraciones de sustrato. Además, son moléculas moléculas de mucha importancia debido a que determinan determinan la pausa en las modificaciones químicas (Anbu, 2015). En aspectos como la fermentación disminuyen el gasto energético y valor de producción pr oducción (Wackett, 2015). Tambien, poseen mayor capacidad de adatarse a un medio y por ende poseen un alto potencial de formación de colonias, con el fin, de mejorar la capacidad catalítica y proveer beneficios mutuos de actividad enzimática 1.1. 1.1. Gran capacidad catalítica y sin tética

La particularidad de muchas enzimas son su dominio catalítico y su especificidad. La catálisis se desarrolla en un lugar específico de la enzima conocida como centro activo. Las proteínas son macromoléculas son eficaces para catalizar alta variedad de reacciones químicas, debido a su eficacia a la hora de unirse a un gran número de moléculas. Además, las enzimas catalizan las reacciones en base a la estabilización de los estados de transición (Stryer, Berg y Tymoczko, 2013). 1.2. Potencial amilolítico de micror ganismos Las enzimas que hidrolizan moléculas de almidón, incluyendo pequeños polímeros de glucosa se denominan amilasas. Estas enzimas pueden ser sintetizadas por animales, plantas y microorganismos. Se dividen en α-amilasas, β-amilasas y glucoamilasas. Estas enzimas poseen beneficios a la biotecnología, industria de textiles y alimentación. Una de las más importantes son las catalíticas: beta-amilasa y isoamilasa que forman parte de gran variedad de bacterias y hongos (Vanegas, Méndez & Murillo, 2015). Además, las enzimas microbianas poseen potencial celulítico y lignolítico de enzimas que aportan beneficios en la obtención de metabolitos que se utilizan de forma industrial, mediante el uso de biodegradación de proteínas de celulosa, almidón y lignina (Buitrago, Sánchez y Guerrero, 2014). 2. Microorganismos productores de enzimas 2.1. Bacteri as 2.1.1. Bacteri as celul olític as Son las responsables de la degradación de celulosa en forma constante, colonizan la superficie de restos vegetales; en donde, forman una cubierta extracelular para su adhesión a las paredes celulares de los vegetales y su posterior crecimiento dependiendo de la cantidad de sustrato existente. Como resultado final de la degradación se produce acetato o propionato, algunos ejemplos de este tipo de bacterias son: Fibrobacter succinogenes, Gram-; Ruminococcus albus, Gram+; Ruminococcus flavefaciens, Gram+ (Frioni, 2011). 2.1.2. Bacterias xilanolíticas Son bacterias menos estudiadas responsables de la biodegradación de xilanos en relación con la celulosa, algunos ejemplos de bacterias son: Butyrivibrio fibrisolvens, Gram+,  produce ácidos butírico, fórmico, acético y láctico como producto final de la fermentación; Prevotella ruminicola, Gram-  que produce ácidos succínico, acético y fórmico como productos finales (Frioni, 2011). 2.1.3. Bact erias amilolíti cas Estas bacterias representan entre el 22 al 51% de bacterias viables, su principal sustrato es el almidón, sin embargo, pueden utilizar lactato; son responsables de la degradación de materiales amiláceos en ácidos grasos volátiles. Algunos ejemplos son: Bacteroides

amylophilus, Gram-; Streptococcus bovis, Gram+; Selenomonas ruminantium, Gram(Frioni, 2011). 2.1.4. Bacteri as proteolíti cas Son organismos de rápida fermentación de aminoácidos y proteínas a amonio, además, de ser una importante fuente de ácidos grasas volátiles (AGV) y proporcionar amonio como fuente de nitrógeno; dichas bacterias se adhieren a la pared del rumen e hidroliza la urea. Algunas bacterias son: Peptostreptococcus anaerobius, Clostridium sticklandii y Clostridium aminophilum (Frioni, 2011). 2.1.5. Bacterias hidr olític as Organismos que utilizan oligosacáridos y azúcares solubles para la degradación y posterior obtención de energía en forma de ATP, poseen un poder reductor y ferredoxina reducida que es reciclada con la liberación de hidrógeno molecular; ejemplos de estas se encuentran en: Clostridium, Bacteroide, Propionibacterium (Frioni, 2011). 2.1.6. Bacterias metanogénicas Son Arqueas, organismos primitivos con un pseudopeptidoglicano en su pared que los permite ser resistentes a pH bajos y altas temperaturas; son anaerobios estrictos y son los únicos microorganismos capaces de producir metano gracias a sus distintas enzimas, sin embrago, son dependientes al sustrato que degradan. Pueden ser: Methanobacterium, Methanospirillum y Methanobrevibacter  (Frioni, 2011). 2.1.7. Bacterias Acetogénicas Organismos especializados en la producción de acetato a través de la reacción de dióxido de carbono e hidrógeno, pueden ser:  Acetobacterium, Acetogenium y Clostridium (Frioni, 2011). 2.1.8. Bacteri as Sulf atoreducto ras Bacterias que emplean los distintos productos de las fermentaciones para reducir sulfatos en sulfuros, de dicha reacción obtienen energía; pueden ser oxidantes completos si degradan ácidos orgánicos de hasta 18 carbonos u oxidantes incompletos si no pueden seguir degradando (Frioni, 2011). 2.1.9. Bacteri as Desnitr ifi cantes Bacterias que obtienen energía por la oxidación de compuestos orgánicos y del azufre, mediante nitratos; este proceso facilita la remoción del oxígeno, la clase más distribuida en la naturaleza son las Pseudomonas (Frioni, 2011). 2.2. Protozoos 2.2.1. Ciliados celul íticos Producen enzimas degradadoras de restos vegetales que f ragmentan el material, pocos géneros de Epidinium (Frioni, 2011).

