ELECTROPHORESE

ELECTROPHORESE

PRINCIPE GENERAL • Séparation d’espèces chargées contenues dans un électrolyte. • Les espèces migrent grâce à un champ électrique.

ANODE POLE (+)

CATHODE POLE (-)

E GENERATEUR

Le champ électrique est créé par deux électrodes reliées à un générateur de tension continue.

Les ions sont attirés par l’électrode de potentiel opposé à leur charge. Les cations → la cathode (pôle -). Les anions → l’anode (pôle +). Les substances neutres ne subissent pas l’action du champ électrique.

ANODE POLE (+)

CATHODE POLE (-)

E GENERATEUR

Les espèces ne se déplaçant pas à la même vitesse → séparation.

Espèces analysées en électrophorèse : • Minérales ou organiques. • De la taille d’un ion simple comme F- (on parle d’ionophorèse) ou de celle d’une macromolécule (comme les protéines). • Chargées dans les conditions de l’expérience.

1. MOBILITE ELECTROPHORETIQUE DES ESPECES CHARGEES • Mobilité électrophorétique = déplacement de l’espèce sous l’action du champ électrique. • Mobilité = distance parcourue par l’espèce pendant 1 s sous l’action d’un champ électrique de 1 V.m-1 . • La mobilité dépend : - de la charge, - de la taille (si le milieu dans lequel s’effectue cette migration est poreux), - de la viscosité du milieu.

Ions minéraux simples : leur charge dépend de leur degré d’oxydation. Exemple : Fe2+ , Cr3+ , F- … → mobilité électrophorétique = μ = q/6πηr Avec

q = charge de l’ion η = viscosité du milieu r = rayon

• Une macromolécule organique possède de nombreux groupements ionisables. • Certains seront chargés positivement et d’autres négativement au pH de l’expérience.

La molécule porte une charge propre globale Q -

+

+

-

-

+ +

-

+

+ -

-

+

-

-

+

-

-

-

+

+

+

-

+

-

-

-

-

L’ensemble forme la couche double

-

Elle attire en surface les ions de charges opposés qui forment la couche liée (avec le solvant).

+ Cette couche liée perturbe aussi la répartition des autres ions en surface. Ils forment la couche diffuse.

Conséquences : • C’est l’ensemble molécule + couche double qui se déplace. • On parle de potentiel électrocinétique ζ’ qui apparaît à la surface de la macromolécule solvatée. • Il dépend : - De la structure de la molécule. - De l’électrolyte qui la contient par sa composition.

• La mobilité électrophorétique vaut alors : μ = ζ’ε/6πη Avec

ε = constante diélectrique du milieu η = viscosité du milieu

POINT ISOIONIQUE ET ISOELECTRIQUE • C’est dans les deux cas le pH pour lequel la mobilité électrophorétique est nulle. • Dans l’eau pure → point isoionique. 5,37 pour l’albumine • Dans un milieu complexe → point isoélectrique. 4,4 pour l’albumine dans du NaCl 0,15 M

2. ELECTROPHORESE DE ZONE La migration s’effectue sur un support horizontal ou vertical, imprégné d’un électrolyte tampon.

Le système est fermé pour éviter l’évaporation.

Les deux bornes sont reliées à un générateur de tension continue. La tension imposée est supérieure à 100 V. → L’intensité du courant électrique est de quelques mA.

2.1 LE SUPPORT • Milieu poreux. • Bande de papier filtre ou d’acétate de cellulose. • Gel minéral ou organique comme le polyacrylamide (permet en plus une filtration suivant la taille).

2.2 MODE OPERATOIRE Dépôt de l’échantillon : - Sous forme d’un trait transversal sur la bandelette.

A l’intérieur de puits aménagés lors de la fabrication du gel. → analyse de différentes fractions en même temps.

Migration : - Suivant le pH et la composition du milieu, les molécules vont acquérir un potentiel électrocinétique. - Elles migrent en direction de l’électrode de signe opposé. - On applique la tension pendant un temps assez court pour éviter la diffusion dans le milieu poreux.

