ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS EN SDS­PAGE  (por: Nereida  Rojas y  Trina Perrone)  INTRODUCCIÓN  La  técnica  de  electroforesis  en  geles  de  poliacrilamida  en presencia  de  Sodio  Dodecil  Sulfato bajo condiciones reductoras (SDS­PAGE) es un método rápido, reproducible  y  de bajo costo ampliamente utilizado para cuantificar, comparar y caracterizar proteínas.  Se  trata  de  una  técnica  analítica­  semipreparativa  en  el  que  se  separan  biomoléculas  según su peso molecular   bajo la acción de un campo eléctrico y se obtienen  moléculas  para estudios inmunológicos. (Laemmli 1.970).  El método permite separar proteínas haciéndolas pasar por una resina: Bis­Acrilamida,  la cual es un  agente entrecruzador que genera un polímero sobre el cual se adherirán las  proteínas.  La  separación  electroforética  se  realiza  en  condiciones  desnaturalizantes,  al  añadir  compuestos que alteren las condiciones nativas de las proteínas y que se agrupan en una  solución  denominada:  tampón  de  carga.  El  tampón  de  carga  consiste  en  un  agente  reductor, Me ( mercapto­etanol) que se encarga de eliminar los puentes disulfuro que se  forman  en  la  estructura  terciaria  de  las  proteinas  entre  los  aminoácidos  Cisteína.    El  SDS (dodecil  sulfato sódico) es el detergente derivado del ácido de doce carbonos, se  une  a  las  proteínas  y  las  desnaturaliza  y  ya  que  está  cargado negativamente,  le  aporta  carga a las proteínas.  En el tampón también se incluye el azul de br omofenol, colorante con carga negativa y  con una movilidad electroforética que equivaldría a pequeños polipéptidos. Su función  es la de ir por delante de las proteínas para ir marcando el frente de electroforesis y que  podamos visualizar como se va realizando la corrida.  Al aplicar un campo eléctrico a la muestra inmersa en el tampón de carga, el complejo  proteína­SDS  migrará  hacia el polo positivo  y  se separará según su tamaño  ya que se  produce  pérdida  de  la  estructura  terciaria  y  secundaria  de  la  proteínas,  generándose  tantas cadenas polipeptídicas como posea la proteína.  Los polipéptidos de menor peso molecular, migrarán más rápido, mientras que aquellos  de alto peso lo harán más lentamente.  Las proteínas separadas en el gel de Bis­ Acrilamida pueden ser visualizadas a través de  métodos  de  tinción,    utilizando  moléculas  afines  a  las  proteínas,  tal  como  el  azul  de  Coomassie, diluido en una solución apropiada. 

Las aplicaciones más comunes de esta técnica son: ·  Análisis del grado de pureza de una proteína. ·  Determinación de su peso molecular. ·  Verificación de la concentración de proteínas.

·  Detección de proteólisis. ·  Identificación de proteínas inmunoprecipitadas. ·  Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos. 

Fundamento Bioquímico  Como  se  mencionó  en  la  introducción  anterior,  uno  de  los  medios  soporte  más  utilizados para la separación de proteínas es el  gel de poliaclilamida. Cuya realización  requiere partir de cuatro componentes líquidos:  CH2=CHCONH2  Acrilamida  CH2=CHCONH 2  CH 2  CONH 2CH=CH 2  Agente entrecruzante: bisacrilamida  (CH 3) 2CHNHCH(CH 3) 2  TEMED (Tetrametilen, etilen diamina)  S  2O 8(NH 4) 2  APS (Persulfato amónico) 

Estos componentes r eaccionan de la siguiente for ma:  APS

Acr ilamida 

Polímero entr ecr uzador  

Materiales y Métodos  Objetivos de la práctica:

·  Someter  a  electroforesis  en  SDS­PAGE  extractos  proteicos  de  parásitos  (Trypanosoma evansi y Anaplasma marginale).

·  Familiarizar  al  estudiante  la  técnica  de  electroforesis  en  SDS­PAGE  y  sus  potenciales aplicaciones en el campo de los hemoparásitos.