2.2.2. Ciliados amilolíticos Utilizan el almidón para la producción de energía, sin embargo, estos son responsables de entre el 30 al 40% de la lipolisis o el incremento del contenido de ácidos grasos saturados, Son todos los Entodiniomorphes (Frioni, 2011). 3. Apli cacion es actuales de las Enzimas mic robi anas 3.1. Enzimas catalíti cas 3.1.1. Amil olíti cas; degradació n de almidó n Son enzimas microbianas responsables de la degradación de almidón, han sido ampliamente utilizadas en los diferentes procesos industriales; es así como, dichas enzimas se emplean en la producción de jarabes, dextrinas, edulcorantes y en la panadería (Fennema et al. 2010). 3.1.1.1.

α- Amilasas

Es una endoenzima responsable de reducir rápidamente el peso molecular de los polímeros de almidón, es utilizado para el procesado de almidón y se caracteriza por tener tres dominios en el interior de la proteína; el primero le sirve para la catálisis, el segundo como sitio de unión del almidón y el tercero une el calcio y une los anteriores dominios. Su tamaño oscila entre 50 a 70 kDa; el producto final son dextrinas ramificadas (Fennema et al. 2010). 3.1.1.2.

β- Amilasas

Es una glicosidasa de tipo exo e inversor responsable de liberar unidades de maltosa de las cadenas de amilasa y mezclarlas con dextrinas β límite, su tamaño es de 30 y 160 kDa. Son enzimas únicas ya que poseen un solo dominio a diferencia de las demás enzimas (Fennema et al. 2010). 3.1.1.3.

Ciclom altodext rina gluc anotransf erasa

Estas son endoenzimas que se encargan de catalizar reacciones de hidrólisis o de transglicosilación inter e intra moleculares, de tipo conservador con cinco dominios proteicos y tamaño alrededor de los 75 kDa. Como producto final de su reacción se producen ciclodextrinas hexa, hepta u octoligómeros (Fennema et al. 2010). 3.1.1.4.

Glucoamilasa

La glucoamilasa o amiloglucosidad es una enzima de tipo exo, de inversión encargada en la hidrólisis de unidades de glucosa a part ir del extremo no reductor del almidón, este, a diferencia de la pululanasa actúa solo sobre el enlace α-1,4 glucosídico, produciendo tan solo glucosa. Su tamaño oscila entre los 37 y 112 kDa y se las puede encontrar principalmente en Aspergillus y Rhizopus (Fennema et al. 2010). 3.1.1.5.

Pululanasa

Son enzimas desramificadoras o dextrinasas límite ya que hidrolizan dextrinas en los enlaces α-1,4 y α-1,6 que forman parte de la ramificación de la amilopectina; se caracterizan por actuar sobre el pululano y como producto final se obtiene glucooligosacáridos pequeños. Dichas enzimas se obtienen particularmente de Kleibsiella y Bacillus (Fennema et al. 2010). 3.1.2. Proteasas; degradación d e prot eínas Son usadas para quitar restos biológicos de la ropa, varios detergentes añaden en su fórmula enzimas como proteasas. Estas enzimas poseen estabilidad en condiciones de lavado que incluyen la presencia de varios agentes oxidantes, surfactantes y en algunos casos altas temperaturas. Las Proteasas pueden clasificarse convenientemente según sus actividades y grupos funcionales. 3.1.2.1.

