Elitamar Quispe Laurente Microbiologia

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En las últimas décadas, entre las técnicas empleadas pa ra contrarrestar los efectos de los contaminantes, se comenzó a utilizar una práctica llamada biorremediación. El término biorremediación fue acuñado a principios de la década de los ‘80, y proviene del concepto de remediación, que hace referencia a la aplicación de estrategias físico-químicas para evitar el daño y la contaminación en suelos. Los científicos se dieron cuenta que era posible aplicar estrategias de remediación que fuesen biológicas, basadas esencialmente en la observación de la capacidad de los microorganismos de degradar en forma natural ciertos compuestos contaminantes. Entonces, la biorremediación surge como una rama de la biotecnología que busca resolver los problemas de contaminación mediante el uso de seres vivos (microorganismos y plantas) capaces de degradar compuestos que provocan desequilibrio en el medio ambiente, ya sea suelo, sedimento, fango o mar. 1.1.

TIPOS DE BIORREMEDIACIÓN BIORREMEDIACIÓN

En los procesos de biorremediación generalmente se emplean mezclas de ciertos microorganismos o plantas capaces de degradar o acumular sustancias contaminantes tales como metales pesados y compuestos orgánicos derivados de petróleo o sintéticos. Básicamente, los procesos de biorremediación pueden ser de tres tipos:

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1.1.1.

DEGRADACIÓN ENZIMÁTICA Este tipo de degradación consiste en el empleo de enzimas en el sitio contaminado con el fin de degradar las sustancias nocivas. Estas enzimas se obtienen en cantidades industriales por bacterias que las producen naturalmente, o por bacterias modificadas genéticamente que son comercializadas por las empresas biotecnológicas. Por ejemplo, existe un amplio número de industrias de procesamiento de alimentos que producen residuos que necesariamente deben ser posteriormente tratados. En estos casos, se aplican grupos de enzimas que hidrolizar (rompen) polímeros complejos para luego terminar de degradarlos con el uso de microorganismos .Un ejemplo lo constituyen las enzimas lipasas (que degradan lípidos) que se usan junto a cultivos bacterianos para eliminar los depósitos de grasa procedentes de las paredes de las tuberías que transportan los efluentes. Otras enzimas que rompen polímeros utilizados de forma similar son las celulosas, proteinasas y amilasas, que degradan celulosa, proteínas y almidón, respectivamente.  Además de hidrolizar estos polímeros, existen enzimas capaces de degradar compuestos altamente tóxicos. Estas enzimas son utilizadas en tratamientos en donde los microorganismos no pueden desarrollarse debido a la alta toxicidad de los contaminantes. Por ejemplo, se emplea la enzima peroxidasa para iniciar la degradación de fenoles y aminas aromáticas presentes en aguas residuales de muchas industrias.

1.1.2.

REMEDIACIÓN MICROBIANA En este tipo de remediación se usan microorganismos directamente en el foco de la contaminación. los microorganismos utilizados en biorremediación pueden ser los ya existentes (autóctonos) en el sitio contaminado o pueden provenir de otros ecosistemas, en cuyo caso deben ser agregados o inoculados.

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La gran diversidad de microorganismos existente ofrece ofre ce muchos recursos para limpiar el medio ambiente y, en la actualidad, esta área está siendo objeto de intensa investigación. Existen, por ejemplo, bacterias y hongos que pueden degradar con relativa facilidad petróleo y sus derivados, benceno, tolueno, acetona, pesticidas, herbicidas, éteres, alcoholes simples, entre otros. Los metales pesados como uranio, cadmio y mercurio no son biodegradables, pero las bacterias p ueden concentrarlos de tal manera de aislarlos para que sean eliminados más fácilmente. Las actividades microbianas en el proceso de biorremediación se pueden resumir en el siguiente esquema:

1.1.3.

REMEDIACIÓN CON PLANTAS (FITORREMEDIACIÓN) La fitorremediación es el uso de plantas para limpiar ambientes contaminados. Aunque se encuentra en desarrollo, constituye una estrategia muy interesante, debido a la capacidad que tienen algunas especies

vegetales

de

absorber,

acumular

y/o

tolerar

altas

concentraciones de contaminantes como metales pesados, compuestos orgánicos y radioactivos. La fitorremediación ofrece algunas ventajas y desventajas frente a los otros tipos de biorremediación:

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.Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguas contaminadas. .Algunos procesos degradativos ocurren en forma más rápida con plantas que con microorganismos. .Es un método apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminación de áreas restringidas en plazos largos. Las plantas pueden incorporar las sustancias contaminantes mediante distintos procesos que se representan en la siguiente ilustración y se explican en la tabla que continúa:

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1.1.4.

