ELISA

Makalah Imunokimia ELISA (Enzim Linked Imuno-Assay)

Disusun oleh : Angg Anggit itaa Set Setya ya Dama Damaya yant ntii 1151 115130 3010 1001 0111 1102 025 5 Rini Nuraini 115130100111026 Hamm ammam Sh Shardi Mi Mirrah 115130100111034  Navilla Y.Afanin M 115130100111035 115130100111035 Oktalavia Dw Dwi No Noer R 115130100111036 Ummu Syahidah R 115130100111040 Dyah Ayu Nur Rohma 115130100111045 Dinta Ard Ardeli Man Mandasari 115130101111026 Wachidatun Ni Nisa’ 115130101111030 Sri Retn Retno o Dewi Dewi And Andrian rianii 115 1151301 130101 0111 1110 1036 36 Septi eptian an Vid Vidya ya Pan Panga gast stut utii 115 1151301 130101 0111 1110 1041 41 Virg Virgin inia ia Anu Anugr grah ah Yut Yutasa asari ri 1151 115130 3010 1011 1111 1104 049 9

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2013

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Penyakit mulut dan kuku (PMK), atau sering disebut Foot and Mouth Disease (FMD), adalah salah satu penyakit menular pada hewan dan sangat ditakuti oleh hampir semua negara di dunia, terutama negara-negara pengekspor ternak dan produk ternak. Indonesia pertama kali tertular PMK pada tahun 1887 di daerah Malang, Jawa Timur. Pada umumnya PMK  menyerang hewan berkuku genap, seperti sapi, kerbau, kambing, domba, babi, gajah, jerapah, dan menjangan. Penyebab PMK adalah virus yang sangat kecil, berdiameter ±20 milimikron, terbentuk dari asam inti ribo yang diselubungi protein. Virus ini sangat labil, antigenisitasnya cepat, dan mudah berubah. Hewan yang terserang penyakit PMK dengan menunjukkan gejala klinis akan dengan mudah didiagnosa dengan melihat gejalan klinisnya, namun untuk PMK subklinis, harus dilakukan serological test untuk dapat menentukan diagnosa. Tes netralisasi virus diketahui sebagai metode standar untuk mendeteksi antobodi FMDV (Foot and Mouth Disease Virus). Tetapi, prosedur laboratorisnya memakan waktu 2-3 hari, sehingga tes ini tidak sesuai untuk   pengawasan hewan dalam jumlah besar. Metode lain dalam OIE manual adalah liqiud phase  blocking (LPB) ELISA. Kekurangannya, pertama, dibutuhkan training dan pengalaman untuk  menghasilkan hasil yang akurat. Kedua, reaksi positif palsu dapat terjadi sebanyak 4% pada hewan sehat yang tidak divaksin dan 18% pada hewan stress. Seperti yang telah diketahui, ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) adalah tes yang menggunakan antibodi dan perubabahan warna untuk mengidentifikasi substansi. ELISA dikenal sebagai uji biokimia bertipe analisis “wet-lab” yang menggunakan solid phase dari Enzyme Immunoassay (EIA) untuk mendeteksi antigen pada sampel liquid atau sampel  basah. Antigen dari sampel akan diikatkan ke permukaan well, kemudian antibodi yang spesifik ditambahankan sehingga dapat mengikat antigen. Antibodi tersebut diberi enzim dan langka langkah h terakhi terakhir, r, substa substansi nsi berisi berisi substra substratt enzim enzim ditamb ditambahk ahkan. an. Reaksi Reaksi subseq subsequen uentt akan akan memproduksi sinyal yang dapat dideteksi, umumnya perubahan warna pada substrat. Untuk itulah, tes deteksi PMK yang berasal dari pengembangan ELISA yang akan dibahas pada berikut ini dipilih dan diharapkan dapat menjadi rujukan untuk deteksi cepat PMK/FMD.

1.2 Tujuan •

Mengetahui prinsip kerja dari ELISA

•

Mengetahui metode pengembangan dari ELISA untuk menyempurnakan metode  pengujian PMK 

1.3 Manfaat •

Dengan mengetahui prinsip kerja dari ELISA diharapkan selanjutkan dapat menciptakan metode pengembangan ELISA untuk menyempurnakan metodemetode sebelumnya.

•

Memberikan rujukan untuk mendeteksi PMK dengan metode yang telah dikembangkan dari ELISA.

