El Laboratorio en El Diagnostico Clinico Tomo 2 Henry.abbyy

Henry

Laboratorio en el

Diagnostico Clinico Homenaje a

Todd-Sanford & Davidsohn John Bernard Henry, M.D.

Distinguised Service Professor Director. Pathology 200 College of Medicine Dircelo): Transfusion Medicine and Transfusion Medicine Fellowship Program Attending Pathologist, University Hospital Siale University of New York Upstate Medical University Syracuse, New York

Frederick R. Davey, M.D. Prolessor and Chair. Department ot Pathology.

Matthew R. Pincus, M.D , Ph.D. Prolessor ol Pathology. State University of New

State University ot New York Upstate Medical

York Downstate Medical Center; Chair.

University. Syracuse. New York

Department ot Pathology and Laboratory

Chester J. Herman, M . D , Ph.D. Professor ot Pathology, Emory University School ol Medicine: Director. Pathology. Grady Health System, Atlanta. Georgia

Richard A. McPherson, M.D. Prolessor ot Pathology; Chair. Division ot

Medicine. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York

Gregory A.Threatte, M.D. Professor ot Pathology; Director ot Core Laboratories and Outreach. Upstate Medical University. Syracuse, New York

Clinical Pathology. Department ot Pathology. Medical College ot Virginia. Virginia

Gail L. Woods, M.D.

Commonwealth University; Director. Clinical

Prolessor ot Pathology; Director. Clinical

Pathology. Medical College ot Virginia

Microbiology. University of Texas Medical

Hospitals, Richmond. Virginia

Branch. Galveston. Texas

Contenido

Sección I. Patología clínica / Medicina de laboratorio Gregory A.

Tetrault, M.D., John Bernard Henry, M.D.

1. L a b o r a t o r i o clínico: o r g a n i z a c i ó n , objetivos y p r á c t i c a John Bernard Henry, MD,Anthony S Kurec,

M

S.HIASCPI

DiM.WiUam

2 . L a b o r a t o r i o s d e consulta m é d i c a

K

3

Dcnwyler.M.7

...

50

Gregory A. Threatte, M o

3. Principios de i n s t r u m e n t a c i ó n

. .

60

Andy N.D. Nguyen. MSMÍ. MD.. Robert L Sunheimer, M S , MriASCPiSC, John Bernard Henry, M D.

4. A u t o m a t i z a c i ó n d e l l a b o r a t o r i o clínico

79

Rodney S. Markin, /no, cft.O.

5. I n t e r p r e t a c i ó n de los resultados de l a b o r a t o r i o

92

Motthew R. Pincus, M D, pii D, Naif Z. Abraham.]r.. M a. «i o.

6. I n f o r m á t i c a , t r a t a m i e n t o de i m á g e n e s e i n t e r o p e r a b i l i d a d

108

Raymond D.Aller, A I O , Ulysses J. Balis, MD

7. Estadística e x p e r i m e n t a l

138

Gregory A. Tetrault. M.D.

8. G a r a n t í a de calidad d e l l a b o r a t o r i o clínico

148

Gregory A. Tetrault, M.D.

Sección II. Química clínica Mathew R. Pincus, M.D., Ph.D., John Bernard Henry, M.D.

9. Evaluación de la función r e n a l , b a l a n c e de a g u a , e l e c t r ó l i t o s , e q u i l i b r i o ácido-base y gases sanguíneos

159

D. Roben Dufour, M D

10. I n t e r m e d i a r i o s m e t a b ó l i c o s , ionesinorgánicos y m a r c a d o r e s b i o q u í m i c o s del m e t a b o l i s m o d e l h u e s o

180

Elena Níkolova Hrístova, M D, John Bernard Henry. M D

21 I

11. H i d r a t o s de c a r b o n o Paul £. Knudson, Mo, Ruth S.Weinstock, M.R.PhO,John Bernard Henry. MD

224

12. Lípidos y d i s l i p o p r o t e i n e m i a Paul S. Bachorik, BiO, Margo A. Denke. MD . ¿van A. Stem, M D PhD. re A P. Bosyl M. Rifikind, MD.FR.CP

249

13. P r o t e í n a s específicas Richard A. McPherson. M o

14. E v a l u a c i ó n de la f u n c i ó n y el d a ñ o h e p á t i c o

264

D. Roben Dufour. M D

281

/5. E n z i m o l o g í a clínica D. Roben Dufour, MD. John A. Loa, n D.,John Bernard Henry, MD

16. Evaluación de la f u n c i ó n e n d o c r i n a

304

Joan H. Howanitz. Mo,John Bernard Henry. M o

17. Toxicología y m o n i t o r i z a c i ó n t e r a p é u t i c a de f á r m a c o s Matthew R. Pincus, M o, Hi a, Naif Z. Abraham Jr., M.D.. PhD.

•••

III

335

Sección III. Orina y otros fluidos Gregory A.

Threatte, MD.. John Bernard Henry, M.D.

18. E x a m e n básico de la o r i n a

367

Christine £ Füller, Mí), Gregory A. Threatte, M D, John Bernard Henry, M.D

19. L í q u i d o c e f a l o r r a q u í d e o , sinovial y líquidos serosos del o r g a n i s m o

403

Gregory P. Smith, M.D., Carl R. Kjeldsberg, M.D

20. L a b o r a t o r i o en a n d r o l o g í a y la e v a l u a c i ó n de la f e r t i l i d a d

425

Siddhartha Sarkar, Pi-.D.John Bernard Henry. M.D

21. T r a t a m i e n t o en el l a b o r a t o r i o de las tecnologías de r e p r o d u c c i ó n asistida

432

AndréVan Steirteghem.MD.PhD.

22. A s p e c t o s d e l l a b o r a t o r i o en el t r a t a m i e n t o de la gestación

446

Robert £ Wenk, M D . . M S , Miriam Blitzer. Hi.ü.

23. D i a g n ó s t i c o de l a b o r a t o r i o de las a l t e r a c i o n e s gastrointestinales y pancreáticas

462

David G. Heisig. M.D.. Gregory A. Theatte. MD., John Bernard Henry, M.D.

Frederick R. Davey, MD.,

John Bernard Henry, M.D.

24. E x a m e n básico de la sangre Michael W. Morris.

M S , DLMIASCPISH.,

479

Frederick R. Davey.

M D

25. H e m a t o p o y e s i s

520

Frederick R. Davey. Mo, Robert £. Hutchison. MD

26. T r a s t o r n o s e r i t r o c i t a r i o s

542

M. Torek Elghetany, M D, Frederick R. Dovey, M D

27. A l t e r a c i o n e s de los leucocitos

586

Robert £. Hutchíson, M D, Frederick R. Davey, M.D

28. P l a q u e t a s en sangre

623

Jonathan L Miller, MO.Ph.D.

29. C o a g u l a c i ó n , fibrinólisis e h i p e r c o a g u l a c i ó n

.

.

642

Elizabeth M. Van Cott, M D , Michael Laposata, M D , P h D .

30. I n m u n o h e m a t o l o g í a

660

WendyV. Beadlyng, M s. MTIASCPISRB, Laura Cooling, MD.MSI ,¡ohn Bernard Henry, Mo

31. M e d i c i n a transfusional

718

Leonard I. Borat, MD.MBA, Eduardo Delaflor Weiss, M D , John Bernard Henry, MO

32. H e m a f é r e s i s

. .

776

Jeffrey L Winters, M D . Alvaro A. Pineda, M D

33. A l m a c e n a m i e n t o de tejidos y células m a d r e

806

Charlene A. Hubbell. 6 s. MTIASCPISBÍ. John Bernard Henry, M D

Sección V. Inmunología e inmunopatología Richard A. McPherson, M.D.,

John Bernard Henry, M.D.

34. V i s i ó n g e n e r a l d e l s i s t e m a i n m u n e y de los t r a s t o r n o s inmunológicos

817

Richard A. McPherson, M.D.

35. I n m u n o e n s a y o s e i n m u n o q u í m i c a Ybshiro Ashihara, PII.D., Yosushi Kasahara, Pii.o., D.M.SC., Roben M. Nakamura, M

36. E x a m e n d e l a b o r a t o r i o d e l s i s t e m a i n m u n e c e l u l a r

821 D

850

He/ene MA Paxton. M.S„MTIASCPI, Susanna Cunningham-Rundles, гьв. Maurice R.G. 0 Gorman, M.Sc.РЛ.О.D/ABMUI

¡V

Contenido

37. E v a l u a c i ó n del f u n c i o n a m i e n t o de las i n m u n o g l o b u l i n a s y la i n m u n i d a d h u m o r a l

878

Richard A. McPherson, MD

38. C o m p l e m e n t o y cininas: m e d i a d o r e s de la i n f l a m a c i ó n

892

Ene Wagner, pt¡o. Haixiang Jiang, Mo.fto. Michael M Frank. MD

39. C i t o c i n a s y m o l é c u l a s de a d h e s i ó n

914

H Dons Massey, MD. FI¡ D. DO S . Richard A. McPherson, M D

40. A n t í g e n o l e u c o c i t a r i o h u m a n o : c o m p l e j o m a y o r de histocompatibilidad del h o m b r e

927

Armead H. Johnson. «iD. Carolyn Katovich Hurley. f i D . Roben]. Haraman. cwrMC.usn.MD,¡udnh A.Wade. 8 k

41. C o m p l e j o m a y o r de h i s t o c o m p a t i b i l i d a d y e n f e r m e d a d

949

julio C Delgado. M o, Edmond j.Yunis, MD

42. T r a s t o r n o s i n m u n o d e f i c i t a r i o s

963

Charlotte Cunnmgham-Rundles. MD.fhD.

43. Evaluación clínica de l a b o r a t o r i o de las e n f e r m e d a d e s r e u m á t i c a s sistémicas Carlos Alberto Yon Múhlen,

MO.F*D..

Roben M. Nakamura.

974

M O

44. Vasculitis

990

Rex M. McCallum. MD. David] Bylund. MD.

45. E n f e r m e d a d e s a u t o i n m u n e s organoespecíficas

1000

David / Bylund. M D. Roben M. Nakamura. M D

46. E n f e r m e d a d e s alérgicas

1016

Henry A. Homburger.MD.

47. D i a g n ó s t i c o y m a n e j o d e l c á n c e r m e d i a n t e m a r c a d o r e s t u m o r a l e s serológicos

1028

Jomes T.Wu. rto

Gail L. Woods, M.D., John Bernard Henry, MD

48. Infecciones víricas

1045

Michael Coste/lo, w D, Margaret Yungbluth, MD

49. Infecciones causadas p o r c l a m i d i a s , rickettsías y m i c o p l a s m a s

1072

Gail L Woods, « D . David H. Walker, MD

50. B a c t e r i o l o g í a m é d i c a

1088

barbara S. Reisner, i* o. Gail L Woods, M O

51. P r u e b a s de sensibilidad in vitro a los a n t i m i c r o b i a n o s

1119

Michael B. Smitli. MD, Gail L. Woods. Mo

52. Infecciones p o r e s p i r o q u e t a s

1131

Michael 8. Sm;(íi, M D . Randall T. Hoyden, MD . David H. Persing. M D . m D., Gail L Woods. M D

53. M i c o b a c t e r i a s

1144

Gail L Woods. MD

54. E n f e r m e d a d e s m i c ó t i c a s Washington C.Wmn.jr,

MD.MRA,

1158 Fred W.Westenfeld.

MIIASCPISM

55. P a r a s i t o l o g í a m é d i c a

1196

Thomas R. Fritsche, Mr>,mo,¡ames W. Smith, MD.

56. P a t o l o g í a m o l e c u l a r de e n f e r m e d a d e s infecciosas

1241

Martín G. Cormican, MD, Michael A. Pfaller, M.D

57. M a n e j o y r e c o g i d a de m u e s t r a s p a r a el diagnóstico de las e n f e r m e d a d e s infecciosas Gail L. Woods, MD

V

1254

Contenido

Chester, J. Hermán. M.D.. Ph.D., John Bernard Henry. MD.

58. I n t r o d u c c i ó n a la p a t o l o g í a m o l e c u l a r

1273

Chester / Hermán. MD..PII.D, John Bernard Henry. * I . D

59. Diagnósticos m o l e c u l a r e s : técnicas y principios básicos Ehzabelli R. Unger.

PIo.

MD,

Margaret A. Piper.

1275

PhD.MP.H.

60. R e a c c i ó n en c a d e n a de la p o l i m e r a s a y o t r a s tecnologías de amplificación

1287

james C. Zimring, MD. PI¡D. Frederick S. No/te, n¡o.

61. Tecnologías de la h i b r i d a c i ó n en serie

1296

jacques Scnrenzet. Mo Jonathan R. Hibbs. M D . David H. Persing. MD.PhD.

62. A p l i c a c i o n e s de la c i t o g e n é t i c a en la p a t o l o g í a m o d e r n a

1304

Constance K. Stein, PhD.

63. O r g a n i z a n d o un l a b o r a t o r i o de diagnóstico m o l e c u l a r

1333

Andrea Ferreira-Gonzalez. PhD, DavidA.WHkinson. MD.PhD.. Coríeton T. Garren, MD..PÍI.D.

64. O n c o p r o t e í n a s y d e t e c c i ó n t u m o r a l p r e c o z

.

1344

Motthew R. Pincus, M D Hi D, Paul W Brandl-Rauf. M D , Ph o. D . P H . William Koslosky, M o., William Appruzzese, PhD.

65. T é c n i c a s m o l e c u l a r e s en el diagnóstico de neoplasias h e m a t o p o y é t i c a s

1355

David S.Viswanatha, MD, Ridiard S. Larson, M D , PhD

66. D i a g n ó s t i c o m o l e c u l a r de las e n f e r m e d a d e s genéticas

1372

Wayne W. Grody. MD.. PhD, Walter W. Noli, MD.

67. P r u e b a s d e p a t e r n i d a d : e m p l e o d e l A D N , p o l i m o r f i s m o y o t r o s m a r c a d o r e s genéticos

1390

Herbert F. Polesky, M D.

68. P r u e b a s forenses d e i d e n t i d a d m e d i a n t e análisis d e l A D N

1402

Víctor W. Weedn. M o) D, Rlionda K. Roby, M P H

1. Soluciones fisiológicas, t a m p o n e s , indicadores ácido-base, m a t e r i a l e s de r e f e r e n c i a e s t á n d a r y t a b l a de conversión de t e m p e r a t u r a s

1417

2. Pesos ideales, superficie c o r p o r a l e índice de m a s a c o r p o r a l ( I M C )

1420

3 . C á l c u l o a p r o x i m a d o d e l v o l u m e n sanguíneo t o t a l ( V S T )

1424

4. Tabla p e r i ó d i c a de los e l e m e n t o s

1425

5 . U n i d a d e s del s i s t e m a i n t e r n a c i o n a l ( S I ) H. Peter Lehmann. Pít 0, jolin Bernard Henry, MD

VI

.. ...

1426

Autores

M a r t i n G . C o r m i c a n , M.D. Professor of Bacteriology (Medical Microbiology). Department of Bacteriology. Clinical Sciences Unit, National University of Ireland, Galway; Consultant Microbiologist. University College Hospital Galway. Galway. Ireland

Naif Z. A b r a h a m , Jr., M.D.. Ph.D. Staff Pathologist. Veterans Affairs Medical Center; Assistant Professor. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York R a y m o n d D. Aller, M.D. Clinical Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine. Emory University School of Medicine. Atlanta. Georgia: Vice President. Medical Affairs and Informatics. MDS Laboratory Services (United States). Nashville. Tennessee

M i c h a e l C o s t e l l o , Ph.D. Technical Director. Advocate Shared Services Laboratory. Park Ridge, Illinois C h a r l o t t e C u n n i n g h a m - R u n d l e s , M.D.. Ph.D. Professor, Departments of Medicine. Pediatrics, and Immunobiology. Mount Sinai School of Medicine. New York. New York

W i l l i a m A p p r u z z e s e , Ph.D. Staff Member and Clinical Assistant Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons. New York. New York Yoshihiro A s h i h a r a , Ph.D. General Manager. Research Laboratories. Incorporated. Tokyo. Japan

S u s a n n a C u n n i n g h a m - R u n d l e s , Ph.D. Professor of Immunology: Vice. Chair of Academic Affairs, Department of Pediatrics; Director. The Immunology Research Laboratory, Weill Medical College of Cornell University, New York. New York

Fujirebio

Paul S. B a c h o r i c k , Ph.D. Professor (retired). The Johns Hopkins University School of Medicine. Baltimore. Maryland

F r e d e r i c k R. Davey, M.D. Professor and Chair, Department of Pathology. State University of New York Upstate Medical University. Syracuse. New York

Ulysses J . Balis, M O Instructor in Pathology. Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital. Boston. Massachusetts

J u l i o C. D e l g a d o , M.D. Instructor. Department of Pathology. Harvard Medical School; Assistant Medical Director. HLA Laboratory. Dana-Farber Cancer Institute, Boston. Massachusetts

W e n d y V. B e a d l i n g , M.S., M T < A S C P ) S B B Assistant Professor. Department of Clinical Laboratory Science, State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York

M a r g o A . D e n k e , M.D. Associate Professor. University of Texas Southwestern Medical Center. Dallas. Texas

M i r i a m Blitzer, Ph.D. Professor and Chief, Division of Human Genetics. Department of Pediatrics. University of Maryland, Baltimore. Maryland

W i l l i a m K. D e t t w y l e r , M.T. Senior Consultant. Health Systems Concepts. Incorporated. Longwood. Florida D. R o b e r t D u f o u r , M.D. Professor of Pathology. George Washington University Medical Center, Washington. DC; Clinical Professor of Pathology. Uniformed Services University of the Health Sciences. Bethesda. Maryland; Chief. Pathology and Laboratory Medicine Service. Veterans Affairs Medical Center. Washington. DC.

L e o n a r d I. B o r a l , M . D . M.B.A. Associate Professor of Clinical Laboratory Medicine and Pathology, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark; Staff Pathologist, Jersey Shore Medical Center, Neptune. New Jersey Paul W. B r a n d t - R a u f , M . D , Ph.D., D.P.H. Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons,

M . T a r e k E i l g h e t a n y , M.D Associate Professor and Vice Chairman. Department of Pathology. University of Texas Medical Branch, Galveston. Texas

New York, New York D a v i d J . B y l u n d , M.D. Laboratory Director. Scripps Reference Laboratory. San Diego. California

A n d r e a F e r r e i r a - G o n z a l e z , Ph.D. Associate Professor. Medical College of Virginia. Virginia Commonwealth University; Technical Director of Molecular Diagnostics. Medical College of Virginia Hospitals, Virginia Commonwealth. University. Richmond. Virginia

Laura C o o l i n g , M . D . M.SC. Assistant Professor. Department of Pathology. University of Michigan Medical School; Assistant Director, Blood Bank and Transfusion Medicine, University of Michigan Hospitals. Ann Arbor. Michigan

vii

M i c h a e l M. F r a n k , M.D. Samuel L. Katz Professor and Chairman of Pediatrics, and Professor of Immunology and Medicine, Duke University Medical Center, Durham. North Carolina

J o n a t h a n R. H i b b s , M.D. Director, Bacteriology Laboratory Wadsworth Center. New York State Department of Health. David Axelrod Institute, Albany, New York

T h o m a s R. F r i t s c h e , M.D . Ph.D. Associate Professor, Department of Laboratory Medicine, University of Washington; Head, Clinical Microbiology Division. University of Washington Medical Center. Seattle. Washington

H e n r y A . H o m b u r g e r , M.D. Professor of Laboratory Medicine, Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine. Rochester, Minnesota J o a n H . H o w a n i t z , M.D. Vice Chair, Department of Pathology. State University of New York at Brooklyn; Director of Laboratories. Kings County Hospital Center, Brooklyn. New York

C h r i s t i n e E. Fuller, M D . Fellow, Department of Pathology, Washington University School of Medicine; Fellow. Department of Pathology, Barnes- Jewish Hospital, St. Louis, Missouri

E l e n a N i k o l o v a H r i s t o v a , M.D. Resident in Anatomic and Clinical Pathology. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York

C a r l e t o n T. G a r r e t t , M.D., Ph.D. Professor of Pathology, Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University; Medical Director, Molecular Diagnostics Laboratory, Department of Pathology, Medical College of Virginia Hospitals, Richmond. Virginia

C h a r l e n e A. H u b b e l l , B.S„ MT S M Clinical Faculty. University oí Vermont: Microbiology Manager (Chief Technologist) Fletcher Allen Health Care. Burlington. Vermont D a v i d S. W i l k i n s o n , M . D . Ph.D. Professor and Chairman, Department of Pathology; Professor of Health Administration. Medical College of Virginia Campus. Virginia Commonwealth University. Richmond, Virginia W a s h i n g t o n C . W i n n , Jr., M . D , M.B.A. Professor of Pathology. University of Vermont College of Medicine; Director, Clinical Microbiology Laboratory, Fletcher Allen Health Care. Burlington, Vermont J e f f r e y L. W i n t e r s , M.D. Assistant Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine; Associate Director of the Blood Bank. University of Kentucky Chandler Medical Center: Associate Medical Director. Central Kentucky Blood Center; Director of Transfusion Service. Cooper Drive Division of the Veterans Affairs Medical Center, Lexington, Kentucky Hemapheresis Gail L. W o o d s , M.D. Professor of Pathology; Director. Clinical Microbiology, University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas J a m e s T . W u , PhD Professor of Pathology, University of Utah Health Science Center; Director of Special Chemistry Laboratory. Associate Regional University Pathologists (ARUP). Salt Lake City. Utah M a r g a r e t Y u n g b l u t h , M.D. Associate Professor of Clinical Pathology, Northwestern University Medical School. Chicago: Staff Pathologist, St. Francis Hospital. Evanston, Illinois E d m o n d J . Y u n i s , M.D. Professor, Department of Pathology. Harvard Medical School: Director. HLA Laboratory, Dana-Farber Cancer Institute. Boston. Massachusetts J a m e s C. Z i m r i n g , M . D . Ph.D. Pathology Resident, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University. Atlanta. Georgia

CAPÍTULO 33

•

811

A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CÉLULAS M A D R E

de la sangre periférica tanto de pacientes como de donantes normales e incluso de placenta o sangre de cordón.

Células madre de sangre periférica El impulso para el desarrollo de tecnologías que permitieran la recogida de CMH de sangre pentérica fue su uso potencial para trasplante autólogo, en que el riesgo de contaminación de la médula con células tumorales es alto. Debido a la relativa facilidad de recogida de médula ósea por hemaféresis, las células madre obtenidas de sangre periférica se usan de forma creciente en el entorno alogénico. Un área de gran importancia puede ser la donación de no familiares o voluntarios, en la que más individuos pueden prestarse de forma voluntaria para los programas nacionales de donación de médula cuando la hemaféresis se ofrece como opción frente a la recogida tradicional de médula ósea. El procedimiento e instrumentación utilizados para la recogida de células madre de sangre periférica se describen el Capitulo 32. De forma clara, la mayor ventaja de las células madre obtenidas de sangre periférica frente a la médula ósea es el tiempo de injerto de neutrófilos y plaquetas, con una media de 8 a 12 días para las células madre de sangre periférica frente a las dos a cuatro semanas de la médula ósea (Gianm, 1989). Esta rápida recuperación claramente reduce la morbimortalidad asociada por neutropenia/trombopenia graves, asi como los costes asociados a la estancia hospitalaria, soporte transfusional. tratamiento de complicaciones y demás. Se sabía que las CMH estaban presentes en sangre periférica tras la recuperación de la quimioterapia (Richman. 1976). pero quedaba pendiente el desarrollo de sistemas de hemaféresis que permitieran una recogida segura de un adecuado número de estas células para proporcionar el injerto al receptor tras la quimioterapia (Kessmger. 1988). En la mayor parte de pacientes para trasplante autólogo. se ha establecido actualmente la recogida de un gran volumen de aféresis I14-201/ procedimiento) como un procedimiento eficaz para recoger un número adecuado de CMH en un razonable número de procedimientos para proporcionar una recuperación hematopoyética adecuada. Las CMH son morfológicamente indistinguibles de otras células mononucleares de la médula ósea o sangre periférica, por lo que resulta esencial la recogida de un número adecuado de células para asegurar el injerto medular en el receptor. El objetivo tradicional para las recogidas de muestras de médula ósea perseguía obtener un número suficiente de células nucleadas que permitiera asegurar un número mínimo de células madre. Los injertos de médula ósea pueden también ser evaluados para la actividad de células madre mediante el uso de técnicas de unidades formadoras de colonias (UFCs) (Iscove. 1971). Una muestra de células mononucleares del injerto se cultiva en medio de metilcelulosa con suplementos de factores de crecimiento hematopoyéticos y aminoácidos esenciales durante 10 a 14 días. Al final de este periodo, se examinan las placas buscando el número y características de las CFU, incluyendo Unidades Formadoras de Colonias Eritroblásticas (BFU-E), Unidades Formadoras de Colonias Granulociticas (CFU-GM) y Unidades Formadoras de Colonias mixtas de granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacanocitos (CFU-GEMM). Los grupos celulares que contienen más de 50 células se valoran como una colonia. Las muestras con más de 1 x 10 UFC por kg de peso del receptor se consideran adecuadas. A medida que la recogida de células madre evolucionó hacia el uso de procedimientos de hemaféresis de sangre periférica, se hizo necesario desarrollar un método que se :

pudiera realizar en el mismo día y que determinara el número de muestras de hemaféresis necesarias. El método más aceptado para valorar las muestras de células madre de sangre periférica es la cuantificación del número de células con antigeno CD34 por citometria de flujo. El antigeno CD34 se encuentra limitado a las células primitivas de todas las estirpes (Civin, 1989). La recogida de productos de hemaféresis utilizando el recuento de células CD34como índice de la eficacia del injerto se ha mantenido para el injerto hematopoyético (Berenson. 1991). La estandarización de la valoración de las células CD34 y la disponibilidad de los análisis de citometria de flujo han ocasionado que la medida de las células CD34+ se utilice por la mayor parte de los programas para determinar el número y adecuación de las muestras de células madre de sangre periférica (Sutherland, 1994). Generalmente, las muestras de células madre de sangre periférica con mas de 3 x 10 células CD34+ por kg de peso corporal del receptor se consideraban adecuadas para conseguir el injerto de neutrófilos entre 8 y 10 días. f

La recogida de CMH en el paciente no "movilizado' o donante requeriría múltiples procedimientos de recogida y aféresis, dado que el número de CMH en sangre periférica se encuentra entre 1/10 y 1/100 del número de células en la médula. En consecuencia, se requieren terapias de "movilización" para aumentar el numero de CMH circulantes y mejorar la eficiencia de la recogida por hemaféresis. Richman (1976) descubrió que mientras hay una caída en el número de células CD34+ circulantes después de la quimioterapia, esto era seguido por un aumento entre 4 y 5 veces en el porcentaje de células CD34+ a medida que el recuento absoluto de neutrófilos comenzaba a recuperarse, a menudo entre 14 y 21 días después de la terapia. Este aumento en células CD34+ circulantes es mayor con agentes quimioterápicos como citoxano y etopisida. Si la recogida por hemaféresis se realiza en este periodo ventana, se pueden recuperar grandes números de CMH con un limitado numero de procedimientos, incluso aunque el recuento total de leucocitos sea menor de 10.000'ul. Como el periodo de aumento de células CD34+ circulante es breve (dos a tres días), son críticos un estrecho control del recuento de leucocitos y células CD34+ circulantes del paciente, así como el control de los tiempos de recogida por hemaféresis. Además, algunos investigadores han señalado que la recogida de CMH en la fase de recuperación tras quimioterapia reduce la probabilidad de contaminación por células tumorales en el producto de aféresis. El uso de factores de crecimiento hematopoyético como el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito-Macrófago (GM-CSF) y el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito (G-CSF) produce igualmente un aumento significativo en el número de células CD34+ en sangre periférica (Siena, 1989). Dosis de 5 a 10 ug/kg de peso corporal durante 4 a 5 días causan un aumento de 5 a 10 veces en el número de CMH en sangre periférica. El uso de G-CSF aislado ha probado ser más eficiente que el cebado con quimioterapia para la recogida de células CD34*. La combinación de cebado con quimioterapia y el uso de factores de crecimiento (en especial G-CSF) provoca la máxima movilización de células madre pluripotenciales en sangre periférica, así como la necesidad de menor número de procedimientos de hemaféresis para recoger una dosis de CMH para trasplante, una estrategia empleada por la mayor parte de los programas de trasplante autogénico. Se ha investigado el uso de G-CSF en el donante alogénico sano para movilizar CMH y. salvo efectos leves como dolor óseo y cefalea, resulta bien tolerado (Anderlmi. 1997). De forma creciente, los programas de trasplantes

Tabla 33-6 Comparación de las tuentes y productos de células madre hematopoyéticas. Lugar de recogida y complicaciones Sangre de cordón (CMSC) Tipo de donante Producto Lugar de recogida Complicación principal

Sangre de cordón umbilical Célula madre de sangre de cordón Cordón umbilical de placenta en el nacimiento Insuficiencia de células madre

Autólogas (CMMO + CMSP) Paciente Médula ósea o CMSP Médula intraoperatona o hemaféresis Recurrencia de la enfermedad original

Alogénicas (CMMO + CMSP) Donante compatible familiar o no Médula ósea o CMSP Médula intraoperatona o hemaféresis Enfermedad injerto contra huésped

CMSP= células madre en sangre periférica; CMMO= células madre en medula Osea; CMSC= c é l u l a s madre en sangre d e

cofdon

812

S E C C I Ó N IV

•

H E M A T O L O G Í A , C O A G U L A C I Ó N Y M E D I C I N A TRANSFUSIONAL

están utilizando sangre periférica como fuente de CMH en lugar de médula ósea, tanto para trasplantes alogénicos como autogénicos.

