Elaboracion de Bioplastico a Partir de Residuos de Camote.1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN FACULTAD DE INGENERIA DE PROCESOS ESCUELA DE INGENERIA QUIMICA

INGENIERIA DE BIOPROCESOS INVESTIGACION FORMATIVA TEMA: EXTRACCION DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA) A PARTIR DE LA CIANOBACTERIA Nostoc commune PARA LA ELABORACION DE PLASTICOS BIODEGRADABLES DOCENTE: DR. HUGO JIMENES INTEGRANTES: ALEMAN FLORES, MAURICIO DANIEL

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CAYO HIHUALLANCA, TONY 

CONDORI QUISPE, MARIANE VANNESA CUMPA PINEDO, MARIA DE LOS ANGELES

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GONZALO CORDOVA, ALDO GONZALO 

ROSAS MENSOZA, MILTON PERCY

Arequipa - perú 2019

EXTRACCION DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA) A PARTIR DE LA CIANOBACTERIA Nos toc c ommune PARA LA ELABORACION DE PLASTICOS BIODEGRADABLES

RESUMEN

Este proyecto tiene por finalidad obtener plástico a partir de la cianobacterias y en este caso se escogió el Nostoc commune que es conocido comercialmente como murmunta, del cual se extraerá el phA mediante un proceso microbiológico dentro de un biorreactor y así poder obtener plásticos biodegradables. Se escogió como materia prima principal el PHA ya que Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son plásticos biocompatibles y biodegradables sintetizados por una amplia variedad de microorganismos, que comparten características muy similares con los plásticos de origen petroquímico.

DESCRIPCION DEL PROBLEMA

La producción excesiva de plásticos a partir de polímeros derivados del petróleo como el poliestireno y polipropileno ha traído consigo graves problemas ambientales, por lo que se busca alternativas para suplir este compuesto. Se ha estudiado que los hidroxialcanoatos presentes en cianobacterias tienen propiedades similares a la de los polímeros derivados del petróleo, lo cual los hace idóneos para la producción de plástico, además de que estos biopolímeros presentar mayor biodegradabilidad. Se propone realizar un estudio de la cianobacteria Nostoc commune, la cual se encuentra en exceso en el departamento de Puno, cuyo uso es únicamente gastronómico. El análisis de las condiciones optimas de polihidroxialcanoatos se llevará a cabo en muestras bajo diversas condiciones, ya que se sabe que bajo un estrés la cianobacteria produce una mayor cantidad de PHA (Sharma and Mallick, 2004). El proceso involucra desde el momento del cultivo, selección y desarrollo de la cianobacteria, pasando por la extracción de PHA y su aplicación en la producción de bioplásticos, cuyos procedimientos serán detallados en el siguiente punto (Arumugan et al 2019).

1. INTRODUCCION PHA

Los biopolímeros o polihidroxialcanoatos (PHA) son considerados fuertes candidatos para el reemplazo de los polímeros de origen petroquímico, ya que siendo sintetizados por microorganismos a partir de sustratos de bajo o nulo valor económico y en general de recursos renovables, tienen características físicas similares a las de los plásticos derivados del petróleo, como el polipropileno y polietileno (González et al., 2013; Lee, 1996; Sudesh et al., 2000; Serrano, 2010), pero tienen la posibilidad de ser degradados a dióxido de carbono y agua en condiciones aerobias o a metano en condiciones anaerobias (Du et al., 2001), en hábitats tan diversos como suelo, mar, aguas estancadas o aguas residuales (Barbosa et al., 2005 Carballo et al., 2003) Estos, son polímeros de ácidos hidroxialcanoicos que algunos microorganismos acumulan intracelularmente como material de reserva, para usarlo posteriormente como fuente de carbono y energía. La polimerización de los ácidos hidroxialcanoicos, por acción de enzimas intracelulares, tiene lugar mediante condensación del grupo carboxilo de un monómero (ácido hidroxialcanoico), con el grupo hidroxilo del siguiente, formándose un enlace éster; de ahí que se han llamados biopoliésteres (Khanna y Srivastava 2005) (Figura 1). Los PHA son acumulados como polímeros líquidos, móviles y amorfos en forma de gránulos que se alojan en el citoplasma de los microorganismos, rodeados de una monocapa de fosfolípidos que contiene enzimas polimerasas y despolimerasas (Figura 2) (Ábalos et al., 2003; Gómez, 2013). Estas bacterias sintetizan los PHA como compuestos de almacenamiento de fuentes de carbono y energía (Lenz y Marchessault, 2005; Ojumu, et al., 2004) y probablemente cumplen con otras funciones en la célula bacteriana. De esta manera, constituyen un grupo de materiales biodegradables de gran potencial biotecnológico (Arcos, 2007).