BAB II ISI 1. Pengantar Penyakit mulut dan kuku (PMK) adalah penyakit yang sangat menular pada hewan  berkuku seperti sapi, babi, domba, dan kambing. Adanya penyakit ini dapat menyebabkan kerugian ekonomi karena penurunan produksi susu serta kendala penjualan hewan hidup dan  produk hewan. Penyakit mulut dan kuku disebabkan oleh virus genus Aphtovirus dari famili Picornaviridae. Virus ini single strand, ada tujuh tipe virus PMK, yakni A, O, C, Asia¸ South African Teritorry (SAT) 1, 2, 3, virus berdiameter 10 – 20 milimikron dan terbentuk dari Ribonucleic acid (RNA) serta diselubungi oleh protein. Sifat-sifat virusnya yaitu sangat labil, antigenisitasnya cepat dan mudah berubah, tidak tahan pH asam dan basa, panas, sinar UV. Hewan yang terinfeksi PMK klinis dapat terdeteksi secara langsung, tetapi hewan yang terinfeksi PMK subklinis harus dilakukan uji serologis terlebih dahulu. Uji yang dapat digunakan adalah uji netralisasi virus untuk mendeteksi antibodi terhadap virus, namun uji ini membutuhkan waktu yang lama dan fasilitas yang memadai. Adapun uji lain yaitu liquid  phase blocking (LPB) ELISA tetapi uji ini memiliki kelemahan yaitu membutuhkan  pengalaman dan dapat menimbulkan hasil positif palsu. Oleh karena itu perlu ditingkatkan solid phase competitive (SPC) ELISA terutama untuk virus PMK serotipe O. Penggunaan virus PMK inaktif membutuhkan antigen yang diproduksi di dalam laboratorium. Tetapi hal ini memiliki resiko sehingga dikembangkan protein rekombinan yang berasal dari virus PMK  P1 dan 3C yang diekspresikan dalam sel insekta. Penyebaran virus PMK di berbagai negara menyebabkan ELISA berbasis protein rekombinan dikembangkan sebagai pengganti LPB ELISA untuk mendeteksi antibodi virus PMK serotip Asia 1. 2. Metode dan Bahan

2.1 Sel dan Virus Sel yang digunakan adalah Sel IBRS-2 ditumbuhkan pada medium esensial alpha minimum (MEM) yang diperkaya dengan 10% serum bovine fetal heat-inactivated dan larutan antibiotic-antimikolitik. Sel Spodoptera frugiperda (Sf9) (Invitrogen) untuk propagasi  bikulovirus rekombinan ditumbuhkan pada medium Grace (Invitrogen) yang diperkaya dengan 10% serum bovine fetal heat-inactivated dan larutan antibiotic-antimikolitik.

2.2. Generation of recombinant baculovirus containing the P1 Viral RNA diekstrak dari FMD yang terinfeksi dan sel IBRS-2 menggunakan ekstraksi RN mini kit. DNA komplementer untuk P1 dan RNA 3 C dihasilkan menggunakan AccuPower RT oremix. Gen diamplifikasi dari cDNA menggunakan nPfu DNA polimerase. Setelah itu menggunakan DNA primer. . . P1F, 5_-GAA GGG ATC C AT GGG AGC CGG GCA ATC AGT CCG-3_; P1R, 5_-TAG G AC TAG T TA CAA AGT CTG TTT CTC AGG TGC-3_; 3CF, 5_-GAT T CT CGA GAT GAG CGG TGC CCC CCC GAC CGA C-3_; and 3CR, 5_-AAC A GC ATG C TA CTC ATG GTG TGG TTC AGG GTC-3_ . •

PCR amplifikasi dari gen P1 dengan menggunakan siklus thermal dengan tahap : Denaturasi 95oC selama 2 menit 30 detik  Dilanjutkan dengan tahapan suhu 55 oC selama 30 detik dan 72 oC selama 2 menit 30 detik. Dan terakhir ekstensi pada suhu 72oC selama 5 menit

•

Untuk PCR amplifikasi gen 3C sama dengan gen p1 hanya saja pada tahap elongasi menggunaan waktu 1 menit dengan suhu 72 oC. Masing-masing amplifikasi dari P1 dan 3C dikloningkan secara terpisah pada kloning

apFastBacDual vector. (Untuk gen P1 menggunakan polyhedrin promotor BamH1 dan Spel untuk disisipkan pada kloning pada pFastBacdual. Sedangkan untuk gen 3C menggunakan P10 promoter XhoI and Sphl). Dari rekombinan pFastBac/P1/3C tersebut

menggenerasi dari

Recombinan DNA

 baculovirus menjadi baculovirus shuttle vector (bacmid) dan diperbanyak dalam DH10Bac Eschericia coli (Invitrogen) menggunakan bac-to-bac sistem ekpresi baculovirus. Hasil yang didapat akhirnya Rekombinan baculovirus yang mengandung gen P1 dan 3C dihasilkan , diikuti dengan transfeksi dari DNA recombinan bacmid kedalam sell sf9 dan kemudian disimpan pada suhu 4oC sampai digunakan

2.3. Expression of recombinant proteins Sf9 ditumbuhkan pada termos(suhu rendah) yang diinfeksi dengan reombinan  baculovirus pada multiplicity of infection (MOI) dan dipanen untuk menentukan ekspresi optimal untuk maksimal rekombinan protein. Sel dibekukan dan thawing 3 kali dan diklarifikasi dengan sentrifugasi pada 10.000xg selama 30 enit. Supernatan (rP13C) digunakan untuk diagnosa antigen pada penelitian. Imunofluoroescence assay (IFA) digunakan untuk menkonfirmasi ekspresi dari rekombinan protein. Sel Sf9 tumbuh pada wadah yang tterinfeksi dengan rekombinan baculovirus pada 5 MOI. Sel yang terinfeksi dicampur dengan aseton dingin dan methanol kemudian diperiksa dengan peptide serum antiVPI kelinci. Anti VPI peptide serum dicampurkan dengan 1:100 pada phosphate buffered saline (PBS) selama 1 jam pada suhu 37 oC. Setelah dicuci dengan PBS , FITC dikonjugasi dengan anti-rabbit antibodi dan dicairkan lagi dengan PBS 1:100 dan diinkubasi selama 1 jam dengan suhu 37 oC. Kemudian diperiksa dengan fluorescence mikroskop untuk western blot analisis. Sampel protein dipisahkan menggunakan NUPAGENovex Bis-Tris gels dengan Xsel SureLockmini-selInvitrogen. Protein ditransfer dari gel ke nitrocelular membran selama 1  jam, kemudian anti VPI kelinci dtambahkan dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Dicuci dengan TBST , antibodi sekunder . Goat anti rabbit dikonjugasi dengan alkalin  phosphatase (KPL). Ditambahkan 1:1000 dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC . Kemudian colorimetric reaction

