Elemente de Biochimie CARTE

FLORIN.DANIRIMIE

Elementede

BIOCHIMIE .I.

CLUI-NAPOCA r9 9 B

O 1998.Florin-Dan Irimie Referenfi.

Prof.llniv. Or. i Cawit tUe-alqiu-l Prof. Univ. Dr. Carmen Socaciu Pregdtiretipograficd . , Cluj Tehnoredactare. Kert6szSdndor Editat de editura uErddlyi Hfrad6o, Cluj ISBN973 9837492 Tipdrit la S.C.(Atid)) Prodimpex, Cluj

Cuprins Cuvint inainte

I

lntroducere ll

CAPITOLUL r. Glucide f .f . Defini1ie. Clasificare

17

1.2. Chiralitatea ozelor lB 1 . 2 . ) .S e r i i l eD ; i L 1 B 1.2.2.Ciclizareamonoglucidelor 19 1.3. Deriva{i ai rnonoglucidelor gi oligoglucidelor 1.3.1.Esterifosforici 28 1.3.2.Antinoglucide 29 1.3.3.Deoxigluctde :10 1.3.4.Alcooli glucidici :ll 1.3.5.,\ciziglttcidici 32 1.3.6.Glicozide 32

28

1.4. Poliglucide 38 1.4.1. Poliglu.ckleclerezerud. 39 1.4.2.PoLiglucide de struL'turd 4l 1 . 4 . : JG. l i c o c o r t j u g a t i ' 1 5

CAPITOLUL2.Lipide 2.1. Clasificarea lipidelor

59

2.2.Lipide simple 60 2.2.1. Acilgliceroli 60 2.2.2.Steriele 6l 2.2.3.Cericle 66 2.2.4.Utolide 67 2.3. Lipide complexe 67 2.3.1.Fosfatide 67 2.3.2.Sfingolipicle 72 2.4. Nte lipide 76 2.4.1.Glicozilglicerolt 76 2.4.2.Terpene;i terpettoicle 76 2.4.3.Icosanoizi 79 2.5. Membrane biologice Bz 2.5.L Caracteristic!generole 82 2.5.2.Straturi dubht lipidk:e B4 2.5.3.Asinrctriamentbranelorplasnmtice B7 2.5.4.Distibufia asirnetricaa lipidelor 89 2.5.5.Tranzifii clefazd ale straturilor dubLttlipidice ;i nzobilitateaacestora 90

Elementede biochimie,l.

CAPITOLUL3. Proteine 3.1. Clasificarea proteinelor

Sz

3.2. Conlinutul de proteind al materialelor biologice gZ 3.3. Purificarea proteinelor 3.3.1.Dezintegrareacehtlara 99 3,3.2.Separareasolid-lichid 102 3.3.3.Precipitarea diferenSiald 103 3.3.4.Metode cromatograficepe coloand 105 3.3.5.Electroforeza 107

95

3.4. Compozi{ia proteinelor 109 3.4.L Con;inutulde qminoacizidin proteine 109 3.4.2.Identificareaaminoacizilor N - terminali 1I I 3.4.3. I dentificareaaminoacizilor C-terminali I 12 3.5. Structura proteinelor I f3 3.5.1.Structuraprimard a proteinelor 113 3.5.2.Structurasecund.ard 122 g domenii 134 3.5.3.Stnrcturi suprasecundare 3.5.4.Structura terliara a proteinelor 139 3.5.5.Structuracuaternard 143 3.5.6.Considerapiigeneralepriuind stabilitateastructwriiproteittelor 143 3.6. Sinteza chimici

a catenelor polipeptidice (Merrifield 1963)

147

3.7. Proteine fibrilare 149 3.7.1.a-Keratirn 149 3.7.2.Fibrotna 150 3.7.3.Colagenul l5l 3.8. Proteine globulare 154 3.8.1.Artticorpi 154 3.8.2.Mioglobina ;i hemoglobina 166 3.9. Proteine membranare l83 3.9.1.N[odalitafi de interacfiunee proteinelorctt straturile dublu llltidce 184 3.9.2.Ilidrofobicitatea catenelorpolipeptidice 189

CAPITOLUL4. Enzime 4.1. Specificitateaqi selectivitateaenzimaticd 193 4.2. Clasificareaenzimelor f 95 4.2.1.Codificarea enzimelor;i nomenclatura 195 4.3. Cuantfficareaactivitdlii enzimatice l98 4.4. Mecanismul de acfiune al enzimelor lg9 4.4.1. Stabilizareastd.riirJetranzilie 200 4.4.2.Modalitdli concretede reducerea energieideactiuarein.reacliileenzimattce 206 4.4.3.Interactiunea substrat- enzimd 212 4.4.4.Enzimeholoproteice218 4.4.4.Cofactorienzimaticisi ttitamine 226

Cuprins.

4.5. Enzimemultimerice

278

4.6.Abzime 280 4.7. No{iuni de cineticd enzimatici 282 parametri 282 4.7.1.Modelulmichaelian, 4.7.2.FactoriicareinfluenSeaza activitateaenzimaticd 291 qctiuittiliienzimatice 307 4.7.3.Reglarea

CAPITOLUL5. Acizi nucleici 5.1.Introducere 319 5.2. Constituenfii acizilor nucleici

320

5.3. Structura acizilor nucleici 324 (ADN) 324 5.3.1. Aciziideoxiribonucleici (ARN) 346 5.3.2.Structurasecundard;iterSiard a acizilorribonucleici 5.4. Hidroliza acizilor nucleici 353 5.4.1.Llidrolizaacida;i bazicda acizilornucleici 353 5.4.2.Ilidrolizaenzimaticd a acizilornucleici 354 5.5. Determinarea structurii primare a acizilor nucleici 359 5.6. Sintezape suport solid a oligonucleotidelor 364 5.6.3.Amplificarea(multiplicareaenzimatica)afragmentelorADN- metodaPCR (Polimerase ChainReactionsaupolicondensarea controlatdenzimatic) 367 Bibliografieselectivd 370

inuinte Cuvfrni Biochimia seafld Ia confluenla a doud;tiinye extrem de dinamice: biologia ;i chimia. Ea estechematd sd elucidezemecanismelemoleculare ale complexelorproceseuitale ;i deopotriud.sa ofere modele de strategie sintetica ;i alternatiue mai ieftine ;i mai prietenoasecu mediul pentru procesarea, materiilor prtme, subproduselor;i chiar de;eurilor, tn scopul modificdrii naturii lor substanliale. Direclionarea eforturilor speciali;tilor cdtre acesteobiectiue,confera biochimiei un ritm de dezuoltarefoarte alert, concretizat tn explozia numdrului de articole de specialitate,al titlurilor de reuistespecifice,;i al coeficientuluide impact al Acestora,mdsurd a gradului audienfa. Sarcina elabordrii unei astfel de cd.rpinu este una dintre cele mai ugoare,pentru cd trebuie asigurat un raport rezonabil tntre componenta biologica;i ceachimicd.a obiectului de studiu. Con;tient de cauzalitatea interacliunilor moleculare tn determinarea complexelorproceseuitale, materialul accentueazdlatura structurald.tn scopulreliffirii acliunii fiziologice,prin intermediulfuncyiunilor proprii compu;ilor. in primul uolum, cel defapd, se prezintd,structura;i proprietdtile claselorfitndamentale de biomolecule:glucidele,lipidele, proteinelesi acizii nucleici. Se insistd asupra aspectelorgenerale,definitorii pentru fiecare clasd tn defauoareaexemplificarilor detaliate. Alaturi de capitolul proteine, materialul dezuoltdpe o tntindere tnare enzimele,principalii biocatalizatori. Motiuul deriud din larga deschidere cdtre caracterul practic, aplicatiu, careface din enzime produse deia comerciale, de mare tonaj, utilizate pe scard largd in industria detergenyilor,farmaceuticd, in industria alimentard, tn scopuri analitice etc. Deqi intitulat ,,Elenrcntede Biochimie", tnlelegereamaterialului presupune din partea cititorului o familiarizare prealabila cu no{iunile elementarede chimie, tn specialorganicd. Termenul de ,,elemente"se referd Ia o introducere sistematicd tntr-un domeniu de granipd ;i nicidecum Ia simplitatea no;iunilor expuse. Materialul esteutil specialistilordin chimte, chimisti gi ingineri chia structumt;ti. Ei uor gdsi tn funcpiile biologiceprezentate,o consecinpd, rii gi reactiuitdfii moleculare.Frumusepeaconstruc;ieisitusului catalitic, perfecliuneaa;ezdrii fiecdrui component, ordnduitd de'a lungul multor

l0

Elementede biochimie.l.

generalii, oglinditd tn actiuitatea cataliticd, specificitatea ;i selectiuitatea, constituie deopotriud modele dar ;i mijloace utilizabile. Cartea se adreseazdcel pu{in tn egald mdsurd biolngilor, medicilor, agronomilor, farmac$tilor, etc. Insistenla aborddrii aspectelor legate de structura, proprietdlile biomoleculelor Si detalierea mecanismelordupd care decurg interac[iile moleculare, creeazd.bam obiectiud.a tnlelegerii posibilitafii, oportunitdtit ;i modalitd.lii interuenliei factorului uman pentru ualorificareatn interespropriu a potenlialului creat de naturd. Autorul este recunoscdtor referenlilor ;tiinlirtci, pentru rdgazul de a zaboui asupra manuscrisului, pentru sugestiilegi obseruagiilefdcute. Un cuudnt de mulpumire se cuuine profesorului Sorin Mager, decanul Facultdlii de Chimie gi Inginerie Chimicd a Uniuersitdfii ,,Babe;-Bolyai", care a sustinut introducerea liniei biochimice in facultate. Nu pot fi omi;i colegii Si colaboratorii, din disculiile cu care, tn perioada redactd.rii materialului, au rezultat elementeutile autorului. In fine, un rol decisiv tn apari;ia acesteilucrdri, il au studenlii Facultd;ii de Chimie ;i Inginerie Chimica;i cei de Ia Facultatea de Biologie, specializareaBiologieChimie, care prin feed-ba*-ul realizat, au cizelat forma concretd de tr an smitere a info r mali ei. Octombrie 1998 Florin-Dan IRIMIE

P.S.in momentelein careprezentacartesegdseatn procesareIa editurd, lumeabiochimi;tilor clujeni afost miscatd.de trecereatn nefiin;a a profesoruluiuniuersitardoctorGaurilNeamfu,unul dintre cei mai pro' lifici truditori din biochimia romdneascd,referentat cdrSiide fa;d. Ii aducemprofundul nostruomagiu.

Introducere Biochimia este chimia viefii. Ca entitdfi, moleculele sunt lipsite de viafa. Materia vie confine insd.molecule, de la cele mai simple pdnd cele mai complexe.Viafa este o nofiune extrem de dificil de definit. Ea presupune cooperarea intre diferite sisteme biologice prin transferul de substanfi 9i de energiein scopul indeplinirii funcliilor vitale. Sistemele vii (organismele)posedd fatd de sistemelechimice nevii o serie de caracteristici particulare: complexitatea, individualitatea, funcfiile biologice, transferui de energie gi de substanfd,reproducerea,evolufia, migcareasi moartea. Complexitatea organismelor vii constd at6,t in numdrul mare de substanfe care le compun, cdt gi in nivelurile ierarhice (subsistemelor biologice) care pot fi identificate in interiorul organismelor.La cele mai evoluateorganisme,mamiferele, moleculele simple gi macromoleculele sunt confinute in celule, care Ia rdndul lor conlin formafiuni infraceluIare specializatefuncfional, organitele celulare. Un grup de celule cu aceeagi funcfie constituie un tesut. ln Frg. 1.1 se prezintd, dupd Lehninger ierarhizareastructurilor, de la cele mai simple molecule Ei pdnd la celuld, unitatea vitalA esenfiald.Cu toatd aceastecomplexitate, organizareasistemelor vii este caracterizatdprin unitate. Componenfii celulari alcdtuiesco serie continud din punctul de vedere al masei moIeculare. Un numdr relativ redus de substanfe au o masd moleculard mici, fiind formate dintr-un numdr mic de atomi. Menfiondm cdteva monozaharide, 20 de aminoacizi, opt nucleotide, cdfiva alcooli, cdfiva acizi gragi. Majoritatea substanfelorchimice sunt biomacromolecule oblinute prin transformareagi policondensareamoleculelor primordiale. Transformdrile chimice suferite de substanle includ intreaga gama a reacfiilor studiate de chimia organicd.Tot legat de complexitatea sistemelor vii, se cuvine a fi amintit caracterul specific gi nespecific al compugilor chimici. Compugii primordiali existd in toate organismele, la acest nivel deosebirile flind legate de prezenfa sau absenla unui termen comparat. Constituenlii biomacromoleculari, sunt insd specifici de la specie la specie, de la organism la organism. Ei pot exista intr-o varietate practic infinitd. Amprenta individualului apare in particularitatea structurilor macromoleculare confinute. De aceea incdrcdtura informationald continutd intr-o moleculi depinde de specificitatea

t2

Elemented,ebiochimie .1,

acesteia.Dintre tipurile de biomacromolecule existente,gradul cel mai mare de specificitate il au acizii nucleici, urma{i de proteine gi de poligiucide. Funcfionalitatea (biochimicd) a acestor structuri care asigurd posibilitatea transformdrilor specifice este asiguratd de structurile mic entropice, realizate prin intermediul interac{iunilor Va:r der Waals, leg[turi de hidrogen, ionice, covalente.Oricdt ar fi de complexd, structura materiei vii conline adevdrul fundamental cd naturir chimici a substanfelorcare o compun poate fi descrisdgi infeleasi. Chimia celulelor vii nu este altceva decdt chimia: chimia organicd,in primul rdnd, chimia supramoleculard,chimia anorganicd, chimia fizicd, chimia coloidali, chimia... Constituenfii celulari se supun principiilor fizice gi chimice care guverneazd natura. Proceselebiologice, indiferent de complexitatea lor, finalmente pot fi descrisein termeni chimici. Aceastapentru cd logica proceselorsi fenomenelorbiologiceestechimia.

Organit€ c6lulars

Ansambluri suPramole&lare ( M : 1 C-F1 d )

Maqomolgculs - 1@ (M:1cP

Monomeri (M:10s350)

Int6rmediari (M:50-250)

Pr€cursoridin m€dlu(M:18-44)

Hto N1

Fig. I. 1. Structura iprarhicd. a substanlelor biaadive

Introducere,

13

I. Individualitatea caracterizeazetoate sistemele vii prin aceea cd existafie o membrand simpld, fie un perete atagatunei membrane, care asigurd separareadintre sisteme asigurdndu-le o autonomie vitald limitatd. 2. Toate structuriiebiologiceale unui organismigi au rafiunea de a fi intr-un rol functional exercitat.De la pirgi ale unui organism, precum frunza sau lesutul adipos gi pdnd la compugii chimici intdlnifi in metabolism, pentru fiecare din acesteelementese poate identifica un scop al existenfeiacestora.caracteristica funclionald este mai degrabdun atribut al structurilor biologice decdt a celor frzice sau chimice, aceasta pentru cd intrebarea ,,ce rol are ?" nu se justificd in cazul sistemelor fizice sau chimice nevii.

r!!

!.

'r' .

,rl1\

Energie solard

,'

tI

Apd9i dioxid de carbon ri

Glucozd gi oxigen (6narglo chimict)

I

t TIE ,

vtvlivv Eneryie biologicd(ATP) Fig. L 2. Schimbul de energieSi substanld tntre sktemele uii

_i

L4

Elementede biochimie .1,

3. Schimbul permanent de energie gi substanfd deosebegtede asemenea sistemelevii de cele neinsuflelite. Sursafinald de energiepentru tot ce esteviu o constituie radiafia solari. Energiasolard esteconvertitd in plante in energie chimicd prin formarea in decursul fotosintezei a glucidelor.Acestea,prin lanful trofic.trec la ierbivore gi apoi la carnivore, la care energia chimicd se stocheazdgi se transportd sub forma unor legdturi macroergice existente in compugi precum ATP sau NADH. Sintezade substanpdorganicd,necesardbunei desfdgur5.ria.activit5lilor organismelor se face pe baza unei surse de carbon. Organismele fotosintetizatoare folosesc dioxidul de carbon atmosferic, pe care il convertescin glucide gi alte substanfe organice, care sunt preluate de animale gi folosite atdt pentru biosinteza substanfelor proprii cdt gi in scopuri energetice.Produsele de degradarea substanfelor organice in proceselede respiralie sunt dioxidul de carbon gi apa, care sunt preluate din nou de sistemelefotosintetizatoarela inchiderea ciclului carbonului. In interiorul organismului energia estefolositi qi pentru a menfine in stare funcfionald o structurd inalt organizat6,,homeostazicd,mic entropicd, aflati in dezechilibru permanent cu mediul. Numai dupd moarte se poate instaura echilibrul cu mediul. Transformdrile energetice gi de substanfi realizatein interiorul fiecdrui organism sttnt orientate in scopul bunei funcfioniri ale acestuiagi sunt in esenfdreaclii chimice. Sistematizarea acestora in reacfii endergonice de sintezd respectiv exergonicegi de degradaredefinegtemetabolismul de ansamblu cu cele doud laturi ale sale catabolism 9i anabolism. 4. Poate cea mai remarcabili insuqire a materiei vii o constituie capacitatea de autoreproducere. Generalie dupd generalie, organismele produc copii virtual identice cu originalul. Mecanismele sunt diferite, mergdnd de la simpla diviziune la bacterii gi termindnd cu reproducerea sexuatdla plante qi animale, dar in fiecare cazin parte sunt caracte'Iotugi rizate printr-o mare f,delitate. aceastdfidelitate nu este perfectd, ea permitand in decursul generafiilor ca prin selecfiea caracteristicilor celor mai adaptate mediului sd se producd evolufia speciilor. Originea mecanismelor reproductive rezidd.in natura chimicd. a materialului genetic format din dublele catene de acizi deoxiribonucleici.Prin procese de policondensare, care au loc pe matrile preexistente se asigurd fidelitatea copiilor de material genetic, defecteleinregistrate ducdnd la aparilia unor caracteristicicare in procesul exprimdrii in mediu pot remdne sau pot fi eliminate.

Introducere.

15

5. Migcarea organismelor in mediul biologic igi are cauzain deplasareaspre sursa de hrani gi de energie,indepdrtareade surselede pericol gi devine cu atdt mai complex motivatd si realizat5,cu cdt pozifia organismului pe scara evolutivd este mai inalte. Natura miqcdrii este de asemeneachimicd, ea realizAndu-seprin intermediul unor reacfii chimice care implicd structuri moleculare specializate. 6. Moartea este o insuqire a viului, un punct in spirala infinitd a evoluFei. Fiecare organism se nagte dintr-o zestre geneticd acumulatd in mii de generafii, trdiegte,contribuind cu experienfa sa la fondul de informafie mogtenit, dupd care prin moarte, se reinte greazd, mediului, ldsind loc noilor indivizi sd.-giexercite rolul rezervat in cadrul diviziunii biologice a activitefii in habitatul ocupar. sistematizdnd Ei abstractizdnd la maxim se poate afirma cd.un sistem esteviu dacd: . poate si se menlind in viafd, prin nutrilie, asimilafie,prin reacti_ ile energeticedin respirafie gi fermentafie, I poate si propageviafa prin reproducere, o poate si-.si coordoneze individual 9i optim activitifile prin sincronizareagi reglareareac{iilor chimice de ansamblu.

l. Glucide CAPIT0IUI l. 1. Definitie. Clasificare Aceastdclasa de compugi este cunoscutd sub mai rnulte denumiri. Fiecaredintre acesteaa incercat sd ilustreze o caracteristicdgeneral definitorie. Numele de glucide sau zaharide derivd de la gustul dulce care caracterizeazdmajoritatea termenilor {glykis- dulce in limba greacd), iar cel de hidrafi de carbon (carbohidra{i). derivd de la compozifia generald(C)-(H2O)..In realitate,nici una dintre acestedenumiri nu reflectdo insugiregenerald,pentru cd se cunosc reprezentanlicare nu au gust dulce, dupd cum se cunosc hidrali de carbon care nu pot fi definili dupd formula (C)*(H2O).precum deoxiglucidele,metil glucidele ori aminoglucidele.ln pofida acestorimperfecfiuni, cele trei denumiri, sinonime, se utilizeazd curent. Foarte frecvent se foloseqte gi denumirea deoze. Definilia bazatd, pe funclionalitatea chimicb alirmd cd aceste substanle sunt compugi de tip polihidroximonocarbonilic, ori produqi de (poli)condensarea mai multor astfelde structuri. Avdnd in vederedoar pondereamasicdin lumea vie, glucidele ocupd primul loc reprezentd.ndastfel o clasd mare 9i importantd de biomoleculeformate in principal prin fotosintezd.Glucidele,atdt cele monomerice cdt gi poliglucidele, indeplin escfunclii esenfialein organismele vii. Astfel, ele sunt substantede stocarea energiei.Prin oxidare energia se elibereazdintr-o formd utiiizabila de organism. ln al doilea rdnd, multe poliglucide sunt constituenpii majoritari ai perelilor celulari ai bacteriilor gi ai plantelor. ln fine, glucidele intrd in componrenlaunor alte tipuri de substanyebioactiueprecum unele coenzimesau acizii nucleici. Clasiflcareaglucidelor are in vederemai multe criterii: 1. dupd natura grupdrii carbonilice distingem: aldoze atunci cdnd existdo grupare aldehidica cetoze atunci cdnd in structurd gasim o grupare cetonica

H

R-C-o pl

I

R-C:O

Elementede biochimie .1.

2. dupd gradul de policondensaredistingem: monoglucide (monomeri) oligoglucide(di_tri_... deca_) poliglucide (cu gradul de policondensaresuperiorvalorii l0) 3. Numdrul atomilor de carbon din structura monoglucielor le subdivide in: tri-, tetr-, pent-, hex-, hept- oze, eventual cu prefixul aldo sau ceto (dupi caz).De exemplu aldohexoze,cetopentozeetc. 4. ln fine, gradul de omogenitate imparte glicanii (o denumire gene, ricd a tuturor poliglucidelor) in homo- gi heteroglicani, dupd cum unitdfile monomere sunt identice sau nu.