Serina-proteasas

Son endopeptidasas que poseen serina reactivo y pH optimo a 7. 3.1.2.2.

Subtilisina

La subtilisina es una enzima que posee actividad proteasas, es decir, elimina proteínas. Al ser obtenida de Bacillus subtilis, esta enzima posee un aminoácido metionina que es apto para ser oxidada, pero tambien disminuye la actividad catalítica. (Martínez y García, 2014). 3.1.2.3.

Carboxipepti dasa A

Carboxipeptidasa A del páncreas de bovino, ayuda en la eliminación de aminoácidos C que proceden de sustratos polipéptidos tales como la fenilamina (Antigua, 2014). 3.1.3. L ipasas; degradación de grasas Las enzimas procedentes de las lipasas catalizan la hidrolisis para digregar lípidos en productos de origen vegetal y animal (Thieman y Palladino, 2010). 4.1.3.1 Fenoloxidasas Estas enzimas son dependientes de actividad oxidativa de microorganismos. En la formación

de

humus

se

polimerizan

fácilmente,

además,

son

excelentes

biocatalizadores en la fase de oxidación de quinonas. Sin embargo, existen casos como Phanerochaete chrysosporium que proporcionan parte de la degradación de compuestos clorados (Sanchez et al., 2011). 3.1.4. Lactasas; degradación de la leche  Algunos tipos de quesos requieren de cepas de origen bacteriano tales como Lactococcus lactis, L. acidophilus  para realizar procesos de coagulación. Estas bacterias degradan una proteína conocida como caseína y usan la enzima lactasa para eliminar los azucares de que se encuentran en la leche, que a menudo son empleadas para realizar la fermentación (Thieman y Palladino, 2010). En la producción de quesos

encontramos una enzima proteolítica conocida como quimosina, se obtiene a partir del abomaso de las vacas jóvenes (Moral, Ramírez & García, 2015). Además, en la fabricación de quesos industriales una de las enzimas más utilizadas es la proteinasa, obtenida a partir de Rhizomucor sp que es parecida a la quimosina. Esta enzimas es termoresistente y termolábil por lo que se rompe en su etapa de calentamiento (Morillo et al., 2015). Se usan porque estas enzimas poseen altos grados de especificidad, además sus periodos de crecimiento microbiano son cortos (Khademi, Abachi y Malekzadeh, 2013). Gran parte de las enzimas coagulantes son de origen f úngica tales como

Thermomucor

indicae-seudaticae,

Mucor

circinelloides

y

Rhizomucor

nainitalensis (Morillo et al., 2015). 3.1.5. Celulasas y hemicelu lasas; degradación d e celulosa  A la celulosa, en la naturaleza, la encontramos en forma de un polisacárido de fácil degradación para hongos y bacterias. Muchos hongos aeróbicos son los principales degradadores de celulosa tales como: Trichoderma reesei y  Aspergillus niger . Además de Neurospora sp  y algunos hongos para la alimentación (Gutiérrez, Pérez y Uribe, 2012). A partir de estos hongos se han obtenidos productos que poseen un sistema enzimático de células, las cuales degradan la celulosa a glucosa y celobiasa. Trichoderma reesei se caracteriza por degradar la celulosa, además, es resistente a reactores químicos e inhibidores de pH bajo. Además, los mecanismos de acción enzimática que muestra Trichoderma reesei  determina modelos parecidos de regulación de genes (Gutiérrez, Moreno y Montoya, 2015). El potencial de las enzimas celulíticas además, se centra en la producción de zumos de fruta, así como en la producción de cuero las cuales se derivan de Trichoderma reesei y Aspergillus niger  que eliminan el pelo y la piel de tejidos y ablandar la indumentaria de vestir para un fácil manejo (Gutiérrez, Pérez y Uribe, 2012). 3.2. Enzimas sint etizadoras 3.2.1. Celulasas y hemicelulasas; en pro cesos de fermentación Dentro de la fermentación denotamos el uso de enzimas y procesos microbianos que tienen como objetivo el producir bebidas y productos como yogur, queso, pan y vino (Cavicchioli et al., 2011 y Mganga, Razavi y Kuzyakov, 2015). Para la creación de vino y cerveza varias técnicas necesitan cepas de levaduras como es el caso de Saccharomyces cerevisae. En el caso de la fabricación de vino se utiliza enzimas celulasa derivadas de Oenococcus oeni una bacteria que es responsables de transformar el sabor agrio del ácido málico a un sabor dulce de ácido láctico. Para el yogur, se utilizan cepas de microrganismos anaerobios que proceden del ácido láctico, tal es el caso de Streptococcus thermopilus, Lactococcus lactis y una última cepa de Lactobacillus bulgaricus (Thieman y Palladino, 2010)