dikembangkan dengan menambahkan satu component

solution of 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitro blue tetrazolium (KPL) 2.4 Sera dan antibody monoklonal  Disiapkan serum kelinci terhadap VP1 peptidewas dari inokulasi kelinci subkutan dengan

hemocyanin

limpet

lubang

kunci

(KLH)

digabungkan

pada

urutan

peptida AY304994,

sintetik 

(139TGPTRRGDLALQRVSNRLP157,

berdasarkan

Asia

1/Ind/63/72) dicampur dengan Freund

untuk menyelesaikan adjuvan pada awalnya dan

kemudian didapatkan adjuvant lengkap pada tiga penguat. Sera ini diperoleh dari Peptron Inc (Daejeon, Korea). Bovine sera yang tertutup di LPB ELISA digunakan untuk perbandingan awal sensitivitas relatif dan crossreactivity dari rP13C ELISA relatif terhadap LPB ELISA. Ini

adalah kontrol yang kuat-positif dan moderat-positif sera sapi untuk serotipe Asia 1 (Shamir  strain), dan serum sapi yang kuat-positif serotipe O, A, dan C. Caprine sera (n = 4) dikumpulkan dari empat kambing pada 40 hari setelah  pengambilan intradermal di leher dengan strain Mongolia (As1/MOG/05) pada 20 hari pasca imunisasi tunggal dengan trivalen Vaksin (O, A, dan Asia 1) dari Merial (Surrey, Inggris). semua subjek tidak menunjukkan gejala FMD seluruh eksperimental periode. Dua babi 60-hari-tua diimunisasi dua kali intramuskular dengan protein rP13C di amixturewith IMS1313 adjuvant (Seppic, Paris, Prancis) dalam volume akhir 3 ml. Mereka  berdarah pada 14 hari posting imunisasi pertama dan pada 13 dan 20 hari posting kedua imunisasi. Divaksinasi bovine serum (n = 68) yang diperoleh di lapangan selama 2000 PMK  wabah di Republik Korea. Bovine divaksinasi dengan dua dosis trivalen (O, A, dan Asia) vaksin. Sera (n = 1.760) dari hewan yang tidak memiliki riwayat paparan PMK virus diperoleh dari sapi (n = 640), babi (n = 560) dan kambing (n = 560) di peternakan dalam negeri yang telah didiagnosa sebagai negatif oleh nonstruktural protein (NSP) ELISA (Jenobiotech, Gangwon, Korea). Sebuah antibodi monoklonal (Mab) digunakan sebagai antibodi capture (70-17) diproduksi dengan metode fusi sel seperti yang dijelaskan sebelumnya (OEM et al., 2007). Untuk mendapatkan Mab, digunakan detektor antibodi untuk bersaing dengan antibodi serum. Tikus (BALB / c) diimunisasi empat kali dengan peptida KLP-terkonjugasi yang sesuai ke VP1

epitop,

138EESSRRGDLAALARRVNNRLP158,

berdasarkan

pada

urutan

As1/MOG/05, yang disintesis di Peptron Inc dan menerima injeksi intravena sebagai booster  akhir 3 hari sebelum fusi sel dengan sel myeloma SP2 / O.Sel hibridoma disaring oleh peptida ELISA, IFA dan tes netralisasi virus. Akhirnya, Mab dipilih (1A31) dimurnikan menggunakan ImunoPure dengan pemurnian Kit IgG (Pierce, IL, USA) dan diberi label menggunakan perodixase pelabelan kit (Roche Diagnostics, Basel, Swiss) sesuai dengan instruksi pabrik. 2.5. Recombinant protein-based ELISA (rP13C ELISA) MaxiSorp ELISA plates yang telah dilapisi, dilakukan pemurnikan MAB 70-17 (2g/ml) didalam 0,05 M Carbonat buffer pada pH 9,6 yang diinkubasi semalaman pada suhu 4 c. Buffer adalah zat yang dapat mempertahankan pH ketika ditambah sedikit asam/basa         

̊

atau ketika diencerkan. Buffer memiliki dua macam yaitu asam lemah dan garamnya atau  basa lemah dan garamnya, sehingga penambahan ini berfungsi untuk mempertahankan pH

larutan. Plate kemudian dicuci 3 kali menggunakan larutan PBS 0,05 % dan diinkubasi dengan 50 чl atau rP13C dengan pengenceran 1:18 dimana dalam pengenceran itu berisi PBST yang mengandung 5 % skim susu pada suhu 37 c selama 1 jam. Larutan PBS berfungsi         