USO DE ORGANISMOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE EN BIORREMEDIACIÓN En los últimos años, los avances en ingeniería genética han permitido el desarrollo de organismos transgénicos. Y la biorremediación hace uso de esta nueva tecnología para resolver varios problemas de contaminación. El futuro promete aún más. Muchos grupos de investigación están desarrollando en el laboratorio, plantas y microorganismos microo rganismos genéticamente modificados para ser mejores agentes de biorremediación, es decir que degraden mejor o más eficientemente a los agentes contaminantes. Por ejemplo, se puede utilizar material genético de bacterias resistentes a metales para insertarlo en el genoma de una planta que, entonces, adquiriría esta nueva característica. Un grupo de investigación utilizó un gen llamado merA, que codifica para la enzima reductasa del ion mercúrico, altamente tóxico, que cataliza su reducción hasta la forma volátil y poco tóxica de mercurio elemental, gaseoso en condiciones de temperatura no muy elevadas. Estos investigadores, consiguieron la transferencia del gen bacteriano merA a cultivos de Liriodendro tulipifera (álamo amarillo). El gen se expresó adecuadamente en ese material vegetal, de modo que las plántulas regeneradas germinaron y crecieron vigorosamente en los medios de cultivo, que contenían niveles de iones mercurio que son normalmente tóxicos, siendo capaces c apaces de captarlo en su forma iónica y de reducirlo en el interior de la planta, tras lo cual era liberado en la forma gaseosa no tóxica. Esta investigación ha abierto el camino para que en el futuro sea posible realizar plantaciones arbóreas transgénicas que, mediante este proceso de fitovolatilización u otros parecidos, sean capaces de descontaminar terrenos con altos niveles de contaminantes. Se están perfeccionando nuevos métodos de biotecnología para el tratamiento del agua, que eliminarán los compuestos que contengan fósforo, nitrógeno y azufre. La biorremediación mediante bacterias ofrece grandes posibilidades de limpiar y descontaminar sistemas complejos y gracias a sus ventajas económicas y ambientales será una de las tecnologías más desarrolladas durante este siglo. Se están utilizando cepas especializadas de microorganismos de alta actividad para tratar agentes contaminantes en diferentes sectores, como las industrias que utilizan catalizadores, las textiles, las curtiembres, el procesamiento de celulosa y almidón, la galvanoplastia, la minería, el desengrasado y recubrimiento recu brimiento de superficies y la impresión.

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Se han evaluado estrategias para minimizar los impactos generados por el cianuro, el método más usado es mediante procesos físicos de exclusión, adsorción con carbón activado, tratamiento químico y recuperación de cianuro, o por el mantenimiento de los niveles disociables de ácido débil (WAD) de cianuro por debajo de 50 mg L -1 (Gurbuz et al., 2004, Novak et al., 2013). Existen sitios en todo el mundo como es el caso de Dakota del sur en Estado s Unidos, Columbia Británica en Canadá que están contaminados con cianuro como resultado de la actividad industrial del pasado y derrames accidentales (Akcil y Mudder , 2003; Huertas et al., 2010; Novak et al., 2013). Los tratamientos biológicos son alternativas factibles puesto que un amplio rango de microorganismos puede metabolizar el cianuro. La bioadsorción es generalmente usada para el tratamiento de metales met ales pesados en desechos, y podría podr ía ser empleada para el tratamiento de efluentes que contienen iones metálicos complejos (Aksu et al., 1999). Un ejemplo de adsorc ión es la pared celular del hongo Rhizopus arrhizus, posee esencialmente varios compuestos orgánicos que incluyen quitina, polisacáridos ácidos, lípidos, aminoácidos y otros compuestos celulares que podrían generar una superficie para la adsorción complejos iónicos de cianuro y hierro (Aksu et al., 1999).