• Après la migration et la révélation, on obtient l’électrophorégramme. • On y observe les différentes bandes correspondantes aux molécules séparées.

Procédés de révélation : - Réactif colorant.

- Observation sous UV avec un densitométre (après avoir rendu le support transparent).

3. ELECTROPHORESE CAPILLAIRE

La migration électrophorétique s’effectue dans un tube capillaire (15 à 150 micromètres de diamètre et La détection des molécules se fait 35 à 100 cm de longueur). grâce à un système placé sur le trajet : ce peut être un détecteur UV ou des électrodes.

Le tube capillaire plonge à ces deux extrémités dans la solution d’électrolyte.

Les potentiels employés sont de l’ordre de 10 à 30 kV.

3.1 LE FLUX ELECTROOSMOTIQUE

La paroi interne du capillaire se polarise négativement à cause des groupements silanols qui s’ionisent quand le pH est supérieur à 3.

Anode

Cathode

Il y aura donc une accumulation de charge positive au contact de cette paroi, créant une véritable enveloppe autour de Sous l’effet du champ l’électrolyte. électrique, on observe un déplacement d’ensemble, à vitesse constante, du milieu vers la cathode (-) → flux électroosmotique

Toutes les espèces (chargées ou non) subissent ce mouvement.

Molécule chargée positivement :

Anode

+

+

Flux électroosmotique

- Cathode

Mobilité électrophorétique de l’ion

Déplacement électrophorétique (en direction de la cathode) et flux électroosmotique ont la même direction, → les deux mouvements s’additionnent et l’espèce est accélérée.

Molécule chargée négativement :

Anode

+

-

Flux électroosmotique

- Cathode

Mobilité électrophorétique de l’ion Déplacement électrophorétique (en direction de l’anode) opposé au flux électroosmotique, → l’espèce est ralentie.

Les molécules neutres ou à leur point isoélectrique se dirigeront vers la cathode à la vitesse du flux. Cette technique est intéressante pour l’analyse des cations puisque leurs vitesses de déplacement seront bien différenciées.

On peut inverser le flux en plaçant dans l’électrolyte un tensioactif cationique qui apportera une polarité positive en surface.

• Il faut cependant veiller au sens de polarisation du capillaire pour que : - L’introduction de l’échantillon s’effectue du même coté. - Les anions migrent bien en direction du détecteur. • Cela permet l’analyse performante et très rapide des anions qui sont accélérés par l’action des deux phénomènes.

3.2 INTRODUCTION DE L’ECHANTILLON • Comme les espèces migrent en général dans le même sens (vers le détecteur), on effectue le dépôt au niveau opposé. • On peut se contenter de quelques nano litres que l’on fait pénétrer dans le capillaire par différentes techniques : - En trempant le capillaire dans l’échantillon et en surélevant l’ensemble : l’échantillon est ainsi siphonné (injection hydrostatique). - Par aspiration par l’autre extrémité (injection hydrodynamique). - Par mobilité électrophorétique (injection par électromigration) qui est discriminatoire.

4. TECHNIQUE DERIVEE : LA FOCALISATION ISOELECTRIQUE • Applicable aux deux techniques. • Cela consiste à créer un gradient de pH dans le capillaire ou sur le support (EZ)

• Sous l’action du champ électrique, les molécules migrent jusqu’à la zone où le pH est égal à leur pI. • Elles restent à ce niveau puisqu’elles ne subissent plus les effets du champ électrique. • Cela permet de lutter contre la diffusion. • Utiliser pour les espèces amphotères.

5. APPLICATIONS

Analyse de protéines sériques (identification et dosage des protéines du sérum)

Détermination des propriétés des molècules - Leur point isoélectrique. - Leur poids moléculaire (par comparaison des mobilités avec celles de standards de masses moléculaires connues).

Séparation et dosage d’espèces organiques ou ioniques.