Materiales  A.­Equipos ·  Se  utilizará  como  modelo  para  la  práctica  el  equipo  Mini­Protean    de  la  casa  comercial  Bio­Rad®  (  Ver  figura  abajo).  El  protocolo  utilizado  puede  ser  fácilmente adaptable a otros sistemas. La  ventaja  de utilizar este aparato es que  se trabaja con un sistema de mini geles que requiere poco material, la corrida es  más rápida y se mantiene una alta resolución en la separación de las proteínas. ·  Fuente de poder (capacidad 200V, 500 mA) ·  Baño de agua con capacidad de 100°C ·  Pipeta Hamilton ·  Contenedores ó recipientes para sumergir el gel ·  Tubos eppendorf® ·  Plancha de rotación 

Modelo Cámara electr ofor ética Mini­Pr otean. 

B.­Reactivos y soluciones para la pr eparación del gel. 

Reactivos ·  ·  ·  ·  ·  ·  · 

Acrilamida, grado electroforesis Bis­acrilamida (N,N´­metilenbisacrilamida) Tris (2­hidroximetil­2­metil­1,3­propanodiol) SDS (sodio dodecil sulfato o sodio lauril sulfato) TEMED (N,N,N´,N´­tetrametilen­etilendamina) Persulfato de amonio 2­mercaptoetanol

·  ·  ·  · 

Glicerol Azul de bromofenol Glicina Ácido hidroclorhídrico (HCl) 

Soluciones  1.­Tr is/HCl 1,5M pH 8,8, 100ml :  Pesar 18,15 g de Tris  Disolver el Tris en 50ml de agua destilada  Añadir gota a gota HCl concentrado hasta que el pH baje a 8,8  Completar con agua destilada hasta el volumen final (100ml)  2.­Tris/HCl 1 M pH 6,8, 100ml :  Pesar 12,1 g de Tris  Disolver el Tris en 50ml de agua destilada  Añadir gota a gota HCl concentrado hasta que el pH baje a 6,8  Completar con agua destilada hasta el volumen final (100ml)  3.­SDS 10%  (p/v), 100ml:  Pesar 10 g de SDS  Añadir agua destilada hasta completar el volumen de 100ml  Infor mación de seguridad: El SDS es un polvo fino neurotóxico, por lo tanto se debe  usar máscara, guantes y lentes de protección para su manipulación.  4.­Glicerol 50%  (v/v), 100 ml:  Tomar un volumen de 50ml de glicerol al 100%  Añadir 50ml de agua destilada  5.­Azul de Br omofenol 1%  (p/v), 10ml:  Pesar 100mg de azul de bromofenol  Completar con agua destilada hasta 10ml y mezclar hasta disolver  Filtrar la solución en papel Whatman No 1 (o cualquier papel de filtro) para  eliminar el colorante no disuelto  6.­Acr ilamida 30%  (100ml)  La solución de acrilamida al 30% (p/v) es una mezcla de acrilamida (29,2g) y  bis­acrilamida (0,8g).  Pesar ambos reactivos y añadir agua destilada hasta 100ml  Filtrar en papel de filtro Whatman No1  Infor mación de seguridad: La acrilamida en polvo y en solución es  neurotóxica, por  lo tanto se debe usar máscara, guantes y lentes de protección para su manipulación.  7.­Per sulfato de amonio al 10%  (p/v), 5 ml:  Pesar 0,5g de sulfato de amonio  Disolver en 5ml de agua destilada  8.­ Solución Tampón de cor rida, 1 lt:  Pesar 3 g de Tris  (25mM)