̊

sebagai larutan penyangga dalam berbagai eksperimen untuk mempertahankan pH protein. Setelah itu dicuci kembai, selanjutnya dilakukan pengenceran berseri dengan perbandingan 1:10 dan diinkubasi kembali pada suhu 37 c selama 1 jam. Setelah pencucian dengan PBST         

̊

50 чl didalam terkandung 0,1 чl/mg MAB konjugat ditambahkan horseradish peroxidase kedalam plate selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 37c selama 1 jam. Pencucian         

̊

 bertujuan untuk melepaskan ikatan non spesifik sehingga didapatkan ikatan spesifik yang dikendaki saja yang ada didalam plate. Setelah plate dicuci total 5 kali pencucian, reaksi colorimetric dapat diketahui setelah 15 menit dengan menambahkan 0,6 mg/ml O phenylenediamine didalam 0,05 M citrate phosphate buffer dengan pH 5 yang mengandung 0,015 % hydrogen peroxide. Selanjutnya reaksi ditambahkan “Stop-reaction” berupa 50 чl yang mengandung 1,25 M sulpuric acid. Optical density dapat dibaca pada panjang gelombang 492 nm. Nilai Optical Density dapat dihitung dengan rumus: Hasil standardisasi dihitung dengan melihat nilai OD pengenceran serum positif  tertinggi dibandingkan dengan nilai OD pengenceran serum negatif terendah.

PI (%)= 100 x {1-(OD

test serum

/ OD control )}

Berikut adalah skema pengerjaan Recombinant protein-based ELISA (rP13C ELISA) -

MaxiSorp ELISA plate dimurnikan dengan MAB yang mengandung 0,05 M carbonat buffer pada pH 9,6 dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 oC

-

Dicuci 3 kali dengan larutan PBS 0,05%

-

Diencerkan 1:8 berisi PBST mengandung 5% skim susu pada suhu 37 oC selama 1  jam

-

Dicuci kembali dan dilakukan pengenceran 1”10 dan diinkubasi suhu 37 oC selama 1 jam

-

Setelah pencucian 5 kali baru ditambah 0,6 mg/ml O-phenylenediamine didalam 0,05 M

-

Ditambahkan “stop reaction” berupa 1,25 M sulpuric acid

-

Pembacaan hasil juga dilakukan dengan menggunakan ELISA reader dengan  panjang gelombang 429 nm

2.6 Others test (tes lain) IFA digunakan untuk menguji rekasi spesifik antara MAB (IA31) untuk FMDV Asia 1. Immunofluorescence assay adalah teknik dimana antibodi berlabel dengan molekul fluorescent (fluorescein atau rhodamine atau salah satu dari banyak zat warna fluorescent lainnya) digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen dalam atau pada suatu sel atau  jaringan oleh fluoresensi yang dipancarkan oleh antibodi terikat. Sel-sel IBRS-2 tumbuh dengan baik pada 96 well micropipette yang telah diinfeksi dengan As1/MOG/05 dan CAM 9/80 selama 48 jam sebelumnya dicampur dengan aceton dan methanol dalam keadaan dingin. Sel-sel tersebut yang telah di treatmen menggunakan 1A31 dimana epitope akan selalu berada  pada bagian VP1 diinkubasi pada suhu 37o c selama 1 jam. Epitop adalah Suatu tempattempat tertentu dari suatu imunogen yang sifatnya aktif, yang akan berikatan dengan antibody atau dengan reseptor spesifik pada permukaan limfosit T Posisi epitope dengan antibody harus berdekatan dan sesuai yang merupakan ikatan non kovalen. Jumlah epitop pada satu molekul antigen berbeda dengan jumlah epitop pada antigen yang lain. Setelah itu dicuci dengan larutan PBS. Fungsi pencucian adalah untuk membuang ikatan non spesifik yang tidak  dikendaki sehingga yang tersisa dalam late adalah ikatan spesifik yang dikehendak. Lalu tambahkan konjugat berupa anti-rabbit-antibodies (KPL) yang telah diencerkan dengan  perbandingan 1:100 dngan PBS dan diinkubasi pada suhu 37o c selama 1 jam. Setelah  pencucian dalakukan pembacaan menggunakan fluorescence microscope. Cara kerja -

Sel IBRS-2 tumbuh baik pada 96 well micropipette yang telah diinfeksi dengan As1/MOG/05 dan CAM 9/80 selama 48 jam

-

Dicampur dengan aceton dan methanol dalam keadaan dingin

-

Ditreatmen dengan menggunakan 1A31 yang memiliki epitope pada bagian VP1

-

Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam

-

Dicuci dengan larutan PBS

-

Ditambahkan konjugat berupa anti-rabbit-antibodies (KLP) yang telah diencerkan 1:10 dengan PBS

-

Diinkubasi pada suhu 37 oC delama 1 jam

-

Dicuci kembali

-

Dilakukan pembacaan menggunakan fluorescence microscope

Uji netralisasi Virus dengan As1/MOG/05 dan CAM 9/80 menggunakan cell IBRS 2. Uji ini berfungsi untuk mengetahui adanya penyakit di suatu daerah, mempelajari penyebaran  penyakit, maupun untuk membantu / melengkapi diagnosis penyakit. Expresi Titer dinyatakan sebagai kebalikan dari pengenceran akhir serum di mana 50% dari well yang telah dilapisi. Intrepentasi hasil Uji netralisasi virus dinyatakan sebagai berikut:

-

negative jika nilainya kurang dari sama dengan 11.