Sangre de cordón umbilical Durante muchos años, se sabía que gran cantidad de unidades formadoras de colonias o células madre estaban presentes en la sangre del cordón umbilical, pero no fue hasta 1989 que se realizaron los primeros ensayos para utilizar células recuperadas de cordón umbilical de placenta para el trasplante hematopoyético (Gluckman. 1989). El éxito aparente de muchos de estos trasplantes precoces de sangre de cordón ha dado lugar a la organización de diferentes bancos de células de cordón en EE.UU. y en Europa en un intento por proporcionar otra fuente de células madre para los pacientes que necesitan un trasplante alogénico. Además, como las células madre se obtienen de sangre del cordón, parece haber un mayor grado de tolerancia para algunos tipos de incompatibilidad HLA entre donante y receptor sin que aparezcan los grados 3 ó 4 de la GVH. Como consecuencia, el trasplante podría estar disponible para algunos pacientes que de otra forma no tienen donante HLA compatible (Cairo, 1997). Las células madre de cordón umbilical se obtienen por canulación de los vasos placentarios, con la placenta todavía in útero o más frecuentemente, después del parto o por expresión directa de la sangre del cordón de la placenta después del mismo. El número de CMH recuperadas es directamente proporcional al volumen de sangre de cordón recogido, lo que depende del tamaño del niño/placenta y también de la experiencia del personal que recoge la muestra (Wagner. 1992). Volúmenes entre 40 y 150 mi son frecuentes en centros con experiencia. Esto permitirá obtener, aproximadamente, una muestra de 4 a 11 x 10 células nucleadas. Las muestras de volumen insuficiente (

Un EIA heterogéneo (Fig. 35-13) consta de los siguientes pasos: 1. La fase sólida unida a los reactivos se mezcla con el analito. independientemente de si el ensayo se basa en el formato competitivo o no competitivo. 2. Después de la adición del conjugado y la incubación, hay unos pasos de lavado con una solución tamponada que contiene un detergente, uno o dos pasos después de la inmunorreacción. La reacción inmunológica debe alcanzar determinados niveles para obtener un ensayo preciso y estable.

3. La fase sólida, con el complejo inmune que contiene el antígeno conjugado a una enzima o un anticuerpo, se incuba a temperatura constante con la solución de sustrato enzimático. 4. La reacción enzimática se detiene (no es necesario en el ensayo de tasas) y el producto de la reacción se mide con varios detectores dependiendo del sustrato empleado.

Ensayo

enzimático

colorimétrico

En este ensayo, la reacción enzimática se realiza utilizando sustratos cromogénicos para desarrollar un color mediante la reacción catalítica principal. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano, catalizando el ABTS [sal de diamonio de 2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolina-6-sulfonato)] con H 0 para dar un color verde, y la fosfatasa alcalina, especifica para el p-nitrofenil fosfato para dar un color amarillo. Ambas enzimas son los tipos más utilizados en los inmunoensayos enzimáticos colorimétricos. Un espectrofotómetro se utiliza para medir la densidad óptima del cromógeno resultante. Existen diversos instrumentos posibles que permiten medir la densidad óptica en tubos o placas de microtiter pasando desde un sistema completamente automatizado que hace desde el pipeteo de la muestra hasta la impresión de los resultados, hasta instrumentos manuales más sencillos. Cuando la reacción EIA se hace sobre una membrana de nitrocelulosa (método de transferencia Western) u otras membranas, se emplean sustratos que generan tintes insolubles. Un test de embarazo para la hCG en un formato de inmunoensayo que se vende sin receta, a menudo utiliza derivados de la benzidina que reaccionan con la peroxidasa, o derivados del indoxil fosfato que reaccionan con la fosfatasa alcalina para generar precipitados coloreados. El precipitado de color que se acumula en la fase sólida por la acción de la enzima puede detectarse a simple vista. Teóricamente, la medida de la densidad óptima está limitada por un rango de entre O y 2.0. Asi, la determinación de la densidad óptica de analitos que requieren un amplio rango puede resultar problemática, incluso cuando se emplean un exceso de conjugado y fase sólida con suficiente capacidad de captura en un ensayo de tipo sandwich. 2

2

Los esfuerzos para mejorar los EIA, un punto clave en el desarrollo de los inmunoensayos no isotópicos, han sacado a la luz diversas desventajas de los RIAs, como son los residuos radiactivos, radiólisis de los analitos marcados, y la corta vida media del l. Ishikawa (1989) desarrolló un EIA ultrasensible que puede detectar 3 fmoles de una IgG específica. Para alcanzar este nivel de sensibilidad, se requieren varios pasos tediosos, como la transferencia del inmunocomplejo de una primera fase sólida a otra distinta para reducir las señales de fondo. l25

Inmunoensayo

L-

ENSAYO de anticuerpo

Figura 35-13. Principios del inmunoensayo enzimático (EIA) empleando la fase sólida: (A) ensayo de sandwich competitivo y (S y C) no compe'itivo.

enzimático

fluorescente

Los EIA fluorescentes son idénticos a otros EIA excepto en que utilizan sustratos fluorescentes. En un EIA fluorescente, el fluoróforo se genera por la reacción enzimática. Después de la excitación del fluoróforo a su longitud de onda de excitación óptima, se emite luz a una longitud de onda característica. Instrumentos como un fluorímetro requieren una fuente de suministro de la luz de excitación y un fotomultiplicador como detector de la emisión de flúores-

CAPÍTULO

AMI'I'I)

35

AMIM)

835

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A

Interim diario ( I

ESTADIO SI

Figura 35-14. Adamaniil 1,2-dioxetano tenil fosfato (AMPPD): un sustrato quimioluminiscente para la detección de la fosfatasa alcalina (ALP). La eliminación hidrolítica del grupo fosfato por la ALP genera una luminiscencia por intercambio electrónico iniciada químicamente (CIEFL: chemically initiated electron exchange lummiscence) con la descomposición del AMPPD mediante la liberación de dioxetano fenolato (AMPD) rico en electrones. La transferencia de carga del fenolato al anillo de dioxetano tiene lugar mediante la formación del intermediario de transferencia de carga (CT) y la consiguiente rotura del peróxido cíclico. Tiene lugar una liberación de energía con emisión de luz.

cencía. Pueden existir sustancias que emitan fluorescencia ya presentes en la muestra. Estas sustancias aumentarían la señal de fondo, lo cual puede interferir en la sensibilidad del ensayo. Así. se debe prestar atención a la elección de sustratos para los EIA para evitar estos factores. Comparado con los EIA colorimétricos, los ensayos fluorescentes generan una intensidad de señal que es al menos de un orden de magnitud mayor.

intercambio de electrones iniciado quimicamente (CIEEL: chemically ¡nitiated electrón exchange luminiscence). mediante la liberación del grupo dioxetano rico en electrones. Una quimioluminiscencia con una longitud de onda máxima de 477 nm se puede detectar desde unos pocos minutos hasta unas cuantas horas, dependiendo de la concentración de sustrato. El sistema de ensayo de la fosfatasa alcalina con el AMPPD tiene una sensibilidad de menos de 10 ' moles (Bronstein, 1989b. 1991: Kricka. 1991). El CL-EIA utiliza el AMPPD como sustrato para la fosfatasa alcalina, que se usa como sonda enzimática. El CL-EIA se puede llevar a cabo en un instrumento totalmente automatizado. Este nuevo sustrato hizo posible el desarrollo de sistemas de inmunoensayo quimioluminiscentes extremadamente sensibles. Se usan partículas férricas de 0.3 pm de diámetro como tase sólida para acortar el tiempo de mmunorreacción a unos 30 minutos y para proporcionar una mayor superficie de inmunoabsorcíon. La relación entre la señal quimioluminiscente y la concentración de analitos es lineal hasta unos siete órdenes de rango dinámico. La sensibilidad del CL-EIA (Nishizono, 1991) era 10 veces mayor que la de un RÍA convencional cuando se ensayó la AFP; se detectó un nivel de 30 pg/ml de AFP en un tiempo de ensayo de 30 minutos. Así. los nuevos sistemas de EIA quimioluminiscentes son una definitiva mejora sobre los RÍA en términos de sensibilidad, eficiencia temporal y simpleza del proceso y están ganando en popularidad en el mercado. 2

Inmunoensayo

enzimático

quimioluminiscente

Los inmunoensayos enzimáticos quimioluminiscentes (CL-EIA) emplean sustratos quimioluminiscentes que reaccionan con varias enzimas que se emplean como sonda La reacción enzimática quimioluminiscente genera luz. similar a la bioluminiscencia. e implica el uso de sustratos naturales como la luciferin-adenosina trifosfato (ATP). Durante los últimos 20 años, se ha prestado mucha atención a la aplicación de la quimioluminiscencia en los inmunoensayos. y se ha desarrollado una variedad de sistemas que combinan enzimas y sustratos. Sistemas actuales que emplean derivados del luminol con un potenciador para la peroxidasa. o derivados del dioxetano para la fosfatasa alcalina, consiguen inmunoensayos muy sensibles. Estos ensayos son efectivos como herramientas en el diagnóstico práctico. La reacción de oxidación enzimática de análogos del luminol se ha utilizado desde hace mucho en los CL-EIA. El empleo de peroxidasa con H,0- es un método frecuente que se puede cambiar por una enzima productora de H.O, como la glucosa oxidasa o la uncasa. El descubrimiento de los potenciadores por parte de Thorpe (1985) para la quimioluminiscencia basada en luminol mejora notablemente la sensibilidad del ensayo. Los potenciadores incluyen derivados del fenol y compuestos aromáticos. Por ejemplo, la luminol-peroxidasa con p-iodofenol como potenciador consigue un incremento de la emisión de luz de unas 2.800 veces en una mezcla de reacción optimizada. Este ensayo puede detectar la TSH a 0.04 mU/iil utilizando suero como muestra. Sin embargo, las reacciones oxidativas. como para el luminol. pueden tener interferencias por múltiples factores que causan un aumento de las señales inespecíficas de fondo (ruido). Bronstein (1989a) desarrolló un sustrato quimioluminiscente para la fosfatasa alcalina que difiere considerablemente de otros compuestos. Este nuevo sustrato se conoce como AMPPD (disodio 3-(4-metilespiro-[1,2-dioxetano3,2'-triciclo-[3.3.1.1]decano]-4-yl)fenil fosfato), un derivado del dioxetano de adamantilo. No requiere moléculas adicionales para la emisión de luz quimioluminiscente, a diferencia del luminol, que requiere compuestos oxidativos externos a las moléculas de luminol. AMPPD es una molécula nueva que constituye un sustrato completo porque está compuesta por un grupo adamantilo como estabilizador de toda la molécula, la unión de dioxetano como fuente de energía, el éster de fosfonlo como diana de escisión para la enzima, y un grupo fenilo para la quimioluminiscencia. todos incluidos en una sola molécula. La estructura de la molécula y el proceso de reacción para la generación de luz se muestran en la Figura 35-14. La escisión del enlace fosfoestérico del AMPPD por la fosfatasa alcalina desencadena la luminiscencia por

Inmunoensayos enzimáticos homogéneos Origen Existen dos opciones para evitar procesos tediosos en el ensayo. Uno es diseñar instrumentos totalmente automatizados con acceso a tipos heterogéneos de reactivos, y el otro es desarrollar reactivos innovadores que no requieren pasos de lavado complicados, como los que requieren los EIA heterogéneos. Las enzimas y sus cofactores son sondas ventajosas en los EIA homogéneos porque la actividad enzimática se puede modular fácilmente cambiando los factores presentes en el microambiente de la reacción Ag-Ab. Este no es el caso cuando se utiliza el decaimiento de un radioisótopo como señal. Actualmente, los EIA homogéneos son menos sensibles que sus equivalentes heterogéneos. Los EIA heterogéneos convencionales tienen una sensibilidad equivalente a la de los RÍA en muchas aplicaciones, mientras que los EIA homogéneos (Nakamura, 1998) mantienen una sensibilidad de uno o dos órdenes de magnitud inferior. Los EIA homogéneos pueden necesitar reactivos inmunoquímicos complejos, pero los sistemas de ensayo son rápidos y sencillos, y se pueden adaptar a instrumentos convencionales. Hay varios tipos de EIA homogéneos En cada uno de estos ensayos, la interacción antigeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima o de la sonda acoplada a la enzima en presencia de sustrato. La modulación de la actividad enzimática refleja el grado de reacción inmunoquímica. En la Tabla 35-7 aparece una lista de las características de los EIA homogéneos típicos. Los EIA homogéneos se pueden clasificar en ensayos de unión competitivos o no

836

SECCIÓN V

•

INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA

Tabla 35-7 Clasificación y características de un inmunoensayo enzimàtico homogéneo típico Nombre y tipo de ensayo Competitivo' EMIT SLFIA ARIS Inmunoensayo de canalización enzimàtica Inmunoensayo de enzima biolmilada y avidina CEDÍA No competitivo' Inmunoensayo de anticuerpo híbrido

s

Conjugado Antigeno con hsozima. G6PD Antigeno con sustrato Aniígeno con grupo prostético Antigeno con G6PD y hexocinasa Antigeno con avidina Antigeno con fragmentos de p-galaclosidasa

Tipo de modulación Inhibición alosténca Inhibición alosténca Inhibición alosténca Facilitación mediante proximidad Inhibición alostérica Inhibición aloslérica

Anticuerpos híbridos específicos para el Inhibición alostérica antígeno y el inhibidor Inmunoensayo de unión proximal Anticuerpo con G6PD y hexocinasa Cascada de suslratos por proximidad Anticuerpo con amilasa Inhibición alostérica EIHIA Anticuerpo con |J-galactosidasa y anticuerpo Electo de cargas Inmunoensayo enzimàtico mejorado frente al succinil Anticuerpo con peroxidasa Estabilización AEST • La negrita indica que el nombre de la enzima está escrito y la enzima descrita en detalle en el texto G6PD-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. De Kasahara Y: Homogeneous enzyme immunoassays En Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA (eds). Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s Washington, DC, American Society lor Microbiology. 1992a. pags. 169-82. con permiso.

competitivos. Los ensayos competitivos generalmente consisten en antigenos sin embargo, la unión de anticuerpos específicos para haptenos a su ligando acoplados a una enzima que funciona como sonda. Sin embargo, en otros for- causa la inhibición de la actividad enzimática. Los haptenos libres presentes matos de ensayo, el antígeno (analito) se puede conjugar al sustrato o a un en la muestra o en el estándar liberan esta inhibición compitiendo por la unión grupo prostético de la enzima. Por el contrario, los ensayos de unión no coma los anticuerpos. Asi, la actividad enzimática es proporcional a la concentrapetitivos emplean un conjugado compuesto por un anticuerpo acoplado a una ción de haptenos libres. Como regla general, el anticuerpo inhibe a la enzima enzima. De entre los distintos tipos de métodos mencionados, se presta espeinduciendo o impidiendo cambios conformacionales necesarios para la activicial atención a cinco EIA homogéneos. dad enzimática (Rowley, 1975). La excepción al mecanismo de inhibición es el ensayo EMIT para la tíroxina, que emplea la malato deshidrogenasa. En este ensayo, el conjugado de tiroxina-malato deshidrogenasa es inactivo enziInmunoensayo de multiplicación enzimática máticamente, pero pasa a una conformación activa cuando se une al anticuerpo anti-tiroxina (Ullman, 1979). Se cree que la tiroxina conjugada inhibe EMIT, el primer EIA homogéneo, fue desarrollado por Rubenstein (1972). la enzima mediante su unión al dominio catalítico, aumentando asi la K„ "apaEl sistema de EMIT está esquematizado en la Figura 3 5 - 1 5 . En el EMIT, la rente" del sustrato. El anticuerpo reactiva a la enzima sacando a la tiroxina del conjugación de las enzimas a haptenos no afecta a la actividad enzimática;

Forma inactiva del compi ej o enzimàtico

Enzima

Forma activa del con jugado enzima-analito Figura 35-15. Diagrama del sistema de inmunoensayo por multiplicación enzimática (EMIT) La actividad de una enzima que actúa como sonda está inhibida por la unión del anticuerpo con el antigeno (analito) conjugado con la enzima. El analito normalmente es un hapteno. Como enzimas se suelen usar la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la lisozima. En el ensayo, la actividad enzimática es proporcional a la concentración de analito. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]; Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)

CAPÍTULO 35

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837

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA

Haz de excitación Figura 35-16. Inmunoensayo con el sustrato marcado con una sonda fluorescente (SLFIA: substrate-labeled fluorescent immunoassay). El sustrato, la |>galactosilumbeliferona. se conjuga con el antigeno (analito) y forma un sustrato no fluorescente El sustrato puede ser escindido por la enzima (1 gaiactosidasa para formar un producto fluorescente. Sin embargo, cuando el conjugado sustrato-antigeno reacciona con un anticuerpo especifico para el antigeno, no se produce la escisión del complejo con la enzima (J-galactosidasa En este ensayo, la concentración del antigeno (analito) es directamente proporcional a la medida de la intensidad de lluorescencia. (De Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor Ihe 1990s. Washington. DC. American Society tor Microbiology ASM Press, 1992. con permiso.)

dominio catalítico. En el ensayo EMIT, la malato deshidrogenasa y la glucosa6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) han resultado las más útiles porque tienen menos probabilidad de verse afectadas por componentes del suero. Estos ensayos generalmente miden drogas a concentraciones de miligramos por litro. Sin embargo, el ensayo de la digoxina posee un limite de sensibilidad muy inferior, en un rango de 0,8 a 2 ug'l.

Inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado El inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado (SLFIA: substratelabeled tluorescent immunoassay) (Burd. 1977) emplea como conjugado un sustrato fluorogénico característico, el umbeliferil (i-galactósido, unido a un antigeno (analito). El producto fluorescente que se produce por la acción de la |Vgalactosidasa es la umbelilerona. La enzima fi-galactosidasa no puede actuar sobre el complejo sustrato-antigeno cuando reacciona con un anticuerpo especifico. El antigeno libre (analito) presente en la muestra compite con el antigeno conjugado con el sustrato para formar el complejo inmunología) (Fig. 35-16). La concentración del antigeno en la muestra es proporcional a la intensidad de fluorescencia del producto fluorescente resultante. Se puede emplear el SLFIA para detectar drogas y haptenos, y también para proteínas como la IgG y la IgM. Una desventaja de este método es que no se utilizan las propiedades de amplificación de la enzima, y por tanto, el sistema de ensayo tiene una sensibilidad limitada en un rango de concentración molar de analito de 10"' a 10 . ,c

Inmunoensayo de reactivación de la apoenzima El inmunoensayo de reactivación de la apoenzima (ARIS) es un ensayo homogéneo desabollado por Morris (1981) empleando el grupo prostético, que consiste en un dinucleótido de flavm adenína (FAD), conjugado al antigeno (analito) y la apoenzima glucosa oxidasa. Tal y como se muestra en la Figura 35-17, el antigeno (analito) y una cantidad constante del conjugado analito-FAD. com-

piten por una cantidad limitada del anticuerpo específico. En el equilibrio, el nivel de conjugado libre es proporcional a la cantidad de antigeno (analito) presente en la muestra. La apoenzima se combina con la forma libre del conjugado, pero no con la que está unida al anticuerpo, para reactivar la actividad de la glucosa oxidasa de forma proporcional a la cantidad de conjugado libre en la mezcla. La enzima activa se genera en este proceso, y además, se ha incluido un mecanismo de amplificación dentro de este ensayo. Se ha utilizado el ARIS para analizar la presencia de leolilma y de IgG (Morris. 1981. 1985). Este ensayo, que emplea el conjugado de FAD. se ha adaptado rápidamente a la medida de proteínas de elevado peso molecular (p. ej., tiroglobulma [TBG]) (Schroeder. 1985). y para otros haptenos como la fenitoma o diversas hormonas.

Inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática El inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática (EIHIA). desarrollado por Ashihara (1988), consiste en un anticuerpo conjugado con una enzima y un sustrato insoluole. Este ensayo es el más apropiado para la determinación de antígenos (analitos) grandes. El EIHIA puede ser homogéneo porque el complejo inmunológico del conjugado con un antígeno grande bloquea la reacción enzimática con el sustrato sólido (Fig. 35-18). La u-amilasa se ha utilizado como sonda enzimática para la detección de ferritína y AFP. La reacción inmune del analito con el anticuerpo conjugado con enzima puede alcanzar su máximo en unos 10 minutos: asi. el EIHIA basado en un ensayo de unión no competitiva requiere un tiempo de incubación menor para alcanzar un nivel de detección sensible. Empleando este método, el rango de medida de la femtina en suero es de 10 a 800 ng/ml y para la AFP es de 5 a 200 ng.ml. Se ha utilizado la dextranasa como enzima alternativa (Nishizono, 1988). También se ha aplicado el EIHIA en un formato sobre película seca (Ashihara. 1991). La película seca consiste en tres capas principales, cada una de ellas con una zona de revelado para la reacción inmunológica y enzimática. una zona de barrera, y una zona de revelado de color. Se utiliza un inhibidor especifico de la amilasa humana presente

838

SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Forma activa Figura 35-17. Inmunoensayo de reactivación apoenzimática (ARIS). Se emplea el antigeno unido al dinucleótido de tlavin adenina (FAD). La apoenzima es la apoglucosa oxidasa, que requiere FAD como cofactor para su actividad. En el ensayo, la concentración de antigeno (analito) es proporcional a la actividad enzimática generada. (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.) en suero para prevenir el londo que puede dar el suero. El ensayo para la detección de la proteína C reactiva del suero (CRP) se completa en 6 minutos, simplemente aplicando la muestra sobre la superficie empleando instrumental químico seco. Sin embargo, la sensibilidad del sistema sigue siendo inadecuada para su aplicación en analitos como pueden ser los marcadores tumorales.

Inmunoensayo mediante clonación de donadores de enzimas El inmunoensayo mediante clonación de donadores de enzimas (CEDÍA: cloned enzyme donor immunoassay) se consiguió por primera vez mediante la

aplicación de la tecnología de ADN recombinante a los inmunoensayos homogéneos por Henderson (1986). Microgenics Corp. (Concord, CA) fue capaz de sintetizar una proteína de p-galactosidasa dentro de un polipéptido de gran tamaño (una enzima aceptora [EA]) y de un polipéptido pequeño (una enzima donante [ED]). Las EA y las ED se reconstruyen para formar tetrámeros con actividad enzimática. En el ensayo (Fig. 35-19), un hapteno antígeno (analito) está unido a la ED. y el anticuerpo específico para ese analito se usa para inhibir el ensamblaje espontáneo de la enzima activa. Los antígenos (analitos) presentes en el suero del paciente compiten con los analitos en el conjugado de analito-ED por la unión al anticuerpo, modulando la cantidad de |í-galactosidasa activa que se forma. La señal generada por los sustratos de la enzima es

Forma activa

Forma inactiva Figura 35-18. Inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática (EIHIA). La enzima es la a-amilasa de Bacillus subtilis o la dextranasa de Chaetomium gracile. conjugada con el anticuerpo específico para un antígeno de alto peso molecular. El antígeno de elevado peso molecular puede ser la ferritina o la a-fetoproteina. La enzima ct-amilasa es inactiva cuando el conjugado enzima-anticuerpo ha reaccionado con el antígeno especifico. La forma activa de la enzima puede reaccionar con un sustrato insoluble. La concentración de antigeno es directamente proporcional a la actividad enzimática de la reacción del ensayo. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press. 1992, con permiso.)

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A

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Figura 35-19. Inmunoensayo de donadores enzimáticos clonados (CEDÍA). Los aceptores de enzimas se asocian con los donadores de enzimas para formar un tetrámero de p-galactosidasa activa. El anticuerpo inhibe la asociación del aceptor enzimático con el conjugado de antigeno-donador enzimático. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press. 1992, con permiso.)

directamente proporcional a la concentración de analito presente en el suero del paciente. El ensayo de la digoxina es un ensayo colorimétrico que no requiere pretratamiento ni prediluciones del suero. El sistema de ensayo es apropiado para su uso en analizadores químicos automatizados.

Resumen Los EIA pueden aplicarse a todos los sistemas antígeno-anticuerpo, incluyendo aquellos que implican a proteínas séricas, hormonas, drogas, otros antígenos y anticuerpos dirigidos frente a patógenos. Los EIA heterogéneos que emplean sustratos cromogénicos pueden tener una sensibilidad comparable a la de los RÍA, y han ganado en aceptación para su aplicación en varios inmunoensayos. Algunos EIA heterogéneos emplean sustratos sofisticados que generan luz quimioluminiscente y pequeñas partículas como fase sólida, y son lo suficientemente sensibles para detectar menos de 1 pg'ml de analito. Su sensibilidad es, pues, mucho mayor que la de los RÍA. Además, la manipulación del ensayo se encuentra muy simplificada en los instrumentos totalmente automatizados. En comparación con los EIA heterogéneos, los EIA homogéneos poseen ciertas limitaciones en cuanto a sensibilidad, rango de aplicación y su aplicación en analitos de gran tamaño. Además, la elevada señal de fondo (ruido) y la relativamente baja señal del ensayo son inevitables debido a la eliminación de los pasos de lavado para separar conjugados unidos de los libres. Los EIA homogéneos son ventajosos porque están basados en un formato sencillo de ensayo y se pueden adaptar a la instrumentación automática preexistente. En este momento, los EIA heterogéneos con instrumentos totalmente automatizados, siguen siendo la mejor elección en cuanto a sensibilidad y simplicidad, y en cuanto a motivos de seguridad, debido a que no requieren el uso de radioisótopos.

tisulares. Los ensayos inmunofluorescent.es en secciones tisulares se encuentran ahora muy establecidos en los laboratorios de anatomía patológica. Durante los últimos años, se han desarrollados muchos procedimientos de FIA para detectar concentraciones de drogas, hormonas y una amplia variedad de proteínas y polipéptidos (Nakamura. 1992a). Al principio de su desarrollo, los FIAs analíticos se vieron dificultados por el descenso de la sensibilidad debido a la fluorescencia de fondo presente en las muestras biológicas. Gradualmente, la sensibilidad de los métodos fluorimétricos fue mejorando, y se hizo posible la detección de analitos a concentraciones de 10 M. También se consiguieron avances gracias a la mejora de la instrumentación y la introducción de sustratos únicos con unas reacciones inmunoquímicas y enzimáticas más óptimas. 15

La selección del fluorocromo que se va a emplear como sonda es importante. La sonda debería ser estable y debería poseer un coeficiente de extinción molar y rendimiento cuántico elevados. También debería emitir en longitudes de onda apropiadas sin interferir con las reacciones del ligando con su anticuerpo. Cuando se irradian la mayoría de los fluoróforos o moléculas fluorescentes con una longitud de onda apropiada, un electrón de la molécula sulre una transición al estado excitado. A medida que el electrón vuelve a su situación inicial, se libera energía física en forma de un fotón de menor energía (mayor longitud de onda) que el de la luz excitadora. El espectro de fluorescencia muestra una longitud de onda de máxima emisión, característica de un determinado compuesto fluorescente. Una de las sondas típicas, el isotiocianato de fluoresceína (FITC), tiene un intervalo de tiempo inferior a 1 ns entre excitación y emisión, mientras que otros compuestos (p. ej., el europio) presentan una fluorescencia retardada con un intervalo de varios cientos de nanosegundos. Los diversos FIA se pueden clasificar en: 1) heterogéneos y homogéneos: 2) de ligando o anticuerpo marcado; 3) competitivos o no competitivos, y 4) de fase sólida o no sólida. Se discutirán los métodos más empleados.

INMUNOENSAYO FLUORESCENTE Inmunoensayo fluorescente heterogéneo Origen y clasificación Coons (1941) fue el primero en introducir el uso de compuestos fluorescentes como sondas inmunoquímicas para detectar antigenos en secciones

Los protocolos de FIA heterogéneos incluyen un paso de lavado para separar las sondas fluorescentes unidas de las libres. El procedimiento de este ensayo es similar al de los inmunoensayos enzimáticos heterogéneos y los

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA

radioinmunoensayos. La mayoría de los ensayos comerciales disponibles emplean un sistema con el antígeno unido a una lase sólida o un anticuerpo. El ensayo puede o no ser competitivo, una propiedad que comparte con los RIAylosEIA.