Pesar 14,4g de glicina  (192mM)  Pesar 1g de SDS  (0,1%)  Añadir agua destilada hasta completar 1 lt  NOTA: El pH debería ser de aproximadamente 8,3. Se puede preparar una solución 10  veces  concentrada  y  diluir  el  volumen  necesario  en  el  momento  de  la  corrida  electroforética.  Esta  solución  puede  almacenarse  indefinidamente  a  Temperatura  ambiente.  9.­Tampón muestr a 5X, 10 ml:  0,6ml de Tris/HCl 1M pH 6,8 (solución 2)  60mM  5ml de Glicerol 50% (solución 4)  25%  2ml de SDS 10% (solución 3)  2%  0,5ml de 2­mercaptoetanol  14,4mM  1ml de azul de bromofenol (solución 5)  0,1%  0,9ml de agua destilada  Las soluciones 1, 2 y 6 son estables por meses a 4°C.  Las soluciones 7 y 9 deben ser almacenadas a –20°C  El resto a Temperatura ambiente.  Geles de Corr ida y Apilamiento  La técnica de separación comúnmente utilizada se denomina electroforesis  discontinua. En la electroforesis discontinua se preparan 2 geles, el gel de corrida,  donde se separan las proteínas, y el gel de apilamiento o gel concentrador (stacking) que  como su nombre lo indica, concentra la mezcla. ·  El gel de Corrida que separará las muestras  debe tener mayor concentración  de Archilamida (10%)  y pH más básico ( 8,3)  de manera que ofrezca mayor  resistencia en la corrida a los polipéptidos. ·  El gel de apilamiento posee baja concentración de acrilamida (4%) en tampón  ligeramente  ácido  (Tris/HCl  1M  pH  6,8),  de  forma  que    ofrezca  poca  resistencia  a  la  mezcla  de  proteínas  sometidas  a  electroforesis  por  tanto  lo  atraviesan con relativa rapidez. ·  Una  vez  preparado  y  polimerizado  el gel  de corr ida,  se  prepara,  en  la  parte  superior de éste el  gel de apilamiento. Bajo la acción del campo eléctrico, la  mezcla proteica, colocada sobre el gel de apilamiento, comienza a migrar hacia  el polo positivo. ·  Cuando  las  proteínas  atraviesan  el  gel  de  apilamiento,  se  encuentran  con  la  resistencia  ejercida  por  el  gel  de  corrida  de  manera  que  aquellas  proteínas  retardadas  puedan  alcanzar  al  resto  y  todas  inicien    la  separación  desde  el  mismo punto, mejorando así la calidad de la corrida.  El gel de apilamiento se prepara siempre a una concentración de acrilamida del  4%, mientras que el gel de separación o gel de corrida se prepara según el rango óptimo  de resolución:

Por centaje de acr ilamida  15%  12,5%  10%  7,5%  5% 

Rango de separación (tamaño)  15­45   kDa  15­60   kDa  18­75   kDa  30­120 kDa  60­212 kDa 

Prepar ación del gel de cor r ida:  1.  Ensamblar,  según  instrucciones  de  la  casa  comercial,  el  cassette  que  consta  de  soportes, vidrios y separadores.  2.  Preparar  el  gel  de  corrida.  El  volumen  del  gel  de  corrida  deberá  calcularse  dependiendo  del  grosor  del  gel.  El  apéndice  1  muestra  distintos  volúmenes  a  diferentes  concentraciones  de  acrilamida.  En  el  caso  de  extractos  de  tripanosomas  se  prepararán  10  ml  de  acrilamida  al  10%  según  se  muestra  a  continuación:  Agua destilada  Acrilamida­bisacrilamida 30%  Tris/HCl 1,5M pH 8,8  SDS 10%  Persulfato de amonio 10%  TEMED 

4     ml  3,3  ml  2,5  ml  100 μl  100 μl  4  μl

3.  Verter  cuidadosamente  la  solución  de  acrilamida  con  una  pipeta  pasteur  en  el  contenedor representado por 2 vidrios sujetos al cassette y distanciados por unos  separadores según se muestra a continuación: 

Figur a 1.­Introducción de la solución de acrilamida (gel de corrida) entre los vidrios (Tomado de  Bollag D.M. y Edelstein S.J., 1.994) 

4.  Dejar aproximadamente 1,5 cms de distancia entre la solución de acrilamida y el  vidrio frontal (figura 2): 

Gel de corrida 

F igur a 2.­Gel de corrida antes de polimerizar (Tomado de Bollag D.M. y Edelstein S.J., 1.994) 

5.  Luego de añadido el gel de corrida, y previo a la polimerización, añadir  suavemente agua destilada para evitar que el borde del gel polimerice de manera  irregular.  6.  Esperar unos 45 min para una polimerización total del gel. 