1.2.Chiralitatea ozelor cu excepfia dihidroxi-acetonei, toate ozele posedd unul sau mai mul{i atomi de carbon chirali, ceea ce conduce la aparilia izomerilor optici. r.2.1.SeriileD gi L H

to n-rf-o" no*n H-*-oH

n-{pon cHpH Dglucoza

H I

c-o

t'o-f n H-tFoH HotH HO-?_H cH2oH L-glucoza

Fig. 1.1.Relafia dintre D- SiL-glucozd

cea mai sirnpli aldozd.,aldehida glicerici, un compus monochiral are cei doi enantiomeri desemnafi prin D gi L. Atribuirea denumirii celor doud substanfea fost f[cuti a]eatoriu,deoarecela data aceeanu era cunoscutd configurafia absolut[ a substanfei. semnificagia iniliald a celor dou6litere a fost: D - dextrogir (rotagiaplanului luminii polarizate la dreapta) $i L - levogir, (rota{ia planului luminii polarizate la stdnga). Pebaza acesteiconvenlii stabilite de Emil Fischer, s-au construit seriile D respectivL ale monozeror, dup6 cum atomul de carbon chiral cel mai indepdrtat de gruparea carbonil, are configurafia identicd cu a celui din

Glucide . Chiralitatea ozelor

r9

D-glicerinaldehidasau cu a celui din L,glicerinaldehidi. De aici rezultd cd monozele din seria D sunt in relatie de enantiomerie cu cele din seria L care au aceeagidenumire. De refinut cd semnificagiainiliali a notaliei D respectivL, referitoare la sensul rotafiei planului luminii polarizate nu s-a pdstrat. Numdrul de izomeri optici ai unei molecule chirale este dat de 2n, unde n este numirul de centre chirale din moleculd. Astfel aldohexozele,de exemplu, posedd patru atomi chiraii, prin urmare vor avea 2a = 16 izomeri, adicd opt perechi de antipozi optici, fiecare pereche fiind formatd dintr-o structurA D- gi una L-(Fig. 1.4.1n cazul cetozelor,numdrul de atomi chirali se reduce cu unu, la acelagi numd,rde atomi de carbon. De aceeacetohexozelevor existasub forma unei familii cu 23 '= B elemente, respectiv cu patru perechi. Diastereomerii sunt tot izomeri care apar la substanle cu mai multe centre chirale. Diasteromerii diferd intre ei prin conflgurafia unuia sau mai multor centre chirale (dar nu a tuturor). Prin urmare, relafia de diastereomerie exclude antipozii optici. Un caz particular de diastereomerie il reprezintd epimeria. Epimerii sunt izomeri care diferi intre ei prin configurafiaunui centm chiral. Glucozagi manoza sunt in relafie de epimerie. La fel si glucoza cu galactoza,dar galactozagi manoza nu sunt epimeri. 1.2.2.Ciclwareamonoglucidelor Gruparea carbonil este susceptibild atacului nucleofil din partea unui reactant corespunzdtor, cum ar fi o grupare hidroxil. Dupi cum compusul carbonilic este aldehida sau cetond, se obline in primd fazd. fie un semiacetalfie un semicetal. ln conditiile unui excesde alcool se obline acetalsau cetal (Fig. J.3)

R1

/

,^'.

n1t ,ons c \ons nzl

Eo T4

R2/ U compuscarbonilic

semi(a)cetal

(a)cetal

Fig. I. 2. aldoznle gi cetozeledin seria D, cu pdnd.la gaseatomi de carbon

20

Elementede biochimie .I, cHo

Aldozele D dinseria cupdnAla qaseatomdecarbon

I

H--{-OH

I

cFhoH cHo

Dglicorinald€hida

"

I

H(4-H

{noo"

H--1-oH

I

H-{FOH

I

CHaOH

"i::" H*1-oH Ft-1-oH

*1-"n CH2OH

Dlcors

,,*i:." *-r-,

clio

no-f" '.-J-o" CH2OH

*,fl'"o"

":i:::" I H-1-oH

"*1-o" H---+--OH

"-l-on I o",l*on

*-.1-, I *1-o"

H-t-oH H-1-oH CH2OH

"o-fn I

H-1-oH

FToH

"-J-o, I

"o-l-n

H-fox

*-1-n H-1-oH H-t-oH CHzOH Dllucoza

Ho--1-H

*fo"

'*1-n

H-t-oH

I

H-t-oH *1-o"

Ho-l--H FlfoH

CH2OH

tt

HtoH

Ho-fn

xo-t-x *-1-" '{-1*oH o-1-o" cl-boH

CH2OH

D.mano.s

cHo

I

Ho-fn H-1-oH

cHo

Ho+r-H

*-t-,

*-1-r H-t-oH

C&OH

Dguloza

D{alactoae

CHzOH }taloza

CHzOH

I I

Cetozele

.cH2oH Dhidroxiaclton8

dinseriaD

cu pinl la Easeatomi de carbon

?FhoH I

I

H-a--oH

I

CH2Oll

cr-hoH j

D€nlruloze

I

HO--+-H

I

H-+-oH l cfhoh Dxiluloai CHzOH

t.

n-I-o" n-I-on i H---!-oH I cFhoH Dpsicoza

CH2OH

I I

H+H I

H--{-OH

I

H-t-oH I CH2OH Dtrucloz6

ct-hoH C:O

I H-T-oH ro-

I r2N-CH(R)-CO-NI r-CH-

so2Nu-cr(R)-co-NH-cH...so2NH-cH(R)-cqH Cloruril de dansil

Fig. 3,9. Dansilarea, metodd de identificare seu marcflre a aminoacidului N-terminal

O metodd asemdndtoareeste cea propusd gi utilizatd de SANGERin anul 1953,care folosegte2,4-dinitrofluorobenzenul.Aceastdsubstanfd va fi un substrat pentru o reacfie de substitufie nucleofild aromaticd realizatdde gruparea aminoterminald a polipeptidei. ln urma hidrolizei se poate identifica astfel aminoacidul N-terminal similar cu metoda dansildrii.

'it'*

NTI.CII(R)-CO-NH-CH. Ir2N-CH(R)-CO-NH-CH-

Y

Nq

NO2

,\-

ill

hidroliz[ acide --____l>

NH-CH(R)-Cq}I Nq +a8l*

Y

tJq

2,4dinitrofluorobenx,en Fig. 3. 10. Metoda SANGER de i.dentificare a aminoacidului

N-terminal

Elemente de b i.ochimie .1.

LL2

3.4.3.Identificarea aminoacizilor C-terminali Se poate reaJizachimic sau enzimatic. O variante chimicd frecvent utilizati este hidrazinoliza, cunoscutd ca metoda AKABORI (Fi9.3.11). Aceastaconsti in tratarea polipeptidei cu hidrazini la 100"C.Hidrazina scindeazi toate legdturile peptidice, formdnd aminoacilhidrazidele corespunzdtoare, cu exceplia aminoacidului C-terminal care rdmdne nesubstituit:

i:2'" r , rLNr--cH*-(D--NH-MI2 p.3 - - - - -NI

I-

pl

q2

lt OJ-

OO- NI{- O{-

A

I

(I]'-NH-CII- CI I-

t

pl

,I

tLt\{---cl-02-

/ lhN-NFI2

q'

rI2N-Nl12

Fig. 3. 11.Metod.aAKABORI de identificare a aminoacidului C-terminal

Aminoacidul nesubstituit poate fi identificat prin reac{ii specifice. O alte varianti chimicd sebazeazd,pe reducerea gmpdrii carboxil libere cu hidruri de litiu si aluminiu LiAlH4.ln urma hidrolizei acide, rezultd un amestecde aminoacizi impreund cu aminoalcoolul corespunzdtor aminoacidului C-terminal, care se determind de asemenea specific. Metodele enzimatice utilizeazd.carboxipeptidazelede tip A, B, C gi Y. Carboxipeptidaza A, extrasi din pancreasul bovin, cLiveazi,toate tipurile de legdturi peptidice C-terminale cu excepfia celor care au ca aminoacid C-terminal arginina, lisina gi prolina. Carboxipeptidaza B, extrasi din pancreasul porcin, cliveazddoar legdturile peptidice C-terminale care elibereazd arginina gi lisina. Utilizarea amestecului de carboxipeptidazdA Ei B va putea deci elibera orice aminoacid terminal cu exceplia prolinei. Carboxipeptidaza C (din frunzele de ldmdi) gi Carboxipeptidaza Y (din drojdia de bere) pot cliva orice legS.turd peptidicd C-terminald. Diferenfieri apar sub raportul disponibilitefii acestorenzime, dar gi aI cineticii de hidrolizd, particulard pentru fiecare tip de legdturdhidrolizatd.

Proteine. Structura proteinelor

r13

3.5.Structura proteinelor Componenta care determind activitatea gi implicit funcliile acestei mari clase de substanfe este structura. Complexitateaedificiului molecular, a cirui stabilitate este asiguratd de interacfiuni fizice gi chimice care acoperd intreaga paleti a t[riei, de la legituri covalente pdnd la forfe Van der Waals de dispersie,este ridicatd gi divers6..De aceea,studiul unor asemeneastructuri nu se poate face fdrd o sistematizarebazatd,pe criterii riguroase.La proteine, structura se poate detalia pe patru nivele, cu complexitate gi implicit confinut de informafie direct corelate. ln ultimii ani incepe si se contureze o abordare mai detaliatd a structurii proteinelor introducdndu-se termeni ierarhici noi. Cei mai folosifi sunt cei de structurd suprasecundard,respectivde domenii, care apar intre structura secundari gi cea tertiard. 3.5.l. Structura primari a proteinelor Este dati de secvenlade aminoacizi a catenei polipeptidice. Legarea aminoacizilor se realizeazl, aga dupd cum se cunoagte prin legdturi peptidice (amidice), care se staH bilesc intre grupdrile carboxil gi NI amino ale aminoacizilor, arnU bele in pozifie relativd a. Acest .-.l tip de leg5.turdconferd catenei I particularitatea alternanfei uH nor porliuni rigide (legdturile amidice -OC-NH-) cu por{iuni Fig.3. 12.Tautomeria legdturiipeptidice mobile (_HN_C"_CO_).Aceasta datoritd tautomeriei grupdrii amidice (Fig.3.12.).lncddin 1930,Linus PAULING gi Robert COREY,pe baza studiilor de difracfie a razelor X, realizate pe catene polipeptidice au evidenfiat cd iungimea legdturii amidice estede 1,32A fald de 1,49A, caracteristicdlegdturii simple C-N, respectiv 1,27A, pentru legdtura dubla C=N. ln structura catenei polipeptidice intri setul celor 20 de aminoacizi naturali, tofi din seria L (Tab.3.2).Din acegtiaminoacizi pentru om, noud sunt esenfiali (vezi mai departe). Caracteristicade esenfialitate,atribuitd unei substanfe se referd,Ia imposibilitatea organismului de referinfi de a o sintetiza, prezenfa sa in respectivul organism fiind rezultatul exclusiv al aportului exogen. Acest aport poate fi ori direct, atunci cflnd substanfa propriuzisd provine din exterior, ori indirect, atunci

-$- -

D (|-n

o

Elementede biochimie ,1.

LL4

cdnd din exteriorul organismului provine un precursor, care poate fi modificat chimic in organismul gazda. Se utilizeazl doui sisteme de prescurtdri ale aminoacizilor, listate in tabelul de mai jos: o abreviere din trei litere gi un simbol dintr-o literd. Rota{ia planului luminii polarizate depinde de natura aminoacidului. Proprietdfi importante sunt valorile punctului izoelectric (pHi), utilizabile in precipitarea fracfionatd in gradient de pH, sau la electroforezade izofocalizare,precum gi valorile pKa corespunzS,toare funcfiilor o-carboxil gi a-amino protonate: Tab,3.2.Aminoacizli naturali cu denumlre, prescurtdri, ualorile pI@ Si pHl Co?H

t-

ttt,Arn,

n3!-

H.

Ala,A L{+)-alanind, GlicinA, Gly,G

2,35 2,34

9,66

9,60

6,02 5,97

L-(-)-proline, Pro,P

'1.99

10,60

6,30

U

"'//,,/CO

2H

INH

H

I

H:N\ Y

.CHz. ./ CHz CHz

/.N.

147

Aq, R L1+)-arginine,

il

9,04 (cr-NH:')

10,76

NIi

(_\."r Ho -.

./ cHz

L-(-)-histidinA, Hrs,H

L-(-)-serin6, Ser,S

1.82

I,17

7(O

2,21

9,15

5,68

z,vt

8,80

5,41

o

tl il

Asn,N L-(-)-asparagina,

HzN

wn2

"-.:

^ J

L-(+)-izoleucine, lle,I

,.a-\H

2,36

6,02

Proteine . Structura proteinelor

115 cO ,H

I n"'Ann,

HO

Y

Thr,T L{-)-treonin5,

:

2,09

9,10

5,60

2.09

9,82

2,98

9,60

5qR

o20

5,88

H

o

A

HO

Acidul L{-)aspartic (L-asparagic), Asp,D

w^2

,,,.f."/

L-(-)Jeucini, Leu,L

I,JO

,/

CH,

I /-+\\

-t\,

r-

|ill

\\

/\

\,2

HS._

L-(-){riptofan, Try,W

NH

L-(-)+isteind, Cys,C

./ CHz

l'l>*

cH2

""

H3c\-/cHz--^,,./ )

Ln2

^o-.'-t"-"u/

il-"'

9,90 8,27(SH)

5,02

2,32

9,62

L-(+)3lutamini, Gln,Q

7.17

a1?

q7n

Met,M L{-)-metionind,

2,28

9,21

5,06

2,19

9,67

3,22

1,83

9,13

5,48

-^,,/

ll o

1.71

L-(+)-valini, Val,V

11:L

H2N-

2,38

acidL(+){lutamic, Glu,E

o

Phe,F L{-)Jenilalanind,

r16

Elementede biochimie .I.

To" t"'A*",

, ,2, r, \r C H r . t . ^ , , . . C H r . , ^ . . . / n Ln2 lt12

L-(-)-lirosind, Tyr,Y

* prolina este singurul aminoacid natural care nu se tncadreazd tn generald. formula Omul are nevoie de noud aminoacizi esen(iali: F, H, I, K, L, M, T, W, V. Numirul de posibilitifi de construirea unei catenepeptidice care sd confinA a aminoacizi de b tipuri este dat de relalia ao.De aceeacu cei doudzecide aminoacizise pot constmi 20100 catene.DacI masamedie a unei proteine de 100 de aminoacizi este de 13800t3de daltoni, atunci masatuturor celor 20100 de catenear fi de 1,38.10138 de daltoni, comparativ cu masa universului observabil,estimatd Ia 1080daltoni. 3.5.1.1. Determinarea structurii primare Deoarece toate procedurile cunoscute si utilizate pdni in prezent necesitdfragmente scurte, de I5-20 aminoacizi, stabilirea secvenfei de aminoacizi este o operafie laborioasi, care presupune parcurgereamai multor etape: a. Separarea catenelor proteinelor formate din mai multe lanfuri peptidice. Aceasti separarepresupune desfacerealegd,turilorcare existd in cazul homo- sau heteromultimerilor. De reguld asociafiile heteromultimerice sunt necovalentede aceeainteracfiunile care le stabilizeazd.pot fl desfd.cuteprin utilizarea de solu{ii 8M de uree sau 6M clorohidrat de guanidind ori alte solufii saline concentrate.

13Masa molard medie a unui aminoacid este de 138de daltoni

Proteine. Structuraproteinelor

ao

'o)

ltzl

\u--r/

rL7

"l)

rar]rrcara:

nrrnf

dlsurrurr-ce de qrur'iri Iib6re-

I

*^-]*-

^r/ i I rrtr

t HcoooH --.-->

[.' v"r

oxidqre cu ocid

qa1^-

c u r o t r m a r e a performic ti.ef,i.eb* punti disulfuice

^*l**

i-'

resturide acid cistaic

z.oI ro+ac

t-

*-ff'

blocoreo grupdrilor tiolice Fig, 3. 13.DesfacereaireversibiW a punlilor dkulfurice

b. Desfacereapun{ilor disulfurice. Dacd exista punli disulfurice intercatenare, odatd cu desfacerea acestora,realizatd ca prim pas, se vor desfacegi punlile intracatenare. Desfacerealegdturilor covalente S-S se realizeazl, practic prin doud metode (Fig.3.l3): S-*€

HS HS

I I l. l

SH

\?HO

SH

ditiotreitol (formaredusa)

ditiotreitol (formaoxidata

Fig.3. M. Ditiotreitolul, agent de desfacerapunfiIor disulfurice

o prin oxidare cu acid performic (Fig.3.13-1),sulful din legdturile disulfurice se oxideazdla sulfat (seformeazd.resturi de acid cisteic).

l18

Elementede biochimie .1,

r pdn reducere cu mercaptoetanol (HS-CH2-CHz-OH), urmate de adifia acrilonitrilului Ia grupele tiolice (Fig.s.IJ.2.a)sau alchilarea resturilor -SH formate, prin intermediul iodoacetatului (Fig.3.I 3.2.b.).Reducerea punfilor disulfurice este urmatd de blocarea grupdrilor tiolice, deoareceacestese pot reoxida cu ugurinfd refdcdnd punfile in pozifiile iniliale sau in alte pozilii. ln locul mercaptoetanolului se poate folosi ditiotreitolul (Fig. 3.14.), o substanfd cu doud grupe tiolice care se pot oxida formdnd punfi disulfuric e intramoleculare. c. Determinarea compozitiei in aminoacizi pentru fiecare catend polipeptidici (rezultatd la punctul l, in urma separdrii). Se face dupd procedura hidrolizei acide totale urmatd de cromatografiere (de reguld in analizorul de aminoacizi). d. Identificarea aminoacizilor N- gi C-terminali. Serealizeazadupi procedurile descriseanterior. e. Fragmentarea fiecirei catene in lan{uri cu lungime mai redusd. Pentru fragmentarese pot folosi enzime sau reactivi chimici. Fragmentele oblinute se separi gi fiecarui fragment i se determind cornpozifia in aminoacizi gi aminoacizii N- gi C-terminali. Aceasti procedurd se repetd cu diferigi reactivi de clivare,fiecare cu altd regioselectivitate. Enzimele utilizate sunt proteaze (Fig.S.15).Acesteadispun de selectivitate variabili, Utilizarea combinatd a lor permite in final obginereaunivocd a secvenleicateneisupusdanalizei.Tab.3.3.listeazd celemai folosite enzime,detaliind locul pentru care posedi afinitate. Tab 3.3. Specificitatea de acfiune ahidrolizei peptidrnice) cu referire la Fig.3.15. Situspreferat Tripsina

R1:Lys, Arg

Clostripaina

R1:Arg

Chinntripsina

Rl:Tyr, Phe, Leu, lle,Val, Trp

Termolisina

R2:Tyr,Phe, Leu,lle,Val,Trp

Pepsina Proteazlstafilococici (tampon fosfat)

R1:Phe, Leu,mulli alliaminoacizi R1:Asp, Glu

(tampon Proteazislalilococicd HCO:-)

R1:Glu

Subtilizina

R1:Mulli

Carboxipetidaza A

(oxceptie, Arg,Tyr,Trp) R2:Aminoacid C-terminal

Proteine . Structura nroteinelor

119

I

^.^ ^-fil-, i;--**.oo. Hfr^ @

ttt o

ttt

H3N-rnz-rn^--CH-C

^i PZ

o -O

@

o

u ^l\r- Qfj-=,\ar..nnlggg

Fig 3. 15.Cllvarea enzirnaticd alegdturii peptidice

De notat ci specificitatea atacului este corelatd invers cu lungimea fragmentelor generate. Dintre reactivii chimici, cel mai folosit este bromocianul (BrCN) in concordanfi cu metoda pusd la punct de Bernard WTKOP gi Erhard GROSS(Fi9.3.16),Aceastareacfioneazdcu resturile de metionind. Se formeazd inifial un derivat de sulfoniu, care elimind rnetil sulfocianura, rezultdnd ca intermediar o iminolactond. Prin acfiunea apei are loc hidroliza legdturii iminice. .,

\,i" H

t: -Y-;irT\'o \.{,Lr)- "

B i T. -c-ru-5rr _

c-oRl

D"i

Caalizd acldd generall

(?,"-^ nz-\ont

,f<

--+

-f

p2-6,

--------{>

u> 6gl

o il g-ORl

R2.zC-OH

o

:B

o" ---------->

H_A

o ll R2-koH

H-ORI

l\ on\

pt

Fig. . 8. Excrnplc de catalizd acido-bazicd specifud SigeneraWtn rea4ia da hi.drolizd. a esterilor

208

Elementede biochimie,I,

Cantitativ, eficienfa intramolecularitdlii se poate calcula din raportul constantelorde vitezS.unimoleculard (reacfiile2-S Fig.4.7.) per bimolecular6, (reacfia bimoleculari aleasdca referin{d dintre acetat Ei acetatul de 4-bromofenil). Raportul are dimensiune molard (M) care poate fi interpretatd. ca molaritate efectivd. Prin aceastd mdrime desemndm, in condiliile exemplului prezentat, multiplul de moli de acetat de 4-bromofenii, care in reac{ia cu un num[r de moli de acetatliber, va da aceeaEivitezd de reacfie ca gi a reacfiei unimoleculare 2,3,4sau 5 (Aceea$i Fig. .7.). Cu alte cuvinte molaritatea efectivd,reprezintd un factor de amplificare datorat proximitifii particulare. ln cazul catalizei enzimatice, de reguld, nu se poate vorbi de o intramolecularitate propriuzisd deoarecegrupdriie reactive nu aparfin aceleiaEispecii moleculare (definitd ca entitate covalentd).Amplificarea printr-o proximitate forfatd are loc agacum s-a prezentat mai sus, prin aducereaspeciilor reactantein vecindtategi intr-o orientare favorabild. 4.4.2.2.Cataliza generald prin acki Sibaze. EsteintilnitA in multe dintre proceselebiocatalitice. Aga dupi cum se cunoagte,interacfiunea directd a H+ sau HO- cu substratul,finalizatd prin transformarea substratului in produs gi regdsireaH* sau HO- este denumitd catalizS.acidd sau bazicd specificd,in timp ce interacfia unui acid sau baza al{ii decdt apa, cu molecule de apd, cu generareaunor specii care reacfioneazd,cu substratul este denumitd catalizd.acidd sau bazicdgenerala(Fig.4.8.). 4.4.2.3. Catalizn coualentd Fie reacfia neenzimaticS: Sr-X+Sz :+

Enz

Sr-Sz+X S2

\_\

Sr-X \'--+,S,-fnzi

\x

t

Sr-Se

\En,

intermediarcovalent Fig. A,9.Schema catalizei enzirnatice prinformare de intermediari coualenfi

Enzime. Mecanismuldeactiuneal enaimelnr

209

r)fr

*:*-ro1\$r

R

EAz-\

or-> ll -/

R-C-X

__J

Enz.-Y

=:

U

o-\ l*-

R-C-X

l\t Enz-Y

R-o-l-o

Fosforil-enziml

Enz_y

o R-f

tl

Acil-enzimd

I

Enz-Y

Fig. 4.10. F.xemplede catalizd enzimatlcd cuformare de intcrmediarl coualenfi

Prin catalizd enzimaticd, pe lingd posibilitefile mai sus enunfate, se poate ajunge la cregtereavitezei de reacfie gi prin formarea covalente a unor intermediari. In acest caz, condifia necesare pentru o catalizA enzimatici si fie o alternativd eficientd fa{a de reactrianecataliticd, este pe de o parte ca gmpele funcfionale din catenelelaterale ale aminoacizilor care atace substratul si fie mai reactive decdt reactantul utilizat in procesul necatalitic, iar pe de alta parte, stmctura nou ataqatdsubstratului (care congine$i componenta enzimaticd),si fie o grupd mai fugace decdt cea preexistentd in substratul inifial. Cataliza covalenti presupune un mecanism secvenfialln care are loc formarea unui intermediar covalent intre enzimd gi substrat. Mecanismul general este redat in Fig. 4.9: De cele mai multe ori, formarea intermediarului covalent Sr - Enz este rezultatul unui atac nucleofil al componentei Y a enzimei asupra unui centru deficitar in electroni al substratului 51. (Fig. 4.10.).Dintre centrii nucleofli ai enzimelor, Y putem cita: grupe amino (lisind), carboxilat (acid glutamic, aspartic), hidroxil alifatic sau aromatic (serind, treonind, tirosind), imidazol (histidind), tiol (cisteini). Dintre fintele atacului nucleofil exemplificdm atomul de fosfor din resturile fosforil, atomul de carbon dublu legat de oxigen, carbonul glicozidic etc. @ig.a.10.) Intermediarii formafi vor conduce la produgii finali prin mecanisme de substitufie nucleofild realizate prin atacul unui al doilea substrat, fie

Element e de b iochimie .1,

210

la carbonul sp3,fie (prin adilie - eliminare) Ia carbonul spz,fosfor (din fosfat) sau sulf (din sulfat) etc. Existd gi cazuri de catalizi electrofild, care de reguld.implici participarea unor cofactori enzimatici, de reguld ioni metalici, capabili prin deficitul electronic,si joace rol de electrof,li. 7n Tab.4.2sunt listate o serie de enzime care formeazd intermediari lega$ covalent, inclusiv glicerinaldehid-s -fosfat dehidrogenazn, o enzimd din glicolizi, care catalizeazl. fosforilarea oxidativi a glicerinaldehid-3-fosfahrlui (esterullui Fischer),in care atacul nucleofil se realizeazd prin intermediul unei gruped tiolice a unei cisteine prezente in situsul catalitic: Tab, 4.2. Enzime care formcazd intermediari covalenSi:

o

-Chimotripsina -Elastaza -Esteraze -Subtilisina -Trombina -Tripsina

cH,-oH _CH

CH?-

o-\*

_CH

senna

acilserina

o

I?-S[I -Glicerinaldehid-3Josfat dehidrogenaza -Papaina

CHN*

,A*

CFI cisteina

fosfatazaalcalind -Fosfogulcomu'taza

-CII

ftz-oa

acilcisteina

lt,,," crl,-OtP-O clr

serina \

-Fosfogliceralmutaza -Succinil-CoA sintelaza

"\U\

CH.