Método fluoroinmunométrico El analito reacciona en solución con un exceso de anticuerpos marcados. Los anticuerpos marcados residuales se unen al exceso de antígeno unido a una tase sólida. La matriz de tase sólida se lava y la intensidad de fluorescencia se relaciona inversamente con la concentración de analito. Este método es adaptable para el ensayo de haptenos y proteínas complejas. El FIA en fase sólida se desarrolló para el análisis serológico de anticuerpos trente a la rubéola, toxoplasmosis, antígenos víricos y anticuerpos antinucleares. Los métodos de FIA heterogéneos para la determinación de antigeno se desarrollaron para proteínas séricas y hormonas, incluyendo inmunoglobulinas. Cortisol, progesterona y tiroxina. La principal ventaja de los FIA heterogéneos es la reducción significativa de la interferencia de sustancias fluorescentes presentes de forma natural en muestras de pacientes, debido a la eliminación física de los tactores de interferencia en el paso de separación.

Ensayo inmunofluorimétrico por partición radial En los mmunoensayos por partición radial, se emplea una cromatografía radial y el ensayo se realiza sobre unos filtros de fibra de vidrio (Giegel. 1982). El procedimiento se ha automatizado para el ensayo de hCG y otros diversos analitos presentes en el suero (Rogers, 1986).

de excitación de luz polarizada vertical, los compuestos fluorescentes en solución emiten fluorescencia parcialmente polarizada. El principio de polarización de la fluorescencia fue aplicado por primera vez a los procedimientos de inmunoensayo por Dandliker (1970. 1973). La luz polarizada que se transmite a través de la muestra puede excitar la sonda fluorescente independientemente de su unión al anticuerpo. Sin embargo, como se muestra en la Figura 35-20. el movimiento térmico aleatorio da lugar a que pequeñas moléculas que contienen un hapteno se muevan libremente en la solución perdiendo su orientación polarizada. Cuando el antígeno sondado se une a un anticuerpo con una masa molecular superior a los 160 kDa, el movimiento molecular se reduce lo suficiente como para aumentar la señal polarizada. Estudios que emplean anticuerpos marcados o fragmentos de anticuerpos no detectaron cambios en la polarización al mezclar antígeno y anticuerpo marcado, aunque la reacción inmune hubiese tenido lugar. Este método es el más útil para la medida de antigenos pequeños y haptenos (Jolley, 1981). Abbott Laboratories ha adaptado este enfoque para el ensayo de muchas drogas y fármacos en el TDx (Abbott Diagnostics, Abbott Park. IL). Desarrollaron un analizador de nueva generación, el IMx. para medir moléculas de gran tamaño molecular como los marcadores tumorales. hormonas y antígenos relacionados con infecciones o anticuerpos (Fiore. 1988). Combinaron dos principios en el ensayo, la polarización de la fluorescencia y el inmunoensayo enzimálico con microparticulas (MEIA). La demanda de capacidades de acceso directo impulsó a Abbott a desarrollar un analizador de acceso directo, de alto rendimiento y totalmente automatizado, denominado AxSYM. Este sistema es ampliamente utilizado en laboratorios clínicos (Smith, 1993).

Fluoroinmunoensayo en tiempo real Esta metodología hace uso de una instrumentación especial y de sondas fluorescentes especiales para aumentar la sensibilidad del ensayo. Implica el uso de sondas fluorescentes que presentan una fluorescencia retardada con un período de tiempo de unos 100 ns o más entre la excitación y la emisión. Debido a que la mayoría de las sustancias responsables de la fluorescencia de fondo poseen un periodo de decaimiento corto, la medida de la fluorescencia retardada reduce significativamente los efectos de la fluorescencia de fondo. Esto se consigue con un fluorimetro en tiempo real, un instrumento especial que produce pulsos rápidos de luz que excitan al fluoróforo. La fluorescencia se mide un poco después de la excitación. Así, el efecto del fondo inespecífico, que generalmente decae en menos de 10 ns. puede descartarse (Halonen, 1973: Soini, 1983). Los fluoróforos que presentan fluorescencia retardada y que se han empleado en estos ensayos (Soini. 1979) incluyen los siguientes: 1. Derivados pirénicos con un periodo de decaimiento de casi 100 ns. 2 Algunos metales raros quelados que poseen un periodo de decaimiento muy largo de casi 50 ps a 100 ps. Incluyen el europio (Eu '), samario (Sm ') y terbio (Tb ). 3

1

3

Los fluoroinmunoensayos en tiempo real se han desarrollado para medir muchos analitos, incluyendo la hCG, IgG, Cortisol, insulina y otros.

Inmunoensayo fluorescente homogéneo Por definición, estos inmunoensayos se hacen en muestras homogéneas. No requieren la separación de los conjugados unidos y libres y. normalmente, no son sensibles a las interferencias de fondo de las muestras. Los FIA homogéneos también poseen la ventaja de ser rápidos Sin embargo, cuando se comparan con los ensayos heterogéneos, presentan ciertas desventajas. Los FIA homogéneos tienen una sensibilidad limitada de aproximadamente 10 molar con una instrumentación estándar. Pueden existir impurezas marcadas que aumenten las interferencias de fondo. Los ensayos requieren un antigeno marcado o anticuerpo especifico relativamente puros, y una instrumentación especial para alcanzar una mayor sensibilidad. 10

Ensayo de polarización de la fluorescencia Una lente polarizante o un prisma pueden resolver la luz en rayos de un solo plano. Cuando se observa desde un ángulo recto con respecto al haz

Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia de excitación El método de transferencia de la fluorescencia de excitación (FETI) (UHman, 1976) emplea dos sondas, la fluoresceína como donador de fluorescencia y la rodamina como aceptor. El ¡sotiocianato de fluoresceína (FITC) tiene un máximo de emisión de 525 nm y la tetraetilrodamma posee un fuerte pico de absorción a 525 nm. Asi. cuando el antigeno marcado con FITC y el anticuerpo marcado con rodamina se unen, se produce un apagamiento (quenching) de la lluorescencía del FITC. Este fenómeno implica una transferencia de energía de una sonda electrónicamente excitada a una sonda aceptora. La tasa de transferencia de la energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre las moléculas donadora y aceptora. Para que se produzca una reducción apropiada de la fluorescencia con el apagamiento, la distancia entre donador y aceptor debe ser de unos 50 a 70 A. Este método resulta útil para el ensayo de antigenos con determinantes antigenicos multivalentes. Porciones separadas de un anticuerpo especifico se marcan con fluoresceína y rodamina. La mezcla de anticuerpos marcados con fluoresceína y rodamina reduce la intensidad de señal de la fluoresceína ajustando la proporción y la cantidad de donador y aceptor para que puedan reaccionar en proximidad para permitir la transferencia de energía. Estos problemas se han superado empleando nuevos compuestos fluorescentes. Se han conseguido mejoras en el método FETI usando un marcador fluorescente como el criptato trisbipiridínico de europio (III) [Eu ] como donador y un fluoróforo como la aloficocianina como aceptor (Alpha. 1987: Malhis. 1995). Estos compuestos transitorios poseen un elevado desplazamiento de Stokes en el que el Eu excitado a 337 nm transfiere energía a través de una molécula aceptora a una excitación de 620 nm y finalmente emite luz fluorescente a 665 nm en un formato en tiempo real. Mathis (1993) ha desarrollado la transferencia de energía mediante la resonancia de fluorescencia (FRET) empleando un metal quelante de criptatos y lo ha aplicado a la detección de AFP y del antígeno carcinoembriónico (CEA) en el suero. CIS Bio International (Cedox. Francia) desarrolló un inmunoensayo homogéneo automatizado, KRYPTOR. para la detección de marcadores tumorales como el CEA. CA 19-9. CA 125 y AFP empleando la emisión del criptato amplificada en tiempo real (TRACE). La sensibilidad para la AFP era de 0.25 ng.'ml con nueve minutos de incubación 3

CAPÍTULO 35

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A

Baja p o l a r i z a c i ó n Figura 35-20. Principio del inmunoensayo de lluorescencia polarizada (FPIA). A. en la ausencia de anlígeno, el conjugado marcado con una molécula fluorescente (F) se une al anticuerpo. Debido a su gran tamaño molecular de más de 160 kDa. la rotación molecular del F unido se ve reducida y se mantiene la polarización 8. en la presencia de antígeno. hay menos conjugado unido ai anticuerpo, de modo que puede rotar libremente en la solución, dando lugar a una disminución de la señal polarizada.

Inmunoensayo de fluorescencia protegida En este ensayo (Nargessi. 1979). el antígeno proteico se marca con fluoresceína y a continuación se hace reaccionar con un anticuerpo específico para el antígeno. El anticuerpo especifico inhibirá estéricamente la reacción de un segundo anticuerpo específico para la fluoresceína. que funciona absorbiendo la fluorescencia de la fluoresceína cuando se une al fluoróforo. La habilidad del anticuerpo específico para la fluoresceína de interaccionar con la fluoresceina cuando está unida a la superficie del antigeno se ve disminuida. El procedimiento se puede emplear para el ensayo de concentración de anticuerpos o de antígenos (analtos) en un sistema homogéneo.

INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE Origen Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean como sonda moléculas que generan quimioluminiscencia, como pueden ser derivados del luminol. esteres de acridinio, o derivados del nitrofenil oxalato y tri-bipridil rutenio [Ru(bpy).'i con tripropilamina (TPH) para la electroquimioluminiscencía. Básicamente, el método del ensayo no difiere del de los inmunoensayos heterogéneos. RÍA y FIA. La generación de luz por derivados del luminol requiere OH iHfi. como iniciador químico, o H,0 con la peroxidasa como iniciadores de la quimioluminiscencia potenciada. Los esteres de acridinio estimulados químicamente con OH H O muestran un rendimiento cuántico quimioluminiscente relativamente elevado comparado con el luminol. Otras moléculas quimioluminiscentes incluyen la acuorina. un compuesto natural (Ador. 1998). Las sondas de compuestos quimioluminiscentes producen luz elelroquimicamente en la superficie de electrodos y se pueden aplicar en formatos de ensayo homogéneos. Tanto los CLIA que usan esteres de acridinio. como los elec;

;

tro-CLIA. se pueden aplicar para los ensayos de diagnóstico práctico, y sus características se describen a continuación

Ensayo quimioluminiscente usando esteres de acridinio como marcadores En este método (Weeks. 1983). los esteres de acridinio (Fig. 35-21) se conjugan directamente con moléculas proteicas. Los esteres de acridinio pueden reaccionar oxidativamente con el H-0 en condiciones alcalinas, para producir intermediarios muy energéticos que se descomponen en el fragmento excitado, generando luz. La emisión de luz por parte de los esteres de acridinio es muy rápida, en unos 5 a 10 segundos después del inicio de la reacción de oxidación. La quimioluminiscencia de tipo flash, como se conoce este proceso, posee una relación entre el espectro de emisión y el tiempo de reacción con una pendiente mucho más acusada que la quimioluminiscencia de tipo resplandor generada mediante enzimas. La sensibilidad de este ensayo es mayor que la de un RÍA, y lleva menos tiempo. La solubilidad de los esteres de acridinio y la estabilidad de los conjugados con proteínas durante periodos de almacenaje se han mejorado mediante la modificación de la molécula y la química de la conjugación. Esta tecnología probablemente aporte mejoras para los ensayos de algunos haptenos y de hormonas. ¿

Inmunoensayo electroquimioluminiscente El ECLIA emplea compuestos electroquímicos como sondas que generan luz electroquímicamente, asociada al ciclo reactivo de la reacción de oxidación-reducción. Con la optimización de las soluciones de reacción, la selección del método de conjugación apropiado y el desarrollo de compuestos como el Ru(bpy), y el TPA, se hizo posible aplicar la tecnología quimioluminiscente a los inmunoensayos (Blackburn, 1991). 2-

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Proteína Figura 35-21. Mecanismo del inmunoensayo quimioluminiscente con un éster de acridinio basado en la descomposición oxidativa.

2

El Ru(bpy), * tiene un sitio de reacción para la conjugación de analitos usando un reactivo de activación como el NHS. El Ru(bpy), -, conjugado con los anticuerpos, se puede aplicar a ensayos de tipo sandwich para moléculas grandes. El conjugado genera luz en la superficie de electrodos de oro. El Ru(bpy), - en una fase sólida y el TPA se oxidan en la superficie de los electrodos para formar Ru(bpy)/' y TPA ', respectivamente. El TPA-' pierde electrones de forma espontánea. El Ru(bpy) - puede generar una emisión de luz de 620 nm cuando vuelve a Ru(bpy)., - como estado basal a través de una reducción con TPA'. La eficacia de generación de la luz (rendimiento cuántico) depende de la proximidad entre el electrodo y el conjugado, y por tanto, de la difusión del conjugado. Los conjugados libres pueden generar más luz que los conjugados fijados a una fase sólida como resultado de una reacción inmune. Esto permite un acceso fácil al formato de ensayo homogéneo, pero un ruido de fondo relativamente alto interfiere con la sensibilidad del ensayo, al igual que en otros ensayos homogéneos. El protocolo de ensayo para la determinación de analitos es el siguiente: microparticulas magnéticas cubiertas de anticuerpo como fase sólida se mezclan con la muestra para permitir la reacción inmune. Después de lavar para separar los conjugados libres de los unidos, una solución con la fase sólida se introduce en un detector que posee un electrodo para medir la quimioluminiscencia. El limite de detección de un ECLIA se ha descrito de 0,2 ng/ml a 0,4 ng/ml para el CEA y de 0,4 ng/ml para la AFP. Este ensayo no requiere instrumentos complicados. Otra ventaja es que el ECLIA requiere menos tiempo para la detección de la señal que los FIA y otros CLIA. 2

3

1

3

3

2

AUTOMATIZACIÓN INSTRUMENTAL Y MODULACIÓN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO Sistemas de ensayo homogéneos A pesar de que muchos inmunoensayos homogéneos se han desarrollado para protocolos manuales descritos en este capítulo, la mayoría de ellos no han sido automatizados todavía. Para el método EMIT, se pueden adaptar analizadores químicos genéricos automatizados (Boyd, 1985). Algunos instrumentos están disponibles para los inmunoensayos fluorescentes homogéneos, pero estos sistemas no son intercambiables entre sí. El sistema CIS Bio KRYPTOR se ha desarrollado con características especiales, incluyendo el uso de un detector de fluorescencia en tiempo real, y usa un método de dos longitudes de onda para la corrección interna del estándar de intensidad de fluorescencia a 620 nm y 665 nm, haciendo posible que se aumente la sensibilidad del límite de detección.

Sistemas de inmunoensayo heterogéneos Hasta el principio de los años 80, la mayoría de los inmunoensayos heterogéneos se hacian de forma manual. Entonces Boehñnger-Mannheim (que se fusionó con Roche Diagnostics en 1998) desarrolló un analizador de acceso directo totalmente automatizado, el ES-600, basado en los inmunoensayos enzimáticos colorimétricos que empleaban la peroxídasa de rábano como enzima (Wu. 1987). Al final de los 80, muchas compañías trataron de desarrollar sistemas de inmunoensayo enzimático totalmente automatizados, que

eran de alto rendimiento, sensibles y de acceso directo. Los antígenos asociados con el inicio de una enfermedad infecciosa, citocinas y factores de crecimiento como la calcitonina, existen en concentraciones muy bajas en el suero, necesitando así un sistema de detección muy sensible para poder medir estos analitos (Nishizono, 1991: Isomura. 1994, 1999). De entre los muchos métodos, los ensayos quimioluminiscentes y sus enzimas son los sistemas de ensayo más sensibles capaces de detectar analitos presentes en concentraciones muy bajas. Los instrumentos totalmente automatizados de los que se dispone ahora son también capaces de utilizar inmunoensayos enzimáticos fluorescentes. Estos sistemas de ensayo se clasifican en varios grupos basándose en la generación y detección de las señales y el tipo de fase sólida. Con respecto a la detección de la señal, el AIA1200, 600 (Toso, Tokio. Japón) y el AxSYM (Abbott, Abbott Park, IL) emplean un método de fluorescencia del inmunoensayo enzimático que usa la fosfatasa alcalina con un sustrato especifico, el 4-metilumbeliferil fosfato. Hay tres tipos de sistemas disponibles para los inmunoensayos enzimáticos de quimioluminiscencia. Lumipulse (Fujirebio. Tokio, Japón). Access (Sanofi Diagnostics Pasteur. Caska, MN) y IMMULITE (Diagnostic Products Corp.. Los Angeles, CA) han utilizado un sustrato quimioluiminiscente estable, el fenilfosforiladamantildioxetano, para la fosfatasa alcalina (Nishizono, 1991; Patterson, 1994: Babson, 1991). El éster de acridinio como sonda quimioluminiscente se ha aplicado en el ACS 180 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY). En el ELECSYS 2010 (Roche Diagnostics. Indianapolís. IN), se usa el Rufbpy)/' como sonda quimioluminiscente (Erler, 1998).

Secuencia práctica del inmunoensayo en el sistema analítico La demanda de mercado esperaba una instrumentación capaz de realizar un gran número de ensayos con capacidad de acceso directo. Para cumplir estas necesidades, es necesario mejorar los reactivos y evitar el tedio que implican los inmunoensayos heterogéneos. Para simplificar el sistema para su posterior aplicación en un sistema de ensayo totalmente automatizado, se diseñaron cartuchos individuales de reactivos previamente empaquetados, o reactivos ya dispensados en cubetas de reacción. Un sistema genérico para los inmunoensayos con sondas heterogéneas está esquematizado en la Figura 35-22. El operador selecciona los componentes del ensayo mediante un programa de ordenador y carga los cartuchos de reactivos o las botellas para cada ensayo. Para un analito concreto, los cartuchos y la cubeta de reacción se introducen de forma automática en el instrumento. Las muestras se transportan a la posición apropiada para la dispensación. El ensayo está diseñado para emplear bandejas de reacción o rotores que automatizan los pasos de mezclado y separación, que dependen del funcionamiento de la primera y segunda inmunoreacción, y la reacción de generación de la señal. Todos los pasos de la reacción tienen lugar de forma secuencial en la línea de reacción y las señales generadas se miden mediante un detector. Los resultados del ensayo se imprimen en los siguientes 20 a 40 minutos y se envían automáticamente a través de la red al ordenador pertinente. El sistema puede tratar entre 60 y 200 ensayos por hora, procesando de 10 a 20 analitos en cada muestra en este sistema de acceso directo.

CAPÍTULO 35

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A

Instrumentación y puntos clave para un inmunoensayo heterogéneo Aunque el principio del ensayo es bastante similar en muchos instrumentos, pueden existir grandes diferencias entre los instrumentos con respecto al formato de la loma de muestras, control de la temperatura, la separación BF, el arrastre, flujo de los desechos y demás. Asi. debemos prestar atención a lo bien que funciona el instrumento después de su puesta en marcha.

Figura 35-22. Breve diagrama de un sistema de inmunoensayo totalmente automatizado en un laboratorio clinico de automatización.

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Cubeta de reacción En un sistema de inmunoensayo. es muy importante diseñar las características de la cubeta con cuidado para obtener datos reproducíbles. Los fabricantes emplean estas cubetas para posibilitar un maneto rápido de los reactivos y del acceso directo. Se ha introducido un tipo de cubeta en un solo paso que contiene los reactivos y la unidad de reacción en el sistema Lumipulse. El sistema Immulite emplea una unidad de reacción para la separación B.'F. El

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 35-8 Nueva generación de sistemas de inmunoensayo heterogéneos AIA-21 (TOSOH)

ACS:CENTAUR ARCHITECT (ABBOTT) (BAYER DIAGNOSTIC)

Sustancia marcada Sustrato enzimático Detector de la señal Formato del ensayo Pretratamiento Flujo de la reacción Duración del ciclo (seg) Duración de la reacción (min) Temperatura de la reacción Numero máximo de analitos Capacidad (ensayos/hora) Fase sóhda Tiempo del primer resultado (min) Separación B/F Método de muestreo

Liotilizado y empaquetado en porciones Recipiente de reacción Inmunoensayo enzimático fluorescente Fosfatasa alcalina 4-metilumbeliter¡l tosíalo Fluorescencia S-1. S-2, competitivo Si Rotatoria 30 10 o 40 min 37°C 20 120 Partícula magnética (bcad> 50 Campo magnético Pipeteando la sonda

Paquete de reactivos (en solución) Cubeta desechable Inmunoensayo quimioluminiscente Ester de acndinio Ninguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo Sí Rotalona 15 7 5-36 37"C 30 240 Partícula magnética 8-40 Campo magnético Chip desechable

Cubeta desechable Inmunoensayo quimoluminiscente Ester de acndinio Ninguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo Sí Rotalona 18 29 37"C 25 200 Partícula magnética 30? Campo magnético Sonda fija

Aulodilución de la muestra

Sí

Si

Si

Paquele de reactivos Cubeta de reacción Principio de la reacción

AxSYM (Abbott Laboratories) emplea otra unidad de reacción única que consiste en pocilios para el reactivo, la incubación y para la muestra dentro de una misma cubeta. El programa combina el contenido de esta cubeta en una unidad rnatricial. Esta última puede emplearse para captar la fase sólida de látex, seguida de una separación B'F y de una segunda reacción inmune de anticuerpo marcado con la fase sólida.

Tipo de toma de muestra y dispensación de fluido En general, el sistema por el que se dispensan los fluidos puede ser de dos tipos diferentes, un chip desechable o una punta fija. La contaminación entrecruzada de muestras debe evitarse en todos los sistemas de ensayo. Con el chip desechable se pueden prevenir por completo estas contaminaciones. En el caso del sistema con punta fija, aunque la muestra original se divida en varias alícuotas pequeñas, la contaminación entrecruzada sigue ocurriendo. Así, el sistema del chip desechable es la mejor forma de evitar la contaminación y de minimizar los desechos biopeligrosos. Por otro lado, el coste de emplear estos chips para el ensayo es superior al del sistema de punta fija. También deben tomarse en consideración las consecuencias medioambientales de los chips desechables.

Arrastre El arrastre de una muestra a la siguiente de un analito a una concentración extremadamente alta, puede a veces dar lugar a diagnósticos clínicos erróneos. Un tubo de plástico desechable para la muestra es la forma más sencilla de evitar este problema. Por el contrario, el sistema de punta fija tiene varias ventajas económicas como se ha mencionado antes. Asi, la mayoría de las técnicas que conciernen a la ingeniería de las muestras se han concentrado en minimizar el arrastre de la muestra mediante pasos de lavado y mantenimiento de la punta. Ahora, hay varias puntas fijas que permiten limitar el arrastre a menos de un orden de 10'. Incluso con un arrastre tan bajo, algunas muestras todavía crean problemas (p, ej., una muestra fuertemente positiva para un antígeno de superficie de la Hepatitis B [HBsAg]. seguida de una muestra negativa). En este caso, se puede emplear un sistema de software para comprobar dicho resultado, mediante un reanálisis automático de los valores positivos semanales que han seguido a resultados fuertemente positivos.

Separación B/F y sistemas de lavado En un inmunoensayo heterogéneo, el conjugado unido debe separarse de la sonda libre. Esta separación B'F depende de las características de la

Solución en una botella

ADVIA IMS (BAYER DIAGNOSTICS) Particulas secas en la cubeta de reacción Recipiente de reacción Inmunoensayo quimioluminiscente Fosfatasa alcalina? Foslato de dioxelano? Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo ? Rotatoria 36 20 37"C 36 100 Partícula magnética ?

Campo magnético Pipeteando la sonda (técnica del aceite) Si

fase sólida. Los sistemas IMx y AxSYM emplean micropartículas de látex como fase sólida y emplean una membrana porosa para atrapar el látex para la separación de particulas de la fase sólida de la líquida. Diagnostics Product Corp.. Los Angeles. CA ha desarrollado una unidad para los sistemas de separación B/F, en la que la solución de reacción sale de una unidad interior a una exterior de desechos, mientras que la fase unida permanece en un lecho de fase sólida (0,5 cm). Una ventaja de estos formatos, es que evitan la contaminación entrecruzada y el arrastre de una mezcla de reacción a la siguiente, y no requieren un proceso excesivo de lavado. Todos los demás sistemas emplean particulas magnéticas (magnette partióles y magnelic beads) en las que se puede conseguir una separación rápida y fácil, mediante la aplicación de un campo magnético.

Nuevos sistemas para la próxima generación (sistemas modulares) La Tabla 35-8 compara varios sistemas de inmunoensayo de alto rendimiento comercial que se han introducido en los últimos años. Muestra las especificaciones instrumentales de cada analizador. Reduciendo los tiempos de incubación y de reacción, se puede obtener un resultado rápido en unos 10 a 25 minutos. Así, es posible una máquina de alto rendimiento que realiza de 120 a 200 ensayos por hora. Además, varios fabricantes han demostrado un nuevo concepto de sistema, que alinea los distintos sistemas analíticos que se necesitan en un laboratorio clínico. Muchos laboratorios clínicos han introducido un sistema de transporte de muestras que se conecta con distintos instrumentos analíticos controlados de forma independiente. Sin embargo, algunos analizadores no son aplicables a este sistema porque la velocidad del instrumento o la duración de su ciclo no se puede armonizar fácilmente con el resto de software y hardware. Para solucionar estos problemas. ARCHITECT (Abbott Laboratories) es un ejemplo de una máquina de nuevo concepto, en el que un sistema de ordenadores puede controlar varios analizadores de inmunoensayo conectados a un analizador químico. El ADVIA IMS. basado en un concepto similar, ha sido introducido por Bayer Diagnostics (Tarrytown. NY), que puede realizar química clínica e inmunoensayos en una misma plataforma. Hay otras combinaciones basadas en este concepto todavía en desarrollo, que harán posible la simplificación del laboratorio clínico a un coste final inferior.

CAPÍTULO 35

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A

SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RÁPIDOS PARA SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIÓN AL PACIENTE Origen Una fuerte demanda para un ensayo que pueda realizarse en casa (p. ej., hCG para el diagnóstico del embarazo) ha simplificado el formato de los inmunoensayos: el ensayo debe ser sencillo, rápido y reproducible. Teniendo en cuenta estas metas, se han desarrollado muchos ensayos de hCG y esto ha dado como resultado una primera generación de formato de ensayo de inmunoensayo enzimático de flujo.

Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de ensayo por inmunofiltración) La Figura 35-23 ilustra esquemáticamente un instrumento típico de inmunoensayo de flujo, el ICON hCG (Hybritech Incorporated, San Diego. CA), que consiste en una membrana porosa con anticuerpo anti-hCG inmovilizado y un parche absorbente bajo la membrana (Valkirs. 1985). El principio del ensayo y el procedimiento se describen a continuación. Varias gotas de la muestra de orina se aplican sobre la membrana. La orina es absorbida por el parche y entonces se añade el tampón de lavado por goteo y a continuación una solución con un anticuerpo anti-hCG conjugado con la loslatasa alcalina.

Tiras reactivas También se ha desarrollado un formato en tiras reactivas que reduce el coste de los materiales en comparación con el formato del ensayo de flujo En este formato, la tira del ensayo contiene un área con un punteado de anticuerpo en la punta de la tira. El ensayo puede llevarse a cabo de la siguiente manera: 1) se introduce la tira en un recipiente que contiene la muestra; 2) se introduce la tira en un recipiente de lavado: 3) a continuación se introduce la tira en una solución de marcado: y 4) finalmente se introduce la tira en un revelador de color si es necesario.

Instrumentos inmunocromatográficos Con el fin de eliminar pasos de adición de reactivos en estos dos formatos, se han conseguido importantes mejoras empleando técnicas inmunocromatográficas. que han dado lugar a un inmunoensayo simple y rápido.

