El método DNS

El método elegido está basado en la medida de la cantidad de azúcares reductores (glucosa + fructosa) liberados durante la hidrólisis de la sacarosa, catalizada por la invertasa. Para ello se utilizará el reactivo 3,5-dinitrosalicilato (DNS; este reactivo fué introducido por Summer en 1921 para la determinación de sustancias reductoras en sangre y orina). En presencia de azúcares reductores el 3,5-dinitrosalicilato es reducido a 3,5-diaminosalicilato. Este compuesto presenta un máximo de absorción a 530 nm y, por lo tanto, el valor de la absorbancia a dicha longitud de onda será proporcional a la concentración de azúcares reductores (glucosa + fructosa) presentes en el medio. Reactivos • Sacarosa 0.3 M, 0.15 M, 0.075 M, 0.0375 M y 0.0187 M; utilizada como sustrato de la enzima. • Tampón acetato sódico 0.05 M de pHs 3.5, 5, 6.5 y 8.5 (normalmente se utiliza el de pH 5 por ser el óptimo) para mantener controlado el pH del medio de reacción. • Disolución acuosa de glucosa + fructosa (0.005 M cada una) que se utilizará como testigo de azúcares reductores para la construcción de la curva patrón. • 3,5-Dinitrosalicilato, el reactivo de color. La solución de DNS se ha preparado del siguiente modo: 2.5 g de DNS se disuelven en 50 ml de NaOH 2N a 80ºC; por otro lado, 75 g de tartrato sódico-potásico se disuelven en 125 ml de agua destilada y se mezclan las dos soluciones en caliente, completando el volumen hasta 250 ml con agua destilada. CURVA PATRÓN La curva patrón permitirá relacionar la absorbancia a 530 nm de los tubos con la cantidad de μmoles de glucosa y fructosa presentes en la disolución y, por lo tanto, haciendo el cálculo correspondiente, se podrá estimar la velocidad a la que ha funcionado la enzima (μmoles de sacarosa hidrolizados por la enzima por unidad de tiempo), es decir, su actividad.