Yt' t N

NwJ/

fosfoserina

Y"')o* o:i

Q

qr"

Fig.4.21. Blocarea tirozinei

se realizeazdcu N-acetilimidazol (NAI) (Fig.4.2j).

218

Elementede biochimie .1.

4.4.3.1.7.Reactiui pentru resturile de tr iptofan serealizeaz d cu bromuri de 2-hidroxi-5-nitrobenzil(Fig. .22.)

{

r,m \r-\2

,,.o, -T-f n/-''/

Fig. 4.22. Blocorea resrurilor de triptofan

4.4,3.1.8.Reactiui pentru resturile de arginind seface cuI,2- ciclohexandiona(Fig. .%.)

r-{

o\^ I

____> -Fto

|

"4t/

1,2-CiClohehandiona

fv ,)

o

iv *"\#1 t-__/

,zn /

.. o4.

i

\

I Fig, 4.26. Interacliunea chimotripsind proteind. tn cazul serinproteazelor

r Selecflalegdturii peptidice care urmeazi a fi hidrolizatd.,cu alte cuvinte specificitatea ac{iunii enzimei, este dependenti de existenla unui ,,buzuna-r"cu structurd complementard restului de aminoacid atagat de carbonul legdturii peptidice care se va cliva. Astfel, acestrest este aromatic pentru chimotripsin6, bazic pentru tripsind etc. NO"

t-

A )'

'4(* a\

acetatulde 4-nitrofenil

r-|-

*.i--#",,,J--#*

o N-acetil fenilalanilatul de metil

o lenilalanilatul N-formil de metil

Fig.4. 27. Substraturi sintetice utiliznte pentru studiul mecankmului reacfiei chimotripsinei

222

Elementede biochimie ,1,

concentra!ia

4-nitro:

Fig.4.28.Dinamica",",f":::fffii:;i#:;yfl;:tahidroliznchimotripticda o In fine, porfiunea N-terminald a catenei polipeptidice imediat adiacentd situsului de clivare este fixatd de enzimd prin formarea unor porfiuni beta antiparalele atdt pe proteini cit gi pe enzimA7n Fig.4.21. se prezinti cele doud modalita{i de fixare ale celor doud stiri de tranzilie de cdtre serin proteaze. Dovada experimentald a existenfei a doul etape in funcfionarea serin proteazelor a fost oblinuta prin utilizarea chimotripsinei ca enzime pentru clivarea unor substraturi sintetice precum 4-nitrofenilacetatul sau N-acetil fenilalanilacetatul de metil ori N-formil fenilalanilacetatul de metil (Fig.4.27.).Primuldintre acestedoud estemai uEor de utiIizat deoarece 4-nitrofenolatul oblinut este uFor decelabil pentru ca prezintd o absorblie intensd la 400 nm.

.

rapid

Enz + 4-nitrofenilacetat$enzAcetil \

-!9!! Acetat+ Enz

I

4-nitrofenolat Fig.4.29. Schema acfiunii chimotripsinei asupra -nitrofenolatului

Utiliz6,nd o cantitate mare de enzimd, se observAinitid o creEtererapidd a cantit[fii de 4-nitrofenolat eliberat, urmatd de o reducere a vitezei de formare a acestuia, dinamica eliberdrii sale in aceastd faz6.urmdnd o alurd liniard, paraleld cu cea a eliberirii acetatului. (Fig, 4.28.). Aceasta confirmfl formarea rapidd a complexului enzimi substrat urmati de eliberareatreptate a acetatului din acest compiex. Pe mS.surd

Enzime. Mecanismul de actiune aI enzimelor

223

ce are loc aceasti eliberareenzima poate ata$anoi cantitdgide substrat, dar viteza procesului este limitati de disponibilitatea enzimei libere, disponibilitate limitatd de etapa lentd a descompunerii complexului enzimd substrat.(Fig. .29) 4.4.4.2. Proteazele aspartice Din multitudinea de enzime proteolitice o noti aparte o face o categorie caracterizatd de prezenfa in situsui catalitic a doud resturi de aspartat.De aici numele de proteaze aspartice.Acesteenzime lucreazd la valori acide,cel mult neutre ale pH-ului. Asp32

ts'^hi

dv

t+-o

\,^' i E - - - - - -" rrei r. ' t' \

46 V \', \_, | hl

l-,,

Asp2l5 |ililt

tv

Fig. 43A, Mecanismul general de acfiune aI proteazalor aspartice

Exemple semnificative sunt: pepsina gi chimozina, enzime stomacale care au rolul de a digera proteinele alimentare, catepsinaD, identificatd in mai multe fesuturi, cu rol in digestia lizozomald, a proteinelor, renina, enzima sintetizatd in rinichi, cu rol in formarea angiotensinei I din angiotensinogeno'.De asemeneaproteazn HIV-I din virusul SIDA, care acfioneazdasupra proteinelor virale SIDA este tot o proteazd,aspartici. Cele mai multe dintre proteazele aspartice au masa de cca. 350 kD ceea ce corespunde la 323 - 340 de aminoacizi. Structura proteicd este organizatdin doud domenii. Fiecare dintre acestedoud domenii confine doue foi beta gi douf, scurte alfa helixuri. Cele doud domenii sunt conectateprintr-o foaie beta cu $asecatene antiparalele.Situsul catalitic se gdsegtein ,,addncitura"formatd intre cele doud domenii. Volumul sdu estesuficient pentru a putea addposti cca. gapteresturi de aminoacizi. Aminoacizii de contact sunt doud resturi de acid aspartic de unde gi numeie clasei. ln cazul pepsinei porcine cei doi aminoacizi de conal Acest proces std Ia baza cregterii presiunii arteriale

224

Elementede biochimie .I.

tact sunt Asp32 gi Asp2I5. Trebuie menlionat cA po4iunea N-terminaia a enzimei se constituie intr-un veritabil capac ce acoperA9i imobilizeazA substratulin situsul catalitic. Mecanismul prin care are loc clivarealegdturii peptidice este o catalizd generald acido-bazic5..Cele doui resturi de acid aspartic funcfioneazd.succesivca donori gi acceptori de protoni, respectiv ca acizi sau baze generale (Fig. 4.30j.In etapa inifiald (I) restul aspartat se comportd cabaz6,generaldacceptdnd un proton de la o moleculi de ap6, a carei oxigen va dobdndi o nucleofilicitate sporitd, putdnd in acestmod sAatacecarbonul legdturii peptidice pozifionati in situsul catalitic. Prin preluarea de cdtre oxianionul tetraedric a protonului de la restul de acid aspartic 215, se va forma o amidd hidrat instabila (II), care se va descompune prin atacul bazic al Asp32,odatd cu ruperea legdturii C-N 0II) Ei formarea resturilor carboxil gi amino ale capetelor N gi C terminale nou formate prin mperea legdturii peptidice. 4.4.4.3.Lkozimul Este o enzimi detectatd prima dati, in albugul oului de gdinf,, de cdtre I,ASTCENKOin 1909 gi apoi in 1922,in mucus qi lacrimi, de cdtre FLEMING, descoperitorul de mai tdrziu al penicilinei, Numele derivd de la capacitatea acestei substante de a liza peretele unor bacterii. Substanfa este de naturS.enzimaticd. Aga dupi cum s-a ardtat, peretele peptidoglicanic al bacteriilor consta dintr-o multitudine de catene poligiucidice, fiecare fiind formati dintr-o unitate diglucidicd repetitivd. Catenelesunt reticulate intre ele prin scurte catene oligopeptidice. Unitatea diglucidici esteformatd din acid N-acetil muramic -NAM- (vezi aminoglucide), de care se gesegte atagatamidic catena oligopeptidicd gi N-acetilglucozamini -NAG-. Lizozimul este o endoglucozidazd.care are capacitateade a rupe legdturile glicozidice dintre NAM gi NAG din peptidoglicani (vezi l-r& 4.31) sau legaturile gicozidice dintre unitdfile de NAG ale chitinei. S-a constatat cd substraturile cele mai potrivite pentru enzimd, pentru care se ating vitezele maxime sunt trimerul (NAM-NAG)3, 9i hexa-Nacetilglucozamina (NAG)o-chitohexoza.

Enzime. Mecanismul de actiune al enzimelor

225

-ffro I I Y

NHAc

NAU

NAM

NAG

NAM

poliglucidicedin Fig.4.3I.Loculacfiunii lizozirnuluiasupracomponentei peptido glicanul peretelul bacterlan

Enzima are o dimensiune micd, fiind formatd din 129 de aminoacizi. Este de altfel prima enzime c[reia i s-a determinat structura prin difraclie de raze X (in 1965de cdtre echipa condusa de David PHILLIPS). Mecanismul de actiune Ei structura situsului catalitic au fost posibile dupd mai multe determiniri structurale ale complexelor enzimi inhibitori competitivi (analogide substrat),realizatepe un set de oligoglucide. Aceasta,deoarececomplexul enzimd substrat are o duratd de viafd prea scurti pentru a putea fi studiat. Cele mai bogate in informafii s-au dovedit datele relevate prin folosirea trimerului (NAG)3.Fald de substratul clasic viteza reactiei de hidrolizd este de cca. 60.000de ori mai scdzutd. S-a constatat cd enzima are $asesubsitusuri in care leagf,necovalent o secvenfi de ;ase glucide (A-F).ln urma rezultatelor oblinute de echipa lui PHILLIPSs-a propus un mecanism de reac{ie,neinfirmat pdna in prezent, ln vecind.tatealegdturii care urmeazi si fie clivatd se gdsegteAsp-52 qi Glu-35, (doud resturi acide).

Elementede biochimie ,1,

Legitura care va fi clivatS.se gase$teintre subsitusurileD gi E. Din acestmotiv trimerii (NAG)3sauNAG-NAM-NAGse comporti ca veritabili inhibitori. ln subsitusulD, glucidaatagatdva suferio modificareconformafionali carela o structurdde tip plic sausemibarcd(structuraB), Fig.4.;72. GlJ3s

?--o

r

PAsp52

t-rl o-"' I-f

F

I

(=o-= '>H

+

\o--\=---lof

ouos f

(E

\)z

J-,

^ -o Asp52

Fig. 4.32 Mecanismul acfiunii liznzimului

ln catalizd acidd realizatd prin participarea restului Glu35 are loc ruperea legdturii O-glicozidice a nucleului D, expulzarea fragmentului dinspre capitul reducdtor iniFal gi formarea unui ion oxocarboniu, sitabilizat prin participarea celuilalt rest acidAsp52. Gruparea carboxilat a restului Glu35 acfioneazd in continu.ue ca o bazd generald prelu0nd protonul din ap6, care astfel va putea ataca structura oxocarboniu, formdnd gruparea OH (reducdtoare) a celui deal doilea fragment. 4.4,4.Cofactori enzimatici gi vitamine Tipurile de reacfii chimice catalizate de cdtre proteinele pure sunt limitate la posibilitdfile de interacfiune cu substraturile ale grupdor funcgionale prezente in catenele laterale ale aminoacizilor: imidazolul din histidind, carboxilul din acidul glutamic qi aspartic, amino din lisin6, guanidini din arginind, hidroxil din serin6, treonind, tirosind, srulf-

Enzime. Mecankmul de actiuneaI enzimelor

227

hidril din cisteina. Aceste guperi pot funcfiona fle ca acizi sau baze generaie in transferul de protoni, fie in calitate de catalizatori nucleofili in cazul transferului de grupe funclionale. Gama de interacliuni poate fi lirgiti prin participarea la actul catalitic a unor componente neproteice numite cofactori sau dupi caz coenzinxerespectiv grupd,ri prostetice. Componenta proteicfl a unei enzime care confine cofactori poartd numele de apoenzimS,.

:X:::X"

Fig.4. 33.Participarea cofactortIor de naturd coenzimaticd Ia procesul catalitic

Distinclia dintre coenzime 9i grupari prostetice,o reprezintd tdria legdrii cofactorului de componenta proteicd pe de o parte gi participarea sau nu a unei a doua enzime sau echipament enzimatic la regenerarea cofactorului. ln acest context, coenzimele, sunt substanfe neproteice, legatenecovalent,deci separabilede apoenzimi prin dializi sau adsorblie pe cdrbune activ. Ele se modifici in urma actului catalitic care transformd substratul ini$al. Regenerarealor se face de cele mai multe ori prin intermediul unei alte enzime pentru care coenzima modificatd devine substrat,iar coenzima regeneratdprodus. ln Flg. 4.33.se reprezintd o reacfie de transfer la care participd o coenzimi (Coenz).Prima enzimi (el) catalizeazdreac{ia principald de modificare a substratului, in timp ce enzirna a doua (e2)asigurdregenerareacoenzimei. Grupdrile prostetice sunt de reguld legate covalent de apoenzimd. Regenerarealor se face cu ajutorul unui substrat secundar, ia reacfia respectivdparticipAnd doar o singurd enzimd. Fig.43 .

''-\aEnz.P ,"r-rAr, Fig.4.34. Cofactori de tip grupare prostcticd

228

Elementede biochimie.l.

Mulfi dintre acesti cofactori sunt formali prin modificarea unor substanfe organice esenfiale (care nu pot fi biosintetizate de citre om respectiv Eobolan), numite vitamine. Acest termen a fost introdus in 1911 in legiturd cu tiamina, prima vitamind, izolati. Ulterior s-a demonstrat ci gruparea aminicd nu este obligatorie pentru aceastdclasi, dar termenul s-a pdstrat. Trebuie ardtat cd nu toate vitaminele pot conduce obligatoriu la cofactori enzimatici. Caracteristicalor principald este cd sunt substanfe esenfialegi ci participd la reglareaunor procese metabolice sau fiziologice (oricum biochimice) cu sau fdrd participarea unor enzime legate, Vitaminele se pot sistematizain doud mari clasevitamine hidrosolubile gi vitamine liposolubile. Pe l6.ngdvitamine se mai cunosc substante cu aceeagifuncfie, dar care pot fi biosintetizatelimitat de cdtre organismul uman respectiv de goarece.Ele sunt cunoscutesub numele de substanfe asemindtoare vitaminelor (vitamin-like substances). 1n Tab.4.3. se prezintd vitaminele qi substanfeleasemdndtoarevitaminelor Tab. 4.3. Principalele uitamine Sifuncgiile acestora Subs&nfi (Br) Tiamina (Bd Riboflavina Biotina (Be) Piridoxina Addulniotinic(Niacina) Acidulpaniotenic Acidulfolic Vitamina Brz Vitamina C A Vitamina Vitamina D Vitamina E Vitamina K

Funclia Vitanine hidrosolubiIe poategeneraberiberi Deficienla tiamlnpirofosfat. Precursor al coenzimei (FMN)gi flavinadeninmononucJeotidd Precursor al coenzimelor poatecauzaint0zierialecrEterii. (FAD).Deficienla flavinadenindinudeotida blccitina Precursor al coenzimei poatecauzadermatite piridoxal lagoareci. fosfat.Deficienp PreruForal coenzimei (NAD)9i nicotinamidadenin-dinucleotida Precursor al coenzimelor (NADP). DeficienBpoatecauzapelagra. nicotinamidadenlndlnucleo$d-fosfat poateonducela dermatite la pesAd, A (CoA).Deficienla Precusoral coenzimei la anemii. Deficienla conduce Precursor acidtetrahidrofolic. al coenzimei perconduce Deficienp la anemia deoxiadenozil cobamida. Precunoral coenzimei nicioase. prolinei Deficienta condu€la la colagen, Anttoxidant. in hidroxilarea Cosubstrat smrbut. Vitamineliposolubile

gireproducere. Arerolinvedere, cregtere gifmforului calciului Reglarea mehbolismului Fac{or antisterilitate Factor decoaqulare

vitaninelor .Subsfanfe dtoare asemdn hormonali in actiunea Mediator alllpidelor factor membranare, detransport allipid€lor Constituent gragiln mitocondrie acizilor bansportului Substanp necesart oxidativa a cetoadzilor indecarboxilarea Coenzimd folic Commrpnt alacidului alalectrcnilor infansportul mitocoqdrial importantA Coenlma Q(ubichinonele) Componentl

Inositolul Colina Camitina Acidula-lipoic Acidul4-aminobenzoic

Enzime.Mecanismul deactriune al enzimelor

Tiamina (aneurina)

229

Tiaminpirofosfat

Fig.4.35.Vitamina Bl St tiarninpirofosfatul

4.4,4.1. Vitaminele hidrosolubile Si coenzimel,elor 4.4.4.1.1.Vitamina Bt (Tiamina sau aneurina) Are o structurd care include doud heterocicluri: un nucleu pirimidinic gi unul tiazolic (Fig. 35.). Atomul de azot al heterociclului tiazolic nu poseddperecheade electroni, neparticipanfi de aceeamolecula apare sub formf, cationicd.Prezenfasarcinii pozitive, labilizeazdlegatura C-H heterociclicd adiacenti, de aceea chiar sub influenfa unei baze relativ siabe, protonul se va elimina carbonul devenind astfel un bun nucleofil. Coenzima derivatd de la tiamind este tiamin pirofosfatul @i9.a35.) Prin legarea restului pirofosfat, pe de o parte se mare$te aciditatea compusului, datoritd efectelor electronacceptoareale restului pirofosfat, iar pe de alte parte, restul pirofosfat, permite interacfiuni puternice cu porfiunile cationice ale componentei proteice ale enzimei. Tiamin pirofosfatul intri in componenta unor enzime care scindeazf, legdturi de tipul prezentat in F4g.4.36.prin covalengdingrogatI: V\J II

il

-crc-

II

tl

oFt o

Iil -c-crc-

ot-l

|

tl

dl

HH b)

Fig.4.36. legdturi care potfi scindate prin intervenSia cofanorilor TPP

Structurile de tip a) caracteristiceo-cetoacizilor fac obiectul reacfiilor de decarboxilare (piruvat decarboxilaza, u-cetoglutarat decarboxilazaetc). Structurilor de tip b) le sunt caracteristice reacliile catalizate de tr anscetolazd respectiv fo sfocetolazi.

230

Ebmente de biochimie.I.

Un exemplu interesant al acliunii tiaminpirofosfatului este acela al transformirilor acidului piruvic in produgi gi intermediari precum acetoina, acetolactatul, acetaldehida, acetatul gi acetilfosfatul Fig.4.S7. Aceste transformdri au in comun adifia directi a carbocationul nucleului tiazolic la piruvat. Intermediarul format se decarboxileazdformdnd un nou intermediar, stabilizat prin rezonanfd, care poate la rdndul sdu, prin intermediul carbonului exociclic,cu ma.redensitatede electroni sd dea reac{ii de adilie nucleofild la acetaldehidf,,sau la piruvat, cu formarea unor compugi tetraedrici instabili datoriti apropierii de azotul cationic. Acegtia,datoritd depiasdrilor electronicevor suferi clivarealegdturii carbon-carbon formate prin adilia anterioard, regenerdnd coenzima gi form0nd respectiv acetoina gi acetolactatul, compuqi identificafi mai ales in fermentaliile anaerobebacteriene sau produse de drojdii, unde concentrafia de acid piruvic esteridicatd. De asemenea produsul de adifie-decarboxilareal TPP-ului poate sd capteze din mediu un proton. Prin ruperea legdturii carbon - carbon se formeazi acetaldehidd. O alta posibilitate este pierderea protonului hidroxilic Ai formarea in consecin{da unui carbon trigonal. Acest compus prin hidrolizi sau fosforolizd va forma acetatul sau acetil fosfatul. Transcetolaza este de asemenea o enzimd TPP-dependentd. O intdlnim in calea pentozofosfafilor, in fotosintezd,- vezi Vol. II. Mecanismul transferului motivului hidroxiacetil este prezentat inFig. 3B. 4.4.4.1.2. Vitamina nZ Riboflavina) Numele ii vine de la latinescul flavius (,,galben")- culoarea formei oxidate a substantei.

? ?Fr,-o-T-o-R o*-?-"

*-f-"

Ho-?--H

FAI

Fig. 4.37. Cofactoriifl^auinici(FADSi FMN)

rTl olro=o,; I

I

['J

Acetoina

cH3

"-\x--( nr^

cH,

/

lr

{>1>_e\s/ .--1 (H-) .c-o

d/

\-nl --->

2

Plrwal

tr

--T I

ta

,,'iJ1'>,.' ,Q"-'

Acetaldehidlt

R2= o&*'

^/2

oo r\ '/

(cF12>-o\

'R,A

____-__> \:i

\Nz&'

cu coc-f-r.rHi carbanion frovenit dintr-unD-aminoacid

I Y NHs

-[].,r-,"

.G

li --'-*-.