Membrana de nylon

c

845

La inmunocromatografía consiste en la separación B. F y generación de la señal simultáneas, seguidas de un flujo lateral sobre un material poroso, como una membrana de nitrocelulosa o una lámina de libra de vidrio. A través de la acción capilar de la membrana, el analito de la muestra puede migrar del extremo proximal al distal. donde existe un parche absorbente para mantener una velocidad de flujo capilar constante. La zona de carga de muestra, la de mareaje y la de detección se encuentran entre los dos extremos. El método inmunocromatográfico se clasifica en varios formatos. La Figura 35-24 muestra los formatos inmunocromatográficos típicos El extremo proximal se usa como puerto de carga de la muestra, y está conectado a un parche que contiene el antigeno o anticuerpo marcado, debajo del cual hay una membrana de nitrocelulosa en contacto con el parche que funciona como una zona de detección. El extremo distal de la membrana se encuentra unido a un parche absorbente que funciona como una fuente de fuerza capilar. La muestra, cargada por goteo, reconstituye el anticuerpo o antigeno conjugado con un coloide de oro o látex coloreado, que forma un inmunocomplejo con el analito que se detecta, y este complejo migra a la zona de detección. El anticuerpo o el antigeno inmovilizado en la zona de detección puede captar el complejo y formar una linea roja o azul positiva. El exceso de sustancia de mareaje migra hasta el parche absorbente. La fase móvil en una migración es la propia muestra. Muestras muy coloreadas debido a una elevada concentración de bihrrubina o hemoglobina, por tanto, pueden interferir en la lectura de los resultados a simple vista. En este formato, la señal que debe detectarse se produce en la zona de detección con una zona donde se concentran partículas coloreadas. Yamauchi y sus colaboradores (1997) han establecido un nuevo formato en plataforma en el que se puede llevar a cabo el EIA de forma automática, incluyendo un paso de lavado. El instrumento aparece de forma esquemática en la Figura 35-25. En este formato, la posición de cada una de las zonas es completamente diferente a la del resto de las mmunocromalografías mencionadas anteriormente. El extremo proximal tiene una solución de revelado, que hace posible que se lleve a cabo el proceso de lavado espontáneamente mediante el flujo capilar. La muestra se aplica sobre un parche que está en el centro del instrumento y contiene un conjugado marcado seco. El extremo distal se conecta a un parche absorbente. Se añaden dos gotas de la muestra al parche para que reaccione con el conjugado después de su reconstitución. La mezcla de reacción que contiene el inmunocomplejo formado por el analito y el anticuerpo marcado puede extenderse a ambos extremos. Cuando se abre el recipiente que contiene la solución de revelado, el sustrato deshidratado se reconstituye y pasa a ser el sustrato de la enzima soluble en la zona de detección. En este momento, el flujo se dirige hacia el extremo distal. Los componentes del suero y el exceso de conjugado que no ha reaccionado se lavarán hacia el parche absorbente. Si la muestra contiene el analito, el anticuerpo inmovilizado captura el complejo en la zona de detección para formar una linea coloreada. Este método presenta algunas ventajas que difieren de otros instrumentos inmunocromatográficos que se revelan con la muestra. En estos instrumentos, un suero hemolitico o lipémico puede interferir en la evaluación del resultado del ensayo a simple vista debido a un elevado color de fondo. Sin embargo, el tipo de instrumento anterior con un reservorio conectado puede no tener interferencias de estos componentes coloreados. Este instrumento ha sido útil en la detección de HBsAg. anticuerpos anti-HB (Yamauchi. 1997) y anticuerpos frente a T. pallidum (Hasegawa, 1995). La mayoría de los componentes, como la membrana, el parche absorbente y el compartimento para la muestra tienen su sitio dentro de un molde de plástico.

Resumen Los instrumentos de inmunoensayo rápidos y sencillos se resumen en la Tabla 35-9. Estos instrumentos se pueden clasificar en tres tipos principales (de flujo, Figura 35-23. Inmunoensayo de flujo, Sección transversal de un Hybritech ICÓN de impregnación o tiras reactivas y de inmunocromatografia) y combinaciones y vista superior del instrumento. Los anticuerpos de captación se encuentran inmovilizados en el centro de una membrana de nylon que posee un parche absorben- de estos tres formatos. La mayoría de los instrumentos inmunocromatográficos te para absorber el fluido de la muestra que no ha reaccionado, el conjugado mar- emplean conjugados marcados directamente, coloides de metal o látex coloreado. Estos tipos de formato resultan apropiados para la migración del inmunocado y el tampón de lavado. El ensayo puede llevarse a cabo de forma secuencial. complejo, junto con la migración de la solución de muestra. Sin embargo, muparecido a un inmunoensayo enzimático en dos pasos.

846

SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Figura 35-24. Tira reactiva para un ensayo inmunocromatográfico típico mediante adición de la muestra. El desarrollo del ensayo se muestra en la parte inferior de esta ligura. Generalmente, el extremo proximal funciona como porción de carga de la muestra y consiste en un parche que contiene el anticuerpo o antígeno marcado con látex coloreado o coloides de oro. El analíto de la muestra forma un complejo con el conjugado y migra a la zona de detección, inmovilizando asi el anticuerpo de captura para forma una linea coloreada positiva. El conjugado y la muestra sobrante migran al extremo distal de la tira.

chos de estos instrumentos requieren un gran volumen de muestra, de 100 iil a 200 ul. Por otra parte, aunque se necesita revelador, el instrumento de tipo EIA permite que el ensayo se desarrolle empleando una menor cantidad de muestra, 25 ul. La corriente actual de ensayos rápidos para POCT se orienta hacia ensa-

yos que emplean instrumentos de inmunocromatografía porque una persona con práctica, como puede ser un usuario en su propia casa o una enfermera, puede realizar el ensayo correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a diferencia de otros instrumentos de inmunoensayo (Kasahara, 1997).

Figura 35-25. Instrumento inmunocromatográfico que emplea EIA. Se aplica un método de amplificación sensible a la inmunocromatografía empleando una enzima. La muestra se añade en la zona de carga de la muestra en el centro de la tira. En este método, se emplea una solución de revelado como fase móvil, que puede servir como tampón de lavado. El dibujo de la derecha de la figura muestra una carcasa de plástico y los resultados de un ensayo para anticuerpos TP.

Tabla 3 5 - 9 Especificaciones sencillas y rápidas para los instrumentos de inmunoensayo Principio del ensayo

Nombre del kit ... . (analito)

Formato inmunocromatográfico Un paso Helisal One Step (Helicobacter pylori) (todo en uno) Biocard Troponin I test Clearview hCG II QuickVue One-Step hCG CARD-I-KIT Troponin I TROPT Troponin T Determine HBsAg BioSign Tumor

_. Tipo de muestra

Sangre

Volumen de muestra (ul) 5C 150-200

Fase móvil

Tiempo de reacción (min)

Sensiblilidad

Alojamiento

Plasma

5

Igual que ELISA

MP"'

15 5 3

0.1 ng/ml 25 mlU/ml 25 mlU/ml

MP MP MP

Cortecs Diagnostics Ltd. ANI Biotech oy Unipath Limited QU1DEL AboaTech Ltd.

Suero Orina Orina

3 gotas (75?)

Suero Orina Orina

Suero

4 gotas (100?)

Suero

5-10

0,1 ng/ml

MP

?

Sangre Sangre/suero Sangre/suero

150 50 50

Plasma Plasma/suero Revelador

5-15 15 5-10

0.1 ng/ml 1 ng/ml?

MP TS' '••IF

HBs Insta test

Sangre/suero

200

Plasma/suero

15-20

0.5 ng/ml

MF

EASY-SURE HBsAg

Suero

Suero

5-20

1 ng/ml

TC'

Revelador

-15

>4 ng/ml

MP

?

MP

2 ng/ml

ccMP MP CC

100-150

Fabricante

Roche Diagnostics' Abbott Princeton BioMeditech Corp. Morningstar Diagnostics West Wind Plus, Inc.

?

1

Toot

Dos pasos

PSA RapidScreen Test

Sangre

1 gota colgante

Triage Cardiac (Myoglobin CK-MB Troponin-I) AMRAD ICT Hepatitis B Espline HBs-Ag TestPack PLUS hcG EASY-SURE HIV 1/2

Sangre

?

Plasma

Sangre/suero

?

Sangre/suero

Plasma/suero Suero/orina Plasma/suero

25 25 40

Revelador Suero/orina Revelador

15 5 10

0.5 ng/ml 50 mlU/ml —

Orina

3

20 mlU/ml

22

Plasma/suero + solución del conjugado

15

3,1 ng/ml

rs

Distribution Dainabot

50

Tampón, etc.

2

10 ug/'ml

TC

Hybritech, Inc. Nyco Diagnostic

1 gota

Tampón, etc.

10

1

MP

Morningstar Diagnostic

?

Tampón. etc.

15

2 ng/ml

MP

Orgenics

Método inmunocromatográfico de tiras reactivas AimStick PBD Orina

Dainascreen HBsAg

Plasma/suero

ICON-II hCG NycoCard CRP

Suero Plasma de sangre completa Suero/plasma

Volumen de la inmersión

Formato de flujo

Chagas dobule-spot test Combinación de inmunocromatografia y flujo DoubleCheck HBsAg

Suero/plasma

15

5-15

Craig Medical Distribution. Inc. Biosite Diagnosticst

j

Amrad Corporation Ltd. Fujirebio Inc. Abbott West Wind Plus. Inc.

Craig Medical

MP = représense moldes de plástico (molóing plástic): TS = representa tiras reactivas {test strip): TC = representa una tapeta de reacción ((esí cara). CC = epresenta un tariete'o (cara case) •Datos de Towt (1995) t Datos de Bruni (1999)

j

848

SECCIÔN V

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INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOLOGIA

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CAPÍTULO 35

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A

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C A P Í T U L O

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Examen de laboratorio del sistema inmune celular • Helene M.A. Paxton, M.S., MT(ASCP) • Susana Cunningham-Rundles, Ph.D. • Maurice R.G. O'Gorman, M.Sc, Ph. D., D(ABMLI) CRITERIOS CLÍNICOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA INTERPRETACIÓN

851

Decisión de analizar Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria

FUNCIÓN GRANULOCITICA EN LA INMUNIDAD MEDIADA POR CÉLULAS

859

METODOLOGÍA: CITOMETRIA DE FLUJO Y DE IMAGEN

859

Hardware y otras herramientas

Significado clínico de las pruebas de inmunodeficiencia RECEPCIÓN Y ANÁLISIS

Efecto de la edad en la respuesta inmune

865

Inmunofenotipificación: aplicación a las muestras

Malnutrición y respuesta inmune

de rutina y leucémicas

Cáncer APROXIMACIÓN METODOLÓGICA A LAS PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR 853 Fases de estudio: fase de exploración Fases de estudio: fase de confirmación Fases de estudio: estudios analíticos de la inmunidad PROLIFERACIÓN LINFOCÍTICA COMO MÉTODO

Análisis del ADN Citometría de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad de fluorescencia CONTROL DE CALIDAD Y GARANTÍA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR

874

BIBLIOGRAFÍA

874

IN VITRO DE EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR

855

Inmunología celular Metodología: determinación de la activación y la proliferación linfocítica en la evaluación de la inmunodeficiencia celular El conocimiento dei sistema inmune se ha mejorado enormemente gracias a la detección de determinadas anomalías en pacientes con sospecha de déficit inmunitario. Estos avances han surgido de estudios de la diferenciación y función de las células inmunes normales, de la deleción experimental de genes, y de análisis detallados de síndromes de inmunodeficiencia humanos. Los nuevos abordajes experimentales han ayudado a dilucidar los mecanismos y las bases funcionales de la desregulación inmune en pacientes con mutaciones genéticas primarias (congénitas) del sistema inmune o de infecciones congénitas secundarias (adquiridas). Por ello, en general, las deficiencias inmunes no se pueden distinguir por la presentación clínica de las infecciones: la información genética está convirtiéndose en un importante componente para las pruebas e interpretación diagnóstica. La misión de la inmunología clínica de laboratorio es transformar las nuevas líneas de investigación en pruebas altamente estandarizadas y clínicamente relevantes para cada paciente en concreto. Los estudios del sistema inmune celular humano se han centrado principalmente en tres áreas: 1) deficiencia inmune primaria, que muestra el impacto de los defectos congénitos inmunes sobre la defensa del huésped; 2) enfermedades autoinmunes, donde es indudable el efecto de una actividad inmune excesiva o inapropiada; y 3) deficiencias inmunológicas adquiridas, en las cuales la infección daña directamente el sistema inmune, como en la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Además, los defectos inmunes celulares de enfermedades con características de mala función inmunológica, como las infecciones crónicas, el cáncer, la malnutrición o las lesiones traumáticas, proporcionan información esencial en la defensa del huésped mediada por la inmunidad.

El concepto general de inmunidad" a menudo se ha confundido con el de inmunidad humoral; esto es. la presencia de anticuerpos potencialmente protectores frente a un agente infeccioso introducido por una infección natural o por una inmunización. Debido a que la inmunología, como actualmente se utiliza en un laboratorio clínico, es una ciencia relativamente nueva (Moulin. 1989,1991), se ha tomado la epidemia del VIH para demostrar el impacto real de este poderosa y cambiante rama del sistema inmune. A diferencia de la inmunidad humoral, la función inmune celular es fundamentalmente compleja y difícil de medir. Las pruebas de inmunidad humoral básicas miden la producción de anticuerpos específicos elaborados en cierto momento como respuesta a una infección por un virus o microbio específico; en contraste, los análisis de la inmunidad celular miden las respuestas actuales. En la historia de los esfuerzos para diagnosticar las alteraciones inmunes primarias, como las deficiencias de los complejos principales de histocompatibilidad (MHC) clase I y II, o el síndrome del linfocito desnudo (BLS) (Tourame. 1979; Villard. 1997; Peijnenburg. 1999), se ha demostrado la importancia de la evaluación estandarizada en el laboratorio clínico de las deficiencias inmunes. El descubrimiento y el estudio de niños con trastornos relativamente raros pero muy importantes, como el déficit de adhesión leucocitario (LAD) (Springer. 1984: Etizoni, 1994) han llevado a desarrollar procedimientos metodológicos, a medida que se iba demostrando en estudios recientes cómo se presentan estos defectos de adhesión (Phillips. 1995; Marquardt, 1999). Nuevos estudios desde la identificación de la enfermedad granulomatosa crónica (CGD) (Barnes, 1970), muestran que este es un grupo de enfermedades heterogéneas con alteración en la actividad de la cadena respiratoria fagoci-

CAPÍTULO 36

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

tica. Los estudios de citometria de flujo introducidos por O'Gorman (1993) han sido útiles en la identificación del fenotipo de las familias (Atkinson, 1997). Actualmente, los pacientes con estos trastornos inmunitarios congénitos pueden ser candidatos al transplante (Godthelp. 1999; Stary, 1996; Leung, 1999) o, en el futuro, a la terapia génica (Malech, 1999). Como la mayoría de los linfocitos en sangre periférica son células en reposo, la reacción inmune celular debe reproducirse o generarse en el sistema de análisis. El sistema debe ser capaz de provocar la respuesta, mantener la reacción proporcionando todos los elementos disponibles in vivo asi como de conseguir un punto final medible. El campo de la inmunología clínica cambió radicalmente durante los años 80, debido al impacto de los importantes esfuerzos de investigación, incluyendo el uso de anticuerpos monoclonales para identificar células inmunes, el descubrimiento de la regulación de las citocinas de la respuesta inmune, y sobre todo por la tremenda necesidad de comprender y controlar la aparición epidémica del VIH. La aparición del VIH ocurrió casi de forma paralela a la posibilidad de identificar las células T CD4+. Los primeros análisis de la inmunodeficiencía funcional celular en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) estaban basados inicialmente en el análisis de la respuesta prolilerativa de los linfocitos (Siegal, 1981; Masur, 1981) y, desde entonces, han evolucionado en abordajes funcionales (Perfetto, 1997; Rosenberg, 1977; Zhou. 1998). En este capitulo se presentan las pruebas inmunológicas celulares actuales a la luz de tendencias futuras. La evaluación de la inmunidad celular está cambiando desde los análisis simples y puntos finales fijos hacia un análisis integrado de la función celular en varios niveles que reflejen las interacciones celulares como un proceso dinámico.

CRITERIOS CLÍNICOS PARA LA EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA INTERPRETACIÓN Decisión de analizar Aunque en teoría la interpretación de las pruebas inmunológicas comprende desde el abordaje diferencial minucioso hasta el cribado, en términos prácticos, la respuesta inmune del paciente se estudia en el contexto de la presentación clínica. Sin embargo, como las pruebas inmunológicas pueden ser caras y lentas, la elección de la prueba a menudo depende de la sospecha clínica. Como hay pocas pruebas de la inmunidad celular, si es que existe alguna, que sean total y específicamente diagnósticas, la interpretación debería realizarse con precaución. La responsabilidad del laboratorio de inmunología clínica es establecer un número suficiente de pruebas, realizarlas de forma sensata para conocer la naturaleza y la extensión de la alteración inmune y considerar un rango de posibles causas cuando se realice su interpretación. Normalmente, la decisión de analizar la respuesta inmune en un paciente surge por una de las razones descritas en la Tabla 36-1. El aumento o la inexplicable susceptibilidad a la infección, el aumento de la gravedad de infecciones habituales, o la reacción inusual a la inmunización son motivos para realizar una valoración inmune. Las infecciones inusuales, especialmente por agentes oportunistas o las infecciones graves que no responden al tratamiento, y ciertos estados alérgicos o atópicos también pueden requerir un análisis inmunológico. En estos últimos años, la posibilidad de la infección por el VIH ha reemplazado a la posible deficiencia inmune primaria como principal diagnóstico de presunción. Sin embargo, como se tratará pos-

Tabla 36-1 Presentación de una posible inmunodeficiencia Infecciones bacterianas frecuentes Reacción sistèmica a virus inusualmente grave Desarrollo de la infección debida a un organismo inusual como hongos o protozoos Reacción sistèmica después de la vacunación con virus vivos Historia familiar de infecciones recurrentes Exposición al virus de la inmunodeficiencia humana

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teriormente. esto puede hacer pasar por alto el diagnóstico de una enfermedad inmune primaria. Los cambios inmunológicos pueden acompañar a muchas entidades clínicas incluyendo los tumores malignos y el tratamiento de la hemofilia, de neoplasias, de enfermedades hematológicas como la anemia de Fanconi, la hemofilia, la trombocitopenia inmune, los trastornos linfoproliferativos como la histiocitosis, y las hemoglobinopatías como la anemia de células falciformes. la talasemia, además de un amplio grupo de anomalías cromosómicas como el síndrome de DiGeorge. el síndrome de Down, el síndrome de Bloom, la disqueratosis congenita de William, la epidermólisis ampollosa, y el síndrome de Duncan (trastorno linfoproliferativo ligado al cromosoma X). Las enfermedades autoinmunes como las enfermedades reumáticas, la enfermedad mixta del tejido conectivo, la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple y la miastenia gravis pueden asociarse con cambios inmunes celulares y se tratan más adelante en los Capítulos 43 y 45.

Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria Las características principales de la inmunodeficiencia primaria, o inmunodeficiencia supuestamente adquirida por infección con VIH. debe distinguirse de los cambios inmunes asociados a otras condiciones clínicas descritas. Incluso a menudo las lesiones traumáticas como las quemaduras o los accidentes que originan una gran pérdida de sangre o un daño visceral producen un periodo de vulnerabilidad a las infecciones. Además, otras situaciones como las enfermedades premalignas o las infecciones subyacentes no diagnosticadas pueden producir cambios inmunes que pueden parecer fenotipicamente idénticos a la inmunodeficiencia primaria. Mientras que la infección por el VIH puede diagnosticarse rápidamente mediante una determinación directa, el laboratorio de inmunología clínica se emplea frecuentemente como un campo de pruebas antes de obtener del paciente o del tutor legal el consentimiento informado para el análisis del VIH. Esto se basa en la observación de que entre los adultos VIH-positivos. casi siempre se observa un cociente CD4/CD8 invertido. Por lo tanto, como resultado de la epidemia actual de sida, el cociente CD4'CD8 invertido ha llegado a considerarse como un marcador de la infección por el VIH. Sin embargo, hay un cierto número de enfermedades que afectan al sistema inmune que pueden producir un cociente CD4,'CD8 invertido o un número de células CD4 tan extremadamente bajo como el VIH. Éstas incluyen, aunque no sólo están limitadas a estos, al síndrome de DiGeorge, el timoma benigno, el comienzo de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC), la enfermedad de Kawasaki, la malnutrición calórico-proteica y las neoplasias. En la Tabla 36-2 se muestran algunos ejemplos de inversión del cociente CD4'CD8 no relacionados con el VIH y con un número bajo de CD4. El lactante del caso n." 3 presentaba múltiples abscesos sépticos del tracto gastrointestinal (Gl) y se creía que tenía un trastorno de la inmunodeficiencia primaria. Sin embargo, esta evaluación se hizo después de un episodio de casi ahogamiento en una bañera en la que se encontraron indicios de un destapacaños. Las lesiones del tracto Gl por cáusticos produjeron lesiones múltiples e inusuales y un desequilibrio del conjunto de linfocitos T periféricos. El desequilibrio del conjunto de linfocitos T periféricos, pero no el daño del tracto Gl. se resolvió rápidamente. Esle caso también muestra la necesidad de llevar a cabo una prueba de confirmación tan pronto como sea posible cuando el paciente esté estable. Los trastornos de la inmunidad primaria casi siempre se presentan en el contexto de una infección o de cambios hematológicos. Los trastornos por inmunodeficiencia se tratan con detalle en el Capítulo 42. La evaluación de laboratorio a menudo requiere de una valoración por etapas, no solo para minimizar la extracción de sangre, sino para elegir adecuadamente entre las pruebas disponibles con vistas a un diagnóstico diferencial. Puede parecer que determinados diagnósticos de presunción se sospechan con demasiada frecuencia, por ejemplo, el síndrome de Wiskott-Aldrich, aunque éste necesita descartarse en casos de trombocitopenia inexplicada. Sin embargo, un síndrome de Wiskott-Aldrich puede pasarse por alto si sólo se valora la respuesta a mitógenos en lugar de la respuesta frente a antígenos. y con el tiempo el defecto inmune puede llegar a ser más importante, de forma que sean necesarias pruebas de seguimiento.

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 36-2 Cociente invertido CD4/CD8 y CD4 bajo en inmunodeficiencia no VIH Conjunto de linfocitos Caso estudio 1. Inicial 2. Inicial 3. Inicial 1 semana 4. Inicial 3 anos 5. Inicial a los 5 meses 6. Inicial al año 7. Inicial 8. Inicial 9. Inicial 10. Inicial al día

Edad

%CD3

%CD4

%CD8

56 73 29 43 89 93 83 76 36 51 0 64 65

26 18 15 25 62 36 51 18 25 42 0 20 26 18 45

29

3 años 6 años 3 meses

—

6 años 3 meses 4 meses 1 semana 12 años 8 años 50 años

—

72

L'-

IO 15 32 57 31 48 7 12 24 33 47 51 35

ABS # 209 330 762 2.846 B74 272 2.734 96 304 2.794 0 No hay dalos No hay datos No hay datos No hay datos

Diagnóstico Deficiencia idiopatica de CD4 Disqueratosis Inmunodeficiencia congènita R/0 Lesión caustica gastrointestinal Aplasia de glóbulos rojos Síndrome de Noonan Sindrome de Williams Sindrome de DiGeorge Talasemia Neutropenia inmune Melanoma uveal Posthipertermia

ABS * = Numera absoluto de linfocitos T CD4.

Significado clínico de las pruebas de inmunodeficiencia Un tema al que a menudo se enfrenta el director del laboratorio clínico es cómo evaluar el significado clínico potencial de la respuesta inmune alterada in vitro. Los estudios de trastornos relativamente bien definidos han demostrado que hay muchas diferencias significativas en el impacto clínico. Sin embargo, el uso de nuevas estrategias de pruebas puede ayudar en la clasificación de los pacientes según el nivel y extensión del defecto. Por ejemplo, los estudios del síndrome de DiGeorge (DiGeorge, 1974), clásicamente una tríada de aplasia tímica y paratiroidea y defectos conotruncales. mostraban que existían diferencias importantes en la gravedad de las infecciones que se asociaban con hallazgos relativamente similares de reducción del número de linfocitos T maduros y una pobre respuesta a mitógenos originada por la hipoplasia tímica. Inicialmente. se observó un alto grado de muertes asociadas a este síndrome, pero con las nuevas técnicas quirúrgicas y métodos anestésicos, se ha visto que un número significativo de niños parecen desarrollarse normalmente sin infecciones graves (Bastían, 1989). Sin embargo, algunos niños desarrollaron infecciones que no respondían al tratamiento y, finalmente, mortales y no hubo ningún modo de predecir la evolución. Recientemente, ha sido posible utilizar análisis del fenotipo linfocítico más exacto y analizar los niveles de los defectos inmunes en el síndrome de DiGeorge. Utilizando análisis longitudinales durante muchos meses y una aproximación paramétrica múltiple, parece que la gravedad puede predecirse mediante un bajo y consistente número de células T CD4, por la inversión del cociente CD4/CD8, y por la producción disminuida de la linlocina interleucina-2 (IL-2) (Cunninghan-Rundles. 1994). La investigación del significado de las deleciones monosómicas del cromosoma 22q11.2, que son la principal causa del síndrome de DiGeorge, del síndrome velocardiofacial y del síndrome de la anomalía conotruncal de la cara, ilustran la importancia de la nueva información genética. Sólo el síndrome de DiGeorge fue descrito originalmente como un trastorno de inmunodeficiencia. Los nuevos estudios orientados a la frecuencia de la inmunodeficiencia en los otros síndromes clínicos asociados con la microdeleción del cromosoma 22q 11.2 han mostrado que en más del 75% de los pacientes existe evidencia de compromiso inmune (Sullivan, 1998). La gravedad de la inmunodeficiencia no se correlaciona con ninguna caracteristica fenotípica particular. La función de las células T puede ser tan importante o más importante en la infección por el VIH que la pérdida de las células CD4^ o la tasa de pérdida. En algunas enfermedades asociadas con virus, hay una considerable incertidumbre sobre lo estrecha que es la asociación entre el délicit inmune detectado ex vivo y la función inmune in vivo (Landay. 1991; Lloyd. 1992). Mientras que los estudios recientes sugieren que la respuesta ortostática alterada (Rowe. 1999) puede explicar algunas formas del síndrome de fatiga crónica o que un aumento de las concentraciones plasmáticas del factor de necrosis tumoral a (TNF-a) pueden ser un marcador de enfermedad (Moss. 1999), no existe un conocimiento claro de la causa y el efecto.

Efecto de la edad en la respuesta inmune Los estudios recientes demuestran que el sistema inmune cambia durante proceso de envejecimiento (Gillis, 1981; Inkeles. 1977: Bogdan. 1994). Aunque hay una considerable variación en esto y muchas veces es una consecuencia del estado nutricional alterado (Mazari. 1998), es esencial que el laboratorio clínico proporcione resultados considerando distintos grupos de edad. El estudio de pacientes pediátricos presenta hallazgos particulares para el diagnóstico de laboratorio en la inmunodeficiencia. El desarrollo del sistema inmune en el niño no está completo al nacer y, además, los niños no han estado expuestos a una amplia variedad de agentes ambientales anormales y pueden ser vulnerables a las infecciones (Zola. 1996). La exposición congénita a un virus o la prematuridad aislada pueden asociarse con anomalías inmunes. Diferencias claves en la respuesta inmune pediátrica incluyen una marcada linfocitosis al nacimiento, una elevación de las células B, un aumento del cociente CD4+/CD8+, y la existencia de pocas células asesinas naturales (NK) (Fletcher, 1992: Yabuhara, 1990: Cunningham-Rundles. 1993). Estas diferencias se reflejan en las claras diferencias en el intervalo de normalidad de las subpoblaciones linfocitarias y deben tenerse en cuenta a la hora de evaluar los resultados (Denny, 1994). También, hay una importante diferencia en la respuesta a varios activadores comparado con los adultos. La respuesta neonatal de los niños prematuros a ciertos activadores microbianos puede ser más potente que la de los adultos o que la de los niños nacidos a término debido a los rápidos cambios en la regulación inmune (Veber, 1991: Cunningham-Rundles, 2000) o debido a diferencias fundamentales en la programación perinatal (Prescott, 1998).

Malnutrición y respuesta inmune Aunque generalmente se cree que la malnutrición es relativamente rara en los países desarrollados, aumenta la evidencia que sugiere que la malnutrición es relativamente frecuente, especialmente en ciertos grupos de edad (Pennington. 1996). La malnutrición se asocia con la inmunodeficiencia y origina una vulnerabilidad importante a las infecciones (Chandra. 1993; Cunningham-Rundles, 1996). Por ejemplo, el déficit de zinc puede presentarse como una inmunodeficiencia marcada que puede relacionarse con el déficit primario de la captación de zinc en el tracto Gl, con una acrodermatitis enteropática o con un déficit del zinc de la dieta (Moynalhan, 1974; Prasad. 1963). Las personas con hipogammaglobulinemia y malabsorción asociada que alecta a las concentraciones de zinc pueden mostrar una respuesta proliferativa in vitro pobre e infecciones que se resuelven con el aporte del zinc (Cunningham-Rundles, 1981). Esto está asociado con el hecho de que el zinc es necesario para la actividad biológica de la hormona tímica, necesaria en la producción de las células T luncionalmente maduras (Dardenne, 1982) y para la activación de las células T (Cunningham-Rundles, 1996. 1998). Hay una

CAPÍTULO 36

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

evidencia creciente de que el desequilibrio de los micronutrientes altera la respuesta inmune (Cunningham-Rundles. 1998. 2000) por efectos específicos en la respuesta inmune. La malnutrición puede ser un factor que aumente la complejidad de muchos casos clínicos. La interacción de las infecciones con el metabolismo alterado secundariamente a la respuesta de fase aguda puede provocar cambios transitorios en los oligoelementos que produzcan la supresión transitoria de la respuesta inmune. El estrés físico puede tener efectos similares y provocar un aumento de la vulnerabilidad a las infecciones en el contexto de la inmunosupresión (Cunningham-Rundles, 1999). Ésle es un proceso bidireccional. La alteración del crecimienlo puede ser el primer signo de la infección por el VIH en un niño VIH+ (Peters, 1998). Por ello, como por otras razones, la evaluación inmune debe ser un proceso continuo en el contexto del tratamiento o de otros análisis.

