UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
FACULTAD ES CU CUELA ELA PROFESIONAL PROFESION ALDE DEINGENIERIA INGE IN GE NI NIER ER ÍA AMBIENT AMBIENTAL AL
TEMA:
“ELECTROFORESIS Y ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE ADN” ADN”
DOCENTE: BLGO. HEBERT HERNAN SOTO GONZALES
CURSO: BIOTECNOLOGÍA
ESTUDIANTE: LIDIA MARLENI COAQUERA ZANGA
CODIGO: 2018205015
CICLO: VII
CORREO:
[email protected] [email protected]
FECHA DE ENTREGA: 22/062021
CONTENIDO
1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ ............................................................................................................... 3
2
OBJETIVOS ................................................................. ........................................................................................................................ ....................................................... 4
3
2.1
Objetivo general: ......................................................................................................... ........................................................................................................ 4
2.2
Objetivos específicos: ................................................................................................ ................................................................................................ 4
REVISIÓN LITERARIA ...................................................................................................... ...................................................................................................... 5 3.1
Electroforesis: ................................................................. ............................................................................................................. ............................................ 5
3.2 Análisis de secuencias secuencias de ADN: ADN: .............................................................................. 5 3.2.1
Alineación de secuencias de ADN: ADN: .................................................................. ................................................................. 6
3.2.2
...................... 6 Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI): ......................
4
PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 7
5
RESULTADOS .................................................................................................................. ................................................................................................................. 11
6
CONCLUSIONES ............................................................................................................. ............................................................................................................ 12
7
CUESTIONARIO ........................................................ .............................................................................................................. ...................................................... 13
8
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 18
1
INTRODUCCIÓN
Los microrganismos son un grupo de seres vivos que se encuentran en una gran variedad de lugares como lo son las plantas, animales y humanos en donde coexisten con el huésped ayudando a realizar un sin fin de funciones. El estudio del ADN de los microorganismos microorganis mos ha potenciado la identificación de estos a partir de diferentes técnicas moleculares, tal es caso de la electroforesi electroforesis, s, una técnica que permite el procesamiento de los fragmentos de ADN que, al ser regiones muy conservadas dentro de cada especie, es posible identificar a estos. (Montalvo Navarro & Lugo Flores, 2016) La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento. El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas. (Yabar Varas, 2003). En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos que presentan ciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de las proteínas etc. (Yabar Varas, 2003). El presente estudio se basa en la recopilación de datos del NCBI (Base de datos de búsqueda de información del Centro Nacional de Biotecnología), para la recolección de la secuencia de su ADN, para después obtener el fundamento de la técnica de electroforesis, usando el programa Snap_Gene.
2 2.1
OBJETIVOS
Objetivo general: Determinar la electrofor electroforesis esis y el análisis de secuencia ADN en el programa
o
Snap_Gene Con 15 nucleótidos obtenido por el sitio web NCBI.
2.2
Objetivos específicos: Análisis del uso del NCBI.
o
Observar la variación de las bandas y a que se debe.
o
Analizar los concepto conceptoss básicos como el uso de los programas de simulación.
o
Definir la el electroforesis ectroforesis y té términos rminos utilizados en lla a prac practica. tica.
o
Analizar las secuencias de las 15 bandas de nucleótidos con las enzimas de
o
restricción.
3 3.1
REVISIÓN LITERARIA
Electroforesis: La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use. (Morales Becerril). La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que contienen ambos al electrolito y están unidos a los electrodos del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeño trazo transversal en la tira. La distancia de migración se mide en relación un marcador interno. Las placas son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular. (Morales Becerril). Fig ura 1: Electroforesis
Fuente: (Morales Becerril).