T --.2*-.

,

v -

il ll \N^\

'i, --rt

H d-cetoacld

q_tl

flavinenzimdreduse

il

\A

f-

ooc-T.-oJ Ril

Fi94.46. oxidarea aminoacizilor de cdtreflauinoxidaze

Reamintim faptul cd oxigenul introdus in structura substratului de cf,tre formele oxidazice ale flavoproteinelor provine de la api, flavina redusdputdndu-se reoxida fie anaerobfle aerob. NADPH,H*

NADP

ct-r

FAD

FADHz

q

C02

I

I

N

v

salicilat hidroxilaza

FADqH

Pirocatehind CO)1

Acid salicilic Fig, 4,47. Oxidarea fenolilor sub acgiunea unor oxidazeflauinice

238

Elementede biochimie,I.

Monoxigenazele flavinice sunt enzime capabile sd introduce un atom de oxigen in structura unui a.numesubstrat. Majoritatea monooxigenazelordin aceastdclasi sunt FAD-enzime.Exemple tipice sunt 4hidroxibenzoat hidroxilaza din diferite specii bacteriene precum Pseudomonas,Azotobacter,Acinetobacter.D e asemenease poate aminti salicilathidroxilaza din Pseudomonas.Numele de hidroxilaze vine de la faptul cd ele realizeazl. intercalarea atomului de oxigen intre un atom de carbon gi unul de hidrogen. caracteristic acestor enzime este ce ele acfioneaz5.sub formi redusd (FADH2),obfinute prin oxidarea NADPH, mai rar a NAD. Ele activeazd oxigenul prin formarea structurii 4a-hidroperoxidice.Aceasti structure va suferi o clivare heterolitici la nivelul legiturii peroxidice, sub asistenfa unui proton din mediu, formdnd ap6. Oxigenul de pe structura flavinici, cu deficit de electroni, deci foarte oxidant, va fi smuls de cdtre substrat careil va incorpora, Importanfa coenzimelor flavinice constd in capacitateaacestorade a catalizao varietate mare de proceseredox, incluzdnd transferul de electroni dar gi activareaoxigenului in proceselede oxigenare. Un alt exemplu interesant il constiuie acfiunea ciclohexanonoxigenazei bacteriene, o enzimi care mediazd transformarea cetonelor ciclice in lactone cu ciclu incrementat. ln acestcaz hidroperoxidul flavinic, atacd nucleofil carbonul carbonilic, intermediarul oblinut suferind o transpozifie Baeyer-Villiger.(Fig. . B.) Acfiunea lor constituie punctul de intersecfie a ciilor citosolice de metabolizarea carbonului, inifiale, care implicd transferuri bielectronise, cu ciile finale, asociatemembranelor care sunt predominant monoelectrontransferazice.

I

H

Fig.a.4& Acgiunea ciclahscanonoxidazei

Enzime , Mecanismul de actiune al enzimelor

239

In celulele mamiferelor, metabo\izareaglucozei (vezi metabolismul glucidelor) duce la formarea de COzgi NADH. Caleaterminali de transfer de electroni, Iegatdde membrand include citocromii, proteinele ferice neheminice precurn si cuproproteinele, toate aclionand succesiv, prin transfer monoelectronic pdnd la acceptorul final oxigenul, cu formare de apf, din protoni gi oxigen astfel redus, NAD*, concomitent cu inmagazinarea unei mari cantitdfi de energie sub form[ de acid adenozintrifosforicformat dinADP gi fosfat. 4.4.4.L3. Vitamina BS ( Acidul pantotenic) OH

I

"otYYNHfco,H HsC CHo O

Acid pantoic

p-alanina

Acidul pantotenic Fig.4.a9.

Denumirea, de origine greacd sugereazdlarga rdspflndire a acestui compus,in fapt amida acidului pantoic cu p-alanina(Fi4.4.49.).Acidul pantotenic natural, existent in enantiomerul R, se absoarbela nivel intestinal qi din acestaderivi doi cofactori enzimatici: fosfopanteteina $i coenzirna A. Ambii se oblin dintr-un intermediar comun rezultat prin fosforilareahidroxilului terminal al acidului pantoic.

fosfopanteteina Fig.4.50.

Fosfopanteteina (Fr6'.4.50.),este prezentd in anabolisrnul acizilor gragi unde iegatd de o componentd proteici formeazi proteina transportoare de acil (ACP - Acil Carrier Protein) care are rolul de suport al sintezeicateneide acid gras (vezimetabolismul acizilor gragiVol.II.).

240

Elementede biochimie .I.

Fosfopanteteina conline legat amidic de carboxil 2-aminoetantiol, iar de capitul oH terminal un rest fosfat. prin restul fosfat al fosfopanteteinei se face joncliunea cu o catend polipeptidicd care conline 7T,d,e resturi de aminoacizi rezultdnd astfel complexulACp. OH

o. ,

)i'

-. -.j. 1, =b*,

"J

*'*r*

I

I

l>r'u o) ,-Yd ^try{l

p '2orno

oH

coenzima A Ftg.4.51.

Cel de-al doilea produs bioactiv la care participa acidul pantotenic este coenzima A (Fig.4.46.)Structura coenzimei A confine fosfopanteteind atagatdfosforanhidridic de acidul adenilic (vezinucleotidele),fosforilat in pozifia 3'. Rolul coenzimei A este de a fixa prin acilarela sulfrrl tiolic diferili acizi. Legdtura tiolestericdformati estemacroergicd,astfel incAt hidroliza acesteia,cu regenerareaacidului, respectiv a coenzimei A, putdnd furniza energie. 4.4.4.1.4. Vitamina 86 (Pirid,oxayosfanl ) este coenzima care derivd de Ia vitamina Bo.In naturd, aceastaesteprezertte.in trei forme: piridoxal, piridoxamina gi piridoxind, (piridoxol) Fig. 4.52: ru

*- /t "' '

*aNH'

"l'

,dG^,/';1u ttl \"/\^, !\ Plrtcloxal fosfat

^{o"/-17o tJ13

Plidoxamina

ttl \rAo. PIrldortne @iridoxol)

Fi9.4.52. Formale vitaminei 86 precurn Si piridoxalfosfatul derivat

Enzime.Mecanismul deacliuneal enzimelor

24r

un "\c2" '''\.4',/" l^oR

!n

"\C2"

I

R\r\'cFl .......,..........l-

ill

R(

\$A.n"

\*Ao.

I

s3

H

H

Fig.4. 53.Mecankmul interacfiunii.piridoxalfu sfatului cuQmtnoacuu

Intrd in componenfa unor enzime care ,proceseazdaminoacizi" reaIizAnd reacfii de transaminare, a- decarboxilare,racemizare, aldolizare gi p-decarbozilarein cazul acidului aspartic.

,^A*,,\/?' *-{t*y

oX*", =r

T'

H

Acorn

Fig.4,54.Mecanismul acgiunii transaminazelor

Acestereacgiisunt posibile datoriti structurii piridoxal fosfatului de a forma imine (bazeSchif2) stabilizateintern, care pot la rdndul lor, prin existenfa centrilor atrdgdtori din structurd, sd stabilizeze perechile de electroni rezultateprin clivareaheteroliticd a unor legdturi adiacente (cr, sau p cel mai adesea). Hidrogenul hidroxilic din pozilia 3 se poate deplasa in pozilia I. ln acestmod se creeazi posibilitatea stabilizdrii iminei prin legituri de hidrogen, gi totodatd apare un centru suplimentar atrdgdtor de electroni (N) - Fig.4.Sa. Transaminazele sau aminotranferazele catalizeazd.reactia de dublu schimb formdnd dintr-o pereche aminoacidr: o-cetoacidzo noui pereche: aminoacid2o-cetoacidr @ig. .54 :

a2Termenul de bazd Schiff se folosegtede reguli penuu iminele Ia care amina de provenienti^ este aromatici..

242

Elementede biochimie .1,

T*"T ?*, Tpx 1,-{"-* xtT* B (izomenzare de exemplu) este denumitS.Uni - Uni, in timp ce o reacfie de tip: A> B + C (scindare)este denumiti Uni - Bi, ori reacfia de dublu schimb: A + B >C + D se poate denumi reacfie Bi-Bi.

Mecanismsecvential- ordonat t

) t

,g

P1

br

E SS E S 1 s 2 = - -

P2

+f

E p r pJ2-

e er $ g

Mecanisrnsecyential - aleatoriu t',

Fs. as'

>Z\ ,-,uK,,

ES 152q:=

EPlP2

>,,,4,,

Mecanismping - pong

Fig,4,110. Princlpalcl.e tipuri de mecankme ale reacliilor bisubstrat

Reacfiilemultisubstrat gi multiprodus, care presupun eliberareaprodugilor de reaclie numai dupd ce au fost legate toate substraturile, poartd numele de reacgiisewen{iale, spre deosebirede cele in care, dupd legareaunui substrat, are loc eliberareaunui produs, apoi are loc legarea altui tip de substrat gi eliberareacelui de-al doilea tip de produs, ;.a.m.d., denumite reacfii ping-pong. Reacfiilesecven{ialepot fi ordonate, dacd legareasubstraturilor respectiv eliberarea produgilor se face intr-o secvenfd determinatd, spre deosebire de reacliile sewenlial aleatorii, la care atagareasubstraturiIor, respectiv eliberareaprodugilor are loc intr-o ordine tntiimpldtoare. Schematicmecanismele de reacfie secvenfial (cu cele doud variante) gi ping pong sunt prezentatein Flg. 4.110.

298

4. 7.2.7. Inhibifu

Elementede biochimie,l.

enzimattcd,

Substanfelecirre interacfiondnd cu enzima duc la scddereaactivitefii acesteiapoartd numele de inhibitori. Ei diferd prin origine (endogeni sau xenobiotice) precum gi prin mecanismul de interacfiune cu proteina enzimatici (in competifie cu substratul sau fdrd competifie cu acesta). 4.7.2.7.1. Inhibifu competitiud Inhibitorul concurd cu substratul la legareape enzimd. Dacd.reacfia cu substratul estedescrisdde modelul:

E+s +L K2

ES

k3

- E*P

reaclia competitivd cu inhibitorul are o formd asemdn{toare:

E+ |

k/\

f,

El X+

fdr6transformar

Similar cu modul de definire al constantei de disociere enzimd substrat Ks [4.11] se definegte gi constanta inhibitorului Ki (tot o constanta de disociere,de data aceastaa inhibitorului de pe enzimd):

=k, 14i=c,'cu C.,

14.341

k4

Cu cit valoarealui Ki va fi mai mare cu atdt complexul enzimd - inhibitor va fl mai putin stabil. Pentru evaluareavitezei globale a reacfiei enzimatice, pebaza bilanlului enzimei gi a faptului cd ecualia de formare a produsului estelimitantd de vitezi se poate scrie cd: Ceo=CE+Cps+Cs1 t4.351 v=ksCcs i4.361 Sepoate construi expresia:

v

k e ' C es

CE^

Q +CEs +CE1

14.371

Elimindnd Ces$i Csrprin intermediul relafiilor de definilie K5 9i K1se obtine: -= \/tr

ks'cs K^ K uc * Cuc + Cr' + K;

sau lindnd cont cd K5nvKy qi cd k3 . Cro= Vmax

t4.3Bl

Enzime. Notiuni de cinetica enzimqticd

Vr"* cs

i4.3el

n"[t+Gr' 1 ) cs

KJ-

prin inversarese obfine:

1=r-fK"l.,.9.].,.l v V,"",1-C. ( K,i I

t'

t4.401

r-t

Notdnd Ky' mirimea K1,4'l f * *1, Kr/ \

a""umind-o constanti Ku

aparentd gi inlocuind-o in expresiile ta.16l qi [4.19]vom obfine formai, expresiile ecuafiilor MICHAELIS-MENTEN [4.19] respectiv LINE\MEAVER-BURKL4.2al:

,,' _ -

Vrr*'Cs KM'*CS

t4.4ll

I

-=

[4.42] *[*.,]

(cu inhibitor)

AA

rl

1

Cs

_1 - 1 KM Kv Fig. a.ll 1. Drepte Lineweaver-Burk in cazul tnhibisiei competitiue

300

Elementede biochimie .1,

deoarececonstanta aparenta are valoare rnai mare decOtconstanta clasicd,,prin prezenfa inhibitorului competitiv, enzima igi micaoreazdaparent afinitatea pentru substrat, valoarea.vitezei maxime nefiind afectat6. Prin reprezentareaLINEWEAVER- BURK se poate identifica acest tip de inhibifie, relevind cineticile enzimaticein prezenfa Ei in absenfa inhibitorilor. Inhibitori competitivi. Substanfele care se comportd ca inhibitori competitivi posedd analogiestructurali cu substratul.Aceastdanalogie, permite inhibitorului sd stabileascdinteracliuni similare atdt ca numdr, tip dar gi ca distribufie spafiald (topologie)1Fig.4.114.-.Problema care apare,estedeci una de specificitateenzimaticd. tln exemplu este oferit de p-galactazidazds din E Coli, o enziml carehidroilzeazl.lactozala glucozdgi galactozl. Enzima, un tetramer cu patru subunitili identice (masatotald 520 kD) se poate doza cu un substrat artificial (sintetic) analog 2-nitrofenil B-D galactopiranozida, (ONFG)asupra cdruia enzima acfioneazdproducdnd hidroliza la galactozd gi Z-nitrofenil (KM= 0,95 mM la 20oCgi pH = 7,6)tn.ln procesulde dozare,dacd se intro duce 2-tiopropil - B-D- galactozida acestaacfioneaza ca inhibitor competitiv tipic deoareceparticipd doar la faza de legare pe situsul catalitic. Galactozidazarruestecapabild sa scindezehidrolitic legdtura tioglicozidicd. Din acest exemplu se observd cd enzima posedd specificitate doar fafa de componenta glucidici, orice modificare la nivelul acesteiainactivdnd-o. Componentele atagatede galactozdinfluenfeazd,in micd mdsurd legareape situsul catalitic. In locul 2-nitrofenil-B-D-galactopiranozidei se mai poate utiliza gi X-Gal, numele de cod al 5-bromo-4-cloro* 3-indolil B-D-galactopiranozidei. Analogii stdrilor de tranzifie sunt de asemeneainhibitori competitivi, deoareceei se leagd mai intdi de situsul catalitic al enzimei, realizAnd complexul enzimd-analogcare ulterior trece in complexul stabilizat enzimd-stare de tranzilie (vezi paragraful legat de mecanismul acfiunii enzimatice Ei abzime).

58Aceastdenzimi va exemplifica reglareala nivel transcriplional a exprimdrii genetice. 5eDozarea se bazeazd pe diferenla intre maximele de absorblie ale nitrofenolului liber in mediu acid (absorblie in W apropiat) gi ale 2-nitrofenolatului in mediu alcalin (420 nm, cdnd estegalben).SemS.soarddeci intensitateaabsorb{ieidupi acliuneaenzimei gi alcalinizare.

Enzime , Nofiuni de cineticd enzimaticd

Lactoza

301

2-nitrofenil- ft D-galactpiranozida

F

OH t(

S\--or rc\--1.-\-^4o,

Ks

-+ E'

?'

OH

*bromo-4-cloro-3 -indoIiI- ft D-galactp iranozida

-*

'OH

21iopropi|- ft D-gaIactozida

ES ESI->

inactiv

K1

inactiv Fig.4.I 12. Inhibigia necompetltivd (schemade principiu)

4. 7.2.7.2. Inhibilia necompetitiud Sianticompetitiud, In cazul in care inhibitorul se leagd de enzimi intr-un situs diferit de cel catalitic, gi prin aceastase reduce itezareacFei enzimatice,vorbim de inhibiyie necompetitiud. Lipsa de competilie intre substrat gi inhibitor face posibili formarea unui complex enzimd - substrat - inhibitor, ordinea legdrii celor doui substanleputand fi oarecare,conform Fig. .ID. Pentru formalizare, plecdm de la ipoteza cd.afinitdfile enzimei fali de substrat gi fald de inhibitor sunt diferite. De asemeneaconsiderdm cd ne aflAm in condigiile stdrii stafionare.

Elementede biochimie .1,

lJtilizdnd acelagimodel de calcul ca $i in cazul inhibiliei competitive avem: v=ksCns t4.43I C " o = C s + C s s + C+sC 1sN 14.441 Raportul vlC1oeste:

k,.c,' CE + CEs + Cr, + Cr,,

CE"

14.451

Concentrafiile complexelor ES,EI qi EIS se deduc din expresiileconstantelorde disociereKs,Kr gi Kr' (sauKs'). Prin inlocuire in relatia [ 12] se obline:

n,9i3

V + =

-Eo

rr cr.c, c..c, - cE.cs.cr "u- K.-_--J(, K.Kl

prin imparlire cu Ce./ Ksse obline: kr' Ct

vEo (-

(

/

c-\

a\

[4.46]

[4.47]

K, II*ot i *cuIi*)nl ^r/ |\r/ \ \

Tindnd seamade deflnitiavitezei maxime obtinem:

V.*C.

n.[' .*)...[,.&)

[4.48]

prin inversarese obline:

5"J*i, )-l r =-:-l(1*g). v V.",L( K,,/C, ( K@./l

[4.491

dacd K1= K'i, suiltem in cazul inhibiliei necompetitiuepure, iar ecuagiile[4.48]pi t4.491pot fi scrisesub forma i4.501,respectiv[a.5f]:

t4.501 respectiv: (| | '-K,

.vl

I

v

IK. ,l v,,* L c, 'J

14.511

303

Enzime. NoSiuni d.ecineticd enzimaticd

(fdrdinhibitor

+I 1 KM Fig. 4.1 13.Drepte Llneweauer-Burk in cazul inhibiflel necompetltlve

Dacd facem apel $i la aproximafia Ks * KM, ecuafiile t4.501gi t4.5ll vor avea formal acelagi aspect cu reprezentdrile MICFIAELISrespectiv LINEWEAVER- BURK tipice. Factorul suplimentar care apare in modelul inhibiliei necompetitive fald de modeiul fera inhibifie, este intotdeauna supraunitar gi pozitivm. De aceeaviteza maximi aparentd va fi mai micd decdt in cazul michaelian clasic (Fig.4.1 13). In reprezentarea LINEWEAVER - BURK, a reacliei inhibate necompetitiv, se observi cd. iteza maximi scade (inversul acesteia cregte). Ecuafiile t . Bl gi [4.49] permit analiza comparativi a comportirii sistemului de reaclie in func$e de raportul Kr / K'r,Aga dupd cum rezultd din fig. Xr cuantifrcd inversul aflnitifii enzimei faf[ de inhibitor, iar K'1cuantifici inversul afinitd{ii complexului enzimd substrat fafi de inhibitor. Sunt posibile urmdtoarele situafii extreme: l. K'1 tinde cetre infinit. ln acest caz inhibitorul nu se atageazdde complexul ESformat. Suntem in cazul inhibifiei competitiue.

60Factorul este unitar atunci cdnd K1-+ B, adicd atunci c6.ndenzima are afinitate nuli fati de inhibitor

Elementede biochimie .1.

304

E+P

eTJJ:i"" Fig.4.114.Schema de principiu a inhibisiei competitlue

2. K1gi K'1au valoare egald. Suntem in cazul inhibiliei necompetitive 3. K1 tinde cdtre infinit. Acestd situafie este cunoscutA ca inhibifie anti-competitivd. Mecanismul de inhibifie presupune legareainifiald a substratului (enzima purd nu are nici o afinitate fafd de inhibitor (Krtinde cdtre infinit). Dupd ce s-a format complexul enzimd substrat inhibitorul se ata$eazede enzimi, impiedicdnd actul cata-

litic. Acestcazestecunoscutca liipi#Jpe,snl.t:"VimtiefffiUa. ln ecuatia [4.49], ca reprezentare LINEWEAVER-BURK,termenul Cr / Kr -+ 0, iar factorul I +

C' Kj

uu afectapanta dreptei ecuafiei [4.49]terme-

nul liber, avdnd aceeagivaloare ca gi tn modelul fare inhibifie (ecuatia 14.241. Reprezentareagraficd a modelului neinhibat gi a inhibifiei anticompetitive relevi paralelismul dreptelor LINE\MEAVERBURK (Fig.4.115.). De cele mai multe ori in practicd se intdlnesc modele intermediare intre A, B pi C caracterizateprin valori finite ale constantelorK1qi K'1. Gradul de apropiere cu unul sau cu altul dintre modele se poate releva din reprezent5.rileLineweaver - Burk. Inhibilia prin produs gi prin substrat Aga dupd cum s-a enunfat, orice substanfdcapabili sd interacfioneze cu o enzimd, reducdndu-i viteza de reactie esteun inhibitor.

Enzime . Notiuni de cineticd enzimafiart

305

(cuinhibitor) (fdr6inhibitor

1

-.->

V 'ma x

II 1 K'M

1

t

Cs

1 Ky

Fig.4.115,Schema de principiu a lnhibiltei anticompetltlue

4. 7.2.7.3. Inhibilia prin produs Cinetica michaeliani este studiat5.prin mdsurarea vitezei inifiale. Aceastdmodalitate exclude produsul de la o eventuald interacfiune cu enzima. Dar, produsul poate avea aceastdabilitate. IJn astfel de sistem poate fi studiat prin introducerea in mediul de reaclie a unei anume cantitifi de produs. Viteza globald a reacfiei enzimatice (de formare a produsului) esteegaldcu diferen{a reac{iei directe (de formare a produsului cu Vmax s gi Kr,as)gi a reacfiei inverse (de consum a produsului cu Vmax p Si K1ai,):

Vrr*, 'C, V_

Vrr-s 'Cp

o*('.*) +cs o*[,*ft) *c,

14.521

dacd reaclia inversdpoate fi neglijabild,vn* s -) 0, atunci rdm0ne doar primul termencareareforma clasicda inhibiliei competitive. 4.7.2.7.4. Inhibifu prin substrat De multe ori, la utilizareaconcentraliilorridicate de substratse constatdo scdderea vitezei de reaclie detectabil5vizibil pe o reprezentare - BURK(Fig.4.116) de tip LINEWEAVER

306

Elementede biochimie,I,

Aceastd scidere poate avea mai multe explicafii. Doui dintre ele, cele mai plauzibile sunt urm[toarele: 1

domeniu de -6h-onl-r:{-

i o

mare de substirat.