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un tipo especial de linfocito T de memoria con capacidad de proliferación reducida capaz de ayudar a la célula B (Kagnotf, 1993; Marsh. 1993). Tanto los linfocitos T de la lámina propia como los linfocitos T mtraepiteliales se desarrollan de forma relativamente independiente del timo y funconan de forma diferente a las células T de sangre periférica en el uso de la vía de transducción del CD2 en lugar de la vía del receptor de células T/CD3. Actualmente, las pruebas de la inmunidad mucosa no se realizan habitualmente en los laboratorios de inmunología clínica y. con raras excepciones, las células inmunes a estudiar corresponden al compartimiento de sangre periférica. Por esta razón, el uso de pruebas cutáneas in vivo y el examen de la respuesta inmune humoral en las vacunas halladas previamente es útil para el inmunólogo celular, ya que proporcionan otra forma de evaluación. En cualquier caso, la utilización de aproximaciones sucesivas y la repetición de análisis son muy informativas.

Cáncer La inmunodeficiencia primaria está asociada con el aumento de la incidencia de cáncer (Cunningham-Rundles. 1987), y cada vez está más claro que hay tumores que se desarrollan asociados a la infección por VIH (Davis. 1984; Chintu, 1995; Krown. 1996). En el paciente con cáncer, la inmunodeficiencia generalizada o la reducción en la respuesta ante un estímulo antigéníco puede asociarse al desarrollo de una neoplasia primaria, ocurrir durante las metástasis o estar causada por los efectos secundarios del tratamiento. La reducción en la respuesta inmune frente a los activadores no específicos estudiados ex vivo en ensayos de proliferación se correlaciona con el estado de la entermedad y tiene un significado pronóstico en la supervivencia (Heimdal. 1999). A menudo se observa en los pacientes con cáncer no tratado un cociente CD4/CD8 invertido y un aumento de la actividad celular supresora (Livisnton. 1987). Los estudios experimentales han demostrado que los tumores pueden suprimirse inmunológicamente pero conducen la respuesta inmune hacia una respuesta no protectora (Lee. 1997). El desarrollo de nuevos métodos ¡nmunoterapeúticos está aumentando, sugiriendo que la respuesta a antígenos específicos del tumor será más utilizada en el futuro (Stockert, 1998). Los ensayos sobre la respuesta inmune también pueden utilizarse en el seguimiento y evaluación de la respuesta a los tratamientos como la IL-2 (Lissoni, 1999) y las vacunas contra el cáncer (Hsueh, 1998). En general, la quimioterapia producirá una supresión transitoria de la respuesta inmune que se resolverá en un corto periodo de tiempo, mientras que la radiación puede tener efectos a largo plazo (Katz. 1993). La evaluación de la respuesta inmune en el paciente con cáncer requiere de la utilización de pruebas muy seleccionadas y el uso discriminante de pruebas y activadores, que refleje los procesos relevantes, así como especificidad en la respuesta.

APROXIMACIÓN METODOLÓGICA A LAS PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR Los estudios en humanos se han basado en la observación de las células inmunes de sangre periférica ya que el compartimento periférico es más accesible y más fácil de medir, pero esta aproximación puede no reflejar los sucesos regionales (Cunningham-Rundles, 1994a). Los conocimienlos sobre las diferencias entre la respuesta inmune sistémica y mucosa pueden explicar finalmente muchas paradojas actuales que surgen cuando se compara la respuesta inmune medida in vitro o ex vivo con la defensa del huésped in vivo (Xu-Amano, 1993). La función de la inmunidad sistémica celular parece estar regulada a través de los distintos patrones de funcionalidad de las citocinas tipo T coadyuvantes, de modo que cuando se producen las cilocinas T coadyuvantes tipo 1 (Th1), IL-2, e interferón-y (IFN-y). se favorece la defensa inmune celular del huésped. Cuando se producen las citocinas T coadyuvantes tipo 2 (Th2), IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10, se induce la respuesta de los Imfocitos B (Barnes, 1993; Yamamura, 1991). En contraste con la inmunidad sistémica, la actividad primaria de la respuesta inmune mucosa es proteger la mucosa bloqueando la entrada de microorganismos, toxinas y antigenos a través de la secreción y el transporte de la inmunoglobulina A (Ig A) a la luz del intestino, un proceso mediado por

Fases de estudio: fase de exploración La evaluación de la función inmune en un paciente con una posible inmunodeficiencia habitualmente se lleva a cabo en etapas. La primera consiste en una exploración de las posibles áreas de deficiencia y se resume en la Tabla 36-3. Estos estudios de exploración deben acompañarse de un análisis de citometria de fluyo apropiada de las subpoblaciones de linfocitos y, en niños, debe incluir del uso de marcadores de células B para evaluar posibles cambios en estas, que pueden aparecer transitoriamente en los neonatos y reflejarse con una baja población de células T. También se recomienda el empleo de un marcador de células NK en niños de más de 3 meses de edad, ya que los niveles de esta población pueden estar disminuidos o ausentes al nacimiento (Zola. 1983). Como existe frecuentemente una limitación en la sangre que va a ser extraída para estos estudios es esencial que la primera evaluación incluya paralelamente un recuento sanguíneo completo (CBC), en la muestra de sangre. Es esencial que se lleve a cabo el recuento diferencial. La etapa de exploración incluirá un panel de pruebas para evaluar la respuesta mitogénica y frente a anligenos proliferativos. La respuesta proliferativa de linfocitos frente a un grupo de activadores continúa siendo una de las herramientas más sensibles para evaluar la función normal, y cuando esta incluye un activador apropiado de células T y B puede ser utilizado específicamente para definir las áreas defectuosas. Aunque esto no se hace siempre, se recomienda la utilización de distintas concenlraciones de cada activador. Además, el tipo de tubo elegido para extraer la sangre es importante. El uso de tubos que contienen heparina de litio o ácido etilenediamintetraacético (EDTA) no se recomienda para ningún estudio de funcionalidad de linfocitos. Deben utilizarse tubos con heparina sódica (sin conservante) o con citrato dextrosa (ACD). La sangre extraída en tubos heparinizados también puede emplearse para el análisis por citometria de flujo, aunque el tiempo para la preparación de la muestra y su análisis es critico (Nicholson, 1993). La pregunta sobre cuándo debe extraerse la sangre es importante. En general, la mayoría de los datos se han obtenido con sangre extraída por la mañana y hay efectos circadianos que pueden influir en los resultados. Cuando esto no puede hacerse, es muy útil continuar manteniendo la uniformidad del tiempo de extracción para cada paciente individual. Este hecho es más crítico cuando se mide el número absoluto de los distintos linfocitos T en la monitonzación de la enfermedad por VIH o como parte de un ensayo clínico (Malone. 1990). Los estudios funcionales necesitan llevarse a cabo en sangre fresca anticoagulada siempre que sea posible (o sangre almacenada a temperatura ambiente en oscuridad durante menos de 24 horas) antes de que las células Tabla 36-3 Exploración básica en los estudios inmunológicos Recuento sanguíneo completo y análisis dilerencial Análisis de las subpoblaciones linlocitanas (numero y porcentaje de células B y T) por citometria de flujo Activación de linfocitos in vitro frente a mitógenos y activadores microbianos Inmunoglobulinas séricas, incluyendo subtipos de inrnunoglobulinas si hay evidencia de infecciones clínicas por bacterias encapsuladas En algunos casos, los niveles de inmunoglobulinas son normales pero se producen anticuerpos no fijadores heterogéneos, por tanto, se necesitan estudios adicionales

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

mononucleares se destruyan. Cuando la sangre se envía por avión u otro transporte a un laboratorio en otro lugar es extremadamente importante incluir un control paralelo de la muestra extraída de una persona sana que sirva como un estándar interno en el proceso de evaluación.

Fases de estudio: fase de confirmación Aspectos

generales

Una vez que se ha llevado a cabo el cribado de cada individuo y se observen evidencias de posibles lagunas, estas pruebas deben confirmarse repitiendo pruebas sobre aspectos específicos de las primeras series. Como poco, debe realizarse un prueba positiva o negativa (rango normal y rango anormal). Pueden añadirse pruebas adicionales que proporcionen el punto de partida de estudios analíticos. Es importante organizar apropiadamente la extracción de sangre cuando el paciente se encuentre en el estado más estable clínicamente. Se recomienda realizar por duplicado los estudios básales antes de llevar a cabo una intervención, o incluso en la fase de confirmación. En algunos casos de posible inmunodeficiencia puede haber un secuestro de células inmunes, que se refleja en porcentajes bajos de linfocitos T en el compartimento periférico, como se muestra en la Tabla 36-2. Caso #3. La etapa de confirmación también debe incluir una cuidadosa reevaluación de la historia médica de los pacientes y de la historia familiar. Los estudios que se deben utilizar en esta etapa de confirmación se muestran en la tabla 36-4.

Persistencia

timica

El roentgenograma de la silueta tírmca puede no ser suficiente, ya que el timo tiende a la depleción por estrés (Haynes, 1998). Aunque es difícil determinarlo con seguridad, se ha visto que el tamaño real del timo evaluado por resonancia magnética nuclear (MRI) se correlaciona con el número de linfocitos CD4+ en la infección por VIH (Vigano' A, 1999). Estudios recientes sugieren que el timo humano puede considerarse como un órgano compuesto por tejido linfoide central y periférico. Haynes (1998) ha postulado que la atrofia epitelial del timo puede resultar en parte de las atocinas o de otros tactores producidos por las células inmunes periféricas del espacio tímico penvascular. Como se describe en la sección específica sobre la evaluación por citometria de flujo de las subpoblaciones de linfocitos T. la expresión de antígenos de maduración normales adquiridos durante el desarrollo tímico será suficiente para identificar la presencia de un timo funcionante.

Tabla 36-5 Causas de anergia en la prueba cutánea Falta de historia antigénica apropiada cuando el panel no incluye activadores ubicuos Inmunodeficiencia primaria inlecciones víricas Malnutrición Enfermedades granulomatosas Neoplasias

».

neas de hipersensibihdad retardada ha mostrado una buena correlación global entre la falta de reactividad, llamada anergia, y la inmunodeficiencia (Mass. 1998) pero no ha sido útil como herramienta analítica para determinar la razón de la falta de respuesta. La prueba cutánea no es muy cuantificable. El empleo de la prueba cutánea con derivados proteicos purificados (PPD) para evaluar la posible presencia de Mycobactenum tuberculosis es una excepción, aunque los individuos anérgicos no responden y. además, hay falsos positivos en las personas que han sido vacunadas con el bacilo de Calmette-Guérin (BCG). Las causas de falta de respuesta en la prueba cutánea se muestran en la Tabla 36-5. Algunos estudios se han basado en una prueba cutánea con inmunización de novo utilizando dinitrofluorobenceno (DNFB) que se llegó a utilizar ampliamente pero ya no se considera de utilidad debido a la ambigüedad del mecanismo de respuesta subyacente. La introducción del prueba de la ventana cutánea" proporciona una medida más cuantitativa e informativa de la respuesta inmune in vivo debido a que la reacción puede emplearse para determinar una respuesta tumoral autóloga (Black. 1998). Sin embargo, aunque con algunas reservas, la importancia de las pruebas cutáneas como demostración convincente de que los defectos inmunes que suceden in vitro pueden tener un significado pronóstico in vivo, no debe ser infravalorada.

Fases de estudio: estudios analíticos de la inmunidad Los estudios analíticos se resumen, de forma general, en la Tabla 36-6. Aunque la descripción completa de estos abordajes no se encuentra entre los objetivos de este análisis, en general estos estudios son válidos para definir el mecanismo subyacente del defecto inmune y proceder en una serie de etapas. Aunque hay diferentes modos posibles de hacerlo, un buen método es evaluar el nivel general del defecto siguiendo el plan general de evaluar la presencia de los tipos celulares y las proporciones relativas de cada uno a la vista de las áreas de función general disminuida y entonces poner en marcha los estudios de la función efectora.

Pruebas cutáneas En este momento puede ser importante la utilización de un panel de pruebas cutáneas. Este abordaje en la evaluación de la inmunidad celular sirvió en un principio como punto de partida para el desarrollo de las pruebas funcionales de la inmunidad celular y mide la respuesta de hipersensibilidad retardada directamente in vivo. La experiencia con las pruebas cutá-

Tabla 36-4 Estudios analíticos de confirmación y de primera etapa Roentgenograma de la sombra timica Prueba cutánea Actividad de las células asesinas naturales (si el niño tiene 6 meses 0 más) Producción de citocinas en respuesta a la activación con T-coadyuvante 1, T-coadyuvante 2 (IL-2, interferón-y, IL-4 y otros) Cultivo mixto de linfocitos con el paciente como estimulador y con el paciente como respondedor Respuesta a la inmunización Prueba para la presencia de anticuerpos específicos según la edad Respuesta de anticuerpos naturales frente a isohemagiulimnas (sustancias de grupo sanguíneo anti-A y anti-B) si el paciente es del grupo sanguíneo A, B o O Prueba para el déficit de actividad de las enzimas adenosín deaminasa y purma nucleótico fosforilasa

Función inmune diferencial Hay dos tipos principales de células implicados en la inmunidad (Haynes, 1990; Paul, 1993): 1) linfocitos T (células T) y 2) linfocitos B (células B). Los linfocitos T se definen por la expresión del receptor del linfocito T el cual se une al antigeno y a CD3, un determinante de superficie asociado con el receptor de células T que es esencial para su activación

Tabla 36-6 Estudios analíticos e inmunorreguladores Desarrollo de los antígenos de la activación durante la respuesta a la estimulación, como el antigeno Tac, el receptor de transterrina, regulación del MHC de clase II sobre las células T, receptores solubles y otros Respuesta do activación precoz (p. ej, canales de calcio) Inmunorregulación Respuesta a IL-1, IL-2, interferones Desarrollo de funciones efectoras Síntesis de inmunoglobulinas in vitro Actividad citotoxica de las células T Análisis de células supresoras/factores de supresión Activación de genes, análisis del ciclo celular Respuesta a la inmunización: inmunización de novo

CAPÍTULO 36

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

Tabla 36-7 Fenotipificación inmunológica de las subpoblaciones de linlocilos Panel básico de sangre periférica (sangre, glóbulos rojos Usados*) CD45/CD14 Inmunoglobulinas control de isofipo de ratón CD3/CD19 CD3/CD4 CD3/CD8 CD3-/CD56 y 16 Células mononucleares aisladas, panel de activación' CD45/CD14 Inmunoglobulinas control de isotipo de ratón CD3/CD25 (IL-2R) CD3/HLA-DR ' Si el CD3 está bajo, entonces repetir y añadir CD2. Posteriormente, pueden añadirse monoclonales trente al receptor de las células T acoplado con CD3. También pueden evaluarse los marcadores de monocitos. Esto también puede realizarse utilizando reactivos de tres o cuatro colores empleando CD45 como iniciador ' Después de 2 días de cultivo, extraer las células y lavarlas antes de teñirlas con los anticuerpos monoclonales escogidos: analizar las células control que no contienen activador, después analizar las células activadas. Los activadores pueden incluir mitógenos. IL-2 y/o mleilerón-y.

Los lintocitos T tienen receptores diferentes, clonalmente variables, para un amplio grupo de antígenos, requieren la maduración tímica para su función normal y median la inmunidad celular. Los linfocitos B se identifican por las inmunoglobulinas de superficie (detectadas mediante anticuerpos monoclonales como el CD19 o el CD20) y tras una activación adecuada se diferencian en células plasmáticas que secretan anticuerpos específicos, mediando, de este modo, la inmunidad humoral. La falta de un timo normal comprometerá la función de los linfocitos T y afectará a la activación de los linfocitos B dependientes de los linfocitos T. El fallo a nivel de la médula ósea puede afectar tanto a la respuesta inmune de los linfocitos T como a la de los linfocitos B. aunque pueden estar implicadas relaciones especificas. Esto se describe con más detalle posteriormente en la Proliferación linfocítica como método In Vitro de evaluación de la inmunidad celular. La distinción entre respuesta inmune específica y no especifica es una necesidad fundamental de la respuesta inmune, ya que el sistema debe ser capaz de distinguir entre lo propio y lo extraño. En general, esto se logra medíanle la incorporación del sistema de autoantigenos del complejo molecular MHC en la fase de reconocimiento antigénico. El antigeno debe ser procesado y presentado en el contexto del reconocimiento del propio MHC y conducir al desarrollo de la memoria inmune. La función del procesamiento antigénico se lleva a cabo por las células presentadoras de antígeno (APCs), siendo el monocito la mejor estudiada. Esta respuesta dispara la activación y la proliferación de los linfocitos. y puede incluir la producción de células electoras y la activación de los linfocitos B para producir anticuerpos. Este tipo de inmunidad, a menudo denominada inmunidad adaptativa. se mantiene como "memoria" y se desencadena típicamente después de inmunizaciones o infecciones naturales (Owen, 1993). La falta de expresión del antígeno MHC de clase II puede detectarse en los linfocitos por citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales contra el HLA-DR o el HLA-DQ y es el mejor marcador de déficit de MHC de clase II (Tabla 36-7). Un segundo tipo fundamental de inmunidad puede describirse como la inmunidad innata, que no tiene memoria, y no aumenta con contactos repetidos. Esta inmunidad está mediada por las células fagociticas. algunas de las cuales, como el monocito. también pueden procesar y presentar antígenos, y las células NK. A diferencia de las células fagociticas. las células NK no están desarrolladas funcionalmente al nacer, debido, probablemente, a que la atocina clave, el IFN-y, que es necesaria para el desarrollo y la maduración de este sistema, está también disminuida al nacer. Esta tercera rama está representada por las células NK. que no son ni célula B ni exactamente células T por no tener ni inmunoglobulinas de superficie ni el receptor de células T. Estas células, antes llamadas células "K", células "nulas" o "tercera población", ha eludido la clasificación convencional por análisis de linaje celular. Actualmente, el CD56 es considerado el marcador más definitivo de la célula NK (Trinchieri. 1998). Las células NK han sido más

855

conocidas como células que pueden matar inespecíficamente (naturalmente) a las células infectadas por virus y bacterias y que evitan las metástasis de las células tumorales. Sin embargo, las células NK también regulan funciones de las células T y B y la hemalopoyesis. Estas funciones de las células NK son, probablemente, dependientes de su capacidad para producir linfocinas, particularmente IFN-y. Las células NK son importantes para la activación de las células fagociticas independientes de antígeno durante las fases precoces de la infección y para favorecer el desarrollo de las células Th1 específicas de antígeno. El sistema NK está por naturaleza activado y no tiene que ser inducido por antígenos para destruir. Sin embargo, cuando se presentan con anticuerpos específicos, estas células pueden matar específicamente. La evaluación funcional de esta población celular puede llevarse a cabo de forma adecuada utilizando un análisis rápido de liberación de cromo ¡conocido como un ensayo de citotoxicidad NK empleando K-562s como dianas) o mediante citometría de flujo. Los estudios futuros estarán encaminados a detectar cómo las células NK ligan la inmunidad innata y la adaptativa (Peritt, 1998).

Desarrollo de la respuesta inmune Si se ha determinado que la población de células está esencialmente intacta en ausencia de activación, la cuestión de un fallo intrínseco puede estudiarse mediante muchos abordajes diferentes que incluyen el análisis expandido de marcadores de superficie de linfocitos, entre ellos los determinantes del receptor antigénico de las células T (TCR) y los antígenos de activación como el CD25. el CD38 y el HLA-DR (Tabla 36-7). La ausencia de regulación del MHC de clase II en respuesta al IFN-y es un ejemplo. Aunque las poblaciones celulares pueden expresar un antígeno de diferenciación normal de referencia, también pueden coexpresar otros inapropiadamente. lo cual puede ser la clave de la anormalidad funcional. Por ejemplo, las células T CD8+ que coexpresan CD38 no son funcionalmente iguales que las células CD8 que no expresan este marcador y se encuentran expandidas en la enfermedad por VIH (Giorgi, 1989). La ausencia de expresión de ciertas moléculas, como el CD28. también es un indicador importante. En algunos síndromes de inmunodeficiencia primaria, la regulación del receptor de IL-2 en respuesta a la IL-2 puede ser anormal. Los receptores pueden no estar translocados normalmente o los receptores pueden estar alterados prematuramente (Cunningham-Rundles. 1990). El desarrollo de la respuesta puede ser anormal cinéticamente, debido al retraso del reclutamiento secundario durante la fase de amplificación. Esto debe ser comprobado mediante estudios periódicos. En algunos casos, no pueden fabricarse citocinas o pueden estar funcionalmente alteradas. Las funciones efectoras pueden haberse perdido o estar alteradas. Esta evaluación puede requerir un abordaje detallado. Los intentos de restaurar la respuesta añadiendo citocinas pueden ser útiles, aunque pueden no mostrar la lesión al compensar y no solucionar la deficiencia real. Las nuevas estrategias de análisis pueden utilizar sangre en lugar de células mononucleares aisladas (Bocchieri, 1995). Este sistema proporciona una excelente visualización, ex vivo, de la respuesta inmune, ya que las relaciones reales entre las células no se alteran. Además, este sistema puede utilizarse para medir la producción de citocinas (Petrovsky, 1995; De Groóte, 1998; Suni, 1998). Se aconseja al laboratorio de inmunología clínica elegir estudios analíticos básicos, que normalmente se realizan de rutina, de modo que exista una base para la comparación. El establecimiento de los valores de referencia y el mantenimiento del control de calidad de los reactivos del laboratorio, especialmente para ciertos elementos variables, es esencial para la exactitud y sensibilidad de estas pruebas.

PROLIFERACIÓN LINFOCÍTICA COMO MÉTODO IN VITRO DE EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR Inmunología celular Activación

y proliferación

linfocítica

Aunque el sistema inmune se divide clásicamente en componentes humoral y celular, esta separación no es absoluta, ya que hay una considerable interdependencia entre las células B y las células T.

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA Í INMUNOPATOIOGÍA

El parámetro funcional de la inmunidad celular más frecuentemente medido es la proliferación linfocitaria. La medida de la activación/proliferación de los linfocitos ha evolucionado sustancialmente desde finales de los años 50 e inicio de los 60. cuando la división celular se determinaba por el recuento del número de linfocitos que se habían transformado en blastos. Estos métodos fueron reemplazados por la cuantificación de la incorporación de precursores marcados de los ácidos nucleicos (timidma tritiada) en el ácido desoxirribonucleico (ADN) recién sintetizado. Aunque este "análisis en masa' permanece como el procedimiento de laboratorio más frecuentemente utilizado para medir la proliferación celular, recientemente han aparecido nuevos reactivos y nuevos procedimientos para evaluar la activación y proliferación linfocitaria. Estos incluyen la disponibilidad comercial de marcadores de proliferación de la superficie celular, la posibilidad de medir el porcentaje de células en fases especificas del ciclo celular, la cuantificación de citocinas y de receptores de citocínas asociados a células y la posibilidad de evaluar el número de divisiones celulares en linfocitos marcados con 'tinciones de seguimiento". En esta sección se revisan los acontecimientos moleculares implicados en la activación y en la proliferación de los linfocitos T y se revisan algunos de los nuevos métodos que se han desarrollado para evaluar las funciones del sistema inmune celular.

Determinación de las vías bioquímicas de la activación linfocitaria Tras la interacción específica del mitógeno o el antigeno/MHC con los receptores apropiados de los linfocitos. tienen lugar muchos procesos celulares que incluyen cambios en el transporte de membrana, redistribución del sistema del ciloesqueleto (polarizando el linfocito hacia la APC) y la activación de múltiples vías de señalización. Estos cambios conducen finalmente a la diferenciación de la célula T. a la secreción de citocinas. a la proliferación, a la anergia o a la apoptosis. Las investigaciones actuales están desvelando las complejas rutas moleculares y bioquímicas que conducen a la célula T activada por estas rutas. Constantemente se están descubriendo alteraciones especificas en estas vías y subyacen en muchas de las enfermedades de la inmunodeficiencia primaria. Desgraciadamente, las alteraciones en los análisis de proliferación en masa indican solo que no hay división celular o que esta es limitada y no proporcionan información sobre las alteraciones subyacentes de la activación del linfocito. Se requieren ensayos más sofisticados para investigar las alteraciones subyacentes de las células T.

Activación de los linfocitos T inducida por antigenos La activación de los linfocitos T inducida por los antigeno/MHC implica una serie de acontecimientos complejos y definidos que difieren sutilmente entre la activación de una célula T nativa frente a la activación de una célula T de memoria. El antigeno es procesado por las células B o por los monocilos provocando el ensamblaje de péptidos inmunogénicos en los productos de los genes del MHC de clase I o II El complejo péptidoMHC es presentado a las células T que portan el receptor apropiado de esa célula T. Además, la APC expresa una serie de moléculas de adhesión y coestimulación que interactúan con los receptores ligando/antagonista apropiados de la superficie de la célula T. La unión aislada del receptor de la célula T no es suficiente para la activación de la célula T lo que ha conducido al "modelo de las 2 señales" para la activación de la célula T (Brestcher, 1992). La primera señal que ocurre por la vía TCR/CD4/CD8 modula la transición de la célula T en las primeras etapas de la activación (p ej.. de G a G.). La 2- señal se produce por la via de los coestimuladores. más concretamente por el CD28 y en menor medida por LFA-3. CD2, CD5 y CD7. y lleva a la inducción de la IL-2 y de otros genes de citocinas requeridos para la proliferación y diferenciación de la célula T hacia células efectoras. 0

Reconocimiento de las células T, activación y transducción de la señal El complejo TCR está compuesto por una estructura de reconocimiento del antígeno heterodimérica (esto es. el TCR) y un complejo de transducción no unido covalentemente que es el CD3. El TCR no puede expresarse en la

superficie celular sin el CD3 (Weiss. 1991) y no tiene capacidad de señalización por si mismo. La estructura de reconocimiento antigénico está compuesta por cadenas estructuralmenle divergentes a y \i (o menos frecuentemente por las cadenas y y 6) y el complejo de transducción CD3 está formado por cinco cadenas polipeplidicas invariantes, a. p\ e. y un dímero de cadena zeta. Cada una de las proteínas del CD3 contienen un residuo llamado residuo inmune de activación de la tirosina (ITAM). que se une al dominio SH2 de la proteina tirosma cinasa. La cadena f¡ (que existe como un homodímero f¿ una cadena i con una n, o una cadena y con una Fe e Rl y) contiene 3 ITAM y es el componente más significativo del complejo TCR. estando implicado en la transducción de la señal desde el TCR (Weiss 1994). Inicialmente descritos por Reth (1989). estos residuos juegan un papel esencial en los acontecimientos iniciales que siguen a la activación de las células Tflrving. 1991). Las moléculas CD4y CD8 de la superficie de las células T también están unidas de forma no covalente al complejo TCR Se unen a las moléculas del HLA Clase II y I. respectivamente, sobre la APC y también están implicadas en la transducción de las señales de activación Una vez procesado el antigeno, este es presentado a las células T en el contexto de los antigenos del MHC. En general, las células T CD4+ responden a antígenos exógenos procesados y presentados en el contexto de MHC de Clase II y las células T CD8+ responden a antigenos endógenos procesados y presentados en el contexto de MHC de Clase I, Los CD4 y los CD8 también están asociados con la tirosina cinasa implicada en los acontecimientos precoces tras la activación de las células T. Además de estas interacciones y las interacciones de las moléculas «estimuladoras, otro grupo de moléculas (moléculas de adhesión), presentes tanto en la APC como en las células T respondedoras, se unen unas a otras y sirven para aumentar la avidez de la unión. Las moléculas coestimuladoras identificadas en las APC incluyen el B7 (CD80) (Linsley. 1991a). el B7.2 (Azuma. 1993). el antigeno estable al calor (HSA) (Liu. 1992) y otros (Foletta. 1998; Wingren. 1995) Sobre las células T. la CD28 es la principal molécula «estimuladora y se une al B7: la CTLA-4. por otra parte, se une tanto al B7 como al B7.2 y está implicada en la disminución de modulación de la activación de las células T (Linsley, 1991b). El receptor en las células T para el HSA no ha sido identilicado. La presentación del antigeno en presencia de reactantes que bloquean las moléculas coestimuladoras lleva a una respuesta anérgica (tolerancia) en posteriores exposiciones a ese antígeno especifico pero no afecta a las respuestas a otros antígenos (Tan, 1993). La posibilidad de hacer no inmunogénicos a tumores inmunogénicos transplantados transfiriéndoles el gen 87 (Townsend. 1993: Chen. 1992; Baskar, 1993: Janeway. 1994) sugiere que las moléculas coestimuladoras juegan un papel importante en la activación de las células T in vivo.