-

positive jika nilainya lebih dari sama dengan 45.

-

dubius jika nilainya antara 16 sampai 32 maka uji harus diulang.

Titer dinyatakan sebagai angka kebalikan tertinggi dari pengenceran akhir yang masih dapat menunjukkan reaksi hasil uji postitif dengan nilai OD sebesar 50%. Namun nilainya tidak selalu tepat 50% akan tetapi jika nilainya sudah menunjukkan 45% maka dianggap hasil  positif . 3. Hasil

3.1 Ekspresi protein rekombinan pada sel serangga Rekombinasi baculovirus yang mengandung gen P1 dan 3C dibawah 2 promoter yang  berbeda dihasilkan melalui transfeksi sebuah rekombinasi DNA bacmid ke dalam sel serangga. rP13C yang diekspresikan di sel serangga dengan rekombinasi baculovirus dapat diidentifikasi menggunakan IFA dengan peningkatan serum kelinci yang melawan peptida FMDV VP1. Untuk mengetahui apakah reaktivitas diperoleh dari precursor P1 atau subunit VP1 membelah oleh 3C. Analisa Western blot memperlihatkan adanya serum yang melawan  peptide VP1.

Pita yang terlihat secara jelas berhubungan dengan adanya VP1, indikasi tersebut memperlihatkan bahwa reaksi fluorescence

sebagian berasal dari protein VP1 melalui

 pembelahan oleh 3C protease seperti yang diharapkan. Secara kontras, pita VP1 tidak secara nyata terlihat pada sel serangga yang terinfeksi recombinan baculovirus yang hanya mengandung

P1. Sebagai protein control, inaktif antigen FMDV pada kit ELISA juga

memprlihatkan pita VP1 yang sama. Untuk menguji profil time course expression,  protein rP13C dikoleksi setiap hari setelah sel serangga terinfeksi oleh rekombinan baculovirus dan kemudian dianalisis menggunakan Western blot, dengan peningkatan serum kelinci melawan FMDV VP1. Pita VP1 mulai diobservasi 4 hari pascainfeksi hingga hari terakhir pengujian (hari ke 7  pascainfeksi).

Gambar 1. (A) Hasil Immunofluorescence assay untuk ekspresi rP13C pada sel sf9. Sel yang diperiksa mengandung serum kelinci untuk melawan peptide FMDV. (B) Profil rP13C pada sel sf9. Protein rekombinan dikoleksi setiap hari setelah infeksi rekombinan baculovirus dan Western blot memperlihatkan anti-VP1 serum pda kelinci mendeteksi pita VP1 yang diperoleh dari precursor P1 melalui pembelahan 3C protease. Nomor 1-7 mengindikasi hari  pertama pascainfeksi (dpi) hingga 7 hari pascainfeksi. C adalah control positif.

3.2 Imunogenitas protein rekombianan pada babi Untuk mengetahui apakah protein rP13C dapat menimbulkan neutralizing antibodies  pada hewan yang peka, 2 ekor babi diimunisasi sebanyak 2 kali dengan protein rP13C dengan  jarak 2 minggu. Diperoleh data yang menunjukkan bahwa sera yang didapat dari seekor babi

(#51) memperlihatkan titer virus neutralization adalah 45 pada 13 hari pasca imunisasi kedua dan turun menjadi 22 pada hari ke 20 pasca imunisasi kedua. Sera dari babi lain (#71) menunjukkan bahwa titer virus neutralization adalah 16 pada hari ke 13 pasca imunisasi kedua kemudian pada hari ke 20 pascaimunisasi juga mengalami penurunan. LPB ELISA juga menujukkan pola yang sama yang berhubungan dengan titer dari semua sera babi. Hasil mengindikasikan bahwa protein rP13C mempertahankan neutralizing epitopes.

3.3 Produksi dan karakterisasi Mab  Neutralizing Mab diproduksi dari tikus yang diimunisasi dengan peptide FMDV VP1 yang berbasis pada As1/MOG/05. Antibodi yang dipilih yaitu 1A31 adalah sebuah isotype IgG1 dan mengandung kappa light chains. Hal ini ditunjukkan dengan reaksi positif untuk  strain Mongolian menggunakan IFA. Untuk mengetahui apakah Mab juga dapat berikatan dengan strain lain dari FMDV serotype Asia 1, IFA menggunakan Cambodian stain (CAM 9/80) dan menghasilkan hasil reaksi positif seperti strain Mongolian. Mab memiliki aktivitas FMDV neutralizing, yaitu supernatant dari kultur hibridoma menunjukkan titer virus neutralization adalah 128 untuk semua strain Mongolian dan Cambodian, hal ini mengindikasikan bahwa penggunaan Mab kemungkinan sebagai detektor antibodi untuk   berkompetisi dengan serum antibodi.