Fig. 4.116. Comportannentul enzimatic ffimeniile

de corrcentrasi.e ridlcatd de

1. odatd cu concentratia de substrat, cre$teconcentrafia impuritdlilor pe care acestale confine. 2. la concentralii mari, substratul este forfat sa se plasezestabil in pozi{ii neproductive, impiedicdnd accesulaltor molecule de substrat la situsul activ. 4. 7.2.7.5. Inhibifu

reversibild./ ireversibild

Inhibilia, ca proces poate fi reversibild sau ireversibild.Inhibitia reversibild presupune atagarea inhibitorului prin interacfiuni necovalente, care pot fi desfdcute. Inhibitorul poate fi indepdrtat, de reguld prin procese difuzive, dializa fiind cel mai comun. Cu c6.tconcentrafia de inhibitor este mai scdzutd,indiferent de mecanismul prin care acesta acfioneazd,efectul asupravitezei de reaclie estemai mic (ecuafiile4.39; 4.509i 4.s2). Spre deosebirede inhibifia reversibili, cea ireversibild presupune o ata$arecovalentd,puternicd a inhibitorului. Acestanu mai poate fi desprins de pe enzimd sau complexul enzimd substrat,de aceeaefectul introdus are caracterpermanent.

Enzime. Nofiuni decineticaenzim.atica

4.7.3. Reglarea activitifii enzimatice Funcfionarea celulei, lesutului sau a organismului presupune un complex de activitf,tri metabolice prin care se produc ai se degradeazl. substanfe, in raporturi cantitative gi de succesiune foarte bine reglate. ln acest context, rolul biocatalitic exercitat de enzime este crucial gi exercitareaacestuiaeste supusdunui proces de reglarepe cdt de complex, pe atdt de eficient. Reglareaactivitefii enzimatice se face la doud nivele: I. reglarea concentraliei locale a eraimelnr, realizatd prin: t mecanisme care intervin in exprimarea genelor corespunzdtoare (la nivel transcriplional sau Ia nivel translafional), t mecanismede degradareale enzimelor I mecanisme de transport al enzimelor de la locul sintezei pini la locul exercitdrii acliunii. Mecanismele concrete ale acestui tip de reglarevor fi detaliate la capitolul reglareaexprimdrii geneticerespectivla sintezaproteinelor. 2. reglarea efectivd,a funcfiondrii (activitd,fii) enzimei. Enzima existenti va cataliza transformarea substratului in produs. Yiteza procesului este dependenti de o serie de factori, asupra cdrora organismul acfioneazd.Concentrafia speciilor reactantereprezintd modalitatea ,,banald" a regldrii activitdlii enzimatice. Reacfia se va deplasa in sensul dictat de abaterea concentrafiilor efective de la valorile de echilibru. O alte modalitate de reglare, caracteristicd enzimelor cu afinitate micd pentru substrat este legatd de concentrafia substratului. Atunci c6.ndconcentrafia substrahrlui se situeazd mult sub valoarea lui Kvr (vezi ecuafia Michaelis - Menten), viteza de reacgieeste liniar dependentd,de concentrafia de substrat. In cazurile in care concentrafia substratului depigegte valoarea lui Kr,a,efectul modificarii concentrafiei se exercitddoar asupra echilibrului (reacfiafiind de ordinul zero. pH-ul constituie un mijloc auxiliar de reglare, avhndu-se in vedere ci fiecare enzimi igi are propria plaji ori chiar valoare optimd a pH-ului. ln ceiuld existdinsfl mecanisme care asigurd homeostazia pH-ului, care limiteazd drastic intervengia pH-ului ca mijloc de reglare. Pentru arealiza func1ia reglatorie, celula dispune de alternative mai sofisticate care se aplicl unui numdr redus de enzime din mul;imea celor existente la un moment dat. Aceste enzime reglabile posedd particularitifi structurale, care le conferd o complexitate sporiti fafd de celelalte enzime. Mecanismele efective prin care are loc reglarea sau modularea activitdlii enzimatice sunt in principal de doud tipuri: L) mod.ificdri coualente

308

Elementede biochimie .I,

realizate prin ata;area unor fragmente sau clivarea unor legituri gi 2) modificdri necovalente, realizate prin intervenfia unor substan{e strdine (efectori)care se pot ata$afie la situsul catalitic (inhibitori competitivi), fie la un situs distinct numit situs alosteric.Prin acestemodificdri se modificd fie afinitatea enzimei pentru substratul propriu (Km), fie viteza maximd a procesului v**. 4.7.3.1.Reglarea activitdfii enzimelor prin modificd.ri covalente Modiflcirile covalente comutd de reguld enzima dintr-o stare inactivd intr-o stare activd. Aceste modificdri constau in formarea sau desfacereaunor legdturi covalente.Procesulpoate fi ireversibil sau reversibil. Modificdrile covalente ireversibile sunt caracteristice enzimelor care sunt produse in forrn6. inactivd. Aceste forme inactive reprezintd o rezewd imediat disponibild de enzimd qi uneori structuri rezistente la agresivitateamediului in care sunt sintetizate.Odatd ajunse Ia locul acfiunii, sunt activate prin desfacereaunor legituri covalente.O altd categorie de enzime activabile prin clivaj proteolitic ireversibil, sunt cele care trebuie sd participe la acliuni rapide al ciror moment de producere este aleatoriu. Este cazul enzineelorcare participd la cascadade reacfii caracteristicdprocesului de coagulare sangvind.In cazul aparifiei hemoragiilor, intervenfia trebuie sf, fie rapidd, neexistdndtimpul necesar sintezei echipamentului enzimatic necesar.Acesta existdsub formd latent6, inactivi, care, printr-o modificare covalentd,hidroliticd.se va activa diminuAnd astfeltimpul de rdspuns. 4.7.3.1.1.Hid.roli.za paryiald, ireuersibild a enzimelor ca modalitate de reglare Multe dintre enzime sunt sintetizate gi secretate sub formd inactivi numitd proenzimd sau zimogen. Prin excizia (cu ajutorul unei enzime proteolitice) a unei porliuni din catena peptidicd a proenzimei rezultd enzima acdve. Exemple de enzime astfel reglabile (activabile) le intdlnim prinue enzimele digestive precum: chimotripsina, tripsina, pepsina, carboxipeptidazeleA 9i B, fosfolipazele,printre enzimele (factorii) implicate in coagularea s0ngelui (vezi vitamina K) ori printre enzimele implicate in dezvoltarea pro gramati (colagenaza,chitinsinte taza etc.). Prin excizia unui fragment N-terminal din zimogen, se modificd intreaga structure spaliaH (tntreagatopologie) a situsului catalitic, acesta din urmi devenind apt pentru procesul catalitic.

Enzime. No{iuni de cineticd ewimaticd,

309

Fr.n l/\ \? His40 M

o

ct-l

n.Y-, n

(o

Aspl94

o

^-t

tripsind --------->

o

Aspl94

/

Ser1e5

t\}|

uo

o

lle16 l\F|

"rr-rffi

o

|\V*%,,'n' ' Chimotripsind

Fig.4.117.Modificarea conformafionald consecutiudcliuajului proteolitic care dtrce la formarea sitn sului catalitic la chimotripsind

Exemplificdnd pe transformarea chimotripsinogen + chimotripsind realizatd sub influenfa tripsinei, in molecula de chimotripsinogen, se remarcd existenfatriadei catalitice (vezi serinproteazele) Asp I02, His 57 gi Ser 195.Aceastdtriadi esteincd nefuncfionalS.datoritd faptului cd topologia definitd.inifial este improprie interacfiunii cu substratul. Prin clivare proteoliticd cei trei componenfi ajung intr-o topologie apta de actul catalitic. Modificirea conforma(ionali care activeazdchimotripsinogenul este schimbarea restului His40 ca partener stabilizant al Asp194cu gruparea amoniu din Ilel6 a fragmentului clivat. (Ftg.4.11V. De asemeneaprin clivajul proteolitic, se modificd pozitia Gly 194, care inifial impiedicd atit fixarea substratului, cdt gi ac{iunea catalitice asupra acestuia.Un proces similar apiue gi la activareatripsinogenului. Formarea zimazei (enzimei active) prin excizia unui fragment din zimogen esteun proces ireversibil. Odatd activatd enzima, activitatea sa nu va scddeadecdt prin digestie,inhibilie sau prin dilulie. Astfel de mecanisme de activare se intdlnesc Ai in cazul hormonilor peptidici precum insulina ori angiotensina, care sunt secretafi inifial sub formd inactivd de prohormoni. Ei vor fl activafi prin excizieproteolitici.

310

Elementede biochimie .L.

4,7.3,1.2,Reglareaactiuitdfii eraimelor prin modifrcd.ricovalentereuersibile I. Reglareaenzimelorprin fosforilare-defosforilare ATP \,/

ADP proteinkinaza

,/\ Enz_OPO3z'

Enz_OF

\ , / \.

foslalaza

,/\ /\ {\ Pi

,/

HrO

Fig. 4. l 18. Fosforilarea-defosforilarea enaimaticd

Prin introducerea unui rest fosfat in molecula unei proteine, apar doud sarcini negative care prin interacfiune cu resturile de aminoacizi vor produce o modificare conformafionald care se transmite situsului catalitic. Spre deosebirede clivareaproteoliticd, reglareaprin fosforilare este reversibild. Fosforilarea (transferul de rest fosfat pe o grupare oH aparfindnd unui rest serinic, treoninic sau tirozinic) este realizatd de cdtre o proteinkinazd, donorul fiind de regul[ ATP-ul. (Fig.4.t1\.). Reacfia inversd,catalizatd de o fosfatazd hidrolizeazd.legdtura fosfoestericd pundnd in libertate fosfatul anorganic. Comutarea enzimei de la forma fosforilat[ la cea defosforilatagi invers,se face sub influenfa unor semnaleextracelulareprecum hormonii sau factorii de cregtere.Adrenalina, de exemplu activeazdprin intermediul cAMP (acidul adenilic ciclic, vezi nucleotide) o proteinkinazd. care fosforileazi o fosforilazkinazd,(o noud proteinkinazi), aceastala ldndul sau fosforildnd fosforrlaza,enzima care elibereazdglucoza din glicogen, Prin fosforilare sunt reglate o serie de enzime intdlnite in metabolismul glucidic: glicogenfosforilaza, fosforilazkirrArtr glicogensintaza, fosfofructokinaza-Z, piruvatkinaza gi piruvat dehidrogenaza (vezi glicoliza respectiv gluconeogeneza) (vezi Vol II), in metabolismul lipidic: hidroximetilglutaril-coA reductaza, acetil-CoA carboxilazaqi triacilglicerol lipaza, in metabolismul aminoacizilor: cetoacid ramificat dehidrogenaza,fenilalanil hidroxilaza,tirozin hidroxilaza etc.

Enzime. NoSiuni de cineticd enaimaticd

311

II. Reglarea activitilii enzimatice prin adenililarea - deadenililare Prin atagarea fosfoesterici a restului adenilil (voluminos, incdrcat negativ) de un rest de tirozind aflat in vecindtatea situsului catalitic, se blocheazi funcfia cataliticA ce poate fi exercitati de glutaminsintetaza, o enzime cheie din metabolismul amoniacului din Escherichiacoli.Rolul acestei enzime este de a atagape un rest de glutamat amoniacul existent in mediu. Procesul de adenilare este reaiizat de o adenililtransferazd,la depdgireaunui prag critic al raportului concentrafiilor glutamind - glutamat, respectivcarbamilfosfat,glucozamino-6fosfat, triptofan, aianind, glicocol, histidind, citidintrifosfat, respectiv AMP (vezi Cap. 5 nucleotidele). Tofi ace$ticompugi reprezintd pentru enzimfl indicatori cd rezervelede amoniac sunt suficiente, ca urmare nu mai este necesard acumularea acestui produs. La r6.ndul si.u, adenililtransferazaeste activati prin deuridinilare, adicd prin detagarea unui rest de acid uridilic, proces declangatde concentrafii crescute ale glutaminei. Procesul invers, de dezactivareeste declangat de concentralii scdzuteale aceluiagimetabolit. III. Formarea gi desfacereapunfilor disulfurice Este o alta modalitate prin care se poate modifica structura enzimei, gi in consecin{dse poate interveni asupramecanismului sdu de acfiune. Aceastdmodalitate este utilizatd de plante frind intdlnitd la unele enzime care degradeazdglucidele.Reducereapuntilor disulfurice se face pe seama oxiddrii unor grupiri tiolice din structura unei proteine de masi. mic5, tioredoxina.La rdndul sdu tioredoxinaesteredusd de reacfii redox dependentede lumind, reacfii care comuti metabolismul glucidic de la oxidare (catabolism)la reducere (anabolism). 4.7.3.2.Reglarea actiuitdlii enzimelor prin modificdri necoualente; Alosteria O modalitate mai subtili de reglare a activitefii enzimatice este alosterismul.Termenul de alosterie(ailos= altul, diferit; steros= spafiu, loc) desemrreazd., modificdri care apar in conformafia gi legat de aceasta, ln activitatea unei enzime, datoritd legarii unui compus intr-un loc distinct de situsul catalitic. Enzimele care posedi aceasti proprietate dispun de o modalitate suplimentari de reglare a reacfiei catalizate. Compusul care se leagi de situsul alosteric poarti numele de efector sau modulator gi in funclie de acfiunea concreti asupra vitezei de reacfie sau afinit[1ii enzimei fald de substrat, modulatorul poate fi activator sau inhibitor.

3tz

Elementede biochimie .1,

studiile efectuate asupra unui numdr mare de enzime alosterice a relevat c[ acesteaposedd o serie de caracteristicidefinitorii: t structurAcuaternare. i au comport:ue nemichaeliand, curbele cinetice v/[S], avdnd o alurd sigmoidald.Dac5.lao enzimd michaelianf,,cei doi parametri Ky gi vmaj{ sunt constanfi, ia enzimele alosterice,acegtiparametri pot fi variabili. Dupa parametrul care suferd modificdri, distingem enzime de tip K la care se modificd numai afinitatea fald de substratul activ, gi enzime de tip V, la care se modificd doar itezade reacfie. r modificirile conformafionale induse de efectorul alosteric sunt temporare gi doar de ordin cantitativ. t au funcfie de reglare in metabolism, fiind prezente pe cdile biosintetice principale. Interacfiunea dintre situsul catalitic ai situsul alosteric 9i de asemenea intre situsurile catalitice ale aceleiagienzime, este denumiti prin analogiecu comportamentul hemoglobinei, dar prin extensie,(deoarece in cazul enzimelor efectorul este diferit de substrat),efect de cooperativitate, sau de cooperare. ,'{ !.:,,A

ooc fH,

\o""rt\

^_-I,-\ I

oA",,A.o,

H"N

1 1(" '\:,/ cadcam iF

OH

aspadat

cabam

ilaspartat

f)sht

Fig. 4.1 19.Reacfia. catali.mtd dc aspartnt tra.nscarbamilazd

Un exemplu clasic, bine studiat de enzimi alostericd este aspartat transcabamilazadin Escherichiacoli (8.C,2.1.3.2)Fig. .119.Aceastase gdsegtein ciclul ureogenetic (vezi in volumul II) gi catalizeazi. prima reacfie dintr-un lan! care conduce la biosinteza nucleotidelor pirimidinice: Daci se variazd.concentralia de aspartat in mediu, menfindnd constanli ceilalli parametri, curba cineticd va avea un aspect sigmoidal. Curba din Frg.4.120.,rede comportarea enzimei in absenfaefectorilor. Studiile s-au fdcut in prezenfa unor substanfe diferite. CTP-ul este un inhibitor tipic. ln schimb AMP sau ATP sunt activatori. Tratdndu-se enzima cu 4-cloromercuribertzoat,un reactiv al grupdrilor tiolice, se constati cd enzima devine michaeliand, pierzdndu-qi sensibilitateala

Enzime. Notiuni de cinetica enzimaticd

313

activatorii susmenlionafi, dovada cd situsul aiosteric posedd in acest caz un rest de cisteini., in timp ce situsul catalitic nu. Enzima cu situsul alostericblocat se numegte enzimi desensibilizatd. Vrax

enzirE desensibilizata

enarncu

- 'inhibitor (CTP)

enzirrq f&A efector

\

enzirnacuacti\,"tor

oroo*,, o)X"

efector ilor alo"sterici

n i absenta "" sas

Se constati deci cd activitatea enzimei native este modulatd de efectori,in func{ie de necesarulcelular.Activitatea enzimei desensibilizate,in acestcaz cre$te,dar, reglareaeste realizatl.doar prin mecanismele termodinamice gi cinetice ,,normale" (concentragialocali de substrat gi de produs de reacfie direct, temperaturi, pH etc). Subunltrie ---.- otrlitica

-{nitata dc Eglaro

- - unihle c.trllticl

Conforma[ieR (activA) - inhibitornelegat-

ConformalieT (inactiv6) - inhibitorlegat-

Fig. 4,121. Celedoud conforrnasii ale aspartai transcarbamila.z.ei

Studii complexe, biochimice qi de difraclie de raze X, au stabilit ci aceasteenzimd esteformatd din 12 unitdfi proteice. $asedintre acestea sunt catalitice gi sunt organizatein doui subunitlfi plasate fa{i in fa{i, flecare dintre acesteaconfindnd trei unitd;i, fi.ecarecapabile sd lege cele doud substraturi (aspartatul Ei carbamilfosfatul). Celelalte gase unitdli sunt organizate in trei subunitili reglatorii, plasate ca pun{i intre subunitdfile catalitice. (Fig. aJ2l. Subunitdfile reglatorii au posibilitatea

3L4

Elementede biochimie .I.

sd lege efectorii.Aceasti enzime prezintd doar douf, stdri termodinamic stabile: o stare tensionatd (T de la ,,tense")-inactivdcatalitic gi o stare relaxatd (R- de la ,,relaxed") capabild. de actul catalitic. Legarea substraturilor pe situsurile catalitice, aduce molecula in conformafia R, din care moleculele de inhibitor (CTp) disociazd.Din contrd, legarea inhibitorului aduce molecula in conformafia T, cdnd moleculele de substrat disociazi de pe subunitd{ile catalitice. competilia inhibitor substrat estereglatd de concentraliile celor doud tipuri de specii. Aparenla enzimei, aga cum rezultd din analizele de raze X permite eviden{iereaunui model mecanic simiiar. 4.7.3.2.1Efectecooperatiue Ia enzimele alosterice Enzimele alostericepot posedaunul sau mai multe situsuri de legare ale substraturilor ;i unul sau mai multe situsuri de legareale efectorilor. ln cazul in care la atagareaunei molecule de ligand pe un situs multiplu modifici afinitatea celorlalte situsuri pentru ligand se vorbegtede un efect cooperativ. Acest efect cooperativ se numegte homotrop dac6, se referd la acelagitip de situs. Dacd efectul de cooperativitateimplicd situsuri diferite (catalitic ai alosteric),implicit liganzi diferifi, se vorbe$te de un efectheterotrop. Cooperativitateareprezintd o modalitate suplimentari de modulare a afinitafii atagarii unui ligand in func1ie de gradul de ocupare al situsurilor la care acestapoate fi atagat.Hemoglobina este unul dintre primele exemple investigate, dar pe lAngd aceasta,o serie de proteine manifestd cooperativitatein ata$areadiferililor liganzi. Astfel de proteine indeplinesc funcfii de enzime, receptori sau proteine de reglare(represorul transcrierii operonului lac). Termenul de alosterie utilizat in specialla enzime, poate fi folosit gi pentru a desemnao proteind aptd sd atagezeliganzi in mai multe situsuri. Modele cooperative Pentru a se putea explora comportamentul cooperativ al proteinelor s-au elaborat modele func{ionale bazate pe premise simplificatorii. Dintre modelele elaborate se disting doui: modelul concertat al lui MONOD, \A/YldAN, gi CFIANGELIX gi modelul secvenfial al lui KOSHI-AND,NEMETHY gi FILME Modelul MONOD, WYMAN, 9i CIIANGEUX (MWC) In 1965 Iacques MONOD, Ieffries \AIY-N{ANgi Jean - Pierre CHANGEUXau elaborat un model simplu al comportamentului alosteric, bazdndu-sepe cdtevaipoteze simplificatoare:

Enzime . Notiuni d,ecineticd enzimatica

3L5

o Proteinelealostericesunt oligomeri. r Proteina alosterici poate exista in doud conformalii alternative: una tensionatd (T), cu afinitate reduse sau nulf, fali de substrat gi una relaxati (R) cu afinitate ridicatd pentru substrat. Cele doui structuri prezintf, diferenfe la nivelul tuturor subunitifilor monomere. De aceea trecereade la structurd la alta, presupune basculareaconformafionaie a tuturor substructurilor, nefi.ind permise stdrile cu conformafii diferite (R) gi G) ale monomerilor.or Intre cele doud structuri se stabilegteun echilibru. Aceste structuri difera prin numdrul de legdturi care se stabilesc intre subunitd.fi.Bariera energetici dintre cele doud structuri este redusd pentru a putea fi compensati de energia eliberatd ca urmare a atagdrii liganzilor. Afinitatea interacliunii proteind substrat poate fi cuantificatd prin intermediul constantelor globale de disociere ale ligandului de pe forma R respectiv forma T, adicd Kq gi K1: R+ nLcuKp= [R].[L]"/ [RL"] RL / tTt l T+nLcuKr= [T].[L]n TL'I Toate situsurile de legare sunt echivalente gi in consecinfd vor avea aceeagiafinitate pentru ligand. In conformitate cu acestmodel, proteina poate atagaligandul in ambele forme R sau T. Evident probabilitatea atagdrii de forma R este mai mare. Odatd cu ata$arealiganzilor forma R se consumd, prin urmare echilibrul T R, (caracterizat prin constanta alostericd iniliald, relevatd in absenla ligandului [o = [To] / tF"gl)se deplaseazd.cdtre forma R, cu afinitate mai mare pentru ligand. Prin urmare contanta alostericd.se va reduce.Valoarea constantei alostericeL = [Ti] / lRil, la atagareacelui de-al i-lea ligand din n posibili este datd de: L =ci ' Lo,unde c este raportul constantelor de disociere: Kn / Kr = c. Evident valoarea sa va fi subunitard. Exemplificdnd pe hemoglobinS.,vom aveaurmdtoareledate: numdrul situsurilor de legare: n = 4 Lo= 9000gi c = 0,014 ln aceste condifii, constanta alostericd, raportul L, va avea valorile 9000,in condifii inifiale gi 126; 1,76;0,025gi 0,00035odatd cu legareaa 6r Datoritd trecerii simultane a subunitdlilor din conformalia T in R modelul MWC mai este cunoscut gi sub numele de modelul concertat sau modelul de tip ,,totul sau nimic". Dac{ de exemplu o proteind. este trimericd., fiecare subunitate poate exista in conformaliile R sau T. Conform modelului MWC, intreaga proteind va putea exista ln conformalia T (TTT) sau R (RRR),nefiind permise structuri hibride de tipul TRT, TTR etc.

Elementede biochimie .1.