Transducción de señales después de la estimulación antigeno-específica La presentación del antigeno a las células T conduce a la agregación del complejo del TCR-CD3 y a la activación de la proteína tirosina cinasa (PTK), El TCR por si mismo tiene un pequeño dominio ciloplasmático sin actividad de transducción conocida. Es la cadena asociada ¡¡ del complejo CD3, que contiene residuos ITAM y que se ha demostrado que coprecipita la actividad de la proteína tirosina cinasa Dos clases bien conocidas de familias citoplasmáticas de PTK están implicadas en las etapas mas precoces que siguen a la agregación del receptor de células T, Src y Syk/ZAP-70. Las cascadas de señalización que se originan a partir del complejo TCR-CD3 y la vía de la coestimulación por CD28 son bien conocidas (Foletta, 1998). La activación de las tirosina cinasas asociadas al TCR. ZAP70. p59- y p56 originan la activación de tres vías. p2T , calcio calicreina. y proteina cinasa C (PKC). La activación del p21"» activa las proleína cinasas activadas por mitógenos (MAPK) que fosfonlan muchos factores de transcripción regulando de este modo la expresión genética. La activación de la tirosina cinasa también activa a la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidil inositol y origina la generación de los segundos mensajeros diacil glicerol (DAG) e inosilol trifosfato (IP3). El DAG activa la proteina cinasa C. y el IP, origina un rápido y sustancial aumento del calcio ciloplasmático. El aumento del calcio libre activa la fosfatasa calcineurina dependiente de calmodulma. 1-

b

CAPÍTULO 36

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

Estos procesos también conducen a la inducción de proteínas de unión al ADN y a la transcripción de numerosos genes incluyendo la IL-2 y el receptor de IL-2 requeridos para la proliferación de la célula T. Para más información sobre las vías de transducción molecular tras la activación del TCP. y el CD28, consultar a Wiss (1994). Zhao (1997), Foletta (1998) y Halloran (1999). La comprensión de las vías que conducen a la activación de la célula T ha llevado al descubrimiento de los defectos moleculares de muchas enfermedades de inmunodeficiencia adquirida y puede ayudar finalmente a proporcionar estrategias terapéuticas para corregir esos defectos. Por ejemplo, se han publicado mutaciones en la proteina tirosina cinasa ZAP70 y están asociadas con la forma autosómica del síndrome de la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) en humanos (Eider, 1998). Las mutaciones en la cadena común y de los receptores de interleucina IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 originan anomalías de la transducción y están asociadas con la forma ligada al cromosoma X del SCID (Noguchi, 1993). Es interesante hacer notar que otras formas de SCI adquiridas autosómicamente están asociadas con las mutaciones en la proteína tirosina Jak3 de la familia de proteínas Jano. la única molécula de señalización asociada con la cadena común y (Russell. 1995). A medida que se van descubriendo más anomalías subyacentes que conducen a la inmunodeficiencia de células T. se ha propuesto que los trastornos deben clasificarse empleando un extenso sistema que identificará los trastornos de acuerdo con las alteraciones en la diferenciación, la maduración y la función (Gelfand. 1993). Estas designaciones podrían comenzar a enfocarse en los defectos fisiológicos o bioquímicos propiamente dichos y pueden finalmente proporcionar nuevas opciones terapéuticas. Para una revisión de las alteraciones moleculares específicas que originan alteraciones en la activación y proliferación de la célula T. consultar a Arnaiz-Villena (1992), Gelfand (1993) y IUIS (1999).

Respuestas de la célula T Recientemente, se ha preterido la designación de la respuesta de la célula T tipo I frente a la respuesta de citocinas tipo II para aquellas respuestas de la célula T que originan unos patrones de secreción de citocinas que se sabe que están implicados en la inmunidad celular frente a los patrones de secreción de citocinas observados en la inmunidad humoral, respectivamente. Las respuestas tipo I se caracterizan por la secreción de citocinas que se sabe que aumentan la inflamación (promflamatorias) e inducen la activación y la proliferación de las células T y los monocitos, a saber, IL-2, IFN-y, e IL-12. Las respuestas tipo II se caracterizan por la secreción de citocinas que suprimen la inflamación (antiinflamatorias) y estimulan a las células B a dividirse y diferenciarse en células secretoras de inmunoglobulinas (esto es, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13). Hay evidencias que sugieren que la secreción de las citocinas del tipo I regulan la secreción de las citocinas tipo II y viceversa (Paul. 1994). Por ejemplo, en presencia de IL-4, tanto in vivo (Châtelain, 1992) como ih vitro (Seder, 1992:1993). las células T no se diferencian en células secretoras de IFN-y (es decir, este ambiente favorece el desarrollo de una respuesta inmune humoral). Se ha propuesto que las cantidades relativas de IL-4 e IL-12 presentes durante la estimulación de las células T nativas dirigirán la respuesta hacia un lado o hacia otro (Paul, 1994). Muchos factores están implicados en la regulación del tipo de respuesta de la célula T que sigue a la estimulación antigénica. Además del ambiente de citocinas, hay evidencias que sugieren que la dosis de antígeno influye en el tipo de respuesta (Bretscher. 1992: Madreñas, 1995). La respuesta predominante que se desarrolla Iras la activación de la célula T tiene implicaciones clínicas significativas. Se ha postulado que el desarrollo de una respuesta de tipo I a la infección por el VIH puede conducir a una inmunidad protectora (Clerici, 1994). Claramente, una respuesta tipo II no es protectora, ya que la mayoría de las personas infectadas seroconvierten y eventualmente fallecen por intensa inmunodepresión. Clerici y Shearer (1993,1994) argumentan que la exposición repetida a una dosis baja de VIH-1 puede originar una inmunidad protectora celular tipo I. Los resultados de estos grupos indican que entre el 39% y el 75% de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) de los individuos de alto riesgo (varones homosexuales, adictos a droga vía intravenosa y niños nacidos de madres VIH positivas) seronegativos para VIH-1 y negativos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secretan IL-2 en respuesta a la proteína env in vitro. Estos científicos proponen que

estos individuos seronegativos de alto riesgo han desarrollado una inmunidad protectora mediada por células como resultado de una baja dosis de inmunización o de infección.

Metodología: determinación de la activación y la proliferación linfocitica en la evaluación de la inmunodeficiencia celular Los defectos del desarrollo, las alteraciones genéticas congénitas y las infecciones adquiridas provocan estados de inmunodeficiencia severa. Además, las quemaduras graves, los traumatismos y las intervenciones terapéuticas también originan mmunodeficiencias. Los análisis en masa pueden emplearse para determinar si un individuo tiene o no una disminución de la respuesta proliferativa de las células T y han estado disponible durante algún tiempo pero están limitados por una baja reproducibilidad y por la limitada información que aportan. El desarrollo de las nuevas tecnologías ha permitido la producción de una variedad de reactivos que pueden emplearse para evaluar múltiples actividades a lo largo de la via de activación de la célula T. Estos reactantes incluyen anticuerpos monoclonales específicos como marcadores de la activación de la célula T. reactivos y sistemas para la detección de citocinas intracelulares. y marcadores de seguimiento y precursores no radioactivos del ADN desarrollados para evaluar la proliferación linfocitica.

Procedimientos empleados para evaluar la activación y la proliferación de la célula T El procedimiento más frecuentemente utilizado in wVopara evaluar la inmunidad celular es una simple prueba cutánea. Una prueba cutánea positiva para la delección de una respuesta de hípersensibilidad implica una inmunidad celular y una quimiotaxis de monocitos intacta (Borut. 1980). Aunque las pruebas cutáneas se llevan a cabo fácilmente, los resultados negativos son difíciles de interpretar, especialmente en niños pequeños, y las pruebas cutáneas no son tan sensibles como los ensayos de estimulación de linfocitos in vitro (Borut. 1980). Otras variables, m vivo, de la inmunidad mediada por células son la sensibilidad por contacto, la formación de granulomas y el rechazo alogénico. Los linfocitos son los únicos en los que se expresan receptores de superficie capaces de identificar virtualmente cualquier molécula o sustancia extraña (antigeno). La diversidad estructural de estos receptores se origina por el reordenamiento diferencial de los genes del receptor de la célula T. En general, solo hay un número limitado de linfocitos circulantes capaces de reconocer un antigeno. In vivo, cuando un linfocito reconoce un antigeno extraño, las células proliferan rápidamente de forma clonal para generar un gran número de células tanto efectoras como de memoria. Los primeros métodos empleados para evaluar la proliferación linfocitica incluían el recuento manual del número de células antes y después de la estimulación. Desgraciadamente, estas técnicas requieren mucho tiempo y presentan muchos problemas técnicos. En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos que miden los diferentes acontecimientos celulares que ocurren en la ruta de la división celular. Hay que subrayar que los métodos que miden los sucesos iniciales en la activación del linfocito T pueden o no correlacionarse con la división celular. 3

Ensayo de incorporación de timidina tritiada H (ensayo TdR) Muchos laboratorios evalúan la capacidad proliferativa de los linfocitos calculando el grado de incorporación de nucleósidos radiactivos del ADN (timidina tritiada) durante un pulso de 4 a 24 horas tras una incubación prolongada de cultivos celulares de mononucleares de sangre periférica con mítógenos (tres a cuatro días) o con antígenos (5 a 10 días). En general, solo un número limitado de células T responden a un antigeno in vitro; por lo tanto, las células deben cultivarse durante 5 a 10 días para detectar la respuesta. Los mitogenos, por otra pane, inducirán la rápida proliferación de hasta el 100% de las células T. Por esta razón, la proliferación puede detectarse en tres o cualro dias proporcionando con ello una herramienta de cribado efectiva. La transformación linfocitaria in vitro en respuesta a un rmtógeno fue descrita por pri-

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

mera vez por Nowell (1960). Los mitógenos son, en general, los estimuladores más potentes, ya que activan una gran proporción de linfocitos en relación con los aloantigenos y los antigenos.

Citometria de flujo en la evaluación de la activación y la proliferación linfocitaria Los análisis en masa, además de sus inherentes problemas técnicos, no proporcionan información sobre las subpoblaciones celulares específicas que están respondiendo. La citometria de flujo con su potencial multiparamétrico inherente se ha convertido en el instrumento de elección para el análisis de la inmunología celular. La figura 36-1 ilustra algunos de los acontecimientos celulares que ocurren a lo largo de la ruta de activación/proliferación de la célula T que pueden medirse por citometria de flujo. Para una revisión extensa de la citometria de llujo y de los métodos empleados para evaluar la activación y la proliferación linfocítica. véase Bauer (1993) y Shapiro (1995). Otro método basado en la citometria de flujo que ha alcanzado un uso importante en los laboratorios clínicos es la medida de los linfocitos en varías fases del ciclo celular. En general, los análisis del ciclo celular se llevan a cabo midiendo el nivel de intensidad fluorescente emitida por las sondas de ADN. El marcador empleado más frecuentemente es el yoduro de propidio. que interacciona estequiométricamente con el ADN (esto es. la cantidad o intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN de la célula). Utilizando complejos modelos matemáticos, es posible medir el porcentaje de células con un contenido en ADN entre 2- y 4 , que se correlaciona con el porcentaje de células en fase "S" del ciclo celular. En general, los linfocitos de sangre periférica se encuentran en la fase de reposo del ciclo celular, con menos del 5% de las células en la fase "S" C

Algunos laboratorios han reemplazado los ensayos de incorporación de timidina tritíada por análisis de inducción de marcadores de superficie celular combinados con una medida del porcentaje de células en vanas fases del ciclo celular tras la activación (Cost. 1993). Recientemente, se han desarrollado marcadores que se integran de forma estable en las membranas de los linfocitos vivos. Tras eliminar el exceso de marcador, se estimula la división de los linfocitos. Con cada división sucesiva la cantidad de marcador por célula se reduce a la mitad. La fluorescencia emitida por las células tras el cultivo puede modelarse permitiendo la estimación del número de divisiones celulares (Fig. 36-2). Esta metodología se ha estandarizado recientemente en un equipo analítico que incluye el soft-

Figura 36-1. Curso temporal de los acontecimientos implicados en la activación de los linfocitos T, que pueden detectarse por citometria de flujo (Modificada de Shapiro HM: Practical Flow Otometry. 3- ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pag 397 Copyright inmunoglobulinas y la inmunidad humoral

• Richard A. McPherson, M.D. PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS

Inmunoglobulina D 878

Moléculas de anticuerpo

Resumen

Interacción antígeno-anticuerpo

IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS

BASE GENÉTICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS

881

Inmunoglobulina M Inmunoglobulina G Inmunoglobulina A

Los anticuerpos son las moléculas electoras de la inmunidad humoral (mediada por células B). Son inmunoglobulinas que reaccionan y se unen específicamente a los antigenos que estimularon su producción. Las inmunoglobulinas constituyen un 20% de las proteínas plasmáticas de un individuo sano. La actividad de los anticuerpos se asocia a las proteínas con menor velocidad de migración en una electroforesis. las y-globulmas. Este capitulo se centra en la discusión de las propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas, su evaluación en el laboratorio y su importancia clínica.

PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS Moléculas de anticuerpo Hay una gran cantidad de trabajo realizado y publicado sobre las propiedades estructurales de los anticuerpos (Padlan, 1991; Poljak, 1991; Tedford, 1991). Una molécula de inmunoglobulina es una glucoproteina en lorma de "Y". Presenta dos dominios de unión al antigeno en las puntas de la "Y" (región Fab) y zonas de unión para componentes del sistema del complemento y/o varios receptores de la superficie celular en la cola de la "Y" (región Fe). Cada molécula de inmunoglobulina está compuesta por 2 cadenas pesadas (H: heavy) y dos cadenas ligeras (L: lighf) idénticas entre si. Estas cadenas polipeptidicas se mantienen unidas mediante interacciones no covalentes que se encuentran estabilizadas por puentes disulfuro. Los dominios de interacción con el antigeno están compuestos por partes de ambas cadenas. Cada una de las cadenas de inmunoglobulina, tanto H como L, consta de una región variable de unos 110 residuos de aminoácidos en el extremo amino-terminal (las puntas de la "Y"), que forma el dominio de interacción con el anligeno, unido a una región constante. La región conslante de la cadena H es unas 3 o 4 veces más grande que en la cadena L. Cada cadena está compuesta por repeticiones de dominios plegados de forma semejante: una cadena L tiene un dominio de región variable (V ) y un dominio de región constante (CJ. mientras que la cadena H tiene un dominio de región variable (V,.) y 3 ó 4 dominios de región constante (C ) (Fig. 37-1). La variabilidad de la secuencia de aminoácidos en H

886

Patogénesis 880

PROPIEDADES GENERALES DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Inmunoglobulina E

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

888

Inmunoelectroforesis Inmunofijación Prevención de las enfermedades y terapia BIBLIOGRAFÍA

891

las regiones vanables de ambas cadenas. H y L, se reduce principalmente a 3 pequeñas regiones hipervariables. las cuales se asocian en el extremo aminoterminal de la molécula para formar el sitio de unión al antigeno. Cada dominio de unión al antígeno tiene sólo el tamaño suficiente para unir un determinante antigénico del tamaño de cinco o seis residuos de azúcar. Las cadenas pesadas pueden ser de cinco isotipos distintos (y, a, p. 8, e) y las cadenas ligeras de dos (•,- y X), donde algunos de los isotipos presentan subtipos. Por ejemplo, las cadenas y presentan los subtipos y„ y , y y y.. Los isotipos se torman como resultado de variaciones en las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras. Estas denominaciones isotipicas forman la base de la nomenclatura de los anticuerpos. Debido a que la cadena pesada por sí sola determina las funciones efectoras. las inmunoglobulinas se denominan haciendo referencia al isotipo de su cadena pesada empleando una letra de nuestro alfabeto (IgG. IgA, IgM, IgD e IgE). 2

3

Los anticuerpos tienen dos dominios idénticos de interacción con el antigeno. El dominio de interacción con el antigeno está compuesto por los aminoácidos de un tipo de cadena H y de un tipo de cadena L. Asi. la molécula monomérica compuesta por 4 cadenas (véase Fig. 37-1) posee dos sitios idénticos de asociación con el antígeno, y se dice que son moléculas bivalentes. Estas moléculas son capaces de entrecruzar moléculas de antigeno, si cada una de ellas presenta 3 o más determinantes antigénicos, formando un complejo macromolecular. y una vez que este complejo supere un determinado tamaño, precipitará (Davies. 1983). Este entrecruzamiento es importante fisiológicamente porque facilita ia internalización del antígeno. como puede ser el expresado por bacterias o por leucocitos lagociticos. También interviene en la activación del sistema del complemento. Además, este entrecruzamiento puede ser necesario para desencadenar la producción de anticuerpos (por la acción de linfocitos B) por parte del antígeno. La eficiencia con la que el anticuerpo se une al antígeno y produce entrecruzamiento se ve aumentada gracias a una región muy flexible (región de bisagra) que se encuentra donde los brazos de la "Y" se unen a la cola, permitiendo que varíe la distancia que separa los dos dominios de unión al antígeno. La multivalencia afecta a la avidez con que un anticuerpo puede unir determinados tipos de antígeno. Un antigeno particulado (como una bacteria o un virus) presenta repeticiones de determinantes antigénicos en su superficie.

CAPÍTULO 37

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EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

879

(denominado asi porque en primates no humanos cristaliza con facilidad). Por otro lado, el corte con pepsina produce un fragmento F(ab\, lamado asi porque consta de dos fragmentos F(ab'), cada uno de ellos un poco más grande que un fragmento Fab, unidos covalentemente; el resto de la molécula está cortada en fragmentos más pequeños de varios tamaños (Fig. 37-1). Como los fragmentos F(ab'),son bivalentes, todavía pueden entrecruzar antigenos y formar precipitados. Esto no ocurre con los fragmentos Fab puesto que son univalentes. Ninguno de estos fragmentos (subunídades de anticuerpos) tiene las demás propiedades biológicas de las moléculas intactas de anticuerpos puesto que carecen de la cola (la región Fe) que media estas propiedades. Sin embargo, los fragmentos monovalentes Fab es la forma de anticuerpo monoclonal que se emplea terapéuticamente (Digibind) para unir digoxina, neutralizando asi niveles tóxicos y facilitando la eliminación de la sustancia del cuerpo.

IKKK'

OKIH

Cada clon de células B produce moléculas de anticuerpo con un único dominio de unión al antígeno. Inicialmente, las moléculas se insertan en la membrana plasmática, donde funcionan como receptores de superficie para el antígeno. Cuando un antigeno se une a los anticuerpos en la superficie celular, activan a las células B, las cuales se multiplican, diferencian en una célula plasmática, y sintetizan una gran cantidad de anticuerpo soluble con el mismo dominio de interacción con el antígeno, que se secreta a la sangre. Los anticuerpos humorales protegen a los humanos y animales de infecciones, inactivando virus y toxinas bacterianas mediante sus dominios V,/V y reclutando el complemento y diversas células para matar e ingerir los microorganismos invasores mediante sus dominios C en la región Fe de la molécula. Las propiedades biológicas de los diversos dominios de inmunoglobulinas se resumen en la Tabla 37-1. t

Figura 37-1. Representación esquemática de la molécula de inmunoglobulina G. Se muestran las posiciones relativas de los puentes disulfuro intercatenarios e intracalenarios que determinan los lazos Cada uno de los lazos determina un dominio de cadena pesada y ligera que reciben un determinado nombre. Se indican las regiones de corte enzimàtico más probables en la región "bisagra" por parte de la pepsina y papaina. Los fragmentos resultantes de la acción de la papaina se laman Fab y Fe. Los fragmentos producidos por la pepsina son Fe' y Fab'2 (2 fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro). La digestión de Fab con pepsina en las condiciones adecuadas libera el fragmento F (V y V asociados de forma no covalente). La porción de la cadena pesada que forma parte del fragmento Fab se denomina Fd. v

H

L

Una molécula de anticuerpo puede interaccionar con una sola partícula de tal forma que ambos dominios de interacción antigénica se encuentren unidos a determinantes antigénicos de esa misma partícula, en lugar de encontrarse en dos partículas adyacentes. Cuando se produce este tipo de unión, la energía efectiva de la interacción o avidez, es mucho mayor que la que presenta una unión monovalente a dos partículas. Se ha demostrado que este mecanismo es muy importante desde un punto de vista fisiológico, en la neutralización de virus por anticuerpos que poseen baja afinidad por la unión. El efecto protector de las inmunoglobulinas no se debe simplemente a su habilidad para unir antígenos. Intervienen en una gran variedad de actividades biológicas mediadas por la cola de la "Y", la región Fe de la molécula. Esta parte de la molécula de anticuerpo determina lo que ocurrirá con el antígeno una vez que se haya unido. Inmunoglobulinas con la misma capacidad de interacción con el anlígeno pueden presentar una variedad de regiones Fe distintas, por tanto, diferentes propiedades funcionales, como puede ser activar el sistema de complemento y unirse a receptores de Fe presentes en la superficie de macrófagos, facilitando asi la fagocitosis de antígenos.

L

Interacción antígeno-anticuerpo La unión de un antígeno a un anticuerpo es reversible. La afinidad y el número de sitios de unión contribuyen a la fuerza de la interacción antígeno-anticuerpo. Esta unión reversible es el resultado de muchas fuerzas no covalentes relativamente débiles, incluyendo uniones hidrofóbicas y de hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones iónicas. Estas fuerzas débiles son efectivas sólo cuando la molécula del antigeno está lo suficientemente cerca para permitir que algunos de sus átomos puedan insertarse en las regiones complementarias de la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de un anticuerpo de cuatro cadenas son sus dos dominios de interacción con el antígeno idénticos entre sí, mientras que la región correspondiente del antígeno es lo que se denomina el determinante antigénico (epitopo). La mayoría de las macromoleculas antígénicas presentan vanos determinantes antigénicos distintos; si dos 3 más de ellos son idénticos, se dice que el antigeno es multivalente. La afinidad de una molécula de anticuerpo refleja la fuerza con que el determinante antigénico se inserta en un solo sitio de unión al antigeno, y es independiente del número de determinantes antigénicos. Sin embargo, la avidez total de un anticuerpo por un antígeno multivalente. como un polímero con

Tabla 37-1

Propiedades biológicas de los dominios de inmunoglobulina (IgG)

Dominio

Función conocida o probable

C„3

1. Reacciones citotrópicas que implican (a) Macrófagos y monocitos (b) Mastocitos heterólogos (c) Células citotóxicas (K) (d) Células B 2. Ensamblaje no covalente de las cadenas pesadas y ligeras 1. Unión al complemento (C1q) 2. Control del ritmo catabòlico 1. Ensamblaje no covalente de las cadenas ligeras y pesadas 2. Ensamblaje covalente de cadenas ligeras y pesadas. 3. Espaciadores entre interacciones entre dominios que conllevan unión del antígeno y funciones electoras 1. Unión al antígeno 2. Formación de enlaces no covalentes entre cadenas pesadas y ligeras

Debido a que posee una localización expuesta y una estructura flexible, la región bisagra es atacada por diversas enzimas proteoliticas. Como su nombre indica, esta región confiere una cierta flexibilidad a la molécula, permitiendo que adopte la estructura en forma de "Y". Esto permite que un anticuerpo se una a una sola partícula (p. ej. una bacteria) mediante sus dos regiones de unión al antígeno o. alternativamente, puede estirarse al máximo para unir dos partículas. Las propiedades que aporta la región bisagra a las moléculas de inmunoglobulina están relacionadas con su alto contenido en prolina y residuos de aminoácidos hidrofílicos. Los puentes disulfuro que se establecen entre las cadenas H en moléculas de IgG. IgA y en IgD se encuentran en la región bisagra (Fig. 37-1).

VHTV,

Las enzimas proteoliticas papaina y pepsina escinden las moléculas de anticuerpo en diferentes fragmentos característicos que permiten un entendimiento de la relación estructura-función de la proteina. El corte con papaina produce dos fragmentos Fab (Iragment antigen-binding. fragmento de unión al antígeno) idénticos, cada uno de ellos con un dominio de unión al antigeno, y un fragmento Fe

De Dornngion KJ Painter RH Biological activities of the constant region of immunoglobulin G. En Mandel TE, el al (eds) Progress in Inmunology III Ciudad de Canberra. Australian Academy of Science. 1977. con permiso

C,,2 C..1/C

880

SECCIÓN V

•

INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

subunidades repetidas, se define como la fuerza total de unión de todos los sitios de unión juntos. Una molécula de IgG típica se une con al menos 10.000 veces mayor fuerza a un antígeno multivalente si ambos dominios de interacción con el antigeno están implicados, que si sólo interviene uno de ellos. Por el mismo motivo, si la afinidad de los dominios de interacción con el antígeno entre moléculas de IgG e IgM es la misma, la molécula de IgM (debido a que es un pentámero y por tanto posee 10 dominios de interacción con el antígeno) poseerá una avidez mucho mayor por un antígeno mullivalente que una molécula de IgG (que posee dos dominios de interacción con el antígeno). Esta diferencia de avidez es importante en vista del hecho de que los anticuerpos producidos al comienzo de una respuesta inmune, generalmente poseen afinidades mucho menores que los que se producirán más adelante. El aumento en la afinidad media de los anticuerpos producidos con el transcurso de tiempo desde la inmunización se denomina maduración de la afinidad. Esto ocurre porque la respuesta humoral frente a un antígeno es heterogénea, esto es, se producen anticuerpos con distintos dominios de unión al antígeno por parte de los clones de linfocitos B de respuesta. Debido a su elevada avidez total, IgM (el principal tipo de Ig producida al principio de una respuesta inmune) puede funcionar incluso cuando cada uno de sus dominios de interacción sólo tiene una baja afinidad. El tamaño del complejo antígeno-anticuerpo se determina por la valencia del antígeno y las concentraciones relativas del antígeno y el anticuerpo. La reacción de precipitación de antigeno-anticuerpo se basa en el entrecruzamiento de antígenos multivalentes por anticuerpos bivalentes. Si sólo está presente un tipo de anticuerpo (una respuesta monoclonal), moléculas con un solo determinante antigénico no pueden entrecruzarse. Si un antígeno es bivalente, puede formar pequeños complejos cíclicos o cadenas lineales con el anticuerpo, mientras que un antígeno con tres o más determinantes antigénicos puede formar complejos tridimensionales que precipitan con facilidad. Sin embargo, la mayoría de los antisueros producidos frente a un antígeno contienen una variedad de anticuerpos diferentes (una respuesta policlonal) que reaccionan con diferentes determinantes del antígeno y pueden cooperar en el entrecruzamiento del antígeno. Por el contrario, anticuerpos homogéneos (monoclonales) sólo pueden precipitar moléculas que presentan repeticiones idénticas de determinantes antigénicos.

Dadas las condiciones de valencia que permiten la formación de grandes agregados, el tamaño de los complejos antígeno-anticuerpo que se forman depende criticamente de las concentraciones molares relativas de los dos reactivos. Si hay un exceso de antígeno o de anticuerpo es poco probable que se formen grandes complejos (Fig. 37-2). El tamaño y composición de los complejos antígeno-anticuerpo no sólo son importantes para las reacciones de precipitación in vilro. también son cruciales para determinar el destino de los complejos en el organismo. Los complejos formados en equivalencia o en exceso de anticuerpo presentan múltiples regiones Fe expuestas en la superficie y por tanto se unen con fuerza a los receptores Fe de los macrófagos, los cuales los ingieren y degradan. Los complejos pequeños, formados en exceso de antígeno, sólo presentan una región Fe por complejo. Así, se unen pobremente a los receptores Fe de los macrófagos y se destruyen con menos eficiencia. En lugar de ser destruidos se pueden depositar en pequeños vasos sanguíneos de la piel, ríñones, articulaciones y cerebro, donde pueden activar el sistema del complemento, causando inflamación y destrucción del tejido. Aunque parece que los complejos antígeno-anticuerpo tienen una apariencia muy rígida, los anticuerpos son entidades dinámicas que sufren fluctuaciones estructurales (Karplus, 1983; Wilson, 1991). Cambios conformacionales pueden ser necesarios para la unión. Estos ajustes incluyen desplazamientos laterales de las cadenas de hasta 2 a 3 A, rotaciones de anillos aromáticos, cambios conformacionales e incluso pequeñas rotaciones entre dominios V y V (Bhat, 1990; Standfield, 1990; Herrón, 1991). H

L

BASE GENETICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS 6

9

Se estima que un individuo puede producir al menos entre 10 y 10 moléculas de anticuerpo diferentes. Han evolucionado mecanismos genéticos especiales para producir una gran cantidad de moléculas de inmunoglobulina, que se desarrollan durante la respuesta a un antígeno sin la necesidad de involucrar un número excesivo de genes (Edward, 1993).

Figura 37-2. Las concentraciones del antígeno y del anticuerpo influencian el tamaño de los complejos antígeno-anticuerpo que se forman. Los complejos de mayor tamaño se forman cuando ambas moléculas están presentes en aproximadamente la misma concentración molar (zona de equivalencia), mientras que los complejos más pequeños se forman cuando existe un gran exceso de antigeno. Nótese que los pequeños complejos formados en exceso de antigeno presentan pocas moléculas de anticuerpo por complejo: por este motivo, no son eliminados eficientemente por los macrófagos de los fluidos extracelulares.