Preparación del gel de apilamiento  1.  Luego  de  polimerizado  el  gel  de  corrida, descartar  el  agua  dela  superficie  del  mismo  y  preparar  4  ml  del  gel  de  apilamiento  (4%)  según  se  muestra  a  continuación:  Agua destilada  Acrilamida­bisacrilamida 30%  Tris/HCl 1 M pH 6,8  SDS 10%  Persulfato de amonio 10%  TEMED 

2,7    ml  0,67  ml  0,5    ml  40  μl  40  μl  4  μl 

2.  Verter  suavemente  el  contenido del  gel  de  apilamiento  sobre  el  gel  de  corrida  polimerizado y colocar el peine cuidadosamente para que no se formen burbujas  (figura 3). 

Gel de  apilamiento

F igur a 3.­Colocación del gel de apilamiento y del peine (Tomado de Bollag D.M. y Edelstein S.J.,  1.994) 

3.  Esperar unos 30 min hasta que polimerice la acrilamida. 

Pr epar ación y colocación de las muestr as  1.  Cuando el gel de apilamiento haya polimerizado, colocar el cassette en el tanque  de electroforesis con aproximadamente 500 ml  tampón de cor r ida  en el cual  estén sumergidos los electrodos (solución 8).  2.  Quitar cuidadosamente el peine para que queden libres  los bolsillos o pocillos  del gel.  3.  Preparar las muestras protéicas. Para ello, se toman aproximadamente 20 μg de  muestra (determinada por métodos cuantitativos como Lowry ó Bradford).  En  este  caso  se  correrán  extractos  totales  y  liofilizados  de  T.  evansi  y  A.  marginale  Para  ello  se  tomarán  5  μl  de  la  muestra  y  se  diluirán  en  20  μl  de  tampón muestra 5X (solución 9) por bolsillo.  4.  Calentar  a  100°C  las  muestras  para  desnaturalizar  las  proteínas.  Incluir  un  estándar de peso molecular.  5.  Sembrar 25μl de muestra/bolsillo mediante el uso de una pipeta hamilton según  se muestra en la figura 4:  muestra

Pipeta Hamilton 

Figur a 4.­Colocación de las muestras en los bolsillos (Tomado de Bollag D.M. y Edelstein S.J., 1.994) 

Cor rida Electroforética  1.  Someter las muestras a electroforesis aplicando corriente (100 mA)  2.  Observar la corrida por unos 40 min. 

3.  Finalizada  la  corrida,  extraer  los  vidrios  cuidadosamente  del  cassette  y  separarlos de manera que el gel quede posado sobre uno de los vidrios  4.  Sumergir  el  gel  en  solución  colorante  (1  g  de  azul  de  Coomassie,  450  ml  de  metanol, 450 ml de agua destilada y 100 ml de ácido acético glacial) por unas 3  horas o durante la noche  5.  Transcurrido  el  tiempo  de  coloración,  sumergir  l  gel  en  solución  decolorante  (100ml  de  metanol,  100ml  de  ácido  acético  glacial,  800  ml  de  agua  destilada)  para eliminar las asociaciones inespecífica del gel al colorante.  6.  Observar  las  bandas  proteicas,  las  cuales  deben  observarse  bandas  proteicas  como se observa en la figura anexa: 

Infor mación  de  segur idad:  El  metanol  es  tóxico,  manipular  las  soluciones  con  guantes. 

Bibliografía ·  Bollag  D.M.,  Edelstein  S.J.,  (1.994)  “Protein  Methods”.  Wiley­Liss  Publications. USA. 229 p ·  Cooper  T.  (1.984)  “Instrumentos  y  Técnicas  Bioquímicas”.  Editorial  Reverté. España.442p