3L6

l; 2;3 si respectiv patru molecule de oxigen per molecula de hemoglobina. Se observ5 cd odati cu scedereavalorilor constantei alosterice cre$te con{inutul in forma R care are afintate mai mare pentru hemoglobind, aceastacrescdndodati cu atagareamoleculelor de oxigen. 4.7.3.2.2.Influenla efectorilor alasteri.ciasupra enzimelar Aga dupd cum s-a ardtat enzimele alostericesunt influenfate de ac!iunea indirecti a efectorilor alosterici asupra situsului activ. Acesta este un exemplu tipic de interacfiune heterotropi sau heteroalostericd.Modelul MWC explicd acest tip de acpune prin stabilizareauneia dintre cele doud forme: R in cazul efectorilor alosterici pozitivi gi T in cazul efectorilor alosterici negativi. ln acest mod se modificd echilibrul T >... R, implicit constanta alosterici L. ln cazuri extreme un efector (activator in acest exemplu) poate deplasa echilibrul astfel incdt forma R sd fie majoritard iar forma T sd fie neglijabild. Daci existd un singur situs catalitic, cooperativitatea este abolitd, enzima dobdndind o comportare michaeliand,afinitatea fafi de substrat inregistrdnd cregteri importante. (Fig.4.122.). Este cazul piruvatkinazei, o enzimi intilnitd in catabolismul glucidic (vezi volumul II), care transformd fosfoenolpiruvatul in piruvat. Aceast[ enzimd este aiostericd,dar care dobdndegteo comportare michaeliani in prezenta esterului fructozo-2,6-difosfat care acfioneazd.ca activator. De asemeneaizocitrat dehidrogenAza,o enzimi intalnitd in ciclul acizilor tricarboxilici (vezivolumul II) esteactivatdpdnd la abolirea cooperativitafii de cdtreAMP (acidul adenilic, vezi nucleotidele). 6-difosloric cu esterfructozo-2.

0,2 fosfoenolpiruvat ImM] piruvaEkinaza

0,4

0,6 izocitrat[mM

izocitrat dehi drogen aza

Fig. 4.122, Efectul efecnrilor alosterici esupra unor enzime

Enzime , Nopiuni de cineticd enzi,maticd

317

4.7.3.2.3.Comportamentul de tip K Siu. Modelul MWC explicd cele doud cazuri de comportament ale enzimelor alosterice sub influenla efectorilor. Modificarea afinitdlii enzimei fafi de substrat, sub influenfa efectorului, intervine in cazul enzimelor de tip K. Efectorul ac$oneazi printr-un efect heterotrop. El influenfeazd afinitatea ataqdrii ligandului stabilizdnd una dintre stirile T sau R. Ambele stdri vor avea aceeagivaloare pentru k""r deci vor conduce la aceeagivaloareavitezei maxime de reactie. ln cazul enzimelor de tip v, substratul are aceeagi afinitate pentru ambele stdri. Cele doud stdri insd diferd prin valoareaparametrului v.*. In schimb efectorul se leagi preferenfial de o anumitd stare pe care o stabilizeazd,modificdnd valoarea constantei alosterice.In acestecondi;ii efectorul nu poate modifica afinitatea pentu substrat ci va influenfa doar viteza de reacfie prin preferinla pe care enzima o poate aveafaf6 de una din cele doud forme. M odelul secuen[ialal lui KOSHIAND, NEMETI{Y ;i FIRMER $i acest model presupune existenia celor doud forme pentru subunitifile ciue atageazdcooperativ ligandul R Ei T. Spre deosebirede modelul MWC, care admitea pentru proteina multimericd exclusiv doui stiri, modelul KNF admite cd pe mdsura legdrii are loc trecereasuccesivi a subunitdfilor de la conformafia T la R, cea cu afinitate mai mare pentru ligand. Caracterul succesiv al trecerii subuniti;ilor agregatului multimeric din forma T in R a dat numele alternativ al modelului - modelul secvenfial.ln acest model deci, se admite existenfa formelor hibride. Ipotezelemodelului sunt: inifial proteina se gdsegtein stareaT, unicd. Pe mdsurd ce are loc atagarealiganzilor, subunitatea care a legat ligandul, va induce o modificare conforma;ionali in subunitatea sau subunitdlile adiacente,care vor trece in stareaR de afinitate mai mare. Aceastdteorie explicd la rdndul ei cregtereaafinitdfii proteinei in urma atagdrii ligandului (cooperativitatepozitivd). Acest model este mai plauzibil, decdt modelul concertat deoarece presupune modificdri conformalionale treptate, reduse ca intensitate la nivelul agregatului multimeric, spre deosebirede tranzilia comutativi intre stS,rileglobale R gi T. Modelul KNF conline ideea ajustdrii induse, enun(atd prima datd de cdtre KOSHI"qND, o teorie care vine in contradiclie cu cea a aiustdrii complementare rigide, intre proteini gi ligand ln general, intre enzimd gi substratul sdu in particular.

318

Elementede biochimie .1.

4.7.3.2,4.Cuantift carea cooperativitdlii Efectul de cooperativitate a fost intens studiat pe hemoglobini (vezi cap. 3). De o manieri similari, efectul poate fi cuantificat printr-o ecuafie derivatd de la formalizarea gradului de saturare al enzimei (proteinei) cu ligand (substrat sau efectori). Folosind ca ipotezi modelul simetric sau concertat al lui MONOD, \ mvIAN gi CFIANGEUX (vezi hemoglobina), se presupune o enzimd cu n situsuri de Iegare pentru substrat: E + nS ES.,cu constantade echilibru:

6 = [E]' [S]' [ES^]

t4.531

Definindgradulde saturareY: Y = t=S+,' respectivgrad,uld,enesaturare1 - Y = l Eo l

IE], IEJ

14.541

prin eliminarea lui [E], intre gradul de nesaturaregi constanta de disocierese obfine expresia:

1_ Y _

K.[ES"] lsl".[Eo]

t4.551

sau prin inlocuirea expresieigradului de saturarerezulti

Y 1_Y

:-

lsl" K,

t4.s6l

expresiecare poate fi liniarizatd prin logaritmare:

-lnK InltY.rl=n.ln[S] _YJ L1

14.571

Ecuafiile de mai sus sunt vaiabile pentru toate tipurile de comportamente alosterice(receptori,proteine de reglare,enzime). Pentru a particulariza strict la enzime ecuafia saturdrii proteinei, gradul de saturareY se poate inlocui cu viteza de reaclie.Evident gradul maxim de saturare (unitar), igi va avea corespondentul in viteza de reactie maximd:

v _ [s]" , saualtfelscris:v = 5* . [sJ" V.",-V K K+[S]"

t4.5Bl

ln coordonatemichaeliene(v = f(lSl)), varialialui vin func{iede variafiaconcentrafieisubstratuluil'a aveao alurdsigmoiddn.

5. Acizinucleici CAPITOLUL 5.1.Introducere Sunt compugi intracelulari cu o incdrcdturd informafionald extraordinard. De reguld, se gisesc in asocialii cu substan{eproteice, formdnd nucleoproteidele.Componentele neproteice, acizii nucleici, sunt compugi macromoleculari care provin din policondensarea nucleotidelor. Existd dou[ tipuri majore de acizi nucleici: acizii deoxiribonucleici (ADN) 9i acizii ribonucleici (ARN). Dintre acegtia,ADN detine informalia necesarabiosintezei tuturor biomacromoleculelor fabricate de un anume organism. Fiecareceluld a unui organism confine tntreaga informafie necesard indeplinirii tuturor funcfiilor organismului. Aceastd informalie se gd'segteinscrisd in ADN-ul nuclear numit genom,intocmai cum memoria unui calculator confine intreaga informa{ie destinatdbunei sale funcfiondri. Prin diviziune, oul fecundat, care reprezintd o singurd celuld, igi va multiplica informalia genetici. Aceasta se va regf,si, pe mdsura cregterii gi dezvoltdrii, in multitudinea de celule nou apdrute. Prin diferenfierea celularS.,care apare pe treptele superioareale dezvoltdrii speciilor, Ele vor folosi doar pdrfi din intreaga informacelulele se specializeazS,. lie stocate.Intre indivizii aceleiagispecii informalia geneticd diferd pufin, aceste diferenfe manifestO.ndu-sepe planul insugirilor fizice dar gi comportamentale. Informafia genetici se gdseqtesub forma unui mesaj genetic,inscrisi prin intermediul unui alfabet format din patru litere, constituit din nucleotidele care formeazdADN-ul nuclear. Succesiuneaacestoradetermind individuaiitatea fiecdrui organism. Genomul uman este format din aproximativ 3 miliarde de perechi de nucleotide ceea ce daci ar fi inscrise pe pagini a 3000 de caractere ar incipea pe 1000 de volume a 1000de pagini. Genomul este organizat pe mai multe subuniti{i, genele,care funcfioneaz6.coordonat. Transmiterea informafiei, de la ADN gi pdnd la catena polipeptidica care se sintetizeazi, se realizeazd prin intermediul acizilor ribonucleici (ARN), care sunt de mai multe tipuri, fiecare cu un rol bine determinat.

Elementede biochimie .1,

320

5.2.Constituen{ii acizilor nucleici Acizii nucleici sunt produgi de policondensare ai nucleotidelor. Nucleotidele,la rdndul lor, sunt substanle care con{in trei tipuri de molecule legatecovalent: obazd,az;otatd,, o pentozd gi acid fosforic. Bazeleazotatedin constitufia acizilor nucleici sunt in numdr de cinci (cele mai frecvent intdlnite) gi dupd structura heterociclici proprie pot fi sistematizatein baze purinice qi baze pirimidinice.

o

7

sl l

'lr^)i-*o zl.

Hrrl

ll

/8

T4Uil

Guanina (2-amino-6-oxipurina)

Adenina (6-aminopurina)

Fig.S. 1. Bazc purinice (R): adenina (A) Slguanina (G)

Bazelepurinice (R), (F9t5.1.) sunt derivafi ai purinei: adenina (A) (6aminopurina) $i guanina (G) (2- amino-6-oxipurina)

o It

'i*\' til o4*

)u

1

Uracil (2,4-dioxipirimidina)

o tl

NHz

,r*,\./cH' 'i' |il

rl

o4Nu/ Timina (5-metil-2,4-dioxipirimidina)

t-

N^l

ttl

o4Nu/ Cltozina (4-amino-2-oxipirimidina

Fig.5.2. Baze pirimid,inice (Y: uracil (I), timina (T) ,i citoztrn(C)

Bazele pirimidinice 00, @ig.5.2.) sunt derivati ai pirimidinei: uracilul (U)-2,4-dioxipirimidina, timina [T)-5-metii-2,4-dioxipirimidina gi citozina (C)-4 - amino-2 -oxipirimidina Timina se gdsegte doar in structura ADN, iar uracilul numai in structura ARN. Celelalte baze azotate se gdsescin ambele tipuri de actzi nucleici.

Acizinucleici. Constituenfiiacizilornucleici

32r 5

HO- CHI

OH

^

HO-CH,

OH

^

-.,L2"\., \

l-2"\,, 4'

,/'

\r,*-.-t2 ./

g,t-CH, 2'| OH p-D.2'4eoxlrlboza

tl

OH OH g-D-rlboza

Fig, 5.3. Pentozele acizilor nucleici

Pentozelesunt de doud tipuri: D-riboza gi D-2'-deoxiriboza (F1g.5.3.). BazeLeazotate se leaga N-glicozidic de aceste pentoze formAnd nucleoztdele.Bazele pirimidinice se leage prin intermediul atomului de azot 1, iar cele purinice prin atomul Ne.Pentru evitareaconfuziilor legate de numerotarea atomilor de carbon, in cazul pentozei acegtiase .,o-3r, - -L2"\-r(1saue) ^ \ui .

N-+ k

d,

( ,=H- deoxinucteozide \ HO-nucleozide \ /

Fig. 5.4. Structura de principiu

a unei rurcIeozide

noteitzdcu numere prime (')(Fi9.5.4.).Numele nucleozidelor se formeazi din rdddcina numelui bazei azotate la care se adaugi sufixul idina pentm cele pirimidinice respectiv ozina pentm cele purinice. Deoxiribonucleozideleprimesc sufixul deoxi (Tab.5.1.) Tab.5,1. Formarea numelui nucleozidelor Bazaazotati

Uracil Timina Citozina

Deoxltimidina Deoxicilidina

Adenina Guanina

Deoxiadenozna Deoxiguanozina

oI o--9-o-cH2

)Tf*,n,

o4'

1'

3'

dt

I

( *= r- deoxinucteotide \ HOnucleotide \ )

Fig.5. 5. Structura de princlpiu a unei nucl.eotide

322

Elementedc biochimie,l,

N

N

) N

Q+p-g

OH

I

I

oAden ozin mo n ofosfatul cicIi c (cAMP) I:ig.s.6. Acidul fosforic, se leagd fosfoesteric de hidroxilul 5' rezultdnd in acestmod nucleotidels,monomerii sau elementele debazd,(cardmizile) ale acizilor nucleici. (Fig. 5.5.). Prezenfa acidului fosforic, conferi caracterul acid atdt nucleotidelor cit gi catenelor polinucleotidice. Policondensarea nucleotidelor se face prin intermediul acidului fosforic, care stabilefte o noui legdturi fosfoestericdcu hidroxilul de la C3' al altei nucleotide. Denumirea acestornucleotide se poate facein mai multe moduri. O primd posibilitate este aceeade a utiliza numele de acid + (prefixul deoxil + rad[cina numelui bazei + sufixul illc, pentru bazele purinice, respectiv idilic pentru cele pirimidinice. Astfel se poate exemplifi ca: acidul (deoxDguanilic, acidul deoxitimidilic, acidul uridilic etc. O altd.posibilitate este de a denumi nucleotidele ca esteri ai acidului fosforic (mono) cu nucleozidele: adenozin-5'-monofosfat, deoxitimidin-5' monofosfat etc. sau de a utiliza prescurtdri aie acestoresteri (AMP = adenozin-S' monofosfat, dAMP = deoxiadenozin-5'-monofosfat,CMP-citidin monofosfat etc). Existd gi nucleotide ,,speciale"care se abat de la structura de bazd mai sus enunlate. Acesteasunt fie intermediari in sinteza polinucleotidelor, fie indeplinesc alte funcfiuni. Astfel amintim zAMP sau adenozin monofosfarulciclic, care confine doud legdturi de tip fosfoestericla poziliile 3' gi 5' (Fr9.5.6).Aceastdsubstanfdfunclioneazi ca un medjator al acfiunii hormonale fiind interpus intre hormon gi enzima specificd asupra cdruia acesta acfioneaze.ln prezenfa hormonului se activeazd

Acizi nucleici. Constituentii acizilor nucleici

323

AMP ciclaza, enzima care mediazS.formarea cAMP din ATP (vezi mai departe). NHz t-

I N^-

lll

? ? ? ^,\*

lll5' -O-P\ O-P\n O-?-O-9Ht

N ) N

iii'>

1'

ooo4', Adenozin trifosfatul

OH

OH

(ArP) Fig.5.7.

Difosfo- 9i trifosfonucleozidele sunt principalele substanfe folosite de materia vie ca tampon energetic. Legfltura fosforanhidridica are o energieliberd ridicati (AG' = 7 kcal/mol). Reprezentantultipic al acestei categorii de substante este adenozintrifosfatul (ATP),care posedd doud astfelde legaturi numite macroergice.ln formulele structurale,legiturile macroergicese reprezintd prin tildd (,,- ,) - Fig.5.7. Pe lAngd ATP existd gi ADP, precum 9i tofi ceilalfi nucleozid di- gi trifosfafi. Dintre insugirile nucleotidelor amintim: I caracterul acid (la pH = 7 toate grupdrile acide ale acidului fosforic sunt ionizate) r absorblia radiafiei UV de 260 nm r hidroliza nucleotidelor la nucleozide se poate realizaintracelular prin acfiunea 5' -nucleotidazelor I pe ldngi rolul lor primordial de a intra in constitu{ia acizilor nucleici, nucleotidele pot fi intdlnite ca tampoane energetice(XTPgi XDP X- bazd azotati), ca mesageri ai acliunii hormonale, precum Ei in calitate de coenzime sau precursori fie in reac{ii anabolice, fie in reac{ii catabolice.

324

Elementede biochimie .1,

5.3.Structuraacizilor nucleici 5.3.l. Acizii deoxiribonucleici (ADN)

'"rj2'i

Reprezintdbaza moleculard,a conservariigi transmiterii informa;iei ereditare, a diferenfierii gi regldrii celulare, a menfinerii gi perpe\-/ tuerii caracterelor,qi totodatd a modificdrilor I @ O:P-O naturale (spontane)sau induse. I In imensa majoritate a cazurilor (excepfie fac cdtevavirusuri), ADN-ul are o structurd biBi ?t+ ^ [-/"\J catenar elicoidalS.(dublu helix). Structura primard aADN-ului este datd de o' I secvenfa de nucleotide, care sunt unite prin ,P-O€ legdturi 3'-5' fosfodiesterice.De fapt structura I primari a ADN-ului este similard cu structura primard a ARN-uIui deosebireafiind la tipul de pentozd gi Ia existenfaexclusivi a: uracilului in moleculele de ARN gi a timinei in molecula deADN. Datoriti ionizf,rii restului de acid fosforic, ADN-ul se comportd ca un macroanion. ln ADN nucleotidele nu participa in cantitd{i echimolare. Totugi intre bazele azotate componente s-au stabilit anumite raporturi. Fig,5. 8, Structura primard a Tab. 5.2. redd cdteva dintre acestea, stabilite ADN pe diferite specii. S-a constatat, gi datele prezentate o confirmi, cd: lAl / tTl = [G] / [C] r t ; (tAl+tcl) / (tTl+tcl) c l. Raportul ([A]+[T])i (tcl+tcl) poarti numele de indice de specific[tate.Acesteraporturi sunt cunoscute sub numele de relaliile sau regulile lui CFIARGAFF,autorul determindrilor cantitative (1950).

v

5.3.1.1. Structura secundard a ADN-ului Modelul ideal al structurii secundarea ADN, a fost creeat de James WATSONgi Francis CRICKin 1953,pebaza rapoatelor lui CFIARGAFF Ei a datelor oblinute prin studiul structurii ADN prin difracfie de raze X

Acizi nucleici, Structura a.cizilornucleici

325

Tab.5.2.Rapoartcintre concentraliilebaze,lorazntatetn ADNprouenitdin difertte spect,

Bou Om Gaind Somon GrAu DOdie Haemophillu s influenzae E.ColiK-12 Bacilul tuberculozei aviare Senatia marcescens Bac/lus scnat

WtGI

FiltCI

tAYIJ

IGYICI

IRYP

1,29 1,56 1,45 1,43

1,43

1,04 1,00 1,06 1,02 1,00 1,03 1,47 1,09 1,09 0,95 1.12

1,00 1,00 0,91 1,02 0,97 1,20

1,1 1,0 0,s9 1,02 0,99 1,0 1,0 1,0 1,1 0,9 1.0

|,12

1,67 1,74 '1,05 0,4 0,7 0,7

,l 7t

I,n 1,43 1,18 1,92 1,54 0,95 0,4 0,7 0,6

nol 0,99 1,08 0,86 0.89

I1g.5.9. Vederede su.sa unui duplex ADN

PotrMt acestui model, ADN se prezinte ca o structurd bicatenard, antiparaleld,dublu elicoidali, de dreapta,ambele catenefiind infSgurate pe aceeaSiaxd. Diametrul dublului helix este de 20 A, pasul helixului estede 34 A, cu l0 nucleotideper pas. Timina

Citozina

Adenina 5

7

H, Cl al deoxiribozei

Fig.S.l\.Imperechereabazelor complementare dln nucleotideleADN prin tegdruri de hidrogen

de biochimie,l, Elem,ente

326

5''CfL

n

t-"-"\ \,/

meninailllilli

o.t

^,)b:-o r€b

Fig.5.11.Stabilizarea duplexului ADN prln legdturi de hidrogen

Bazele azotate se aflA dispuse inspre interior, (Fi9.5.9.),cu planul perpendicular pe axa comund de rotafie, decalateintre ele cu un unghi de 36o,iar moleculele cledeoxiribozdau planul paralel cu axa de rotatie. Dispunereainterioard a bazelor azotateestefa\rorizati de hidrofobicitatea conferitd de electronii n delocalizafi ai nucleelor acestor structuri. Stabilitateahelixului este asiguratdprin legdturi de hidrogen intre perechile A-T Ei G-C (cdte dou[ gi respectivtrei pentru fiecare pereche.Fig. 5.10.)Acestelegdturi de hidrogen nu se pot stabili decit dacd cele doud catenepolideoxirib onucleotidice sunt antip aralele (Fig.5.I 1.) In dublul helix se delirniteazd doui caneluri, una mare gi alta micd, care urmeazd traseul celor doui catene antiparalele.Structura descrisi mai sus se referd la cel mai des intilnit tip de ADN gi anume la structura de tip B. Pe lAngd aceasta,au fost identificate gi alte forme sub care se poateprezentaADN-ul. 5"3.1.2.Mobilitatea confo r mafiona,Ui aADN-uIui Studiul sistematic, prin difracfie de raze X, efectuat pe cristale de ADN a fost impulsionat de descoperireagi perfecfionareatehnicilor de sintez[ chimicd, gi de biosintezl.,,in vitro" a catenelor oligonucleotidice, de amplificare a numdrului acestorfragmente.

Acizi nucleici . Structura acizilor nucleici r\gzurlatertr observafiilor ul moRezultatele ilu confirmat au uustrtvautrur propus gi delul CRICK, dar in de WATSON \,_/ acesacelagi au mobilitatea timp evidenfiat Y", ^ i tuia. Dublul helix se poate indoi, rlsuci, desf\ . / > pirala Eiretrospirala. \ / difractometreRezolutia Rezoluflala scard scard atomici. atomici. a difractometreo lor de raze X a relevat cd intr-o nucleotidd I P componentd a unei oligo- sau polideoxiribonucleotide dublu catenare existd gase tipuri Fig.5.12. de leg[turi care permit o rotafie limitatd, justifi cdnd mobilitatea catenard(Fig.5.12., legiturile ingro$ate).

^D \ ^-or^,

C2'-endo

C3'-endo

C2'-exo

3'

C3'-exo

Fig.5.13.Conformagii ale nucleului pentozic din nurlcotl.de

Astfel, prin analiza unui dodecamer, DICtrGRMAN, relevi o mare variabilitate a unghiului de decalare a nucleotidelor, care se intinde in plaja 28" - 42o,fali de valoareafixd dati de modelul WATSON - CRICK (36'). Mai mult, el a observat cd bazele azotate perechi devrazd,adesea de la planaritate intocmai ca gi palele unei eiice. Mirimea devialiilor de la valorile modelului inifial, depind atdt de condil.iile de mediu (pH, temperature, terie ionici), dar gi de secvenfa particulard a nucleotidelor in catend. ln ceea ce privegte inelul furanozic, al deoxiribozei, acesta nu este plan. El se gisegte in diferite conforma;ii, patru dintre acesteafiind pre-

328

Elementede biochimie,I.

zentatein Flg.S.J3.ln structura de tip B a ADN-ului, cea mai favorizatd formd esteconformatia C2'-endo. Planul bazelor azotateeste perpendicular pe planul pentozei. Deoarece legitura glicozidici estemobild, pot apare conformeri sin respectiv anti (Fig.5.M).7n cazul nucleotidelor pirimidinice, conformafia sin este defavorizatf, energetic pe temeiul repulsiei dintre atomii de oxigen ai ciclului furanozic respectiv cel legat in pozifia 2 a nucleului pirimidinic. In cazul nucleotidelor purinice, ambii conformeri sunt stabili. Cea mai rdspO.nditdformi. este anti- gdsiti in structura de tip B (vezi mai departe), in timp ce conformafia sin se gdsegtein structuradetip Z.