1. DEGRADACION BIOLOGICA Estas metodologías se han empleado con éxito en el tratamiento de diferentes residuos líquidos industriales (Kuyucak y Akcil, 2013), las bacterias son las principales responsables de la degradación biológica (Akcil et al.,

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2003), exhiben una amplia gama de funciones metabólicas y son capaces de degradar estructuras químicas como el cianuro (Botz, 2001). La degradación biológica o biodegradación de cianuro se da por la capacidad de ciertos grupos de microorganismos microorganismo s (en su mayoría bacterias) para utilizar compuestos cianurados como fuente de carbono y nitrógeno (Oudjehani et al., 2002; Trapp et al., 2003), este tipo de estrategia biológica se puede aplicar in situ, en medios aeróbicos y anaeróbicos, crecimientos en suspensión de forma activa y pasiva. Las especies microbianas pueden crecer en múltiples entornos que permitan la captación, el tratamiento, la adsorción y precipitación de cianuro, sus compuestos y metales (Akcil, 2002;  Akcil et al., 2003; Oudjehani et al., 2002; Trapp et al., 2003; Kuyucak y Akcil, Akcil, 2013). Se sabe que la toxicidad del cianuro en altas concentraciones puede limitar la capacidad de los microorganismos para utilizarlo como sustrato para su crecimiento (Patil y Paknikar, 1999. Los microorganismos involucrados en la degradación de efluentes de minería, poseen varios sistemas enzimáticos específicos que les permite adaptarse en ambientes con alta concentración de cianuro. Entre los microorganismos más conocidos están los hongos del género Fusarium, Hasenula, y las bacterias de los géneros E.coli, Pseudomonas fluorescens, Citrobacter, Bacillus subtilis, quienes asimilan el cianuro usándolo como fuente de nitrógeno y/o carbono, con un 18 Microorganismos potenciales degradadores de cianuro en residuos de minería de oro intermediario como es el NH (Akcil y Mudder, 2003; Botz et al., 2005; Novak et al., 2013; Kebeish et al., 2015).  Algunos microorganismos tienen la capacidad de asimilar el mineral y eliminar el cianuro o llevarlo a amoniaco, fumarato y otros compuestos menos peligrosos ambientalmente, como es el caso de Ferrobacillus ferroxidans,  Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans;

Pseudomonas

putida

y

Pseudomonas

fluorescens

Pseudomonas aeruginosa también lo elimina con niveles adecuados de aireación entre 100 y 120 rpm Pseudomonas paucimobilis emplea

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moderadamente fuertes complejos metálicos de cianur o como el [K, Ni (CN)] para transformar este químico en sustancias menos contaminantes (Barclay et al., 1998).  Algunos hongos reportados en la literatura como degradadores degradadore s de cianuro son; Gloeocerocospora sorghi (Fry y Munch, 1975; Wang et al., 1992), Fusarium lateritum y Stemphylium loti (Fry y Millar, 1972). En el caso de Fusarium solani ha sido demostrada su habilidad de utilizar el cianuro como nutriente para su crecimiento. Para Fusarium oxysporum se ha reportado tolerancia al KCN transformándolo en formamida (Barclay et al., 1998). En el caso de Fusarium lateritium este presenta tolerancia al cianuro por la inducción de la enzima cianuro hidratasa (Barclay et al., 1998). Otras especies de hongos como es Trichoderma spp, también ha sido reportada, encontrando que una variedad de cepas de Trichoderma harzianum actúan en la descomposición del cianuro (Ezzi y Lynch, 2005). Existen estudios relacionados a la desintoxicación de cianuro por algas como es el caso de  Arthrospira maxima, Chlorella sp. y Scenedesmus obliquus en aguas contaminadas obteniendo un porcentaje entre el 86 al 90% de remoción del cianuro (Gurbuz, 2004).

2. AISLAMIENTO Y LA EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS BIODEGRADADORES DE CIANURO La ruta de asimilación de cianuro en P. pseudoalcaligenes CECT5344 transcurre a través de un nitrilo formado por la reacción química del cianuro con el oxalacetato, siendo este último acumulado como consecuencia de la acción conjunta de una malato:quinona oxidoreductasa (MQO) y la oxidasa terminal resistente a cianuro (CioAB) (Luque-Almagro et al., 2011b). Los nitrilos pueden ser convertidos en amonio por la acción de una nitrilasa o un sistema nitrilo hidratasa/amidasa. Con el objetivo de elucidar la ruta de asimilación de cianuro en P. pseudoalcalígenes CECT5344, CECT53 44, se ha analizado pág. 10