Figura1: Esquema del gránulo de PHA acumulado intracelularmente 2. METODOLOGIA

DIAGRAMA DEL PROCESO

Enfoque general: Proceso para la obtención de PHA a partir de la biomasa del Nostoc

En general, la producción de los PHAs consiste en tres etapas: (a) Fermentación, (b) Extracción o recuperación, (c) Purificación. En el proceso de fermentación se produce el crecimiento de la biomasa y se sintetiza y acumula el polímero. Posteriormente, se extrae y recupera el polímero de las células, y finalmente se lleva a cabo la purificación del mismo.

3. EXTRACCION DE POLIHIDROXIALCANOATOS La metodología reportada más frecuentemente para la extracción de PHA de la biomasa microbiana ha sido el uso de hidrocarburos clorados, especialmente la técnica utilizando reflujo con cloroformo (Fuchtenbusch et al. 1996). La solución de PHA resultante se filtra para remover restos de células, luego se concentra y el PHA se precipita en metanol o etanol (Fig. 9). Con esta técnica los lípidos de bajo peso molecular se queden en solución y no interfieren con la determinación. El uso de solventes clorados es más utilizado para la extracción de PHA de cadena corta como el P3HB, sin embargo, los PHA de cadena media son solubles en un rango de solventes más amplio. Debido a que el uso a gran escala de los solventes mencionados anteriormente puede ser costoso, también se han desarrollado otros procesos de extracción con base en el uso de etileno y propilen carbonato (Fiorese et al. 2009), así como metodologías que se basan en la liberación del polímero de las células mediante la ruptura de las mismas usando soluciones de hipoclorito de sodio, ácidos o bases.

Figura2: Esquema general de producción de PHA, en el que se indican las características de los procesos de fermentación, recuperación y procesamiento del polímero según su uso final (Babel y Steinbüchel 2001).

2.1 Análisis cualitativo METODO: TINCION CON AZUL DE NILO Es el método mas adecuado ya que por fluorescencia, los PHA desprenden un poco de brillo (la materia inorgánica se excita a una determinada longitud de onda), y se puede establecer una diferencia sin interferencias (López García, 2016). Descripción: a) Excitar la muestra por fluorescencia, de modo que resalte los PHB. b) Fijar por calor unas gotas de la muestra en un portaobjetos. c) Añadir azul de Nilo al 1% a 55°C por 5 minutos, d) Limpiar la muestra con una dilución al 8% de ácido acético en agua. e) Dejar secar.

f) Observar en un microscopio de fluorescencia. 2.2 Análisis cuantitativo METODO: CALIBRACION ESPECTROFOTOMETRICA Es el método mas conocido para hallar la concentración del componente en estudio del sustrato a partir de su absorbancia (López García, 2016). Descripción: a) b) c) d) e) f) g) h) i)  j) k) l) m) n) o) p) q) r)

Extraer cierta cantidad de muestra e introducirla en un tubo de DQO. Añadir 3mL de hipoclorito de sodio al 15% p/v. Añadir 5 gotas de NaOH al 50%. Añadir 3mL de cloroformo. Colocar toda la muestra en baño de agua a 70  – 75°C durante 1 hora y 30 minutos, agitando con el vortex cada 15 minutos. Centrifugar a 4200 rpm por 5 minutos y descartar el sobrenadante. Añadir 3mL de cloroformo, colocar en baño de agua hirviendo esperar a que se caliente el cloroformo y agitar con vortex 2 minutos. Centrifugar a 4200 rpm por 3 minutos. Extraer el cloroformo y verterlo en un matraz aforado. Añadir 2mL de cloroformo al tubo. Colocar en agua hirviendo, esperar a que se caliente el cloroformo y agitar con vortex por 2 minutos. Centrifugar a 4200 rpm por 3 minutos. Extraer el cloroformo, verter en matraz y enrrasar. Evaporar el cloroformo. Añadir 10mL de H2SO4 y poner en baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Esperar a que enfrie y agitar. Esperar a que el acido quede sin burbujas y medir en el espectrofotómetro a longitud de onda de 235nm. Extraer varias muestras en distintas fechas y repetir el procedimiento.

4. PURIFICACIÓN DE LA MUESTRA a) Separar la biomasa del caldo. b) Añadir un disolvente, para evitar el cloroformo (agente altamente contaminante) se suele utilizar carbonato de etileno o de propileno, así como metodologías de digestión química con hipoclorito de sodio, ácidos o bases. c) Centrifugar la solución resultante y filtrar. d) Precipitar el polímero en metanol o etanol. e) Recuperar el polímero por evaporación.

3.1 Análisis de parámetros de control 

pH: Mediante el potenciómetro. El pH del sistema debe ser neutro entre 7.5

 – 8.5. 