{}

I

sin-adenozind anti-adenozind

sin-citidind

anti-citidind

permise rezultdnddln rotasiatn Fig.5.14, Conformafii Siinterzkepentrunucleotide, j urul Iegdrurli glicozidlce Posibilitatea acestor deformalii ale dublului helix are o remarcabild semnificafie biochimicd, deoarecepermite formarea speciilor de ADN circular precum gi ,,mularea" reciproci, stabili a ADN-ului de proteinele nespecifice- histonele sau temporard de enzime sau diferili factori proteici. Pe lOngd aceasta,trebuie menfionat cd gradul mare de compactitate al ADN-ului, care ii permite sd existein celuli, in ciuda lungimii sale imense in stare nepliatd, nu esteposibil decdt pe suportul mobilitAfii saleconforma{ionale. 5.3.1.3. Tipuri necanonice de duplexuriADN Structura canonicd, labaza cireia sti modelul WATSON-CRICK,este cunoscutd sub numele de structuri B sau B-ADN. De fapt aceastaeste forma predominantd sub care se pare cd se gi.segte,,in vivo" ADN-ul. Pe lAngi acesteaau mai fost identificate in experimenterealizate ,,in vitro" incd doui. tipuri de ADN respectivA gi Z.

Acizi nucleici . Stntctura acizilar nucleici

329

5.3.1.3.1.Structura d,etip A (A-ADN-ul) Reprezintd o modificare a dublurui helix B-ADN care se produce in condilii de deficit de apd, astfel incat hidratarea molecutei(lor) nu se poate face complet. Din aceasti cauzd.dublulhelix devine mai compact fa;d de axa principali dar mai larg (in diametru), conformafia inelului piranozic se va modifica in c3'-endo, planul bazelor azotatenu va mai fi perpendicular pe axa dublului helix, fiind rotit cu aproximativ lg". De asemeneabazele azotate vor fi distribuite spre periferia dublului helix. se pare cd astfel de structurd este adoptati de hibrizii ADN-ARN precum gi de zonele dublu helicate din ARN. E:rplicafia acestui comportament rezultd din prezenla hidroxilului din pozifia 2' la resturile de ribozd aleARN. 5.3.1.3,2.Structura de tip Z (Z-ADN)

Z-ADN

ftg.S. 15. Modalitatea deformare a structurii Z_ADN

A fost identificatd de cdtre Alexander RICH de la MassachusetsInstitute of Technology in cursul determinirilor structurv,ls lsalizate pe

Elementede biochimie .I.

330

fragmente deoxiribonucleotidice sintetice cu secvenfaCGCGCG.Acestea cristalizeazd.in duplexuri antiparalele cu o conformafie dublu helicoidali de stdnga mai puiin compacta decdt stmcturile B. Aceasta se datoreazdalternanlei bazelor purinice cu cele pirimidinice gi in special resturilor guaninice care se acomodeazdusor cu conformalia sin. lntr-o astfelde conformafie inelul ribozic basculeazdla structura C3'-endo. Topologic, esteposibil ca guanina si basculezein conformafia sin. In aceastAconformafie, pentru realizareaimperecherii cu citozina ar fi necesar ca aceastasI igi roteascl planul cu 180o.Ori aceastdmigcare nu este permisi datoritd imposibilitdlii adoptdrii de cdtre citidine a conformaliei sin. Prin urmare, in aceasti situatie este nevoie ca intreaga catenAcare con{ine citidina si se roteasc6la nivel ribofosforic (sdfaci o bucla). Succesiuneaalternanti GC pe o cateni gi implicit pe cealaltdva conduce la un mers zigzagal catenelor deoxiribofosforice.Astfel, in zone din ADN care confin motivul repetitiv conformaliaZ poate fi adoptatd. Trecereade la conformafia B la Z modifici helixul de dreapta intrunul de stanga, in care scheletul ribofosfat merge dupi un zigzag de unde 9i numele acesteiforme. lnTab.5.3. se prezintdcomparativcdteva caracteristicidefinitorii ale modelelorA, B gi Z aleADN (Flg.s.i6). Tab. 5.3. Principalele caracterlstici ale d.iferitelor tipuri de duplexurl ADN Caracteristica Prop(ii globale Lungime / pereciedebaze

A

Tipdedubluhelix B

scunglgros

tunggisubtire

234

3.32Ar0,19A zl/ A

z foarte elongat, sublire

3,8A

Diametru helix

zs,s A

Sensul derotatieal helixului

dedreapta

dedreapla

desHnga

Pelechidebaze/ sDire

11

-10

tz

Unghide rolatiei pereche de baze

33,6"

35,9" t 4,2.

40"t2

Pasulhelixului

24,6A

33,2 A

45,6 A

planuluibazelor Deplasarea fa€ perpendicuhritate

+19o

-1,2o + 4,1o

_9o

Pozitia axeidublului helix

Propo4ii alecanelurii mari Propo(iialecanelurii mici Confonnalra legeturii olicoldir:e

re,qA

in canelura mare intreperechile debaze TncanelunmicS Foarte inguslidarfoarte Laql, darcuaddncime DeplasatA spreexterior adanca intermediara Foarte laeadarpulin Ingustllcuadincimein- FoarteingusEdarfoarte adand termediard ad6nctr antl

anti

sinpentru G

Acizi nurleici. Stnrcturaaciailornucleici

33r

5.3.1.4.Comportareadublului helix ADNtn solu(ie

B-ADN

A.ADN

Fig. 5. I 6. modelel,eformclor A, B gi Z ale duplcxurilor

Z-ADN ADN

ln solulie apoase precum gi ,,in vivo", stmctura dublu helicatd. a ADN, in conformalie majoritard. B este dinamicd, rdspunzdnd fluctuagiilor termice care ii modifici local conformafia. Atit scheletul ribofosforic, cdt gi bazeleazotatese migcd elastic cu perioade de ordinul nanosecundelor.Local, aceasti mobilitate este influenfat[ de secvenfa nucleotidici particulard. De aceeadublul helix, departe de a fi o stmcturd rigidi, apare cu o conformatrie mobili aparent dezordonatd. Aceastdstructura permite, in anume momente, in zone precis delimitate, prin conformatii optime, interacfiuni tranzitorii cu substanfeproteice, care in majoritatea cazurilor moduleazd procesele de transformare ciue au Ioc la nivelul ADN-ului (replicare,transcriereetc). Tot legat de mobilitatea structurald in solufie trebuie amintit cazul aganumililor agenli de intercalare. Chimic, acegtiasunt substanfearomatice cu nuclee condensate,prin urrnare plane. In contact cu ADN-ul ln solulie, acestesubstanle pdtrund intre planurile bazelor.Lzotateunde igi stabilizeazd.paziliaprininteracliihidrofobe cu nucleeleheterociclice ale acestorbaze. Formarea in acest mod a complecgilor de intercalare, pe de o parte reduce mobilitatea dublului helix rigidizdndu-l, iar pe de alte parte duce la pierderea elicitdfii in zona de intercalare, implicit creAndu-setensiuni la niveiul scheletului fosforibozic. (Detalii suplimentare in Vol. II la secfiunea rnutafii). ln plus, agenlii de intercalare afecteazdinteractiunea ADN-ului cu proteinele specifice (echipamentul proteic al proceselorde replicare, transcriereetc.) perturbdnd procesele in care acesteproteine sunt implicate.

Elementede biochimie .1.

332

5,3.t.5. Denaturarea ri renaturarea ADN ln anume conditii de temperaturl, pH gi tirie ionicd acizii deoxiribonucleici igi pot pierde structura bicatenard, cele doud catene separ0ndu-se.Acest fenomen este cunoscut sub numele de denaturare. ln cazul in care intensitatea cu care acfioneazdacegtifactori nu afecteazd structura primard a celor doud catene, prin indepirtarea agentului denaturant (ricire, aducereapH-ului in limitele normal fiziologice,indepdrtareaionilor) structura bicatenardse reface,fenomenul numinduse renaturare. Evolulia denaturdrii, respectiv a renaturarii poate fi monitorizatd spectrofotometricprin monitorizarea absorbanfeila 260 nm. La aceastd lungime de undd absorb bazele azotate. In structura dublu helicatd, datoritf, mascdrii bazelor, absorbanfa are o valoare relativ redusd. Pe misurd ce catenele se indepirteazi reciproc, cregte gi valoarea absorbanfei, efectul fiind cunoscut de specrometrigti sub numele de efect hipercrom saudeplasarehipercromd.Pfin analogiecu punctul de topire al solidelor, respectiv cu cel al enzimelor (vezi efectul temperaturii asupra structurii - activitdlii enzimelor), se poate deflni !\ punct de topire al ADN-uIui (p.t.). Acesta este temperatura la care se inregistreazdjumatate din variafia totalS a absorbanfei. Desigur relevareaacestuia se face pe baza inregistrd.riivariafiei absorbanfeiin funclie de temperaturd (Fi9.5.17.).

E

c o (D

l ,

(\ -g {! .E o 1)

a. (E €o o

o

1.0

'

oC Temperature

Fig.S.17,Efectul hipercrom al ri.dicdrii temperaturii unei solufii de duplex ADN

Punctul de topire (p.t.) estespecificf,ecdrui ADN fiind determinat de raportul G+C / A+T. Cu cdt aceastd.valoare este rnai mare cu atdt interacfiunile dintre catene sunt mai puternice gi in consecin(d punctul de topire va fi mai ridicat.

Acizi nutleici. Structura atizilor nucleici

33t

Trebuie subliniat cd punctul de topire este corelat direct cu concentrafia ionilor. Acesta,pentru cd in prezenfa ionilor, are loc o neutralizare a sarcinilor grupdrilor fosfat, care le anuleazd repulsia intercatenari reciprocd, rezultind in acest mod o stabilizare a structurii dublului helix. Experimental s-a constatat cd in api distilatl p.t al ADN-ului este situat la temperatura camerei. Odata cu cre$terea concentrafiei ionice, creEteqi punctul de topire. Pentru o solugie0,2M de Na", s-a stabilit o relafie cantitativA, hniard in concentralia perechilor G+C, pentru punctul de topire: p.t. = 69,3+ 0,41[%G+C]. pH-ul are o influenfd nefavorabild asupra stabilitefii macrostructurii ADN. Prin protonarea respectiv deprotonarea moleculei, are loc destabilizarea sistemului intern de legdturi de hidrogen, cu pierderea dublei helicitili. Acest proces este practic complet in afara plajei de pH 2,3 11,5.De notat, cd.in cazul ADN-ului, denaturareaprodusd de baze este reversibild,in timp ce acizii, prin ruperea leglturii glicozidice consecutivd protondrii, duc la denaturare ireversibili (vezi hidroliza acizilor nucleici). Renaturarea, este procesul invers denaturirii, ln evolufia sa, cele doud catene se vor alinia reciproc, stabilind interacfiunile complementare. Viteza renaturirii este dependenta de lungimea, concentratia ADN gi de timp. Temperatura acfioneazdla un nivel optim, difuzia macromoleculelor fiind direct dependenti de temperaturd, dar peste o anumitd limita,se poate declanga,,topirea" duplexului. Cinetica renaturdrii estedescrisdde modelul bimolecular: dC^C1 _ =Uar sausubformdintegratd: = f.tcr, * * Proceselede denaturare-renaturareau ca aplicafie formarea hibrizilor ADN-ADN sau ADN-ARN, utilizafi in tehnicile de manipulare a acizilor nucleici. 5.3.1.6. Hibridizarea aciailor nucleici. Dupa cum se cunoagte,atatARN-ul cdt mai alesADN-ul coniin zone dublu catenare.La incdlzire la 100oCsau in prezenfa unor agenfi denaturanfi are loc un proces de desfacerea pun{ilor de hidrogen care asiguri interacfiunile intercatenare, proces cunoscut sub numele de denaturare. Procesul este in anumite limite reversibil. De aceea, opusul sdu, refacerea interacfiunilor intercatenare gi implicit a structurii bicatenare a acidului nucleic, in totalitate sau pe porfiuni, poartd numele de renaturare sau hibridizare. In practicd acest fenomen apiue la men$-

334

Elementede biachimie .1,

nerea un timp suflcient de lung a partenerilor de hibridizare la temperatura de 65'C. Viteza renaturerii depinde de probabilitatea intdlnirii secvenlelor complementare, implicit de concentrafia speciilor care confin acestesecvenfe.De aceeaviteza ,,dereacfie" poate servi ca mdsurd a concentraliei acestorspecii.Combinareapebazd,de stereocomplementaritate abazelor poate produce hibrizi (de unde gi denumirea) ADN - ADN, ARN-ARN sau mai alesADN-ARN, pentru cd imperecherea bazelor se poate face pe intreaga structurd a celor doud catene sau pe porfiuni ale acesteia. Importanfa analiticd a procesului rezultd fdra dificultate, in identificarea secven{elorcomune a doud fragmente de ADN care pot aparfine unor indivizi diferifi. Preciziagi sensibilitateametodei permite identificarea unor substanle existentein concentrafii de pane la o moleculd pe celuld. Dintre problemele care le rezolvd hibridizarea amintim: r determinarea numiruiui de copii ale unei secvenle particulare de nucleotide care existdintr-un genom. r detcrminarea secvenfelorcomune ale aceluiagitip de geni care aparfin Ia specii diferite. r determinarea genelor exprimate intr-o anume celuld prin hibridizare ADN - mARN, Etiut fiind ci nu toate genele dintr-o celuli igi vor gdsi expresiain sub forma unei substanfe proteice, implicit a mARNului corespunz5.tor. I determinarea exactda regiunilor de contact intre ADN gi ARN-ul celular cu stabilirea exacti a situsurilor de start gi stop gi mai mult, intre acesteadeterminarea poziliei secvenlelorintercalate (a intronilor) care ulterior vor fi indepirtate in procesul de excizie - splicing (vezi vol. 2 transcrierea). Practic,tehnica de hibridizare a acizilor nucleici folosegteo monocateni ADN numiti sondd nucleotidicd sau pur gi simplu sondi care va ,,detecta"fragmente complementare.Sonda trebuie sd fie in mod obligatoriu marcatd fie radioactiv fie chimic, pentru a putea fi vizualizatd odatd cu fragmentul complementar de care se va atagadupi ce esteintrodusi i:ntr-un mediu care confine material nucleic (fie ADN fie ARN). Dupa o incdlzire in timpul cireia are loc desfacereatuturor duplexurilor are loc hibridizarea sau combinarea catenelor complementare, proces la care va participa gi sonda. Imperecherea catenelor nu necesit[ o complementaritatestrictfl, procesul avdnd loc Ai in condiliile unor catene complementaredoar pe porfiuni. Un rol important in hibridizare,

Acizi nucleici . Stuctura acizilor nucleici

335

atunci cind gradul de complementaritate este redus, il are temperatura. Cu cdt aceastaeste mai ridicatd, selectivitatea procesului este mai ridicati, gi invers. Sonda nucleotidici se ob;ine prin clonare (PCR, sau clonare ,,in vivo" - vezi in continuare) plecdnd de la fragmente de restricfie (obfinute in unna clivdrii cu enzime de restricfie sau de la fragmente complementare (cADN) ob;inute din mARN, sub influenfa reverstranscriptazei62.Uneori, in cazul fragmentelor scurte, acestease pot obline prin sintezd chimici. Marcarea radioactivd a sondei nucleotidice se poate face principial prin doui metode: marcare interni gi marcare extemi' a) marcarea internd. {Fig.s.18.)se realizeaznprin biosinteza catenei sondei in prezenfi de ADN polimerazd, utilizdnd deoxiribonucleozid trifosfa$, marcali la fosforul crcu t'P. Aceastdmetodd se poate realizala rdndul ei prin doud variante: (1) deplasareabregei gi (2) amorsajul aleatoriu. Harca@ Nin'depl.sar8

'.mo/9d Uarcrrat prln

brerei'

tleatodu'

l rn'*

I oo*--o

Y

I

J

5

t ADNpollm€r@o| + I )cfP(uo6l€ morcqte Y b to8toruld)

I

t

6

3'

I ADNpolherolo I + I XfP (unele mo€oto to iosforulc) i

s s.

---

Fig, 5.18. Marcarea internd a sondclor nucleotidice

(l) Marcare prin deplasarea breSei (nick translation): prin tratarea unui fragment ADN surs[ cu ADN-azn I in prezen{a ionilor MgZ*, se creeazdbreqeintr-o catend ADN. Dispunerea pe cateni a acestor brege este aleatorie.Extremitelile 3' ale acestorapot servi ca reactant pentm reac;ia de policondensare la care mai participd nucleozid trifosfafi (unii dintre ei marcafi la Pcr)Ei desigur ADN-polimercaa.L In acest mod, se 62Reverstranscriptazafolosegte o matrila de ARN pentru a sintetiza monocatene de ADN. Vezi tehnici de inginerie geneticiVol. II.

336

Elementede biochimie .1.

vor obline catene identice cu cele clivate inilial, dar care vor avea incorporafi atomi 32P. (2) Marcareaprin amorsaj aleatoriu (random priming) utilizeazd.hexanucleotide sintetice, disponibile comercial, cu rol de primeri in sinteza catenelor marcate. Hexanucleotideleigi vor avea corespondentul complementar in catenele63 ADN din care se ob;ine sonda. Dupd decuplarea catenelor helixului prin incdlzire, la rdcire are loc atagareaprimerilor. ADN p olimeraza, in prezenfa nucleozidtrifosfatilor (din care unii marcati va sintetiza noi cateneplecdnd de la pimerii existenfi. Diferenta intre cele doui metode este cd in cazul amorsajului aleatoriu se oblin fragmente de ADN de lungimi diferite. b) marcarea externi se realizeazdla capetele 5', foiosind in acest scop polinucleotidkinaza codiflcatd de genomul bacteriofagului T4 gi extrasddin bacterii E. coli infectate cu acest fag. Fosfatul radioactiv se va atagain pozilia 5' gi provine dinATP-ul marcat la fosforul o.

brat

de distan

HOn

Fig. 5,19. Nucleotidd marcati chimic, detectabild imunologic

Aceasti metodd se utilizeazd cu fragmente ADN cu pdnd la 100 de nucleotide, deoarece peste aceastevaloare confinutul de fosfor radioactiv per catenAar deveni prea mic (avdndu-sein vedere ci existd doar un ttP la fiecare catend). 63probabilitatea de a intAlni un fragment de secvenld datd de lungime n este ll4" - in cazul nostru 1/4096adicdlungimea medie a unui fragment carepoate conline secvenla hexanu.lcleotidicd. estede 4096de nucleotide).

Acizi nucleici . Structura atizilor nucleici

337

Marcarea chimicd, este mai complexe, insi are avantajul evitdrii contaminarii radioactive.De reguli marcareachimicd se face cu o componentd pentru care se dispune de un anticorp (F85.I9.). Acest anticorp conline atagati o enzim6. Dupd separareaelectroforeticd a fragmentelor de analizat, are loc hibridizarea cu sonda nucleotidicd. Dupd hibridizare, se indep[rteazd, prin spdlare excesul de sondd, gi in mediu se introduce anticorpul, mediul se incubeazi suficient pentru ca reacfia sd.aibd loc Ei apoi se introduce substratul pentru enzima atagate de anticorp. Locul existenfei enzimei (locul unde s-a atagat anticorpul) se detecteazdde reguld prin schimbareaculorii produsului de reacfie prezenla hibridului. Identificarea fragmentelor hibridizate prin transfer (blotting)

t'/

gd culngmartr ADll oblinutprinclectrolonri

innsforulfngmcntelorpclolla dr pollemidisaunitrccclulorl(blottingul propriuzit)

f-l

ffi hibridartacu sondcnuclaqlidicc

h'tbtidc lirueliranr f ngmcntelor prinaulondicgrrfir(sondrcaldr) mufluorcsoanli(sonderuoi!

Fig.S.20. Schema tehnlcil ,,blatting"

338

Elementede biochimie .1.