3.2
Análisis de secuencia secuenciass de ADN: El análisis de la secuencia de ADN, es el descubrimiento de similitudes
funcionales y estructurales, y las diferencias entre múltiples secuencias biológicas. Esto puede hacerse comparando las nuevas (desconocidas) con las bien-estudiadas y anotadas (conocidas) secuencias. Este análisis incluye la alineación de secuencias, la búsqueda en la base de datos de secuencias, el descubrimiento de patrones, la reconstrucción de las relaciones evolutivas, y la formación y la comparación del genoma. Los científicos han encontrado que dos secuencias similares poseen el mismo papel funcional. La comparación se puede hacer desde aspectos de comportamiento bioquímico o de acuerdo a la estructura de la proteína. Si hay dos secuencias de diferentes organismos son similares, se dice que son secuencias homólogas. (Meneses Escobar, Rozo Murillo, & Franco Soto, 2011).
Alineación n de secuencias de ADN: ADN: 3.2.1 Alineació La comparación de la secuencia de ADN está centro del análisis bioinformático. Se trata de un importante primer paso hacia el análisis estructural y funcional de las secuencias reciente recientemente mente determinadas. El proceso más fundamental en este tipo de comparación es la alineación de secuencias. Este es el proceso por el cual, se comparan las secuencias mediante la búsqueda de patrones de caracteres comunes y el establecimiento de los residuos de correspondencia entre las secuencias relacionadas. El alineamiento de pares de secuencias es fundamental en la búsqueda de similitudes dentro de la base de datos y el alineamiento de secuencias múltiples. Un concepto importante en el análisis de la secuencia es una homología de secuencia. Cuando dos secuencias son descendientes de un origen evolutivo común, se dice que tienen una relación homóloga u homología. (Meneses Escobar, Rozo Murillo, & Franco Soto, 2011).
3.2.2
Centro Nacional para la Información I nformación Biotecnológica (NCBI): El Centro Nacional para la Información Biotecnológica es parte de la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos, una rama de los Institutos Nacionales de Salud. Almacena y constantemente actualiza la información referente a secuencias genómicas en GenBank, un índice de artículos científicos referentes a biomedici biomedicina, na, biotecnología, bioquímica, genética y genómica en PubMed, una recopilación de enfermedades genéticas humanas en OMIM, además de otros datos biotecnológicos de relevancia en diversas bases de datos. Todas las bases de datos del NCBI están disponibles en línea de manera gratuita, y son accesibles usando el buscador Entrez. El NCBI ofrece además algunas herramientas bioinformáticas para el análisis de secuencias de ADN, ARN y proteínas, siendo BLAST una de las más usadas. (Wikipedia, 2021).
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PROCEDIMIENTO
Entrar a la página del NCBI (Base de datos de búsqueda de información del Centro Nacional de Biotecnología), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ , de esta manera debemos colocar en nucleótido y buscar 16s.
Al realizar esa búsqueda búsqueda nos mostrara mostrara un montón de su sugerencia, gerencia, de las ccuales uales seleccionaremos cualquiera de ellas:
De los cuales realizamos la selección de 15 especies, primero se procedió a dar clic en fasta, donde nos muestra la secuencia, después de ello copeamos toda la secuencia en un blog de notas.
De esta manera realizamos todo, logrando almacenar 15 blog de notas de distintas especies y géneros, todo ello con la información de la secuencia.
Los cuáles serán insertados en la SNAP-GEN, en el cual daremos desplegamos en tools, y seleccionamos simulación del gel agarosa. Después de ello insertamos las 15 especies, como se observa en la imagen, esto nos indica el comportamiento de los 15 nucleótidos.
En el lado derecho observ observaremos aremos los gráficos, hay grafica circular, o lineal, por ejemplo, esta es de la especie Aeromonas hydrophila. hydrophila.
Después agregamos 1 tubo vacío y también un MW Maker (gel simulado para que se pueda interpolar fácilmente cualquier ADN, para poder comparar con los demás tubos.
Para dar a conocer las enzimas de restricción se cambió en la parte inferior del formato mapa al formato-secuencia y se realizó cortes, por ejemplo, Aeromonas hydrophila. Se realizó 2 cortes basándonos en
PspFi , las
cuales se del total de 2488
pb, separándose en dos partes lla a primera de 1716 1716 bp y segundo segundo 772 pb.