Aniones: Corresponden a nitritos, nitratos, fosfatos y sulfatos. El método de

medición es por cromatografía iónica. 5. SINTESIS DE BIOPLASTICO La norma ASTM- 5488-944, define la biodegradabilidad como la capacidad de un material en descomponerse en CO2, metano, agua y componentes orgánicos, por acción de microorganismos. Clasificación Plásticos biodegradables a base de almidón: Se crea una mezcla entre almidón y plástico (almidón-polietileno). Polihidroxialcanoatos: (PHA) Son polímeros 100% biodegradables producidos por microorganismos. Mezclas de polímeros biodegradables: Como los polivinilalcohol (PVOH) + Policaprolactonas (PCL) Pullulano. Formado por unidades de maltotriosa. (tres unidades de glucosa unidos por enlace α -1, 4). Las maltotriosas están unidas por enlace α-1, 6. PHA: Los polihidroxialcanoatos más comunes son el P3HB (ácido polihidroxibutírico), el PLA (Poliácido láctico o poliláctida), el PGA (Ácido poliglicólico), el P3HV (poly 3-hidroxivalerato) y el P(3-HHx) poli 3-hidroxihexanoato (Koller, Vadlja et al 2017). 

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6. METODOLOGIA PARA ELABORAR EL BIOPASTICO A PARTIR DE PHA El método más empleado es el cultivo por lote alimentado. En el cultivo de bacterias con producción de PHA asociada al crecimiento, se utiliza un sistema de lote alimentado en una sola etapa en la que se proporciona un medio enriquecido en nutrientes. En cambio, para el cultivo de bacterias que requieren la limitación de algún nutriente esencial, el método más empleado es el cultivo por lote alimentado en dos etapas. La primera etapa se lleva a cabo en un medio enriquecido en nutrientes para favorecer el crecimiento celular, y en la segunda etapa se limita la concentración total o parcial de un nutriente esencial para promover la síntesis de PHA. En esta segunda etapa, el incremento en biomasa se debe a la acumulación intracelular del polímero (Khanna y Srivastava, 2005). También se han estudiado métodos de cultivos mixtos por lote alimentado en dos etapas, en los que se usan dos tipos de microorganismos diferentes. Uno de los microorganismos transforma la fuente de carbono barata en sustratos asimilables para que el otro microorganismo los utilice para producir PHA (Tanaka y cols., 1993) Después del proceso de fermentación, para la recuperación de la biomasa, el caldo de cultivo se centrifuga y la biomasa precipitada se filtra. Para la extracción del polímero del interior de las células se usan normalmente disolventes clorados, especialmente por reflujo con cloroformo. Debido a que los disolventes clorados son altamente agresivos para el medio ambiente y para la salud humana, se han desarrollado otros procesos de extracción basados en el uso de carbonato de etileno o de propileno, así como metodologías de digestión química que se basan en la liberación del polímero mediante la ruptura de las células usando soluciones de hipoclorito de sodio, ácidos o bases. Una vez añadido el disolvente, la solución resultante se centrifuga y se filtra para eliminar restos de células. Posteriormente, el PHA se precipita normalmente en metanol o etanol y se recupera el polímero por evaporación del disolvente (Fiorese y cols., 2009) 7. CONDICIONES ADECUADAS PARA EL CULTIVO DE MURMUNTA Aldave (2015) asegura que el “cushuro” crece en ecosistemas que contienen cloruro de

calcio, sulfatos de magnesio y otros elementos que están en forma natural en las lagunas y que existen medios de cultivo para industrializar el Nostoc en laboratorio (Ver Tabla 1). Tabla 1: Medio de cultivo para la industrialización de Nostoc sp en laboratorio.

A) Tratamiento para la Utilización de Murmunta Se utilizó colonias de cianobacterias Nostoc commune “murmunta”, adquiridas en un

mercado local, hidratadas por 24 h en agua destilada y mantenidas en contenedores de polietileno de alta densidad en medio hidropónico y temperatura ambiente hasta su empleo. Las colonias fueron mantenidas con fotoperiodos de luz indirecta de 10 a 12 h por día (López García, 2016). B) Condiciones de crecimiento en el Biorreactor Se desarrolló en un biorreactor, que contenía las células algales del Cushuro, el medio de cultivo y la fuente de carbono, con dos luminarias a 50 µmol de fotones (3700 lux ambas luminarias), durante 12 horas (12 horas de luz, 12 horas de oscuridad), a una temperatura de 10 ± 2 °C, con constante suministro de aire. Las fuentes de carbono fueron: dióxido de carbono, bicarbonato de sodio y etanol (López García, 2016).

8. REFERENCIAS: 

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