Capacitatea hibridizdrii, ca instrument de lucru, de a realiza identificareaunor fragmente complementare cu sonda nucleotidicd, igi gdsegtevalorificarea prin combinarea cu separarea electroforeticS.. Fragmenteleoligo- sau polinucleotidice supuse analizei sunt separate prin electroforezd, in gel de poliacrilamidd sau agarozd (cele peste 20 kD).Acestefragmente nu pot fi supuseoperafiei de hibidizare cu sonda nucleotidici pe gelul de separare,deoarecepe de o parte fragmentele nucleotidicese gdsescincluse in gel, iar pe de altd parte sunt necesare operafii de incdlzire, spdlare,condifii in care fragmentele nucleotidice igi vor pierde pozifia dati de lungime. De aceeaestenecesartransferul si ,,fixarea"fragmentelor oligo- sau polinucleotidice pe un suport inert la condiliile de lucru (de reguld folii poroase de poliamida - nylon sau de nitrocelulozd). Transferul are loc in condiliile unui mediu de tdrie ionicd ridicatd. Realizareapracticd a blottingului se face prin: capilaritate,sucfionarela vid sau electromigrare. Practic,placa cu gelul care con{ine fragmentele de acizi nucleici separate electroforeticse introduce intr-o solufie de NaOH, care are rolul de a denatura duplexurile ADN. Apoi placa se introduce tntr-o cuvd care confine o solufle salin6. Pestegel se ageazdfolia poroasdde nitrocelulozd sau nylon. Pe aceste folii se vor ata;a doar monocatene. ln cazul transferului prin capilaritate, peste placa poroasi de nitrocelulozd sau poliamidd se ageazdmai multe straturi de hdrtie absorbanti. ln timp, prin capilaritate, se realizeazdtransferul fragmentelor. ln cazul electromigrarii pe gel se plaseazdo placi electroconductoarecare se leaga la anod, catodul fiind legat la solu{ia in care este plasatd placa cu gel. Transferul se face prin deplasaleapolianionilor in cdmp electric pdni la placd..Transferul prin vacuumsucfiune se face prin conectarea pldcii poroasela o incintS.vidatd care realizeazdtransferul materialului. Dupd uscare intr-o etuvi de vid, folia cu monocateneleADN se supune unei operafii de prehibridizare, care constf,in incubare cu o solulie proteicd (de reguld albumind sericdbovind) sau / gi o solufie de detergent. Prehibridizareaare rolul de a ocupa situsurile din folie unde sar putea atagafragmenteleADN din sonda nucleotidicd. ln continuare, folia care conline fragmenteleseparatese pune in contact, intr-o pungd de plastic, cu solufia care conline sonda nucleotidicd marcatd radioactiv sau chimic. In timpul incubdrii, sonda nucleotidici se hibridizeazd. cu fragmentele complementare. Dupi incubare are loc spdlareafoliei pentru indepirtarea excesului de solutie care con{ine sonda. Vizuali-

Acizi nrcleici - Structura acizilor nrcleici

t39

zuea sondei, implicit a fragmentelor hibridizate se face prin autoradiografie, in cazul utilizdrii sondelor calde sau prin expunere la lampa de ultraviolete. Tehnica a fost aplicatd prima datd. de citre SOUTHERN. De aici si numele de SOUTHERN blotting. O varianti a acesteia este utilizatd pentru hibridizarea fragmentelor ARN, in acest caz tehnica se numegte NORTHERN. In acest caz, pentru denaturarea fragmentelor de acid ribonucleic se folosegte formaldehida, dupd care are loc hibridizarea propriuz.is6. Ca tehnici de hihridizare, atdt tehnica NORTHERN cdt 9i SOUTHERN. se bazeazd.pe complementaritatea catenelor ADN * ADN sau ARN ADN ori mai rar ARN-ARN. Pe acest model a fost elaborati metoda WESTERN pentru determinarea unei anume proteine, prin complementaritatea legdrii cu un anume anticorp (care constituie sonrla). Proteina este denaturatd in prealabil cu SDS.Anticorpul se marcheazi prin ata$area covalentd a unui colorant sau a unei enzime. Dup{ incubare, excesul se indepdrteazd prirr spilare, complexele antigenanticorp formate putand fi puse in evidenfd direct, in cazul marcdrii prin colorare, sau indirect in cazul marcdrii enzimatice. In acest ultim caz, dintr-o molecul{ de proteind legatdde anticorp se oblin mai multe molecule de substrat transformate, care se pun in evidenfi printr-o tehnici analiticd corespunzitoare. 5.3.1.7. Structura terfiard a ADN-ului ComplexitateaADN depinde de tipul procariot sau eucariot al celulei precum gi de pozifia organismului pe scara evolufionald. Organizarea spaliald a macromolculelor de ADN in interiorul celulei definesc structura tertiard a ADN-ului. Procariotele nu au materialul genetic separat de alte structuri, neprezentdnd un nucleu distinct. Virusurile gi bacteriile posedd o singuri moleculd de ADN bicatenar, de reguld circular, inchis covalent, De menfionat cd, in cazul virusurilor, materialul genetic poate fi stocat gi sub formd deARN. Eucariotele posedd de reguld un nucleu distinct structural de citosol, de care este separat printr-o dubld membrani poroasi. Dimensiunile reduse aie celulei, pentru a nu mai aminti pe cele ale nucleului, oblig5.

340

Elementede biochimie,l.

ADN-ul sd adopte conformatii cu grad mare de impachetareo4. Atingerea acestorconformafii este posibili doar prin interacfiunea ADN-ului cu substanfeproteice care vor ghida duplexul cdtre conformatii dense. Substanleleproteice tipice care interacfioneazi cu ADN-ul au caracter bazic conferit de aminoacizi precum lisina, arginina, histidina Ei sunt cunoscute sub numele de histone.Peldngi histone, ADN-ul se mai gdse;te asociat temporar cu o serie de proteine nehistonice,al cdror rol acoperi o mare diversitate,legati in principal de expresiagenelor,de la factorii proteici responsabili de declan$areaproteosintezei,pdn6.la enzimele care faciliteazi acestproces. Raportul masic intre materialul genomic gi proteinele asociate este aproximativ unitar. Histonele sunt proteine de cinci tipuri diferite: Hl, H2A, H2B, H3 gi H4. Tipurile H2A, H2B, H3 gi H4 prezintd un grad foarte inaintat de conservare,structura primari deosebindu-se extrem de pufin intre specii. Aceasta atestd menfinerea mecanismelor de pliere a ADN-ului. De fapt, acestepatru tipuri de proteine formeazd.un octamer, prin asociereain perechi.Acest octamer reprezintd miezul unei structuri repetitive, nucleoz,omul. Acestaesteformat din octamerul proteic descrismai sus,in jurul cdruia se infi,goarddoui spire de dublu helixADN, in care intrd 164pb6s. lnfdgurareadublului helixADN in jurul miezului nucleozomului presupune deformarea dublei catenein zona de contact cu proteina. Energia necesari procesului de deformare estemaximS.in caneluramicd. De aceeain zonele de pliere corespunzdtorecanelurii mici in contact cu nucleozomul se intdlnesc foarte frecvent perechile A - T. Stabilitatea structurii nucleozomice este ridicatd, poziliile ocupate de octamer pe catenadeoxiribonucleotidicd fiind fixe. Pe lAngfloctamerul histonic ai cele doud spire de duplexADN, nucleozomul (Fig.5.21.)contine ca structuri de legIturS, proteina Hl precum gi un numdr variabil de perechi de nucleotide (0 - 100).Histona HJ.posedd trei situsuri de legare prin intermediul cdrora se conecteazi doi nucleozomi adiacenli. Astfei in zona centrali a structurii H1 se afld a9anumitul miez, care se ataqeazdpe nucleozom. Celelalte doui situsuri 6aO celuli umani obignuiti ^re un diametru de 20 pm. Materialul genetic cu 3.10spb consti din 23 de perechi de molecule bicatenare de ADN, care existd sub forma de cromosomi. Lungimea medie a unui cromosomestede 3.10e/ 23 = 1,3.108pb. La o distanla de 0,34 nm / pb in conformalia B a cateneiva corespundeaproximativ 5 cm per cromosom. Cei 46 de cromosomi vor aveain total, conform acestuicalcul 2,30 m. Pentru ca acest material sd poatd intra in celuld este nevoie de reducerea cu cinci ordine de mi.rime a lungimii materialului genetic. 65Perechi debaze

Acizi nucleict . Structure acizilor nucleici

34r

sunt capetele N- respectiv C- terminale ale catenei polipeptidice. Ele interacfioneazecu rniezurile H1 atagatenucleozomilor aldtura;i. OuplexADN "

Histona Hl

Nucleozom

T Miezu!nucleozomicformatdin octarnerulhistonic Fig. 5.21. Structura unui nurleozom izolat

O dubla catend ADN, apare astfel ca o ingiruire de nucleozomi (care au aspectul unor mdrgele pe o afe). Dublul helix care leagi doi nucleozomi adiacenli poartd numele de ADN de legatura (linker). Daci dublul helix in conformafie ideald (Watson-Crick) avea un diametru de 2 nm, girul polinucleozomic, saufilamentul de cromatind, va avea un diametm de 11 nm, iar lungimea sa se reduce. Filamentul de cromatind nu esteo structurd ideal5, deoarecelungimeaADN-ului linker estevariabila. De asemenease intdlnesc po4iuni fdrd nucleozomi, in care exista proteine de legiturd nehistonice.Acestezone sunt hipersensibilela acliunea nucleazelor. La rdndul sdu, girul polinucleozomic se aranjeaze intr-o structurd superhelicoidald cunoscuti sub numele de solenoid sau fibrd de cromatind. Dianetrul acestei structuri ajunge la 30 nm. Suprahelixulformat confine in medie cca. gasenucleozomi pe spird. ln continuare fibrele de cromatind se vor aranja in structuri mai compacte cu aspectde bucle (anse),al cdror diametru mediu este de cca. 300 nm. Acesteanse,la rdndul lor se aranjeazd.instructuri cu grad mai mare de

Elementede biochimie .I.

342

compactitate, numite heterocroma.tina, structuri cu un diametru de cca. 700 nm, care in cursul diviziunii celulare vor atinge forma maxim condensatdnumiti cromosorn Diametrul acesteistructuri de cca. 1400 nm (1,4Fm) o face bine vizibildla microscopul optic. ln alte faze ale ciclului celular decdt diviziunea, aspectul microscopic aI materialului genomic estedifuz. 5.3.I.B. Superhelixuri. Topoizomeri Si topoiznmeraze l0

zo

15

i

25

I

A. Forma liniarl a unui dublu ]tclix ADN 23..

l5 B. Fomra circularl relaxatli

15

I

to

C. Formaoirculardtensionati prin incizic - der[suchea a dou6spirc - sudatc

D. Formacircularl rclaxattrdc supraheiixncgativ (suprarilsucirede dreapta)

Fig.S. 22. Formarea superhelixurilor (suprardsucirilor)

ADN-ul dublu catenar se poate prezenta gi sub formi circulari inchisd, cum este cazul marii majoritdfi, dacd nu a tuturor cromosomilor bacterieni.Plasmidele, care sunt purtatorii unei informalii genetice secundarela bacterii, sunt tot molecule de ADN circulare.Chiar ADN-ul liniar poate fi considerat o structurd cu capetelefixate, datoritd asocialiilor cu proteinele. Tuturor acestor forme le este caracteristicun anumit numd,r de spire dependent de numirul nucleotidelor gi de tipul catenelor (A, B sau Z). Acest numdr de spire nu poate fi modificat decdt prin incizia unei catene urmati de rdsucireasau derdsucireaacesteiagi, final, de sudarea capetelor libere. Prin aceste rdsuciri - derdsuciri se creeazd.o tensiune in structura moleculei de ADN, care este compensatd prin aparilia unor suprardsuciri ale intregului dublu helix, in sens opus rS.suciriicauzi. Considerim un dublu helix de 260 pb, forma B. PlecAndde la valoarea medie de 10,4 nucleotide per spir6, acest dublu helix liniar ipotetic va aveain forma sa relaxate 260 I 10,4= 25 de spire (F1g.5.20.A). Prin le-

Acizi nucleici . Structura acizilor nucleici

343

garea celor patru capete (2x2), se va obtine un dublu helix relaxat tot cu 25 de spire (Fig.S.20.8). Dacd inainte de legareacapetelor doud spire se vor desfdqura,se obfine un dublu helix circular tensionat (Fig.5.20.C),care va aveadoar 23 de spire. La acelagiefect se poate ajunge gi plecdnd de la dublul helix circular prin incizia unei catene, derS.sucireaa doud spire, urmatd de sudarea celor doud capete rdmase libere. Structura este tensionati, deoarecenu se mai pot stabili toate legdturile de hidrogen posibileintre perechile de baze opuse, ceea ce conferd structurii un excesenergetic fafa de forma relaxati. Aceastd structure tensionatd va trece spontan intr-o structur5,relaxatdprin suprainf[gurarea dublului helix asuprasine-insugi, desigur in sens invers rdsucirii care a creat tensiuneainiliald (Fig.5.20.D) Cuantificarea helicitatii diferitelor forme ale ADN-ului circular sau liniar cu capetelefixate se face prin intermediul unor parametri topologici: L Numdrul de legare (,,linking number" - L) desemneazi numdrul de spire spre dreapta, formate de o monocatend.de ADN tn iurul celei complementare,Atunci cdnd axa dublului helix este constrdnsasa rdmdnd pland.ln exemplul considerat,formele A gi B au L = 25, in timp de formele C gi D au L = 23. Conformerii care diferd prin valoarea lui L poartd mrmele de topoizomeri. Interconversia topoizomerilor se face cu ajutorul unor enzime specializate, topoizomerazele. 2. Numdrul de suprar{suciri (,,vwithenumber" - \d) desemneazi numdrul de spire pe care dublul helix le executdasupralui. Prin aceasta dublul helix nu mai poate adopta o structuri pland. Semnul acestui parametru este negativ in cazul in care rotafia are loc spre dreapta, deci cAnd este cauzat de o structura tensionati plani rezultatd prin derisucire, gi pozitiv in caz contrar. In exemplul considerat pentru structura D parametrul W= - 2. 3. Numdrul de rdsuciri (,,twist number" - T) desemneazdnumdrul total de spire helicoidale. Tot in exemplul de mai sus,pentru conformafia B: W=0, l=25i pentru conformafia C: W=0, T= 23, iar pentru conformafia D: W=-2, T=25. Intre acegtiparametri, dupd cum se observd,existdo relafie simpld: L=T+W Prin aparilia suprardsucirilor sau a suprahelixurilor, cregtegradul de compactitate al ADN-ului (scadevolumul ocupat), astfelincdt wteza de

i44

Elementede biochimie,l.

migrarein cdmp centrifugal,respectivin c6.mpelectriccre$te.De fapt, pe bazaacesteiproprietdfiobservatede JeromeVINOGRAD, in 1963,au fost demaratecercetdrileasupraformelor de suprahelixaleADN-ului. Gradul de suprarisucire poate fi de asemeneacuantificatprin densitateade suprariisucire(o). Aceastase definegteca raport intre diferenpadintre numerelede legarealeformei suprarisucite (Ld gi aleformei originareIa, gi Ia:

o=kl= Lo

Lt=o

K . (.,H Ll=nrl

? ffi?"*F -

|@

Fig.S.23.Modul dc acfturu al topoitnmerarplor de tip I.

ln exernplulconsideratvaloareasa este{23..2s)I 2s =-0.0g. pentru majoritateamoleculelordeADN naturaleo arevaloareamediede -0,06. Valoareanegativdatestdcd formelesuprahelicate seobfin prin despiralarea conformerilorinifiali. suprardsucirilenegativepregdtescdublul helixADN pentru procesecarepresupunseparareacelor cloui catene: replicare,recombinaregi transcriere.Supraheiixurilepozitive sunt de asemeneacompacte,dar procesulde separareestemai dificil decatin cazulsuprahelixuluinegativ.

'-L^ l-"

J n/'

f-;.-2

I *l:"

*P-".-r"' /gY I

Fig, 5. 24. Mecankmulde qcfiuru alnpoiz,omerazelor

Acizi nucleici. Structuraacizilor nucleici

345

Topoizomerazelesunt enzime care modificd numerul de legare,sau altfel spus, fie introduc, fie eliminf, suprarflsucireaduplexului ADN circular ori cu capetelefixe. Dupd cum ele realizeazdsectiunea uneia sau a ambelor catene ale dublului helixADN, topoizomerazelesunt de tip I respectivde tip II. Topoizomerazele de tip I se mai numesc gi enzime de relaxare,intruc6.tele reduc densitatea de suprar5.sucire.Ele acfioneazdsecvenfial. Inilial, are loc scindareaunei legdturi fosfoestericedintr-o monocatend. Energia chirnicd a legdturii se conservd prin formarea unui conjugat topoizomerazal - ADN, prin intermediul unui rest de tirosinf, care va participa la o reacfie de transesterificare,Capdtul secfionat aI ADN-ului liber (capatul3'-OH), va putea suferi o rotalie liberd in jurul cateneiintacte, dupd care printr-o noud reacgiede transesterificareare loc alipirea fragmentelorde catenl qi eliberareaenzimei.(Fig.5.23gi Fg. 5.24.). Ciraa

/-_:\

'c/ I

'+

6p!q.ADNcircuLr

IrSrilgirszoi

n.

i-w' \C/

Socdoroa abpkroluid lo{tiorrtc dcplsrErlocopotoloa

+

t

t? l{

ADP+P rn'&nci ib po Dcoprindcroa Optcrutngarnult ncgdiv

Suducrcrpotclc &pk"nlui

Fig.5.25.Modul de acfiune al topoizomerazelor de tip II

Topoizomerazetede tip II, secfioneazdambelecatene ale duplexului ADN. Celemai cunoscute sunt girazele.Ele introduc suprarisuciri, intrun proces defavorizat energetic.De aceeaactiunea lor este cuplat[ cu hidroliza ATP. Introducerea unei suprardsuciri intr-un dublu helix cu o = 0,06,necesitdaproximativ g kcal.mol-t. O astfel de enzim6, binecunoscutd, este giraza din E coli, care este un tetramer format din doui

346

Elementede biochimie .I.

perechi de subunitifi identice. Una dintre subunitdli are masa de 105 kD, iar cealaltdde 105 kd. Interacfiunea primard dintre enzimd gi dubla catend conste in infdgurarea pe o porfiune de aproximativ 200 pb in jurul proteinei. In aceast5,structurd, legareaATP-ului declangeazdprocesul de clivare al ceior doui cateneADN, odatd cu a tetramerului AABB in dimeriiAB AB. Situsul de clivare de pe o catendADN, estedeplasatcu patru nucleotide de cei de pe cealaltdcatend. Capetele5'-fosfat secfionate vor fi legate de cdte un rest de tirosind de pe cdte o subunitate A. Aceasti legare a ambelor capete ale secfiunii impiedicd pierderea de suprahelicitate.In continuare, unul dintre capetelefixate se va deplasa printr-o migcare de rotatie (doar in sensul realizdrii unei suprar5.suciri negative), in jurul porfiunii intacte, cele doud capete revenind una ln apropierea celeilalte.ln aceastdconformalie, are loc hidroliza ATP-ului legat de enzimd, care duce la reformarea legdturilor fosfodiestericedin cele doud catene si totodatd refacereastructurii tetramerice a enzimei qi disociereaacesteiade peADN (Fig.5.25.) 5.3.2.Structura secundard gi te4iard a acizilor ribonucleici (ARN) Dacd pentru ADN, starea ,,normald",adici majoritari, este de dublu helix (duplex),pentru ARN, stareacea rnai frecvent intdlnit[ este aceea de monocatend. Excepfiile observate,apar pe porliuni de catend de ARN, at6.tintracatenar cdt gi intercatenar.Catenelepartenere pot fi atat ARN, cdt gi ADN (hibrizii ADN-ARN joaca un rol important in hibridizarea acizilor nucleici). Zonele dublu catenare (inter- sau intra- catenare se formeazd tot prin imperechereabazelor complementareA-T(U) respectiv G-C. Deoareceprezen{a hidroxilului din pozitia 2' impiedicd porfiunea dublu catenarasd adopte o conformafie de tip B, in structurile de tip duplex ale ARN se intilnesc conformalii de tip A, cu I1 pb per spird gi cu bazele puternic deplasatede la perpendicularitateafafd de planul dublului helix. S-au sistematizattrei tipuri principale de ARN, ce diferd intre ele prin rolul jucat in sinteza proteici: ARN mesageri (m"4.RM,ARN de transport (fARM gi ARN ribozomali (rARM. C6,tevadintre caracteristicile esenliale ale acestora, relevate din bacteria Escherichiacoli sunt prezentate in tabelul5.4. Pe ldngi acestea mai existi gi ARN de masd micd snRNA (small nuclear ribonucleic acids) sau scRNA (small citosolic ribonucleic acids), care au rol in procesareaacizilor ribonucleici de transport.

Acizi nucleici . Struttura acizibr nucleici

347

Tabelul5.4.Tipuri de ARN0nEscherichiacoli

Con$nut

Tip

Funcfie

Nurnlr Intensitate relatlv la Diversitate relativi de Stabllitate de total ARN nucleotide sintezl % o/o celular

500- 6000

40-50

3

instabil perioadade injumdtd[ire de 1 -3 min

50

90

stabil

5S

2800 1540 120

50-60

75-90

transporta ridicati informatia mARN (cAtewmii de la ADN la rihozomi

rARN

trARN

detipuri)

3 specii: intrain 23S structura 163 ribozomilor transportd aminoacizii pAni la

3

stabil

rih6Tnm

5.3.2.I. ARN mesageri (nARN) Poartd informafia continuta intr-o secvenfdde ADN, sub forma unei secvenfetranscrise, similard celei inifiale. Secvenfaunui mARN66este similard.celei originale. Diferenfele intre catena matrifA (ADN) $i cea copie (ARN) constau in inlocuirea deoxiribozei din ADN cu riboza in mARN Ei inlocuirea timinei din ADN cu uracilul in mARN. Ulterior, mARN-ul replicd, se va traduce intr-o secvenfede aminoacizi, care va forma noua catend polipeptidicd sintettzatd..Aceast5.catene polipeptidicd sintetizati reprezinti expresia, sau forma exprimatA a inforrnaliei geneticestocatein ADN (in geni). Degi intensitatea relativa de sintezd este mare, corespunzatoarenevoilor constante ale celulei pentru diferite proteine, confinutul momentan de mARN este redus, durata de viatrda acestuia fiind mult mai micd faf[ de celelaltedoui tipuri. Aceastase exp[ce prin hidroliza imediati a mARN-ului dupa indeplinirea rolului s6.u,pdni la nucleotidele componente, care vor servi ca materie prim6 pentru noi procese de transcriere.Faptul cd fiecdrei proteine (secvenfeproteice) ii corespunde o secven{dde mARN justifici diversitatea moleculard a acestui tip de ARN. 66Procesul de sintezi al unei catene de nARN dupi modelul unei anumite secvenle din ADN poartd numele de transcriere qi va fl descris in detaliu in Vol II la capitolul de sintezaproteici.

348

Elementede biochimie .I.

La eucariote, mARN se sintetizeaze i\ nucleu, (transcriere), se transferdin citosol, se atageazdpe ribosomi unde participd ca model (matri;a; la sinteza noii catene polipepticidice in cursul procesului de traducere. 3' OH A Punct de atagare

c

Buclaanticodon

Cbdon

Fig.S. 26.Modelul plan al unei molecule de I-ARN

Structura mARN este monocatenare. Pot exista insd zone limitate ca lungime, in special la procariote in care apar legdturi intracatenare (porliuni stereocomplemetarecu baze perechi A-U EiG-C), care conferd structurii locale aspectulunei agrafede pdr (hair pin). Structura mARNului estedificil de explorat datoritd instabilitdlii acesteia. 5.3.2.2. ARNde transport sa,ude transfer (IARN) Au rolul de a transporta aminoacizii din citosol, pdnd la locul sintezei catenei polipeptidice, ribosomul. Aici, tot datoritd tARN, aminoacizii sunt ordonafi in catena polipeptidicd in formare, pe baza secvenfei nucleotidice din mARN care se gdsegteata9at de ribosom. Acesta le conferd caracteristicade moleculi adaptor intre catena de mARN gi catenapolipetidicd. Pentru realizareaacestorprocesefiecare acid ribonucleic de transfer poseddcapacitateade recunoagterea unei anumite secvengede nucleotide din mARN gi in acelagitimp de legarea unui anume aminoacid. Pe ldngd funcfiile de recunoagterea secvenfelor nucleotidice din mARN qi de legarea aminoacizilor, tARN-ul mai indeplineqte func$a de activator al moleculei de aminoacid care va intra in reacfia de policondensare.Aceasta pentru cd aminoacidul va fi transportat prin legare

Acizi nucleici. Structuraacizilor nucleici

349

esterice la IARN,(pentru detalii vezi sinteza proteice). Structura tARN asigurdindeplinirea funcfiilor sale. Fa{d de variabilitatea mare a mARN, numirul de specii de tARN la nivel celular estelimitat la cca.40 cu varialii relativ mici intre specii.

-rr"^J-.I

)H,

I

r/)r"\

H:\

N

i,Y\ =^^l

R:A/ ^l

N I Prbod

,ta"norinl