Desplazamiento se agrega el líquido para ver cuanto a recorrido
5
RESULTADOS
En el grafico se muestra el comportamiento de los diferentes nucleótidos en la electroforesis con la simulación del gel agarosa en el programa “ SNAPGENE” . En el grafico se muestra todas las separaciones de al menos 2 enzimas de restricción para cada secuencia.
Conforme corre el gel, los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a través de los poros de la matriz del gel que los fragmentos más grandes. Después de un rato que ha corrido el gel, los fragmentos más cortos de ADN estarán más cerca del extremo positivo del gel y los más largos se mantendrán cerca de los pozos. Los fragmentos de ADN muy pequeños podrían correr hasta salirse del gel si lo dejáramos corriendo por demasiado tiempo (¡algo de lo que definitivamente he sido culpable!). Una vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño de las bandas que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se coloca bajo luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN presente en distintos lugares a lo largo del gel. (LabXchange, 2021).
6
CONCLUSIONES
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño. Además, las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel. Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo. Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes así mismo los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo. Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes. Atreves del uso del programa se pudo visualizar y realizar cada uno de los objetivos planteados, donde se observó la separación de fragmento de ADN según su tamaño, cada uno de las 15 muestras analizadas.
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CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un ge gell de agarosa y cómo influy influyee la concentra concentración ción en la mig migración ración de los fragmentos de ADN? Es un polisacárido natural provenientes de las algas. Su función es la separación de cadenas en tamaños pequeños hasta un rango r ango de kb (kilobases). El gel suele correrse de manera horizontal y. con buffer de manera TBE (Tris, Borato, EDTA) y TAE (Tris, Ácido Acético, EDTA). Para la migración de los fragmentos de ADN, se separa por tamaño en un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular, ya que es sabido que el ADN tiene una uniforme relación masa / carga.
2. ¿Dibuje a mano el proc proceso eso de la PCR PCR? ?
el proceso de la electroforesis electroforesis? ? 3. ¿Dibuje a mano el
4. ¿En el primer video mostrado por el profesor por que las muestras de ADN ADN son mescladas con un colorante azul? ¿Cómo se llama? El buffer de carga (azul), cargar y visualizar las muestras en el gel, para poder interpretar cargar un marcado de peso molecular, glicerol presente en la muestra de carga, bromuro etidio. El buffer de carga (azul) contiene colorante que sirve para visualizar la migración de DNA durante el proceso de electroforesis.
bromuro de etídio (BrEt), (BrEt), como lo podemos podemos remplazar, remplazar, existe 5. ¿Qué es el bromuro otros colorantes? El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante (se intercala entre las bases nitrogenadas) que se usa como colorante fluorescente para la visualización de ácidos nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida. Lo podemos remplazar por GelRed™ y GelGreen™ son tintes fluorescentes ultra sensibles para ácido nucleico, extremadamente estables y ambientalmente seguros; diseñados para reemplazar el altamente tóxico bromuro de etidio (EtBr) para teñir dsDNA (DNA bicatenario), ssDNA (DNA monocatenario) o RNA en geles de agarosa o geles de poliacrilamida. Si existen otros colorantes que pueden remplazar al bromuro de etidio.
6. ¿Por qué se utilizaron dos m marcadores arcadores de peso molecular? Un marcador es un carácter o un gen que debido al ligamiento puede usarse para indicar la presencia de otro gen; es decir, cualquier característica A (sea un gen, una proteína, tipo de hoja, etc.) que esté asociada a la presencia o expresión de una característica B (como vigor, altura, resistencia a enfermedades, etc.) puede considerarse como un marcador, pues la presencia de A necesariamente implica la de B. La importancia de los marcadores radica en que ofrecen la posibilidad de estudiar poblaciones de organismos y seleccionar aquellos que presentan rasgos de interés para el hombre.
