Elaboración de Una Curva Patrón para Det de Sacarosa

 

Espectroscopía: elaboración de una curva patrón para cuantificar la sacarosa

1. Objetivo  

El objetivo de esta práctica consiste en utilizar la técnica de espectrofotometría para elaborar una recta patrón de sacarosa a partir de concentraciones conocidas de este disacárido. Mediante interpolación, esta recta permite determinar la concentración de sacarosa en una muestra desconocida. Se utilizará un método colorímetrico que utiliza el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) para que reaccione con la sacarosa tras su hidrólisis química con HCl. 

2. Fundamentos

El DNS reacciona únicamente con los azúcares reductores. La sacarosa es un disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado.

La

intensidad

del

color,

que

se

puede

medir

por

métodos

espectrofotométricos espectrofotomé tricos es proporciona proporcionall a la concentración de sacarosa. Los métodos espectro espectrofotométricos fotométricos permi permiten ten calcular la in intensidad tensidad de ra radiación diación (luz con una longitud de onda determinada) emitida o absorbida por una sustancia. La cuantificación se realiza aplicando la ley de Lambert-Beer  Lambert -Beer :  A =

.c.l

donde: •

   A  = Absorbancia medida medida en el espectrofotóme espectrofotómetro tro

•

 

= Coeficiente de absorción molar a una determinada longitud de onda. Es la absorción de luz con una determinada longitud de onda de una disolución 1M, cuando el paso óptico es de 1cm. Se expresa en M -1. cm-1 

•

  c = Concentración en moles/litro (M) (en las mismas unidades que ε)

•

  l = Paso óptico (espesor del tubo que contiene la disolución, en cm). En las cubetas estándar que se utilizan para hacer las medidas es de 1 cm.

 

3. Preparació Preparació n   a) Materiales

Vasos de precipitados (de 2 de 50 y 2 de 100 ml),   gradilla con tubos de 20 ml, rotulador para vidrio, pipetas automáticas de diversos volúmenes, pipetas de vidrio con su dispositivo para pipetear, cubetas especiales para medir en el espectrofotómetro, espectrofotómetro visible, pipetas Pasteur de plástico, baño de agua a 90ºC, baño de hielo, agitatubos, agitador magnético, tubo de diálisis.

b) Reactivo Reactivo s

 Ácido 3,5-dinitrosalicílico 3,5-dinitrosalicílico (DNS), sacarosa 10 mM, HCl 2 M, NaOH 2M, NaCl 2M, agua destilada.

b) Prepara Preparación ción de los tu bos con c oncentraciones cono cidas de sacarosa sacarosa 

Se utilizarán tubos de cristal de unos 20 ml que se numerarán del 0 al 5. Se les añaden distintos volúmenes de una disolución de sacarosa 10 mM (se utilizará una pipeta automática) y se añade agua destilada de modo que, al final, todos los tubos tengan un volumen de 8 ml, tal y como se indica en la siguiente tabla: Tubo nº  

0 

1 

 2 

 3 

 4 

 5 

Sacarosa 10 mM (ml) H2O destilada (ml)

0 8

0,5 7,5

1 7

1,5 6,5

2 6

2,5 5,5

c) Tratamiento

La sacarosa no lleva carbono anomérico libre, por lo que no es reductor. Por tanto, antes de mezclarla con el reactivo DNS, es necesario hidrolizarla con un ácido fuerte como el HCl. Por lo tanto, la reacción colorimétr colorimétrica ica se lleva a cabo en 3 etapas:

 

1. 1.-- Hidrólisis ácida:

Tubo nº  

0 

1 

 2 

 3 

 4 

 5 

Sacarosa 10 mM (ml)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

H2O destilada (ml)

8

7,5

7

6,5

6

5,5

HCl 2 M (ml) AGITAR

1 +

1 +

1 +

1 +

1 +

1 +

Calentar 20 minutos a 100°C

+

+

+

+

+

+

Introducir en agua fría

+

+

+

+

+

+

Tubo nº  

0 

1 

 2 

 3 

 4 

 5 

NaOH 2M (ml)

1

1

1

1

1

1

AGITAR

+

+

+

+

+

+

2.- Neutralización:

En este momento, cada tubo contiene un volumen aproximado de 10 ml. Para continuar con el protocolo hay que tomar 2 ml del contenido de cada tubo y transferirlos a un nuevo juego de tubos de ensayo , numerados igual que los

anteriores. 3. 3.-- Reacción Reacción c on DNS (con (con aparición de produc to c oloreado):

Tubo (nuevo) nº  

0 

1 

 2 

 3 

 4 

 5 

ml del juego de tubos anterior

2

2

2

2

2

2

ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (ml)

1

1

1

1

1

1

AGITAR 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

Calentar 5 minutos a 100°C

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

Introducir en agua fría con hielo  

+

+

+

+

+

+

H2O destilada (ml)

7

7

7

7

7

7

AGITAR 

+

+

+

+

+

+

Medir la Absorbancia a 540 nm (A540)

+

+

+

+

+

+

NOTA IMPORTANTE: Cuando se manipule el DNS es necesario utilizar guantes.  

 

d) Medida de la Ab so r ban ci a a 540 nm (A 540) y elaboración de la recta patrón

  Se enciende el espectrof espectrofotómetro otómetro y se selecciona la longitud de onda de 540

•

nm (luz de color verde)   Se espera al menos 10 minutos para que se estabilice el aparato

•

  La ab absorbancia sorbancia (A) se mide e en n tubos especiales   adecuados a cada

•

espectrofotómetro.   Con el contenido del tubo blanco (tubo 0, [sacarosa] = 0) se ajusta la

•

transmitancia al 100% (T = 100) o la absorbancia a cero (A = 0), siguiendo las instruccioness del fabricante. instruccione   Para re realizar alizar las m medidas edidas se llen llena a el tubo e especial special del e espectrofotómetro spectrofotómetro hasta

•

1 cm del borde. El contenido de los tubos no se tira por la fregadera sino que se devuelven al tubo original original y se tirará después de represe representar ntar la curva patrón en el bidón de residuos preparado a tal efecto.  

Realizar las medidas comenzando por el tubo de menor concentració concentración n y

•

terminando con el de mayor concentración. Los valores de A 540  se van apuntando en la tabla adjunta: 

Tubo nº 

0 

[sacarosa] (mM)

 

1 

2 

3 

4 

5 

 A 540 

d) Cálculo Cálculo s y Resultados Resultados  

  1.- Calcu Calcular lar las concentracion concentraciones es de sacarosa en cada tubo y añadir e ese se dato a

•

la tabla anterior  

  2.- Representar en un gráfico los datos de A540 frente a la [sacarosa] 

•

  3.- Determinar el coeficiente de absorción molar (ε) de la sacarosa 

•