ENZIMAS LABORATORIO -1.docx

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRÁCTICA N: 06

DATOS GENERALES

ALUMNOS:

ALEJANDRA BANEGAS MARIA JOSE PAREDES PAOLA ARCOS ALEXIS PUMAGUALLI

1.- TEMA: CARACTERIZACIÓN CUALITATIVA DE DOS ENZIMAS (CATALASA Y AMILASA) 2.- OBJETIVOS: 2.1.- Objetivo General:  Caracterizar cualitativamente dos enzimas 2.2.- Objetivos Específicos:  Determinar la presencia de la enzima catalasa en una muestra de hígado animal.  Comprobar la visualización de la desnaturalización de una enzima mediante la acción de la temperatura.  Comprobar la acción hidrolítica de la amilasa. 3.- MARCO TEÓRICO RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y oxígeno, por lo que se soluciona el problema. (1) La reacción de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente: 2 H2O2

2 H2O + O2

Esta función la efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno. Además la catalasa se usa en la industria textil para la eliminación del peróxido de hidrógeno, así como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solución de peróxido de hidrógeno.(2) El mecanismo completo de la catalasa no se conoce, aun así la reacción química se produce en dos etapas (1) H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E H2O2 + O=Fe(IV)-E → H2O + Fe(III)-E + O2 Donde Fe-E representa el núcleo de hierro del grupo hemo unido a la enzima que actúan como cofactores. (1) La enzima se presenta en forma de homotetrámero y se localiza en los peroxisomas. (1)

Esta enzima puede actuar como una per oxidasa para muchas sustancias orgánicas, especialmente para el etanol que actúa como donante de hidrógeno. Las enzimas de muchos microorganismos, como el Penicillium simplicissimum, que exhiben actividad de catalasa y per oxidasa, son frecuentemente llamadas catalasas-peroxidasas. (1) La deficiencia en catalasa produce acatalasia. Esta enfermedad está caracterizada por la ausencia de actividad de la catalasa en los glóbulos rojos y se asocia con las lesiones orales ulcerantes. (1) Reacción A La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patógenas son anaerobias (no pueden vivir con oxígeno), mueren con el desprendimiento de oxígeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada. DESNATURALIZACION Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de proteínas, que es la desnaturalización. Ya que la catalasa químicamente es una proteína, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perderá también la función y como consecuencia su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos. (3) AMILASA La amilasa, denominada también sacarasa o ptialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 1-4 del componente α-Amilosa al digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene actividad enzimática a un pH de 7. Cuando una de estas glándulas se inflama, como en la pancreatitis, aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre (amilasemia). Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautizó en un principio con el nombre de "diastasa".(4)

Clasificación α-Amilasa (Nombre alternativos: 1,4-α-D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa) Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actúan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos,

descomponiéndolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es más rápida que la β-amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH óptimo está entre 6.7 y 7.2. Β-Amilasa (Nombres alternativos: 1,4-α-D-glucano-maltohidrolasa; amilasa sacarogénica) Otra forma de amilasa, la β-amilasa es también sintetizada por bacterias, hongos y plantas. Actúa desde el extremo no reductor de la cadena, catalizando la hidrólisis del segundo enlace α-1,4, rompiendo dos unidades de glucosa (maltosa) a la vez. Durante el proceso de maduración de la fruta la β-amilasa rompe el almidón en azúcar dando lugar al sabor dulce de la fruta. La amilasa presente en el grano de cereal es la responsable de la producción de malta. Muchos microorganismos también producen amilasa para degradar el almidón extracelular. Los tejidos animales no contienen β-amilasa, aunque puede estar presente en microorganismos saprófitos del tracto gastrointestinal. Tiene un pH óptimo de 12. (4) γ-Amilasa (Nombres alternativos: Glucano 1,4-α-glucosidasa; aminoglucosidasa; Exo-1,4-α-glucosidasa; glucoamilasa; α-glucosidasa lisosómica; 1,4-α-D-glucano glucohidrolasa) Además de romper el último enlace α (1-4) glicosídico en el extremo no reductor de la cadena de amilosa y amilopectina, liberando glucosa, la γ-amilasa puede romper los enlaces glicosídicos α (1-6). A diferencia de las otras amilasas esta forma es más eficaz en medios ácidos y su pH óptimo es de 3. (4) Usos Sirve en el diagnóstico de enfermedades determinando sus niveles en plasma para saber si se puede producir una pancreatitis. Sus niveles pueden estar elevados por un daño a las células productoras de la enzima en el páncreas, o bien, por una deficiencia renal (excreción reducida) o también por paperas. (4) Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricación de pan para romper azúcares complejos como el almidón (presente en la harina) en azúcares simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azúcares simples y convertirlos en productos de fermentación alcohólica. Este proceso da sabor al pan y hace elevar la masa. Las células de la levadura contienen amilasas pero necesitan tiempo para fabricar la suficiente cantidad para romper el almidón. Este es el motivo de la necesidad de largos tiempos de fermentación (especialmente para determinadas masas). Las técnicas modernas de elaboración de masas incluyen la presencia de amilasas para facilitar y acelerar estos procesos. (4) Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para disolver almidones en determinados procesos industriales. En la maduración de frutas la amilasa es sintetizada en la maduración, degradando el almidón de las frutas en azúcar, y volviéndolas más dulces. (4)