Gambar 2. Immunofluorescence assay dari 1A31 untuk FMDV serotype Asia 1. Sel IBRS-2 diinfeksi dengan strain Mongolian (A) dan strain Cambodian (B) dari FMDV Asia 1 dan diuji dengan Mab 1A31 yang spesifik untuk FMDV VP1.

3.4. Pembacaan hasil dari rP13C ELISA

rP13C ELISA dibaca menggunakan rP13C dan neutralizing Mab (1A31). Sebuah standarisasi awal dari semua komponen dilakukan untuk menentukan konsentrasi optimal rP13C terdiri dari antigen, peroksidase-conjugated Mab dan pengenceran serum. Untuk menentukan tingkat cut-off PI untuk rP13C ELISA, naif sera (n = 1760) yang  berasal dari babi, sapi dan kambing domestik diperiksa oleh rP13C ELISA (Tabel 2). Cut-off  tingkat PI ditentukan pada 50% untuk mengamankan kekhususan tinggi terlepas dari spesies, dengan menghitung nilai rata-rata ditambah tiga kali standar deviasi. Dengan tingkat cut-off, rP13C ELISA menunjukkan lebih dari 99% spesifisitas untuk  setiap spesies sera secara keseluruhan, kekhususan akhir menjadi 99,7%. Selain itu, ditunjukkan pada Gambar. 3, lebih dari setengah dari total sera yang diuji termasuk dalam PI 10. Evaluasi rP13C ELISA dibandingkan dengan LPB ELISA dan uji virus netralisasi. Ketiga alat uji dibandingkan untuk caprine sera yang dikumpulkan pada 40 hari setelah injeksi oleh As1/MOG/05 FMDV vaksinasi single dengan vaksin trivalen (Gambar 4). Titik akhir  titer rP13C ELISA dan LPB ELISA yang setara untuk satu caprine serum (# 1) dan sekitar 3 kali lipat lebih tinggi dibandingkan oleh Uji netralisasi virus atas dasar tingkat cut-off setiap assay ini. Untuk dua lainnya caprine sera (# 2 dan # 3), titik akhir titer oleh rP13C ELISA adalah 1,5 kali lipat dan 2 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan LPB ELISA dan uji netralisasi virus. The rP13C ELISA dan LPB ELISA menunjukkan endpoint titer yang setara 1,5 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan uji netralisasi virus untuk serum (# 4).

Untuk menguji kecocokan rP13C ELISA pada PMK di masing-masing spesies, sera dari dua ekor babi diimunisasi dengan rekombinan protein (rP13C) yang bekerja (Tabel 1). Tiga uji serologis menunjukkan pola titer yang sama, mencapai puncak pada 13 hari pasca imunisasi kedua dan menurun pada 20 dpi. Untuk satu babi serum (# 51) dikumpulkan pada 13 hari pasca imunisasi kedua, akhir titik titer oleh rP13C ELISA adalah sekitar 6 kali lipat dan 3 kali lipat lebih tinggi daripada yang di uji dengan uji netralisasi virus dan LPB ELISA. Untuk serum (# 51) yang dikumpulkan pada 20 hari pasca imunisasi kedua, titik akhir titer  oleh rP13C ELISA 8 kali lipat dan 4 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan uji virus netralisasi dan LPB ELISA. Titik akhir titer oleh rP13C ELISA setara dengan LPB ELISA dan lebih tinggi dibandingkan dengan uji netralisasi virus untuk sera babi (# 71) yang dikumpulkan pada 13 dan 20 hari pasca imunisasi kedua. Karena protein rP13C dan 1A31 Mab diproduksi pada dasar urutan Mongolia strain,  perlu dibuktikan apakah rP13C ELISA juga bisa mendeteksi antibodi terhadap jenis lain FMDV Asia 1. Sebagai tes awal untuk spektrum yang luas dari reaktivitas ini, sera kontrol  positif digunakan dalam LPB ELISA kit. Seperti ditunjukkan pada Tabel 3, rP13C ELISA memberikan titer endpoint 4 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan LPB ELISA untuk  Asia 1 serum yang positif kuat (C ++) yang berasal dari ternak terinfeksi strain Israel FMDV. Untuk Asia 1 moderate-serum positif (C +), rP13C ELISA juga mengakibatkan endpoint titer  2 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan LPB ELISA. Untuk menguji reaktif silang kontrol serum positif serotipe lain yang diterima. Selama rP13C ELISA bereaksi dengan serotipe O serum pada tingkat sebanding dengan LPB ELISA, yang menunjukkan kurang reaktivitas silang untuk serotipe A dan C sera. Selain itu, rP13C ELISA dievaluasi untuk tahap FAO XVIII referensi sera internasional yang terdiri dari tingkat cut-off kuat, dan lemah (Tabel 4). LPB ELISA mencetak cut-off serum sebagai positif, rP13C ELISA mencetak serum positif lemah sebagai positif dan cut-off serum sebagai negatif. 3.5. Validasi rP13C ELISA Untuk uji musiman rP13C ELISA bisa menggantikan LPB ELISA untuk surveilans serologi di lapangan, 68 sapi sera dikumpulkan pasca vaksinasi selama 2000 wabah PMK di Korea. Sementara rP13C ELISA mencetak empat sera sebagai negatif, LPB ELISA hanya mencetak dua sera sebagai negatif. Dari empat negative sera oleh rP13C ELISA, hanya satu serum yang juga negative oleh LPB ELISA. Tiga sera lainnya, bagaimanapun, dibagikan sekitar tingkat cut-off, PI 50, menunjukkan bahwa secara keseluruhan, rP13C ELISA setara

dengan LPB ELISA dalam mendeteksi antibodi terhadap FMDV Asia 1 yang divaksinasi sera sapi.