CAPÍTULO 37

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EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

881

Figura 37-3. Organización y reagrupamiento de los genes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas (exones) en el cromosoma 12 de ratón. Cada gen V„ tiene también una secuencia líder que no aparece en la representación Los genes de la región constante se identifican mediante el isolipo de la cadena pesada, y existe más de un gen para los isotipos C, y C„ A diferencia de los genes de C,, y C,. los genes C están compuestos por múltiples exones, tal y como se ilustra para el gen C„ (dominios C„,-C,„...). Los sitios de recombmación se encuentran en el extremo 5' de cada uno de los genes C„ y tampoco se muestran. La linea continua representa las secuencias intermedias (intrones) entre genes o segmentos génicos. Cada cadena pesada está codificada por cuatro segmentos génicos diferentes. V, D. J. y C. (Reproducido de Marcu KB: Immunoglobulin heavy-chain constant region genes. Cell 1982; 29:719, con permiso. Copyright © de Cell Press). M

Las inmunoglobulinas se producen mediante 3 grupos de genes que codifican para las cadenas K, K y H. respectivamente Los grupos de genes que codifican para las cadenas ligeras y pesadas se encuentran en cromosomas diferentes. En cada grupo, distintos segmentos génicos que codifican para diferentes partes de las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas se pueden poner en contacto mediante procesos de recombinación específicos que tienen lugar durante la diferenciación de células B. Los grupos de genes de cadenas ligeras contienen uno o más genes constantes (C) y juegos de segmentos variables (V) y de genes de unión (J). El grupo de genes de la cadena H contiene un juego de genes C. y juegos de genes V. genes de diversidad (D) y segmentos J. Para generar una molécula de anticuerpo, un segmento génico V se recombina con otro segmento génico J , dando lugar a un gen V para la cadena ligera; y un segmento V„ se recombina con un segmento D y otro J para generar un gen V para la cadena pesada (Fig. 37-3). Cada uno de los segmentos génicos generados se cotranscribirá con el segmento de la región constante correspondiente para producir un ARN mensajero que codifica para la cadena polipeptidica completa. Mediante la combinación de los diferentes segmentos génicos que codifican para las regiones V, y V.„ los vertebrados pueden producir miles de cadenas ligeras distintas y miles de cadenas H diferentes que pueden asociarse para dar lugar a millones de moléculas de anticuerpo diferentes. H

Este repertorio inicial de moléculas de anticuerpo se puede expandir incluso más mediante la hipermutación somática, la cual se activa mediante la exposición al antígeno. Así, el papel que juega el antígeno en presencia de la mutación somática parece derivar en un refinamiento de la respuesta inmune y a una diversidad prácticamente ilimitada de moléculas de anticuerpo. Mutaciones somáticas puntuales tienen lugar en células B (no en células germinales) durante toda la vida de un animal o un humano (Tonegawa, 1983). Las hipermutaciones somáticas se encuentran, en su mayoría, confinadas a los genes de las regiones variables de las cadenas H y L y a los intrones contiguos. Se estima que tendrá lugar, aproximadamente, una mutación en la región V de la cadena H o L. en cada célula individual con cada división celular. Esto no sólo aumenta la diversidad de anticuerpos, sino que también puede causar un cambio en la afinidad con la que el anticuerpo se une a su ligando. Aquellas células B resultantes que puedan unir al antígeno con mayor avidez presentan una ventaja sobre otras células B que no son capaces de unir al antígeno con tanta avidez. A medida que decae la concentración de antígeno, aquellas células B que presentan receptores con mayor avidez dominan la población de células involucradas en la respuesta. Esto origina

una mayor afinidad de los anticuerpos que se producen en un segundo contacto con el antigeno que en la respuesta inicial. Asi. este proceso de hipermutación somática puede dar lugar a la presencia en individuos inmunizados de anticuerpos de alta afinidad que resultan mucho más efectivos. Todas las células B producen inicialmente anticuerpos IgM. Más adelante algunas pasan a producir otros tipos de anticuerpos (isotipos) que poseen el mismo dominio de unión al antígeno (idiotipo) que la IgM original (exclusión alélica) (Fig. 37-4 y Tabla 37-2). Este cambio de lipo en combinación con la exclusión alélica permite que los mismos dominios de unión al antígeno (la misma cadena V„ y L) se distribuyan entre anticuerpos con distintas propiedades biológicas (funciones efectoras secundarias). Así. este mecanismo de organización gémea permite la construcción de moléculas de inmunoglobulina con una variedad de especificidades. La diversidad de los anticuerpos depende de la presencia de múltiples segmentos génicos, su reagrupación en diferentes secuencias, la combinación de distintas cadenas pesadas y ligeras en la construcción de moléculas de inmunoglobulina, y de mutaciones somáticas.

PROPIEDADES GENERALES DE LAS INMUNOGLOBULINAS (Spielgelberg. 1974: Carayannopoulos. 1993) Los diversos tipos de inmunoglobulinas humanas y sus propiedades están resumidos en las Tablas 37-3 y 37-4.

Inmunoglobulina M Esta glucoproteína es el principal tipo de anticuerpo secretado a la sangre en las primeras fases de una respuesta humoral primaria. Normalmente, la IgM se secreta en forma de pentámero compuesto por cinco unidades de cuatro cadenas cada una. una macroglobulina con una velocidad de sedimentación de 19S y una masa molecular de 900 kDa. Sin embargo, en trastornos autoinmunes humanos, como puede ser el lupus entrematoso sistémico (SLE), la forma monomérica de 7S se puede detectar en cantidades apreciables en el suero. La deficiencia selectiva de IgM es un trastorno poco frecuente asociado con una ausencia de IgM y niveles normales del resto de inmunoglobulinas. El origen de este trastorno es desconocido.

882

SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Figura 37-4. Estructura de las cadenas pesada y ligera mostrando las posiciones y longitudes de las regiones hipervariables del dominio V\ (denominados Lv1. Lv2. Lv3) y del dominio V„ (denominados Hv1. Hv2. Hv3). Los residuos de aminoácidos se enumeran empezando por el extremo amino-terminal. En algunas cadenas pesadas, se ha observado una región hipervariable adicional (N84-N91). En el diagrama también se ilustra la región donde pueden encontrarse la mayoría de las vanantes de inmunoglobulina. Los determinantes idiotipicos se encuentran exclusivamente en los dominios V, y V„. y el marcador isotipico en las regiones constantes de ambas cadenas. Los marcadores alotipicos pueden aparecer a lo largo de ambas cadenas.

Debido a que la forma pentamérica de la IgM tiene un total de 10 dominios de unión al antigeno, resulla más eficiente que su forma monomérica 7S o la IgG en el entrecruzamiento del antígeno y en la activación del sistema del complemento una vez unido al antigeno. Asi, esta elevada eficiencia en la unión y activación del complemento, unido a su temprana

aparición durante el transcurso de una infección, hace de la IgM un agente especialmente potente para combatir las invasiones microbianas. Cada pentámero de IgM contiene una copia de otra cadena polipeptídica. denominada cadena J (del inglés joming). con un tamaño molecular de 15 kDa. Este polipéptido accesorio se produce por parte de las células secretoras de

CAPÍTULO 37

Tabla 37-4

•

EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGIOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

883

P r o p i e d a d e s de las i n m u n o g i o b u l i n a s h u m a n a s IgM

IgG

IgA

IgD

A Fisiológicas Concentración mg/ml en suero de un adulto normal 1.2-4.0 8.0-16.0 0.4-2.2 0.03 17-450 ng/ml Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 C2t Vía alternativa Factor B Factor D Properdina Via de la MBLectina MBL Complejo de ataque a la membrana C5 C6 C7

Autosómica recesiva

Infecciones piógenas recurrentes, glomerulonefritis

Autosómica Autosómica Autosómica Autosómica Autosómica

Glomerulonefritis. LES Glomerulonefritis. LES Glomerulonefritis. LES LES LES, LED. artritis reumatoide juvenil, glomerulonefritis

recesiva recesiva recesiva recesiva recesiva

Autosómica recesiva Autosómica recesiva Ligada al X

Infecciones por Neisseria meningitidis Infecciones piógenas recurrentes Infecciones piógenas recurrentes, meningococcemia fulminante

Autosómica dominante

Infecciones recurrentes

Autosómica recesiva Autosómica recesiva Autosómica recesiva

Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria. LES Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria, enfermedad de Raynaud Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria Nada

C8 (cadenas ß y a-y) Autosómica recesiva C9 Autosómica recesiva Proleinas de control del fluido sanguineo C1inh Autosómica dominante o adquirida C4bp Autosómica recesiva Factor I Autosómica recesiva Factor H Autosómica recesiva Proteínas unidas a células CR1 Autosómica recesiva ' CR3 Autosómica recesiva" DAF/CD59/HRF Adquirida 1

Angioedema hereditario, enfermedades autoinmunes' Angioedema, síndrome semejante al Behcet Inlecciones piógenas recurrentes Inlecciones piógenas recurrentes, glomerulonefritis Asociación entre la expresión baja en eritrocitos y el LES Infecciones piógenas recurrentes, leucocitosis Hemoglobinuria paroxística nocturna

* Véase que algunas personas con deficiencias del complemento, especialmente C2 y componentes del complejo de ataque a la membrana, están clínicamente bien. Un número sustancial de pacientes con defectos en del C5 al C9 han tenido una enfermedad autoinmune. Las deficiencias del Ct al C9 están asociadas con un CH50 de O. Las deficiencias de Ct. C4 y C2 están asociadas con LES y los pacientes a menudo tienen prep. LE negativos Las deficiencias de C3 a C9 eslán asociadas con una ausencia o una baja actividad bactericida en suero La deficiencia de C3 o C5 está asociada con la ausencia o disminución de la actividad quimiotáctica en suero y puede estar asociada con la ausencia de respuesta leucocítica a la infección. i La deficiencia en cualquier gen del C4 (C4A y C4FJ) se denomina "qO", para la cantidad cero Tal deficiencia es designada C4AqO o C4BqO Los pacientes con tales deficiencias tienen una incidencia mayor de lo normal de enfermedades autoinmunes. Los individuos heterozigóticos para la deficiencia de C2 también tienen un aumento de la incidencia de enleimedades autoinmunes. Aproximadamente el 85% de los casos incluyen aletas silentes, y un 15% incluyen alelos que codifican para la variante adquirida disluncional de la proteina Ct inhibidor. En el angioedema hereditario, el nivel de C1 esta normal o disminuido, el nivel de C3 está siempre normal, y el nivel de C4 eslá disminuido. En la enfermedad adquirida, los niveles de Cl y C4 están disminuidos, el nivel del antigénico Cl inhibidor suele ser normal o alto, y el nivel funcional del Cl inhibidor esta muy disminuido. La homocigosis para la expresión numérica ba|a (no ausente) de CR1 en los eritrocitos es detectable in vilro y puede estar asociada con el LES También puedo detectarse un defecto adquirido en el número de CRI Niveles bajos, pero no ausentes de CR3 leucocitico son detectables en los padres de la mayoría de los niños con delicit de CR3. LES = lupus eritemaloso sislémico. LED = lupus eritematoso diseminado. MBL = lectina fijadora de mañosa 1

CAPÍTULO 38

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN

903

do que las infusiones de MBL purificada corrigen el defecto y la susceptibilidad Es importante reconocer que la medición de los niveles del complemento a las infecciones en los niños con deficiencias del MBL (Valdimarsson, 1998). sérico representa los niveles estáticos de proteínas que se recambian rápiAdemás, se ha sugerido que la deficiencia de MBL conduce a enfermedades damente. Incluso en los individuos normales, el Índice fraccional catabólico autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (Turner. 1996) y que es un de la mayoría de los componentes que han sido medidos está alrededor del factor de riesgo para el aborto recurrente (Christiansen. 1999). 2% por hora. Muchas de estas proteínas se comportan como reactantes de La deficiencia en cualquiera de los componentes de la cascada del com- fase aguda, y sus niveles en suero pueden aumentar drásticamente en los estados inflamatorios. Sus índices de catabolismo pueden aumentar en plemento tiene alguna asociación con la susceptibilidad a infecciones (Figueroa. 1991; Densen. 1998). Debido al papel central que el C3 tiene en la opso- varias enfermedades autoinmunes. El hallazgo de una disminución del nivel del complemento puede avalar la sospecha de que el sistema del complenización, la deficiencia de C3. de otros componentes de la vía alternativa, o mento participa en el daño tisular, pero no lo prueba. El hallazgo de un nivel de las moléculas reguladoras como los factores H e I está asociada con un normal de complemento en el suero no excluye la participación del compleaumento de la incidencia de infecciones. Interesantemente, las deficiencias mento en el daño tisular. Por ejemplo, los pacientes con cirrosis biliar tienen de los componentes del complejo de ataque a la membrana (C5-C9) están un aumento del Índice catabólico de C3, y se ha sugerido que el C3 puede altamente asociadas con un aumento de la incidencia de infecciones por jugar un papel en el desarrollo de esta enfermedad. No obstante, el nivel de Neisseria meningitidis, sugiriendo la importancia de la lisis mediada por el C3 en el suero de los pacientes con cirrosis biliar está casi siempre elevado. complemento en el control del meningococo La vacunación empleando un En este caso, el aumento de la síntesis encubre el catabolismo aumentado. polisacárido capsular multivalente para Neisseria meningitidis demostró ofreTambién debe reconocerse que la función del complemento en los diversos cer alguna protección frente a la infección menmgocócica en los pacientes compartimentos del cuerpo puede ser diferente. La actividad del complecon deficiencia del complemento (Fijen. 1998). mento en la sangre de pacientes con artritis reumatoide seroposítiva puede Otra característica de la deficiencia del complemento, especialmente en los ser normal o elevada; sin embargo, la actividad del complemento del liquido componentes iniciales de la via clásica (C1. C4, C2). es la asociación con enfermedades autoinmunes como el LES. Ya que el complemento es impor- sinovial puede eslar severamente disminuida. tante en el aclaramiento de los complejos inmunes de la circulación, puede ser Muchos investigadores han intentado identificar qué vía de activación del que la deficiencia de los componentes iniciales del complemento conduzca a complemento predomina en la mediación del daño tisular o en los niveles disuna degradación inadecuada de los complejos inmunes con su acumulación minuidos del complemento en una y otra enfermedad estableciendo el" perfil en los tejidos como el riñon. Recientes datos experimentales que emplean del complemento". La aproximación más simple a este problema examina los ratones transgénicos sugieren que la autommumdad asociada con la deficienniveles de varios componentes y da por hecho que los niveles disminuidos de cia de Clq origina un aclaramiento inadecuado de las células apopléticas que. un complemento dado de una de las vias de activación del componente es a su vez. conduce al desarrollo de anticuerpos autorreactivos (Bofto. 1998). más frecuente que ocurra cuando la vía está activada. Por lo tanto, si un Como se discutió previamente en la sección Complemento e inmunidad adqui- paciente tiene niveles disminuidos de C3 y C4 y niveles normales de factor B, rida, la deficiencia del complemento (especialmente de C4 o CR1 CR2) tam- seguramente estará implicada la vía clásica. Si un paciente tiene niveles disbién puede alterar el mecanismo por el que las células B se hacen tolerantes minuidos de C3, factor B y properdina, y niveles normales de C4, probablea los antígenos propios, conduciendo por ello a una autoinmunidad (Prodeus, mente estara activada la vía alternativa. De esta manera, la determinación de 1998). Existen deficiencias en las moléculas reguladoras del complemento los niveles de un número limitado de componentes puede proporcionar unidas a la membrana. La deficiencia de CR3 origina severas infecciones pió- mucha información. Exceptuando el caso de alteraciones conlroladas genétigenas y defectos en la adhesión leucocitana (Fríes. 1986; Morgan. 1991). La camente del complemento, uno nunca necesita conocer los niveles de todos deficiencia en la capacidad para generar el enlace glicosil fosfatidilinositol que los componentes excepto para objetivos de investigación. une algunas proteínas de control del complemento a la membrana celular oriUn importante avance en este área es el empleo de ensayos de enzimas gina HPN. Los pacientes con tal enfermedad no tienen DAF. CD59 y HRF en fijadoras inmunoabsorbentes (ELISAj para detectar los complejos estables la superficie de sus células y sufren una hemolisis intravascular crónica, tromformados en el suero durante la activación del complemento. Estos ensayos bocilopenia y disminución de la hematopoyesis (Jarva, 1999). La deficiencia son muy sensibles y pueden demostrar rápidamente que vía del complemendel C1 inhibidor origina el angioedema hereditario, una enfermedad caracteri- to está activada en varios estados de enfermedad (Morgan. 1994a). zada por episodios recurrentes de edema subcutáneo y submucoso. Esta defiEn la activación, muchas proteínas del complemento expresan nuevos ciencia puede heredarse o adquirirse tras el desarrollo de autoanticuerpos conantigenos (neoantígenos) que no son expuestos en la proteína nativa plastra el C1 inhibidor. Los pacientes con deficiencia del C1 inhibidor a menudo mática. El neoantígeno presente en el MAC pero no presente en los compomuestran niveles bajos de C4 y C2. demostrando una activación incontrolada nentes nativos termínales es quizás el más interesante. El anticuerpo para del C1. Se cree que el angioedema hereditario es causado principalmente por este neoantígeno existe y se ha utilizado para estudiar el nivel de neoantíla pérdida de la regulación del sistema generador de cininas por el C1 inhibigeno por inmunofluorescencia así como por ELISA (Falk. 1983; Sanders. dor (Cugno. 1998; Davis. 1998). 1985). El nivel de neoantígeno está elevado en sangre y en líquido cefaloLos pacientes con hypogammaglobulinemia o inmunodeficiencia combinada rraquídeo en muchos pacientes con activación consiguiente del complemensevera a menudo tienen disminuidos los niveles de Clq. En parte, estos nive- to (Sanders. 1986). Además, está presente en los tejidos en los lugares de les disminuidos de C1q se relacionan con los niveles bajos de IgG en la circu- depósito del complejo terminal. Por ejemplo, está presente en el tejido lesionado en los glomérulos de los pacientes con glomerulonefritis (Falk. 1983) y lación. Parece que el Clq interacciona con la IgG en la circulación y que esta en la piel lesionada en los lugares de LES activo (Biesecker. 1982). A queinteracción conduce, a su vez. a una disminución del catabolismo del Clq. rencia del C3 depositado en la piel normal de pacientes con LES y con test de banda para el lupus positivo, el neoantígeno MAC solo se encuentra en las lesiones. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD En muchos contextos de enfermedad, las funciones del complemento son normalmente producir inflamación o daño tisular. Cuando el complemento juega un papel en el desanollo de la enfermedad, a menudo es activado por un Enfermedades reumatológicas anticuerpo anormal, un complejo inmune o por material extraño. FrecuenteLa enfermedad reumatológica que ha sido evaluada más extensamente mente es importante evaluar el nivel de uno y otro componente del comple- en cuanto a la contribución del complemento a la actividad de la enlermedad mento como medida de la actividad de un proceso de enfermedad. Por ello, loses el LES (Agnello. 1986: Alkinson. 1986). En esta enfermedad se forman pacientes con LES activo pueden tener disminuidos los niveles de C3 y C4, y grandes cantidades de complejos inmunes. Se encuentran inmunocomplejos estos niveles disminuidos del complemento pueden seguirse como un marca- circulantes y unidos a tejidos. Estos inmunocomplejos activan el compledor aproximado de la actividad de la enfermedad. mento, y los productos de activación del complemento contribuyen a que

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matismo severo o sepsis incontenible. Hay evidencia de activación masiva continúe la inflamación. A menudo están disminuidos los niveles de C3 y C4 en el LES y, en general, los niveles bajos se encuentran en los pacientes condel complemento en estos pacientes, lo que sugiere que las bacterias y los productos bacterianos activan el complemento (Hammerschmidt, 1980). enfermedad activa. Algunos sugieren que un nivel bajo de C4 es el mejor Parece que se activan la vía clásica y la vía alternativa (Langlois. 1988). Se indicador de que la enfermedad continúa activa. Sin embargo, hay pacientes forman factores inflamatorios como el factor activador de neutrófilos y el C5a. con enfermedad activa que muestran niveles normales de C4. De acuerdo Hay evidencia de que los neutrófilos infiltran el pulmón, y se cree que los procon otros, el nivel de sC5b-9 circulante o de neoantígeno del MAC puede ser ductos oxidativos neutrofílicos y las proteasas son responsables de mucho un indicador mejor de enfermedad activa (Gawryl, 1987). Como se trató previamente, el complemento parece jugar un papel esencial en el aclaramien- del daño pulmonar que ocurre. to de los inmunocomplejos circulantes, particularmente de aquellos que contienen isotipos activantes del complemento IgM o IgG. El depósito de C3b sobre el inmunocomplejo procede de la activación del complemento, que Enfermedades renales permite la interacción con células que poseen el receptor de C3b (CR1). Con la unión a los eritrocitos a través del CR1. se impide que los complejos inmuEl complemento parece ser una clave importante en el daño glomerular en nes se difundan del plasma a los tejidos donde pueden originar daño. Los erimuchas de las glomerulonefritis (West, 1998). Esto se demuestra a menudo trocitos que unen a inmunocomplejos circulan hacia el hígado, donde los por el depósito de C3 y otros componentes, en o cerca de la membrana basal inmunocomplejos son eliminados por un proceso que no disminuye la vida glomerular. Además, el MAC ha sido reconocido en el daño glomerular en media de los hematíes (Cornacoff, 1988; Birmingham, 1995). En las enferpacientes con glomerulonelritis y LES. Se ha demostrado que los pacientes medades en las que el complemento es activado y estos productos inmuno- con enfermedad del suero debida a inmunocomplejos circulantes tienen lógicamente activados se forman en la circulación, el número de CR1 por erilesión glomerular. En el análisis del suero, estos pacientes mueslran la actitrocito está disminuido. Esto puede resultar de la eliminación de algunos de vación de las vías clásica y alternativa, o de ambas. Tradicionalmente, se ha los CR1 cuando el complejo inmune es retirado del eritrocito en el hígado creído que los complejos son depositados en los glomerulus a medida que (Ross, 1985). Además del LES, se ha publicado que los eritrocitos de paciense filtra el plasma que contiene los inmunocomplejos. Una vez depositados, tes con enfermedad crónica por aglutininas frías. HPN, anemia hemolíhca estos complejos activan el complemento. Un punto de vista alternativo es autoinmune. síndrome de Sjogren y neumonía por Mycoplasma pneumoniae que los anticuerpos contra las estructuras glomerulares forman inmunocomtienen reducido el CR1 eritrocitano, sugiriendo que los depósitos inmunes plejos en el riñon que luego activan el complemento para causar daño local han sido eliminados de los eritrocitos en estas enfermedades (Atkinson, (Daha, 1979). Aunque los anticuerpos frente a las estructuras de la mem1986: Ross, 1985). brana basal glomerular son claramente importantes en el síndrome de Goodpasture, su papel global en las glomerulonefritis es más cuestionable. El Las proteínas del complemento actúan como reactantes de fase aguda y papel del complemento en la enfermedad intersticial y tubular está menos los niveles pueden no estar disminuidos incluso en situaciones en las que claro; sin embargo, hay quienes creen que el complemento también funcioocurre la activación del complemento. Se encuentran niveles séricos del complemento normales o aumentados en la artritis reumatoide juvenil, en el reu- na en estos trastornos. Interesantemente, en algunos pacientes con glomerulonefritis con niveles muy bajos de C3. una proteina lamada factor nefrítimatismo palindrómico. en la seudogota. en la gota, en el síndrome de Reiter co C3 (C3NeF o Nf) estabiliza la vía de la C3 convertasa alternativa. Este y en la artritis gonocócica. AI mismo tiempo, parecen existir niveles disminuifactor es un autoanticuerpo dirigido contra el Bb que aumenta la vida media dos del complemento en el líquido sinovial en un número de otras enfermede la C3 convertasa de la via alternativa en más de 10 veces (Daha. 1979. dades reumatológicas. incluyendo la artritis reumatoide. Se cree que la dis1976). El C3NeF parece proteger a la C3 convertasa de la vía alternativa de minución de la actividad hemolitica total del complemento (CH50; véase l a eliminación por la disociación por el factor H (Fearon, 1980). Se cree que después en Ensayos del complemento) y la presencia de productos de degrael C3NeF es responsable de los niveles tan bajos de C3 presentes en estos dación del C3 y del factor B representan la activación intraarticular en el líquipacientes pero no se cree que juegue un papel central en el desarrollo de la do sinovial de muchos pacientes con artritis reumatoide seronegativa. LES, nefritis. seudogota, gota, síndrome de Reiter y artritis gonocócica. Esto no es cierto a

en fluidos obtenidos de pacientes con artritis degenerativa. Enfermedades dermatológicas Enfermedades infecciosas Como en los otros grupos de enfermedades señalados, se cree que el complemento toma parte en el daño tisular en una variedad de enfermedaComo se mencionó anteriormente y como se evidenció en hallazgos clínides dermatológicas. Estas incluyen el penfigoide ampollóse el penfigoide cos en pacientes con deliciencias genéticamente controladas del complemento, el sistema del complemento juega un papel crucial en la defensa con- gestacional. el penfigoide cicatricial, la epidermólisis ampolosa adquirida, la tra los microorganismos. Los pacientes con septicemia por Gram negativos dermatitis herpetiforme y el pénfigo vulgar (Yancey, 1998). Es importante a menudo tienen niveles disminuidos de C3 y de componentes de la vía alter-saber que los niveles séricos del complemento suelen estar normales o elevados en estos estados inflamatorios, y de que la importancia del complenativa, al igual que pacientes con ciertas enfermedades fúngicas como la mento es estimada por análisis de inmunofluorescencia de las biopsias lisusepticemia criptocócica. El complemento puede estar implicado en el daño lares y por estudios del liquido de la ampolla. Además. Gammon y cois. tisular asociado con la infección crónica. Se sabe que los pacientes con (1984) han desarrollado un modelo in vilro útil para el estudio de enfermehepatitis infecciosa HbsAg positiva tienen una caída precoz en el C3 sérico, que posteriormente vuelve a la normalidad. Esto puede estar asociado con dades cutáneas mediadas por anticuerpos anli-membrana basal. Estos autores han mostrado concluyentemente que el C5a es un elemento clave signos de enfermedad por inmunocomplejos (esto es, la artralgia). De una forma similar, el complemento parece jugar un papel importante en muchas en la patogénesis del penfigoide ampolloso y de la epidermólisis ampollosa adquirida. El C5a actúa como un quimioatrayente necesario para el aflujo de infecciones parasitarias, incluyendo la leishmaniasis, la tripanosomiasis, la leucocitos polimorfonucleares a los lugares de daño tisular en estas enfergiardiasis y la malaria. La discusión detallada de las interacciones entre el medades. sistema del complemento y los parásitos, las bacterias y los virus no se encuentra dentro de los objetivos de este capitulo y el lector debe remitirse a revisiones sobre el tema (Frank, 1998; Kozel, 1996: Cooper, 1998; Moffitt, 1994; Fishelson. 1994). Sin embargo, es importante reconocer que los nive- Enfermedades hematológicas les del complemento sérico en general no son un índice fiable de actividad de enfermedad en estas condiciones. En muchos tipos de anemia hemolitica autoinmune, el complemento juega un papel importante en la opsonización de los eritrocitos, conduciendo a su Se ha estudiado el papel del complemento en el síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), un proceso frecuente en pacientes con trau- aclaramiento por las células del sistema reticuloendotelial.