4.- MATERIALES Y REACTIVOS Materiales

Reactivos

Gradilla

Trozos de hígado de pollo 5 Tubos de Ensayo Agua oxigenada Vaso de Precipitación de Sol. Diluida de almidón 25 ml Reverbero Reactivo de Benedict Termómetro Reactivo de Lugol. Pipeta de 10ml Pera de succión 5.- GRÁFICOS RECOCIMIENTO DE LA CATALAZA

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON

DESNATURALIZACION

PRUEBAS CON FEHLING

REACCION DEL ALMIDON CON EL LUGOL

6.- PROCEDIMIENTO: A. RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA Se coloca en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado

Se añade 5 ml de agua oxigenada.

Se observa un intenso burbujeo debido al desprendimiento de Oxigeno.

B. DESNATURALIZACION

Se coloca en un tubo de ensayo varios trocitos de hígado

Se añade agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos

Después de este tiempo, se retira el agua sobrante

Se añade el agua oxigenada

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON

Se toman 4 tubos de ensayo, numerados del 1 al 4

Se añade a cada tubo 5ml de una solución diluida de almidón

A los tubos 3 y 4 se añade una pequeña cantidad de saliva.

TUBO 1 Se realiza la Reacción de Benedict

TUBO 2

Se realiza la Reacción de Lugol

TUBO 3 Y 4

contiene almidon y saliva

PONEMOS EN UN VASO DE PRESIPITACION A BAÑO MARIA

CONTROLAMOS LA TEMPERATURA A 37 ºC dEJAMOS POR UNOS 15 MINUTOS

A continuación se realiza las siguientes reacciones: Tubo 3

Reacción de Benedict.

Tubo 4

Prueba de Lugol

7.- REACCIONES

Hidrólisis de la catalasa

2 H2O2

2 H2O + O2

8.-OBSERVACIONES RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA:  Al añadir al hígado agua oxigenada se desprende de el oxigeno e hidrogeno  En el hígado existía la presencia de catalasa ya que las burbujas nos indicaron la presencia de oxigeno.  La catalasa se encuentra en el hígado

DESNATURALIZACIÓN: *Ausencia de catalasa (se inactiva la catalasa)

HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN *En el tubo 1, la Reacción de Benedict da negativa por que no existe cambio de colores.

*En el tubo 2, la Reacción de Lugol da positiva porque su color negro.

*En el tubo 3, la reacción de Benedict, da positiva y su coloración cambia de azul a un verde medio amarillo .

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En el tubo 4, la prueba de lugol, da negativo, no se produjo cambio de coloración. Se queda del color del lugol mismo.

Tubos 1, 2, 3, 4,5

9.- CONCLUSIONES 

Se caracterizó cualitativamente las dos enzimas ocupadas en la práctica realizada y se puede concluir que ambas enzimas son de naturaleza distinta, la amilasa es una hidrolasa, esto quiere decir que descompondrá por hidrólisis enlaces 1-4 del componente α-Amilasa al digerir el almidón para formar azúcares simples, mientras que la catalasa es una enzima de naturaleza oxidorreductasa, que mediante procesos REDOX descompone el peróxido de hidrógeno en agua y en oxígeno molecular.

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Se pude determinar la presencia de la enzima catalasa en una muestra de hígado de gallina, y se llegó a la conclusión de que la catalasa se encuentra en alto contenido en la superficie del tejido liso que conforma este órgano vital para el animal, esta afirmación se la fundamenta con el intenso y prolongado burbujeo que existió al momento de colocar una pequeña cantidad de peróxido de hidrógeno en la muestra de hígado.

 Comprobar la acción hidrolítica de la amilasa. 

Se comprobó la visualización de la desnaturalización de una enzima, específicamente de la catalasa en la muestra de hígado, mediante la acción de la temperatura, teniendo en cuenta como conclusión que la temperatura es un factor importante y decisivo al momento en que las enzimas cumplen sus funciones, ya que si la misma no se considera dentro de un proceso metabólico dentro del laboratorio, no se pueden obtener los resultados esperados por el mal funcionamiento del enzima.

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Se comprobó la acción hidrolítica de la amilasa y se concluye que la misma posee una gran capacidad catalizadora al hidrolizar polisacáridos como el almidón y el glucógeno, en monómeros más sencillos.