4. Pembahasan

Dalam studi percobaan ini digunakan sel serangga untuk membuat protein rekombinan dari virus Penyakit Mulut dan Kuku (FMDV) untuk mendeteksi antibodi FMDV serotype Asia 1. Sebelumnya terdapat

metode menggunakan VP-1 peptida (virus capsid Protein)

 berbasis ELISA dalam mengukur respon serologis untuk FMDV serotipe protein sturktural O. Namun dalam percobaan tersebut vaksin yang digunakan pada hewan coba gagal bereaksi dengan VP-1 peptida. Oleh karena itu, perlu untuk mengatasi keterbatasan antigen yang dibutuhkan yakni memasukkan sel epitop B kemudian membangun partikel mirip virus P1 dan gen 3C yang sesuai dengan pembentukan alami dari FMDV sendiri. Beberapa penelitian melaporkan bahwa prekursor P1 dan gen protease 3C atau 3CD dalam famili virus Picornaviridae dapat membuat partikel mirip virus dengan menggunakan bakteri E. coli, Baculovirus, dan vaksin vektor virus. Berdasarkan hasil tersebut, upaya untuk menghasilkan  partikel virus FMD yang dibuat menggunakan vektor baculovirus yang berisi baik P1 dan gen 3C dalam sel serangga untuk menggantikan virus FMD yang aktif untuk mendeteksi antibodi terhadap serotipe Asia 1. Ekspresi

dan

pembelahan

P1 prekursor

dengan 3C protease

dikonfirmasi

menggunakan analisis Western blot , dengan identifikasi dari VP1 yang tidak muncul ketika P1 saja yang diekspresikan. Walaupun tidak dikonfirmasi secara langsung menggunakan mikroskop electron namun hasil dari ekspresi dan pembelahan P1 dan 3C protease dapat membentuk partikel sebagai serotipe O yang diinginkan untuk percobaan ini. Dihasilkan  protein rP13C yang memiliki sturktur yang sama dengan virus FMD yang kemudian bersaing dengan antibodi FMD yang berupa vaksin atau infeksi virus FMD sendiri. rP13C dihasilkan dalam sel serangga sehingga bisa menimbulkan antibodi pada babi, meskipun pada praktiknya titer netralisasi virus rP13C ini rendah sehingga perlu pemurnian lebih lanjut untuk menilai imunogenitas dari vaksin protein rekombinan ini. Jenis vaksin virus FMD yang dilemahkan yakni Mab (1A31) digunakan sebagai detektor diagnostik dalam  penelitian ini dihasilkan oleh imunisasi yang VP1 peptida sesuai dengan loop GH yang dikenal imunologis penting karena berisi situs reseptor sel. Sebuah penelitian sebelumnya mengenali situs antigenik kelanjutan Mab I (residu 144-159) yang digunakan untuk fase  padat ELISA untuk mendeteksi antibodi serotipe O dari virus FMD. Penggunaan Mab di

ELISA ini juga menjamin kontrol kualitas yang konsisten dibandingkan dengan serum  poliklonal yang