7. ¿Cuál es ta tamaño maño molec molecular ular de cada gen obtenido por usted, en ca caso so que se sea de diferentes tamaños como justifica? En el caso del peso molecular ya está determinado en el cuadro que nos presenta el resultado, por ejemplo si nosotros colocamos el click en una de las bandas ahí nos indica los pares de bast que tiene cada una, y los números que salen a la izquierda de los datos de las bandas serian el peso molecular pero en KB, los tamaños se justifica por las secuencias escogidas, es decir a mayor secuencia como 4000 pb y otro de 1500 pb, el peso molecular de la de 4000pb se colocaría primera en nuestros resultados, indicando su peso molecular mas alto.
8. ¿Tipos de electroforesis y cómo funciona en gel de agarosa para segmentos de ADN? Tipos: La electroforesis en gel se utiliza en biología molecular, genética y bioquímica: 1.
Electroforesis de frente móvil o libre
2.
Electrof Electroforesis oresis de zona: (convencional) o En papel En acetato de celulosa
o
En gel (agarosa, poliacrilami poliacrilamida da y almidón)
o
3. Electroforesis capilar 4. Electroforesis de ADN. 5. Zimografía o zimogramas 6. Extracción en gel. 7. Electroforesis en gel de campo pulsado La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma.
9. ¿Es posible re recuperar cuperar un fragmento de A ADN DN del gel de agarosa para clonar en un plásmido y mantener en un organismo? Fundamente. Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular muy comunes en bacterias que se replican de modo autónomo e independiente del cromosoma de la célula. La frecuente necesidad de recuperar y purificar fragmentos de ADN separados sobre geles de agarosa y poliacrilamida ha llevado al desarrollo de gran variedad de métodos (1 -9). Teniendo en cuenta que ninguno ha mostrado ser plenamente satisfactorio, se han realizado modificaciones a cada uno de ellos con el fin de hacerlos más eficientes. Uno de los métodos utilizados es la electroforesis y recuperación sobre un papel de DEAE-ce lulosa. Es una técnica simple que se puede aplicar a varias muestras simultáneamente. El ADN obtenido es de alta pureza.
10. ¿Qué son las enzimas de restricción, mencione 10? Las enzimas de restricción son aquellas que presentan actividad endonucleasa, son de origen bacteriano y cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica denominada secuencia diana. Enzimas de restricción y los organismos de donde se extrae: EcoRI (Escherichi (Escherichia a coli)
EcoRII (Escherichi (Escherichia a coli)
HindII (Haemophilus influenzae)
HindII (Haemophilus influenzae)
Haelll (Haemophilus aegyptius)
Hpall (Haemophilus aegyptius)
Pstl (Providenci (Providencia a stuartii)
Mayi (Serratia marcesens)
Baml (Bacillus amyloliquefa amyloliquefaciens) ciens)
BgIII (Bacillus globiggi)
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BIBLIOGRAFÍA
LabXchange. (2021). Electroforesis en gel . Recuperado el 22 de junio de 2021, de https://es.khanacademy.org/science https://es.khanacad emy.org/science/ap-biology/gen /ap-biology/gene-expression-a e-expression-andndregulation/biotechnology regulation/bi otechnology/a/gel-electroph /a/gel-electrophoresis oresis Meneses Escobar, C. A., Rozo Murillo, L. V., & Franco Soto, J. (Diciembre de 2011). Tecnologías bioinformáticas para el análisis de secuencias de ADN. Universidad Tecnológica de Pereira, 16 (49), (49), 116-121. Recuperado el 21 de Junio de 2021
Montalvo Navarro , C. A., & Lugo Flores, M. A. (30 de noviembre de 2016). Electrophoresis: fundamentals, advances and applications. Universidad autónoma de baja california, 1-7. Recuperado el 21 de junio de 2021
Morales Becerril, I. (s.f.). electroforesis. Recuperado el 21 de junio de 2021, de http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archi http://depa.fquim.un am.mx/amyd/archivero/Exposi vero/Exposicion_electro cion_electroforesis_5087 foresis_5087.pdf .pdf Wikipedia. (19 de abril de 2021). Centro Nacional para la Información Biotecnológica. Recuperado
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