3.2.2. Penicili na acil asas; producc ión de penicili na. La penicilina fue el primer antibiótico utilizado a gran escala en humanos y fue descubierto de Penicillum notatum un hongo que impide el crecimiento de la bacteria Staphylococcus aureus. La gran mayoría de los antibióticos se aíslan de bacterias, y la mayor parte de esta materia inhibe el crecimiento de otras bacterias. Además, en la actualidad tenemos antibióticos que derivan de bacterias o arqueas tales como Bacillus subtilus que se encuentra en el antibiótico Bacitracina o Streptomyces erythraeus que está en Eritromicina (Thieman y Palladino, 2010). 3.3. Enzimas termoestables Son enzimas capaces de soportar incrementos de temperatura sin que lleguen a desnaturalizarse, existen algunos casos del uso de enzimas termoestables, pero hay demasiado uso por el momento, a pesar de las continuas investigaciones de las que objeto. La posibilidad de resistir incrementos de temperatura es ideal para reacciones que requieran de energía en forma de calor (Zapata, Castellanos, 2014). 3.3.1. Tac polimerasa Una de las primeras y más famosas enzimas para la PCR es conocida como Taq ADN polimerasa. Taq se obtiene de Thermus aquaticus, una especie que se desarrolla en fuentes de agua caliente, además su ADN polimerasa se transforma a tal punto que aguanta muy altas temperaturas. Como Taq es estable a altas temperaturas, puede tolerar los cambios de temperatura necesarios sin desnaturalizarse. Una de las ventajas del PCR es su capacidad para aumentar millones de copias de ADN partiendo de un pedazo muy pequeño de material vivo (Tamay de Dios, I barra y Velasquillo, 2013). 4. Persp ectiva fut uras de las Enzimas Microbi anas 4.1. Búsq ueda de enzimas li políti cas termó fil as Las investigaciones microbiológicas se ven cada vez más impulsadas por la diversidad de soluciones que los microorganismos proveen a numerosos escenarios, es por ello que en el futuro se vislumbra un sinfín de usos de microorganismos para resolver de manera satisfactoria y controlable los problemas que se presenten. Pero para lograr resolver los problemas primero es necesario contar con los medios necesarios. Las enzimas microbianas tienen una variedad enorme de usos, pero condiciones que limitan su uso y eficacia son factores físico y químicos, tales como la elevada temperatura de reacción (Zapata, Castellanos, 2014). Es en base a esto que se busca usar microorganismos termófilos, por tener una alta estabilidad a altas temperaturas, pH extremos y agentes desnaturalizantes (López, 2015). En un estudio en la zona geotermal de Calientes, en el Perú, se llevó a cabo un muestreo en fuentes termales con temperaturas entre 60-88 ºC, un pH entre 7,1-7,5 (Zapata, Castellanos, 2014). Se usaron muestras de tapetes microbianos

y biopelículas Se determinó la actividad cualitativa y cuantitativa de la celulasa, la biomasa celular, cuantificación de proteínas solubles y se extrajo el ADN. Se encontró un alto grado de heterogeneidad entre las poblaciones de las bacterias celulolíticas termófilos, se notó la actividad de la celulasa, con cepas que mostraron gran actividad de

endoglucanasas, enzima que actúan en la degradación de la celulosa.