meminimalkan jumlah variasi. Karena sebagian besar variasi FMDV

menyebabkan perubahan kodon dan

fenotipe virus baru. Maka perlu untuk memastikan

 bahwa 1A31 Mab juga mengikat strain virus FMD Asia 1. Penelitian yang lebih luas perlu dilakukan untuk virus FMD jenis lainnya di masa depan untuk memastikan bahwa 1A31 Mab dapat mengikat spektrum yang luas dari strain Asia 1. sejak rP13C ELISA merupakan sandwich ELISA dengan 70-17 Mab yang dilapisi untuk menangkap protein rP13C, itu tidak diperlukan untuk memurnikan rP13C untuk  menghapus protein lain yang berasal dari sel-sel serangga. Tetapi sejak rP13C ELISA dilakukan dalam pemblokiran Format ELISA, dapat digunakan untuk menguji serum dengan cara yang sama terlepas dari spesies hewan.  Namun, diketahui bahwa epitop pada permukaan antigen dikenali langsung oleh Mab competitor atau diblokir oleh sterik hindrance atau perubahan konformasi yang diinduksi oleh antibodi yang mengikat epitop lain. uji netralisasi virus untuk sera dikumpulkan dari kambing yang ditantang dengan FMDV Asia 1 post-vaksinasi mungkin telah disebabkan oleh strain (As 1 / MOG/05) yang homolog dengannya dari rP13C dan Mab berasal. The 1A31 Mab digunakan dalam rP13C ELISA bisa menetralisir strain Kamboja FMDV Asia 1 ke tingkat yang sama seperti strain Senin-golian. Hasil ini menunjukkan rP13C ELISA memiliki potensi untuk menggantikan LPB ELISA dan uji netralisasi virus untuk FMDV Asia 1 surveilans serologi di negara-negara Asia Tenggara yang endemis PMK. rP13C ELISA menghasilkan titik akhir titer lebih tinggi dibandingkan dengan uji netralisasi virus dan LPB ELISA untuk sera yang berasal dari babi yang diimunisasi dengan  protein rP13C. Hal ini karena homolog imunogen dan rP13C ELISA menunjukkan pola titer  sama dengan virus uji netralisasi dan LPB ELISA, untuk semua babi sera dimana nilai-nilai titer berbatasan tingkat cut-off masing-masing tes. Karena wilayah Timur Tengah berada pada risiko tinggi untuk PMK melalui  perdagangan ruminansia hidup dari Asia dan Afrika, dan beberapa negara dianggap memiliki endemik PMK, itu perlu untuk menguji serum yang berasal dari strain FMDV memiliki origi terkontaminasi di daerah ini. Oleh karena itu, kontrol tambahan serum positif, tertutup dalam LPB ELISA kit, yang berasal dari sapi yang terinfeksi dengan strain Israel FMDV Asia 1, yang digunakan untuk menilai rP13C ELISA dalam kaitannya dengan LPB ELISA. Meskipun kontrol serum positive berasal dari strain FMDV homolog terhadap antigen tertutup di LPB ELISA kit, titik akhir titer oleh rP13C ELISA lebih tinggi dibandingkan dengan LPB ELISA.

rP13C ELISA mencetak serum positif lemah dengan benar. Lemahnya serum positif  telah disarankan untuk digunakan dalam mewakili standar minimum untuk mendeteksi antibodi dalam tes yang diterapkan untuk serosurveillance berbasis kawanan. Hasil bahwa rP13C ELISA mencetak cut-off serum sebagai negatif sedangkan LPB ELISA mencetak gol itu sebagai batas positif tidak mendevaluasi utilitas dari rP13C ELISA. Tes serologis untuk mendeteksi antibodi terhadap FMDV protein struktural juga dapat  berguna untuk menilai status vaksinasi, serta status infeksi FMDV. Kemudian dilakukan rP13C ELISA dibandingkan dengan LPB ELISA untuk bovine serum divaksinasi dengan vaksin trivalen (O, A, dan Asia 1) di lapangan. Hasilnya, kedua tes yang setara dalam mendeteksi antibodi untuk FMDV protein struktural di divaksinasi sera sapi. Dengan vaksin trivalen, antibodi akan diajukan terhadap serotipe O, A, dan Asia 1. Hal ini mungkin menjelaskan mengapa LPB ELISA mencetak lebih sera sebagai positif  dibandingkan dengan rP13C ELISA, karena ada sedikit lebih tinggi reaktivitas silang untuk  serotipe A oleh LPB ELISA. rP13C ELISA dapat digunakan sebagai sebuah metode yang sederhana dan dapat diandalkan untuk menggantikan LPB ELISA atau tes netralisasi virus. Kebanyakan dari semua, protein antigen rekombinan, rP13C, bisa EAS-ily diproduksi di laboratorium umum tanpa batasan, yang merupakan keuntungan dari rP13C ELISA atas yang lain tes serologi saat ini

yang

memerlukan

FMDV

aktif

sebagai

antigen

diagnostik.

Sebagai kesimpulan, ELISA berbasis protein rekombinan dapat digunakan sebagai alternatif  untuk LPB ELISA atau tes netralisasi virus untuk mendeteksi antibodi terhadap serotipe FMDV Asia 1. Penyebaran virus yang baru PMK di seluruh benua Asia menunjukkan kebutuhan terus untuk surveilans aktif dan pengembangan bulu-ther program pengendalian daerah

BAB III PENUTUP

3.1 Kesimpulan Uji serologis yang telah menjadi standar untuk uji PMK atau FMD masih memiliki  beberapa kelemahan, sehingga untuk menunjang metode-metode tersebut, dikembangkan  protein rekombinan yang diperoleh dari FMDV P1 presecutor dan gen 3C protease yang digunakan sebagai alternatif sebagai antigen virus yang dinonaktifkan untuk LPB ELISA atau virus neutralization test untuk mendeteksi antibodi dari FMDV serotype Asia 1. Penyebaran dari FMD virus baru-baru ini di Asia menunjukkan bahwa dibutuhkan  pengawasan berkelanjutan dan perkembangan lebih lanjut dari regional control programs. Adanya rP13C ELISA dapat bermanfaat untuk tujuan ini.

DAFTAR PUSTAKA Joon Ko, Young, Hye-Young Jeoung, Hyang-Sim Lee, Byung-Sik Chang, Seung-Min Hong, Eun-Jeong Heo, Kwang-Nyeong Lee, Hoo-Don Joo, Su-Mi Kim, Jong-Hyeon Park, Chang-Hee Kweon. 2009. A Recombinant Protein-Based ELISA For Detecting   Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus Serotype Asia 1. Journal of Virological Methods 159 (2009) 112–118.