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el proteoma de este microorganismo en condiciones cianotróficas frente a nitrato como fuente de nitrógeno como control. En este estudio se identificaron proteínas relacionadas con la ruta de asimilación de cianuro en la estirpe CECT5344, que aparecían inducidas por cianuro, como NitB y NitG, cuyos genes se encuentran localizados en la agrupación génica nit1C. Además de NitB y NitG, de función desconocida, la agrupación génica nit1C codifica un regulador transcripcional del tipo Fis dependiente de σ54 (NitA), una nitrilasa (NitC), una proteína que pertenece

a la superfamilia S-adenosilmetionina (NitD), un miembro de la superfamilia N-aciltransferasa (NitE), un polipéptido de la familia AIRS/GARS (NitF) y una oxidorreductasa dependiente de NADH (NitH). Un análisis transcripcional mediante RT-PCR determinó que los genes nitBCDEFGH se cotranscriben, mientras que el gen regulador nitA se transcribe de forma divergente.  Además, resultados obtenidos por RT-PCR confirman que la expresión de los genes nitBCDEFGH está inducida por cianuro y reprimida por amonio. La relación entre el cianuro y el grupo de genes nit1C queda patente por el fenotipo de los mutantes deficientes nitA, nitB y nitC, incapaces de usar complejos cianuro-metálicos o 2-hidroxinitrilos como única fuente de nitrógeno. Todos estos datos indican que la nitrilasa NitC, junto con la proteína NitB, utilizan de forma específica determinados nitrilos alifáticos como sustrato, entre los que se encuentran el formado durante la asimilación de cianuro (Estepa et al., 2012). Además, entre las proteínas inducidas por cianuro se identificaron una dihidropicolinato sintasa (DapA), un a fosfoserina transaminasa (SerC) y una proteína de función desconocida (Orf1), las tres codificadas por genes del operón cio, una cianasa (CynS), la proteína S6 de la subunidad ribosomal 30S (RpsF), una superóxido dismutasa (SodB), la ferritina (Dps), una oxidorreductasa (Fpr) y un factor fa ctor de elongación P (EF-P). Una vez identificadas, estas proteínas se s e han analizado funcionalmente y se han localizado en el genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 los genes correspondientes, así como los genes adyacentes. La inducción de estas proteínas en condiciones cianotróficas sugiere que el metabolismo del

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cianuro incluye, además de la resistencia y asimilación de este tóxico, otros procesos biológicos relacionados con el metabolismo del cianato y de algunos aminoácidos, el estrés oxidativo y la homeostasis de hierro, entre otros. Por otra parte, el conocimiento en profundidad y la interpretación de la secuencia génica de P. pseudoalcaligenes CECT5344, así como el análisis comparativo frente a organismos no cianotrofos ha permitido entender algunos de los mecanismos implicados en la resistencia y asimilación de cianuro, lo que permitiría conducir a la posterior mejora del proceso de biodegradación de cianuro. Además, el estudio del genoma de la estirpe CECT5344 permitirá explorar la capacidad de este organismo para ser utilizado en procesos de biorremediación de residuos cianurados en los que se encuentran metales y otros tóxicos (Luque-Almagro et al., 2013; Wibberg et al., 2014). En este trabajo se muestran y discuten los resultados de la secuenciación del genoma de P. pseudoalcaligenes, así como el estudio del análisis filogenético y evolutivo de la cepa, estableciéndose de esta manera relaciones con otras especies en base a los genomas secuenciados de las mismas, entre las que destaca P. mendocina ymp relacionada con P. pseudoalcaligenes CECT5344. El estudio de las características del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 ha sido completado con un análisis comparativo frente a los genomas de otras especies de Pseudomonas, encontrándose así semejanzas y diferencias en cuanto a la distribución génica funcional. Por último, se muestra un análisis del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 en relación con los genes implicados probablemente en los procesos de asimilación de cianuro y residuos cianurados, tales como los codificantes de nitrilasas y aquellos implicados en la resistencia a cianuro como los constituyentes del operón cio que codifican la oxidasa terminal insensible a cianuro. Finalmente, se discute la presencia de genes implicados posiblemente en otros procesos con una alto potencial biotecnológico, tales como la producción de bioplásticos y la biodegradación de diversos contaminantes.

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