10.- CUESTIONARIO: 1. Describa la Catalasa La catalasa EC 1.11.1.6 es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua.(1) El peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene entre otras una función protectora contra microorganismos patógenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos menos peligrosos. Esta función la efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno. Además la catalasa se usa en la industria textil para la eliminación del peróxido de hidrógeno, así como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solución de peróxido de hidrógeno. La ausencia congénita de catalasa es causante de una acatalasemia (o acatalasia), la enfermedad de Takahara que se manifiesta con severas infecciones gangrenosas de la cavidad bucal, pudiendo producir la pérdida de los dientes y graves destrucciones de loa maxilares y regiones blandas que los cubre. Enfermedad congénita del Japon (2 de 100.00 habitantes sufren de este trastorno).(1) 2. Describa la amilasa Amilasa salival humana. Un ión Calcio es visible en color amarillo.La amilasa, denominada también ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene un pH de 7. Cuando una de estas glándulas se inflama aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautizó en un principio con el nombre de diastasa. (2)

3. Indique que factores afectan la velocidad de una reacción catalizada por una enzima  

La temperatura: es importante porque cambia la actividad enzima por dos razones(4) Si se aplica calor: al calentarse las moléculas adquieren mayor energía térmica, presenta mayor energía cinética (mayor velocidad), si aumenta la velocidad del sustrato y el enzima, facilita el encuentro de los dos (el calor puede ser en un principio beneficioso ya que aumenta la velocidad y facilita el encuentro), pero si se aplica demasiada calor

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puede provocar la desnaturalización de la proteína (decae la actividad catalítica), desnaturalización del enzima. (4) Pero si disminuye la temperatura, disminuye la velocidad, la energía cinética, no se van a encontrar con tanta velocidad, su posterior unión y su posterior formación. Si se disminuye tanto la temperatura, puede ocurrir la desnaturalización de la proteína del enzima. (4) Se desnaturaliza antes si se aplica demasiada temperatura que si se disminuye demasiado la temperatura. Todos los enzimas van a tener una temperatura optima, para que la actividad de los enzimas sea perfecta, trabajan mejor que nunca (la de los seres humanos es la de 36.5º) (4) El pH: las enzimas tiene que trabajar en unas concentraciones de pH concreta (como proteínas que son) si se salen de esas condiciones de pH se pone al enzima en condiciones desfavorables y se puede producir la desnaturalización del enzima. Es malo tanto el pH básico como el pH ácido. Nuestros enzimas tienen un pH óptimo de trabajo, sobre pH 7. (4) Inhibidores: disminuyen la actividad enzimatica e incluso la pueden llegar a anular. Son sustancias perjudiciales pero también beneficiosas: (4) Inhibidores Irreversibles: anula para siempre la actividad enzimatica, alteran el centro activo del enzima de manera que esta alteración queda permanente, se conocen como venenos y serían inhibidores perjudiciales para el individuo. (4) Inhibidores Reversibles: inutilizan temporalmente al enzima, en función del mecanismo que empleen para inutilizarlos se clasifica: (4) Competitivos: sustancias que se caracterizan por tener una forma muy parecida a la del sustrato especifico de ese enzima, y por lo tanto compite con ese sustrato para instalarse en el centro activo, el hecho de que posean la misma forma, permiten a los organismos disminuir la acción del inhibidor aumentando la concentración de sustrato. Este es un mecanismo beneficioso en algunas ocasiones y es el que hace que el enzima no esté siempre trabajando. (4) Acompetitivos: no suelen unirse nunca al centro del enzima por lo tanto no va a tener una forma parecida al sustrato. Este se une a uno de los muchos huecos que tiene en su superficie el enzima pero no va a ser el centro activo. Provoca un impedimento fisco para la actuación del enzima, o bien, el inhibidor se coloca antes de que lo haga el sustrato en el centro activo e impide la unión sustrato-enzima porque va a estar tapando el centro activo, o bien, se coloca después de que se hayan unido enzimasustrato e impide su separación. La mayoría son perjudiciales. (4)

4. Indique el significado de la constante de Michaelis Menten La cinética de Michaelis-Menten describe la velocidad de reacción de muchas reacciones enzimáticas. Su nombre es en honor a Leonor Michaelis y Maud Menten. Este modelo sólo es válido cuando la concentración del sustrato es mayor que la concentración de la enzima, y para condiciones de estado estacionario, o sea que la concentración del complejo enzima-sustrato es constante(3) Para determinar la velocidad máxima de una reacción enzimática, la concentración de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formación de producto. Esa es la velocidad máxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima están saturados con sustrato.(3)

Diagrama de velocidad de reacción y constante de Michaelis-Menten. 12.-BIBLIOGRAFÍA MARCO TEORICO RECONOCIMIENTO DE LA CATALASA: (1)http://es.scribd.com/doc/17469299/Informe-N9-laboratorio-de-BioquimicaI 14/06/12 http://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa 14/06/12 (2)http://www.foroswebgratis.com/mensajereconocimiento_y_desnaturalizacion_de_la_catalasa-103635-2242874-1-6020868.htm 14/06/12 *Enciclopedia Virtual Microsoft Encarta 2002, Microsoft Corporation 1993 - 2001.

DESNATURALIZACION (3) http://jose-canel.blogspot.com/p/presencia-y-desnaturalizacion-de-la.html 14/06/12 AMILA SA (4) http://es.wikipedia.org/wiki/Amilasa 14/06/12 CUESTIONARIO    

1.http://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa 14/06/12 2.http://es.wikipedia.org/wiki/Amila 14/06/12 3.http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C%A9tica_de_Michaelis-Menten 14/06/12 4.http://html.rincondelvago.com/enzimas_12.html 14/06/12