Obtuvieron el valor óptimo de pH 5,9 y temperatura 67,5 °C, dando un valor maximizado de actividad enzimática de endoglucanasas de 0,56 UI ml (Zapata, Castellanos, 2014). Esta investigación arroja un resultado interesante para la biotecnología y la industria, tal como en la cepas obtenidas las “características fisicoquímicas son favorables para el desarrollo de microorganismos productores de celulasas (Zapata, Castellanos, 2014). Pudiendo ser usadas a la temperatura de 70 °C y pH neutro, que facilitan que bacterias esporógenas y actinomicetos incrementen su actividad (Granados, Valderrama, 2003). La diversidad de microorganismos que pueden ser usados por sus enzimas termófilas es bastante variado, en este caso podemos analizar la construcción de dos cepas productoras de enzimas lipoliticas de Thermus thermophilus, todo esto se hizo usando un sistema de expresión en la levadura Saccharomyces cerevisiae (López, 2015). Las enzimas usadas fueron la esterasa y la lipasa, la esterasa fue clonada y exhibió una actividad óptima a los 40ºC y un pH superior a 7, la producción de la cepa de levadura recombinante, Saccharomyces cerevisiae, fue 10 veces mayor en la actividad extracelular a lo usual para Thermus thermophilus en el caso de la lipasa no se mostró actividad lipolítica en el medio extracelular, a pesar de que si mostro actividad fosfatasa superior al grupo de control (López, 2015). Si usamos el enfoque de enzimas microbianas que sean funcionales, podemos ligarnos al hecho de que estas pueden ser optimizadas. Es por ello que debemos conocer la posibilidad de optimizar enzimas, para ello analizaremos un experimento donde se buscó el mejoramiento de la termoestabilidad (Jofré, 2012). Tal como nos dice Jofré (2012) “Se diseñó una estrategia basada en la dinámica de la estructura enzimática que permite la proposición de mutaciones rigidizantes de regiones flexibles en la estructura de una enzima.”. En este experimento se simulo el comportamiento de la enzima a temperaturas de 27ºC, 77ºC y 127ºC (Jofré, 2012). A partir de esto se determinó la funcionalidad en diferentes enzimas, se encontraron 5 enzimas para una mutación que mejoraba la termoestabilidad (Jofré, 2012). 4.2. Micror ganism os y l a degradación de plaguic idas El impacto de los plaguicidas son bien conocidos, pero un tratamiento eficaz para su degradación o eliminación son bastante cuestionables, es por ello que los microrganismos son una respuesta eficaz para este problema. Gran cantidad de plaguicidas son usados actualmente, en este caso hablaremos de los plaguicidas N-metilcarbamatos, usados para

eliminar insectos, ácaros, nematodos, hongos y malezas en diferentes cultivos (Castellanos, Rache, 2013). Las enzimas carbamato hidrolasas pueden actuar sobre una gran cantidad de sustratos y en diferentes condiciones (Castellanos, Rache, 2013). En la investigación analizaron las enzimas carbamato hidrolasa, estas enzimas actúan la hidrolisis primaria de carbofuran, aunque existen otras enzimas que actúan para que se complete la degradación pero no se conocer aún, es por ello que el autor habla sobre el análisis de diferentes microrganismos para identificar las diferencias entre enzimas carbamato hidrolasas y su funcionamiento (Castellanos, Rache, 2013). Se reconocen 2 rutas para la degradación de los N-metilcarbamatos, una es la vía oxidante y la otra es la vía hidrolítica (Castellanos, Rache, 2013). Pero existe un gran problema con la vía catabólica oxidante, ya que al darse el proceso se producen metabolitos que son aún más tóxicos que los N-metilcarbamatos; afortunadamente la hidrolisis es el mecanismo primario para la degradación de N-metilcarbamatos, cuando ocurre la hidrolisis del enlace carbamato se pueden dar dos resultados, el rompimiento del enlace éster o un rompimiento del enlace amida (Castellanos, Rache, 2013). Sea cual sea el resultado después de la hidrolisis será carbofuran 7-fenol, el cual es menos toxico que el carbofuran, también metilamina la cual fuente de carbono o nitrógeno para cartas bacterias que hidrolizan suelos (Castellanos, Rache, 2013). Por ello no se puede estancar el uso de estas enzimas, puesto que generar degradadores de compuestos xenobióticos, solubilizadores de fosfato, fijadores de nitrógeno y controladores biológicos, entre otros toman un papel preponderante para ser usadas con interés agrícola, ambiental y para la salud humana (Castellanos, Rache, 2013) 4.3. Usos d e enzimas c eluloli tic a en la indu stri a. La alimentación es extremadamente importante y su mejoramiento es transcendental para el ser humano, por ello analizaremos un uso de enzimas celulolítica en la industria pecuaria, ya que la alimentación en esta industria ocupa un enorme porcentaje de gastos, alrededor del 80 % (López, 2013). El uso de microrganismos que tengan enzimas celulolíticas es un apartado en esta industria que se encuentra fuera del foco por el momento, para este caso se los uso un microrganismo el cual produjo la enzima en una medio especifico con temperatura constante de 39ºC (López, 2013).Se puso a prueba la enzima colocándola 60 minutos antes en los alimentaos que iban a ser ingeridos por los individuos (López, 2013). Se usaron diferentes grupos, en los cuales había un grupo de control, alientos con enzimas, y alimentos sin enzimas. (López, 2013). Al analizar los metabolitos en la sangre se constató que la glucosa tenía mejores resultados pero para los otros metabolitos (proteínas, queratina, colesterol, calcio y fósforo) no se obtuvieron estos resultados favorables. (López, 2013). 5. Referencias

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