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Practica N°09 NUMERACION, AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROCOCCUS I-INTRODUCCION Los enterococos son bacterias esféricas que forman sus colonias en grupos o cadenas. Se encuentran de manera natural en muchos organismos, incluidos los humanos, como parte de su

flora

intestinal.

Son

microorganismos

muy

resistentes,

capaces

de

tolerar

concentraciones relativamente altas de sales y ácidos. En muchos estudios, los niveles de concentración de los enterococos se relacionan con la incidencia de enfermedades adquiridas por bañistas y constituyen un indicador muy importante de la contaminación en las playas y de las aguas salobres. Por presentar una mayor resistencia a la salinidad del agua marina y por el riesgo a la salud que representan, también se cuantifican los enterococos. Se han identificado más de 22 especies del género enterococcus; una de las especies que lo constituyen son E faecalis y E. faecium. Estas especies son muy parecidas entre sí, pero pueden diferenciarse mediante pruebas fisiológicas.

E. faecalis es resistente al calor y suele ser más veces de prudencia humana, mientras que E. faecium actúa más en vegetales. Las bacterias de este grupo crecen tanto a 10 ºC como a 45 ºC. Los Enterococcus poseen ciertas características en común que los convierte en Enterococcus muy particulares, son: termodúricos resistiendo fácilmente a temperaturas de pasteurización de la leche o incluso otros más altos. Toleran un % de sal de 65% o superior, crecen a pH de 9,6. Se desarrollan a un intervalo de Tº amplia, algunos desde los 5-8º C la mayoría incluso pueden hacerlo a los 48-55º C. Los enterococcus son cocos Gram. + De cadenas cortas o largas y que se diferencian de los demás cocos Gram. + En que son Catalasa (-). Los enterococcus al igual que los coliformes son de origen fecal y también están presente en vegetales, insectos y en el suelo.

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II-OBJETIVOS 

Familiarizarse con la técnica de aislamiento de Enterococcus a partir de aguas y alimento deshidratado.



Determinar la numeración e identificar Enterococcus a partir de aguas y alimentos deshidratados.



Conocer la metodología más adecuada para análisis.

III-FUNDAMENTO TEORICO

El recuento de Enterococcus en los alimentos se lleva a cabo, por lo general, como medio para evaluar la eficacia de los métodos de limpieza y desinfección en las industrias de alimentos, en particular de superficies, para corroborar otras indicaciones de contaminación fecal y como índice de calidad microbiológica general



El procedimiento considerado de modo general como más satisfactorio lleva consigo tres fases o estadios:

a.

Recuento presuntivo utilizando Agar Sangre Azida Cristal Violetada de Packer y por la técnica de recuento Standard en placa por siembra en profundidad.

b. Identificación confirmativa de las colonias sospechosas, previa purificación, en agar glucosa tetrazolium acetato de talio (TTC).

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IV-MATERIALES 

Muestra biológica: agua de acequia (Santa Rosa), leche en polvo a granel.



Medios de cultivo:

   

Medio para detección presuntiva: Caldo Glucosa Azida. Medio de detección confirmativa: Caldo EVA. Medio para aislamiento: Agar Enterococcus Pruebas bioquímicas: Caldo triptosa para pH 9.6; NaCl 6.5%, supervivencia a 65ºC/35’, crecimiento a 45°C.

         

Diluyentes: agua estéril (para la leche) Tubos de dilución Placas Petri Gradillas Frascos Tubos para pruebas bioquímicas Pipetas de 1 y 10 mL. Mechero Balanza Incubadora

V-PROCEDIMIENTO Para Leche en polvo 1. Primero, pesar 10g y lo diluimos en 90 ml de agua destilada estéril, obteniendo la dilución 10-3

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2. Luego, Realizamos diluciones hasta 10-3.

3. Sembrar

cada

dilución duplicado

por en

una

placa con Agar selectivo para Enterococos por siembra en profundidad (1 mL de inoculo).

4. Incubar a 35-38ºC por 24-48 horas. 5. Lectura: Deben observarse colonias rojas, con centro rojo o colonias blancas. 6. Luego realizar la identificación de las colonias a través de la tincion Gram y otras pruebas como catalasa, crecimiento a 45 ºC, crecimiento en NaCl 6.5%, crecimiento a pH 9.6, resistencia a 65°C/ 35’, entre otras.

PRUEBA CONFIRMATIVA

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Se siembra en medio TTC unas u colonias Se hace las pruebas respectivas : Creen a 45c° Crecimiento en bilis Catalasa pH 9.6

Para Agua de acequia 1. Para esta muestra, se utilizara el método del NMP (agua) de 3 tubos.

2. Prueba presuntiva: Sembrar diferentes alícuotas de 10 mL, 1mL y 0.1mL en Caldo Glucosa Azida. 3. Incubar a 37º C x 24-48 horas. 4. Prueba confirmativa: De los tubos positivos en detección presuntiva, sembrar una asada en Caldo EVA (Confirmativo). 5. Incubar a 37º C x 24-48 horas. 6. Lectura: Observar crecimiento o presencia de turbidez con sedimento rojo ladrillo. 7. De los tubos turbios continuar el aislamiento llevando al Agar Enterococcus por agotamiento y estría. 8. Realizar aislamiento y las pruebas de identificación respectivas.

VI-RESULTADOS Para la muestra de leche en polvo:

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10-1

10-2

10-3

No hubo crecimiento de colonias en ninguna de las placas de agar Enterococcus sembradas con la muestra de leche en polvo, lo que nos indica ausencia de Enterococcus en la muestra.

Para la muestra de agua de acequia: 

Prueba presuntiva:

Sedimento (+) Se observó crecimiento con sedimento en los 3 primeros tubos de la primera alícuota (10 mL). Por lo que la Numeración es: 3-3-3 [Título del documento] | [Subtítulo del documento]

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

Prueba confirmativa y Aislamiento

Tinción GRAM

Se observó crecimiento y precipitado en los tubos con caldo presuntivo, sembrados con la muestra (agua de acequia, y finalmente al sembrar en agar enterococos desarrollaron colonias blancas pequeñas, y realizar tinción de GRAM se observó la morfología propia de

Enterococcus sp. Por lo tanto esto nos indica que hay presencia de Enterococcus sp en la muestra analizada.

VII-CONCLUSIONES 

Se aprendió la Técnica para el aislamiento de Enterococos a partir de Alimentos (leche en polvo) y aguas (agua de acequia).



Se logró la numeración en tubos con la muestra de agua de acequia.



Se logró la detección y aislamiento de Enterococcus sp a partir de la muestra de agua de acequia.



No se pudo identificar la cepa de Enterococcus sp

por falta de las pruebas

bioquímicas necesarias. 

La muestra de leche en polvo a granel no tiene presencia de Enterococcus sp por lo tanto la muestra es apta para el consumo humano.

VIII-REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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

Medios de Cultivo en Microbiología: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º Edic. Lima.

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http://es.wikipedia.org/wiki/Enterococcus

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http://tierra.rediris.es/hidrored/ebooks/ripda/contenido/capitulo13.html



Granados, R. 1997. “Microbiología. Bacteriología, Medios de Cultivo y Pruebas Bioquímicas. Micología General. Parasitología General.” Editorial Paraninfo.



Aurazo de Zumaeta, Margarita. Lima. Perú 2004. Manual Análisis Básicos de Calidad del Água de Bebida.

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