CAPÍTULO 38

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN

Sin embargo, incluso en aquellos casos en los que el complemento está claramente implicado, los niveles séricos del complemento suelen ser normales. El complemento es particularmente importante en el aclaramiento de células recubiertas con crioaglutininas tipo IgM con especificidad anti-l. Estos autoanticuerpos (aglutininas frias) están asociados con trastornos linfoprolíferativos que siguen a infecciones, o pueden ser hallazgos aislados, especialmente en los ancianos. Las aglutininas frías generalmente se unen óptimamente a temperaturas subfisiológicas, que se encuentran en algunas áreas del cuerpo como la punta de la nariz, los dedos de las manos, y las orejas. Suelen mediar la lisis celular cuando los eritrocitos circulantes vuelven a la temperatura corporal central. No todas las aglutininas frías son anticuerpos IgM. El síndrome de la hemoglobinuria paroxistica fría (HPF), por ejemplo, resulta de crioaglutininas IgG de Donath-Landsteiner. que se unen a las células a temperaturas menores de 37 C pero median la lisis una vez calientes. Aunque el anticuerpo es diferente, los efectos fisiopatológicos son similares. Otros autoanticuerpos que activan el complemento se unen más eficazmente a temperaturas calientes. En general, estas aglutininas calientes son del isotipo IgG. En algunos casos, estos anticuerpos pueden estar asociados con enfermedades malignas linfoprolíferativas y con infecciones virales. La mayoría de los anticuerpos IgG reactivos al calor encontrados en la anemia hemolitica autoinmune tienen especificidad Rh y son pobres activadores del complemento en contraposición con las aglutininas frías y con los anticuerpos frente a los grupos sanguíneos anti-A y anti-B. Sin embargo, algunos anticuerpos, como el Tja, activan el complemento y originan la lisis. En una anemia hemolitica adquirida rara, llamada HPN (hemoglobinuria paroxistica nocturna), los pacientes experimentan episodios recurrentes de lisis mtravascular. Se cree que la lisis de los eritrocitos en estos pacientes se lleva a cabo por la vía alternativa (Jarva, 1999; Rosse, 1998). aunque los niveles séricos del complemento siempre son normales y el test directo antiglobulina es siempre negativo. El defecto en la HPN es una pérdida de proteínas de enlace glicosil fosfatidilinositol en la superficie de las células de los pacientes originado por mutaciones en el gen fosfalidil glicano A (p/g-A). Entre otras proteínas de unión a través de este enlace de membrana están el DAF y el CD59. dos moléculas que controlan la activación del complemento a nivel de la C3 convertasa. y el C8 y C9 respectivamente (véase anteriormente en Regulación de la activación del complemento). Se cree que la lisis de los eritrocitos en pacientes con HPN se debe a la activación incontrolada del complemento en la superficie de estas células. Recientemente, se informó de que, aunque la pérdida de DAF y CD59 de la superficie de los eritrocitos en pacientes con HPN es responsable del aumento de la sensibilidad a la lisis mediada por el complemento, la deficiencia de CD59 origina una mayor sensibilidad a la lisis celular que la deficiencia de DAF (Shichishima, 1999).

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temente, el tipo de célula glial más abundante, el astrocito, demostró sintetizar in vitro todas las proteínas del complemento en condiciones inflamatorias (Morgan. 1996). Además, los astrocitos y las células microgliales expresan receptores del complemento ¡n vitro (Morgan, 1997a). Por lo tanto, a pesar de la barrera hematoencefálica. el cerebro tiene la capacidad de preparar una reacción inflamatoria dependiente del complemento como mecanismo de defensa.

Enfermedades cardiovasculares Se admite la implicación del sistema del complemento en la lesión por isquemia'reperfusión miocárdica. Se ha revisado recientemente (Lucchesi. 1997a). El mecanismo por el que el complemento contribuye al infarto agudo de miocardio en los pacientes todavía no está claro. Sin embargo, se han demostrado los depósitos de los componentes de las vías clásica y alternativa en el miocardio afectado junto con C5b-9 La producción de analilotoxmas que acompañan a la activación del complemento parece ser responsable de la reacción inflamatoria local. La demostración más clara del efecto del complemento, especialmente de los componentes finales (C5b-9). proviene del modelo animal de oclusión de arterias coronarias (Kilgore. 1998). Los conejos con deficiencia genéticamente controlada de C6 muestran una significativa reducción del tamaño del infarto en comparación con los conejos normales. Además, la infiltración neutrofilica se redujo significativamente en los conejos con deficiencia de C6. sugiriendo un papel crucial de los componentes finales del complemento en la generación de inflamación local. El complemento también parece jugar un papel en el desarrollo de lesiones de aterosclerosis (Torzewski. 1997). De nuevo, el mecanismo exaclo por el que el complemento contribuye al desarrollo de las lesiones arterioscleróticas no está claro. Sin embargo, el depósito de los componentes finales del complemento (C5b-9) ha sido demostrado en las íntimas adelgazadas y en las placas fibrosas. La activación del sistema del complemento está asociada con etapas prelesionales y con la progresión de lesiones arterioscleróticas (Niculescu, 1987; Seifert, 1989). Los conejos con déficit de C6 demostraron ser menos susceptibles que los conejos normales a las lesiones arterioscleróticas inducidas por colesterol (Schmiedt, 1998).

Biocompatibilidad Muchos de los biomateriales implantados en el cuerpo activan el complemento, particularmente la vía alternativa del complemento (Mollnes, 1997) En contacto con la sangre o con los líquidos tisulares. estos materiales pueden activar el complemento y producir inflamación local o daño tisular. Los materiales deben ser testados sobre su capacidad de activar el complemento antes de ser utilizados ampliamente.

Trasplante de órganos Enfermedades neurológicas El papel del sistema del complemento en las enfermedades del sistema nervioso se ha hecho evidente en los años recientes. Esto es algo sorprendente, ya que la barrera hemaloencefálica bloquea eficazmente la penetración del complemento en el liquido cefalorraquídeo. La activación del complemento fue demostrada en enfermedades como la miastenia gravis. la esclerosis múltiple, el lupus cerebral, el síndrome de Guillain-Barré y la enfermedad de Alzheimer (Shm, 1998; Morgan. 1994a, 1997b). El depósito de proteínas del complemento fue demostrado en enfermedades tisulares y se demostró la activación del complemento en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con muchas de estas enfermedades. Presumiblemente, la inflamación origina una ruptura de la barrera hematoencefálica con la penetración local de proteínas del complemento. Además, algunas células sintetizan proteínas del complemento. Hay evidencia de que la activación del complemento puede estar implicada en el daño a la mielina, originando de este modo enfermedad tanto del sistema nervioso central como del periférico. También se demostró que el complemento estaba implicado en la enfermedad de Alzheimer y en la enfermedad de Pick. En la enfermedad de Alzheimer, un péptido derivado del amiloide y denominado [5A4 se une al Clq y activa el complemento en las placas seniles del cerebro enfermo. Interesan-

El éxito del trasplante de órganos ha creado un gran problema, la escasez de órganos humanos para satisfacer las demandas para un número de pacientes que no deja de crecer que lo están esperando como técnica quirúrgica. Por lo tanto, muchos han propuesto el empleo de donantes animales como el cerdo en este campo como una lógica alternativa a los órganos humanos. Sin embargo, los órganos porcinos vascularizados son susceptibles de una intensa reacción de rechazo, denominada rechazo hiperagudo. cuando son implantados en primales o en humanos (Platt. 1998; Dalmasso, 1992). Esta reacción es mediada por anticuerpos que se unen a las células endoteliales y la activación del complemento. Se demostró que la activación del complemento era crucial en el daño tisular en la reacción hiperaguda de los xenotransplantes. La activación del complemento en las células endoteliales xenogénicas origina su activación (es decir, las células endoteliales adoptan un fenotipo procoagulante), que conduce a trombosis intravascular e intersticial y a hemorragia. Tal intensa reacción se debe a la incapacidad de las moléculas reguladoras del complemento asociadas a las células porcinas como el DAF, MCP y CD59 de controlar la activación del complemento humano. Por lo tanto, el éxito de esta prometedora intervención terapéutica recae en la capacidad de controlar la activación del complemento. El papel del complemento en el rechazo de órganos huma-

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

nos (aloinjertos) es menos aceptado pero parece que la activación del complemento contribuye de algún modo a los episodios de rechazo agudo y crónico (Baldwin, 1995).

UTILIDAD CLÍNICA DE LOS INHIBIDORES DEL COMPLEMENTO La activación del complemento contribuye indudablemente al daño lisular observado en una variedad de enfermedades humanas. Por lo tanto, el empleo de agentes que bloquean la activación del complemento debe mostrar su utilidad para limitar el daño tisular. Desgraciadamente, no hay agentes disponibles para el uso en la práctica clínica. Se están realizando investigaciones para desarrollar inhibidores del complemento que demuestren eficacia y seguridad. Ya que el complemento es fundamental en el control de la infección, un inhibidor del complemento adecuado no debería interferir con esta función del complemento. También se sabe que el C3a y el C5a son potentes inductores de las reacciones inflamatorias. Por lo tanto, el inhibidor deseable deberá actuar a nivel de la C3 convertasa clásica y alternativa para evitar la producción de estas anafilotoxinas. Se han producido muchos inhibidores recientemente y están siendo desarrollados actualmente. Nos centraremos solo en aquellos inhibidores que se muestran como promesas en el área clínica. Para una descripción más completa de los recientes inhibidores desarrollados del sistema del complemento, se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Makrides, 1998; Wagner, 1998). Como se discutió previamente, el CR1 es un potente regulador tanto de la via clásica como de la alternativa del complemento. Acelera la desintegración de las C3 y C5 convertasas de ambas vías y sirve como cofactor para la degradación del C4b, C3b y iC3b mediada por el factor I. Por lo tanto esta molécula representa un excelente candidato para la inhibición terapéutica del sistema del complemento en los estados de enfermedad. Una forma recombmante soluble del CR1, denominada sCR1, fue producida y demostró mantener todas las propiedades de la proteína nativa unida a la membrana. En una variedad de modelos animales de enfermedad humana donde se sabe que la activación del complemento tiene un papel, el empleo del sCR1 mejora significativamente el proceso de enfermedad. Estos incluyen, entre otros: xenotransplante cardiaco de cerdo en monos cinomolgus (Pruitt. 1994). alveolítis en un modelo de reacción pulmonar de Arthus (Mulligan. 1992), lesión tisular de isquemia/reperfusión miocárdica (Weisman, 1990), desmielinización en un modelo experimental de encefalomielitis alérgica en ratas (Piddlesden, 1994) y glomerulonefritis (Couser, 1995). El sCR1 ha entrado ahora en la fase I de los ensayos clínicos en pacientes con infarto de miocardio y en pacientes con SDRA inducido por quemaduras. Otro inhibidor del complemento que ha entrado también en la fase I de los ensayos clínicos es un anticuerpo humanizado de cadena simple contra el C5 humano. La ventaja de tal anticuerpo es que permite el bloqueo de la activación del complemento sin liberar C5a y depositar C5b-9, lo que se sabe que promueve el potente daño tisular debido a la inflamación y a la activación celular. El anticuerpo monoclonal para el C5 demostró en modelos animales interferir en el rechazo hiperagudo de los órganos porcinos en sistemas de perfusión in vilro (Kroshus, 1995), para prevenir el desarrollo de artritis en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (Wang. 1995), para disminuir la glomerulonefritis en un modelo de ratón de LES (Wang, 1996) y para disminuir el tamaño del infarto en un modelo de rata con un modelo de lesión de isquemia/reperfusión miocárdica (Vakeva. 1999). EL anticuerpo anti-C5 humanizado demostró ser un potente inhibidor del sistema del complemento in vitro (Evans, 1995). Los resultados de los ensayos clínicos sugieren que este anticuerpo puede disminuir significativamente el daño al miocardio en los pacientes que sufren un bypass quirúrgico cardiopulmonar ¡Rollins, 1998). Las preparaciones de IgG humana purificada para el empleo intravenoso (IVIG) se han empleado en un número de enfermedades autoinmunes e inflamatorias como la púrpura trombocitopénica idiopática, la enfermedad de Kawasaki, el síndrome de Guillain-Barré y la miastenia gravís (Dwyer. 1992). Sin embargo, el mecanismo exacto por el que la IVIG ejerce su acción bene-

ficiosa no está claro y puede incluir el bloqueo de anticuerpos a través de las interacciones idiotipo-antiidiotipo, el bloqueo de los receptores Fe para IgG en las células lagocíticas, la modulación de las funciones de las células T y B y la selección de repertorios inmunes. Sin embargo, la IVIG claramente tiene un efecto sobre el sistema del complemento (Frank, 1992). La IVIG ha demostrado interferir en la reacción de shock dependiente de la via clásica de Frossman en los conejillos de Indias (Basta, 1989) y prolongar la supervivencia del xenomjerto cardiaco porcino en primates (Magee, 1995). Además, el tratamiento con alias dosis de IVIG de pacientes con dermatomiositis inhibió el depósito de C3b y C5b-9 que normalmente se ve en los capilares del endomisio de estos pacientes (Basta, 1994). La IVIG inhibe la activación del complemento a través de su porción Fe. El mecanismo exacto por el que la IVIG bloquea la activación del complemento en la superficie del objetivo todavía no se comprende completamente. Informes han demostrado que la IVIG puede prevenir el daño tisular mediado por el complemento interactuando directamente con el C 1 o previniendo la unión del C4 con la célula diana (Mollnes, 1995; Miletic, 1996).

ENSAYOS DEL COMPLEMENTO Principios generales Están disponibles los métodos que permiten asegurar la determinación de los niveles de cualquiera de los componentes de las vías clásica, alternativa y de la MBLectma, así como muchas enzimas y reguladores del sistema del complemento. Sin embargo, muchos de estos ensayos no están disponibles en los laboratorios clínicos de rutina y están restringidos los laboratorios de investigación. Centraremos nuestra atención sobre las técnicas que no requieren para su realización un laboratorio especializado en la investigación del complemento. Para más detalles relativos a métodos que requieren técnicas más especializadas se remite al lector a otras publicaciones (Whaley, 1985: Dodds, 1997; Harrison. 1986; Giclas. 1997: Würzner, 1997). Los ensayos sobre el complemento se pueden dividir en dos lipos: aquellos que miden las proteínas del complemento como antigenos en los líquidos biológicos y aquellos que miden la actividad funcional de un componente dado. Ambos tipos de técnicas tienen ventajas e inconvenientes. Los métodos de análisis antigénico (inmunoquimicos) generalmente son fáciles de realizar. Estos ensayos antigénicos con altamente específicos, requieren menos reactantes especializados, son más baratos y se realizan en una cantidad de tiempo considerablemente menor. Los anticuerpos para las proteínas del complemento humano y para las proteínas purificadas del complemento humano están comercialmente disponibles. El Linscott's Directory ol Immunological and Biological Reagents (1998) es una guía útil para conocer los reactantes del complemento disponibles. Son sulicientes en estos ensayos, en los que pueden utilizarse tanto suero como plasma, los métodos comunes de almacenamiento congelado (-20 C). Por esta razón, los ensayos antigénicos son fácilmente adaptables al laboratorio clínico. Por otra parte, los ensayos antigénicos no proporcionan información sobre la actividad de un componente ya que pueden detectar los productos de degradación asi como los componentes funcionalmente activos. La presencia en suero de pequeños fragmentos de una proteina con actividad antigénica puede confundir los resultados. Algunos ensayos antigénicos emplean inmunodifusión radial. En estos ensayos, un fragmento proteico puede difundir más rápidamente que la molécula pariente, lo cual puede originar niveles falsamente elevados. Como ejemplo, el ensayo antigénico más frecuentemente empleado para el C3 mide su principal producto de degradación, el C3c. por inmunodifusión radial. Para mediciones seguras del C3c. la muestra debe guardarse a 37 C durante un número de días para permitir la completa conversión de C3 en C3c. En realidad, esto no se hace normalmente y por ello representa un motivo de error, aunque el error es pequeño y normalmente no tiene consecuencias clínicas. En general, los ensayos antigénicos no son tan sensibles como los ensayos funcionales y pueden no detectar niveles bajos de un componente presente en ciertos líquidos corporales. La sensibilidad de los ensayos antigénicos en cierto grado de la concentración del anticuerpo empleado, y con los ensayos habituales, puede medirse una cantidad de proteina antigénica tan pequeña como 10 pg/ml.

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN

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Hay kits disponibles que emplean la inhibición de la unión de un sustraTabla 38-5 Amortiguadores e m p l e a d o s frecuentemente e n los to radiomarcado para detectar varios péptidos del complemento. Estos e n s a y o s del complemento equipos están disponibles para la medición del C3a. C4a y C5a. La utilidad Soluciones stock* de estas mediciones todavía está debatiéndose. Está disponible un infor1. Salino tamponado con Verona tslock 5 x VBS) me detallado sobre los procedimientos de medida de la actividad lítica funDisolver 85 g de NaCI y 10.19 g de Na-5.5'dielil barbilurato en 1.5 I de cional y sobre los niveles antigénicos de los componentes de la vía alteragua destilada. Ajustar el pH a 7.35±0.05 con CIH IN y llevar hasta 2 l de volumen con aguda destilada Esta solución es cinco veces la nativa (Minta, 1985). También se han descrito ensayos diseñados para concentración de una solución isotómca y puede almacenarse a 4"C medir la actividad funcional de los factores proteicos H e I de control en el durante al menos un mes. suero humano pero requieren reactantes especializados que pueden no 2. Ácido disodio etilendiaminetertetr acético 0.01 M (stock EDTA) estar disponibles comercialmente (Gaither. 1979). Han sido desarrollados Disolver 37,2 g de Na-EDTA en alrededor de 600 mi de agua duslila ensayos con ELISA para la medición de productos de degradación de las da. Ajustar el pH a 7.65±0.05 con NaOH 2 N y llevar hasta I I de voluproteínas del complemento o para los complejos formados tras la activamen con agua destilada El stock EDTA puede utilizarse durante al menos tres semanas con almacenaje a 4"C. ción del complemento. Hay equipos comercialmente disponibles (Quidel. San Diego. CA). Estos miden los productos de degradación de las proteí3. Dextrosa con CaMg •' y gelatina (D5wg++) Disolver 100 g de dextrosa en 1 I de agua destilada. En un tubo sepanas del complemento a medida que se generan tras la activación del comrado disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentánplemento empleando anticuerpos monoclonales específicos. La activación dolo hasta que los granulos de gelatina estén disueltos Añadir la del complemento por la vía clásica puede medirse siguiendo los niveles de solución de gelatina a la solución de dextrosa Añadir 2 mi de la soluC4d en suero frente a los de C4. También, la medición por ELISA de los ción stock 4 y 2 mi de la solución stock 5 a la mezcla Ajustar el pH a 7 35+-0.05 con NaOH 1 N y llevar hasta 21 de volumen Esta solución complejos C1r-Cls-C1 inh proporciona una medida de la activación del puede emplearse durante una semana cuando se almacena a 4 C complemento a través de la via clásica. La activación de la vía alternativa 4. MgCI. 1 M puede medirse por ELISA evaluando los niveles de los complejos Bb, o Preparar 100 mi de solución que contenga MgCI, 2 M aproximadaC3BbBP o C3bP en la circulación (Mayes, 1984). Se informó de que las mente. Medir la gravedad especilica de la solución y determinar la mediciones de dichos complejos cuantifican tan poco como 10 a 20 ng/ml concentración de MgCI.. del Handbook ol Chemistry and Physics' de C3bP en suero. Este ensayo puede también emplearse para medir los (tablas de conversión para valores concentrados de soluciones acuocomplejos de activación unidos a la superficie. La activación a través de sas) A|ustar la concentración a 1 M añadiendo agua destilada Almacenar a 4°C. cualquier via puede monitonzarse midiendo los niveles de iC3b o de la lor5. CaCl 0.15 M ma soluble del complejo de ataque a la membrana. sC5b-9. Además, los Se preparan 100 mi de una solución de CaCK.3 M aproximadamente kits de ELISA están disponibles para medir la generación de anafilotoxmas Medir la gravedad especilica de esta solución y determinar el CaCl, en sueroplasma. Ya que el C3a y el C5a son rápidamente convertidos en como se describe arriba Ajustar a 0 15 M añadiendo agua destilada sus fragmentos desArg inactivos por carboxipeptidasa-N en el suero, estos Almacenar a 4"C. ensayos emplean anticuerpos monoclonales específicos para el C3a-desSoluciones de trabajo Arg y el C5a-desArg. Debido a su alta sensibilidad, estos ensayos con ELI¡ 1. VBS isolónico con gelatina y metales (GVBS++) SA proporcionan una herramienta excelente para evaluar la activación del Añadir 200 mi de la solución stock 1 (arriba) a 700 mi de agua destilacomplemento en los líquidos biológicos a través lanto de la via clásica da en un malraz alorado de 1 I de volumen Añadir 1 mi de la solución como de la vía alternativa. Sin embargo, estos equipos generalmente son stock 4 y 1ml de la solución stock 5. Disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentando como se describió en la solución stock caros y requieren que el usuario establezca una curva de dilución están3. Añadir la solución de gelatina y ajustar el pH a 7.35±0.05 Llevar dar. Por lo tanto, en un solo kit se puede incluir una cantidad limitada de hasta 1 I de volumen con agua destilada El GVBS++ debe prepararmuestras. se en Iresco una vez cada semana 2. Dextrosa-VBS Daß en iones con metales y gelatina (DGVBStt)

Evaluación funcional de la vía clásica Los ensayos funcionales del complemento son herramientas sensibles y precisas para proporcionar información sobre la actividad de un componente. Algunos de estos métodos pueden utilizarse para cuantificar la actividad del nivel molecular, y otros para expresar la función del complemento en unidades arbitrarias. Los reactantes comerciales están disponibles para valorar cada componente de las vias clásica y alternativa. Sin embargo, para la mayor parte, estos ensayos son desarrollados en un limitado número de centros de investigación. Muchos ensayos funcionales requieren procedimientos que requieren tiempo y componentes del complemento relativamente muy purificados, que son más caros que aquellos requeridos por los ensayos antigénicos. Por lo tanto, se limitará la descripción de los ensayos del complemento a los métodos de referencia para la evaluación de la activación tanto de la via clásica como de la alternativa. Los amortiguadores que se emplean frecuentemente en la mayoría de los laboratorios donde se desarrollan los ensayos del complemento se describen en la Tabla 38-5. Uno debe darse cuenta de que la preparación precisa de estos amortiguadores es crítica ya que cambios en la molaridad y en la concentración del ion metal pueden afeelar a los títulos obtenidos.

Los amortiguadores de diferentes potencias iónicas son preparados mezclando la solución stock 3 con la solución de trabaio 1. El DGVBS++ 0,065 u se prepara mezclando tres partes de la solución citada primero con dos partes de la segunda solución. El DGVBS+t debe prepararse en Iresco. 3. EDTA-VBS isotómco (EDTA-GVBS—)

Preparar el GVBS como en la solución de trabajo 1 con la excepción de utilizar 600 mi de agua destilada en lugar de 700 mi Ademas, las soluciones 4 y 5 no se añaden a esta solución. Añadir 100 mi de la solución stock 2 y ajustar el pH a 7.35 t 0,05 Llevar a un volumen de 1 i con agua destilada Esta solución es estable durante al menos una semana a 4°C 4. VBS isotónico con glicol etilen bis (b-aminoetil éter) N. N N. N • acido tetraacetico e iones Mg- (EGTAGVBS+)

Añadir 50 mi de la solución stock a 1 a 100 mi de agua destilada en un matraz aforado de 250 mi de volumen Añadir 1.25 mi de la solución stock 4 Disolver 0 25 g de gelatina en 25 mi de agua destilada calentando como se describió en la solución de Irabaio 1 y añadir a la solución. Preparar una solución stock EGTA añadiendo 0.761 g de EGTA a 5 mi de agua destilada Disolver EGTA con NaOH 5 NI A|ustar el pH a 7,35±0.05 con acido acético al 5% y llevar a un volumen de 10 mi con agua destilada Añadir esa solución stock de EGTA a la solución de trabajo Ajustar el pH a 7,35t0,05 y llevar a un volumen de 250 mi con agua destilada El EGTA-GVBS+ debe prepararse en Iresco. I " Las soluciones stock 1. ? y 3 deben almacenarse de 20"C a -50"C durante un

Los ensayos que miden la actividad hemolitica total en una muestra (CH50) periodo de lempo indefinido * De West RC (ed) CRC Handbook Ol Chemistry and F-hysics Boca Ratón FL. CRC o la actividad funcional de los componentes del complemento aislados en Press 1985-t986. con permiso general emplean eritrocitos de oveja como objetivos de la lisis mediada por el complemento. Los eritrocitos de oveja son más sensibles a la lisis por anticuerpos y mediada por el complemento que los eritrocitos de otras especies. adecuados están comercialmente disponibles. La activación de la via alternaAdemás, estos eritrocitos expresan un glicoesfingolípido (antígeno de Forsstiva del complemento se mide fácilmente empleando eritrocitos de conejo. man) que provoca una respuesta potente de los anticuerpos en conejos una Estas células son particularmente sensibles a la lisis independiente de antivez inmunizados estos animales con eritrocitos de oveja. Los anticuerpos cuerpos mediada por el suero humano.

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA

Manejo de las muestras

tos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA) anti-Forssman de conejo. Como se describió anteriormente, este antígeno es altamente inmunógenc e induce una respuesta de anticuerpos fuerte y especifica en los conejos inmunizados. El procedimiento para producir este anticuerpo fue descrito con detalle por Mayer (1961). Antes de utilizarlo, la actividad del complemento del antisuero es destruida por la inactivación con calor a 56 C durante 30 minutos. Los métodos para la titulación del anticuerpo y para la preparación de las células óptimamente sensibilizadas se explican en otras obras (Gaither, 1984). Es esencial que se utilice suficiente anticuerpo para sensibilizar a los eritrocitos de oveja de modo que pequeñas diferencias en la cantidad de anticuerpo sensibilizado no afecten al titulo. Los eritrocitos de oveja sensibilizados con cantidades óptimas de anticuerpo se denominan EA Los componentes intermediarios de la célula con componentes del complemento unidos a la membrana, que se utilizan en la titulación funcional individualizada de los componentes, pueden prepararse utilizando componentes de complemento purificados Los métodos para la preparación de estos intermediarios celulares ya se han descrito (Gaither, 1984).

El correcto manejo de las muestras es crítico para el correcto análisis funcional del sistema del complemento. Par la mayoría de los ensayos funcionales, se prefiere el suero al plasma para el análisis ya que los quelantes del calcio como el EDTA o la heparina pueden ser no complementarios. Cuando las muestras son diluidas más de 1:100 en los ensayos funcionales, el EDTA del plasma puede emplearse ya que la dilución sobrepasa el electo quelante. Para obtener el suero para los ensayos funcionales, la sangre debe dejarse coagular durante 30 minutos a una hora a temperatura ambiente y después en hielo durante al menos una hora. Si se necesitan estudios del fijador de C1q. se de|a la muestra coagular durante dos horas a temperatura ambiente. En este caso, la polimerización completa del coágulo parece facilitar la precisión del ensayo. Para separar el suero, se recoge el coágulo y se centrifuga de 0 a 4 C durante 5 minutos. Si se sospecha la existencia de anticuerpos cnoprecipitantes. la centrifugación y formación del coágulo de la muestra debe hacerse a 37 C ya que puede ocurrir la fijación del complemento si la muestra se enfría. En ciertos casos, la congelación disminuirá los títulos de complemento considerablemente. Aunque las razones de esto son desconocidas, debe tenerse en menEnsayo del complemento hemolítico total te que un título considerablemente disminuido de complemento sólo puede reflejar un artefacto de una preparación sérica inadecuada. Si se sospecha El ensayo más simple sobre la vía clásica mide el complemento hemolítico esto, el suero debe prepararse a 37 C invariablemente para evitar la activación total. La ausencia de cualquiera de los nueve componentes, como ocurre en del complemento. Las muestras de suero o plasma deben dividirse en varios los pacientes con déficit genético homocigotos. generalmente origina un títuvolúmenes pequeños y almacenarse inmediatamente a una temperatura de lo de complemento hemolítico total (CH50) de cero. Sin embargo, un valor -40 C a -80 C Las proporciones pueden almacenarse durante largos perionormal no excluye niveles disminuidos de los componentes individuales. dos de tiempo a -80 C o durante cortos periodos a -20 C sin pérdida de la Cuando la historia y los síntomas de un paciente sugieren una posible defiactividad. Cuando los sueros deban transportarse, deben sellarse bien antes ciencia, deben pedirse los títulos hemolitico y anligénico de los componentes de empaquetarse en un contenedor con grandes cantidades de hielo seco. individuales. A menudo, el título de CH50 será una medida funcional adecuada de la actividad del complemento.

Preparación de eritrocitos La sangre de oveja estéril se obtiene de una solución estéril de Alserver. La sangre anticoagulada se almacena a 4' C durante una semana antes de utilizarse y puede emplearse durante un máximo de seis semanas si se mantiene estéril. La edad de las células afecta mucho a los títulos de la mayoría de los componentes del complemento, y los títulos pueden ser falsamente bajos si se utilizan células frescas. En condiciones estériles, se extrae asépticamente y se centrifuga a 4 C un volumen de células. Se extraen el sobrenadante y la capa leucocitaria. y se remtroducen las células en una solución tampón adecuada. Los detalles del lavado y sensibilización de las células con anticuerpos se pueden ver en otras obras (Gaither. 1984). En caso de la via alternativa, se extrae asépticamente sangre de coneio en tubos con EDTA y se procesa como la sangre de oveja.

Preparación de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos Muchos trabajadores que publican titulaciones funcionales de componentes individuales o el título de complemento hemolítico total emplean eritroci-

El titulo de complemento se expresa en unidades CH50 iei reciproco de la dilución de la cantidad de complemento que lisa el 50% de EA). Se preparan diluciones seriadas de la muestra y se añaden al EA (Tabla 38-6). En este caso, el punto linal del 50% se determina por la transformación de los datos de Von Krogh. Esta fórmula derivada empíricamente convierte la curva dosis-respuesta en forma de S en una función lineal. Se calculan los valores de / / 1 - / donde Yes la fracción de glóbulos rojos usados en el test de dilución. Se construye una gráfica en donde se representa el logaritmo del volumen relativo del complemento frente a los valores del logaritmo de V'1-V. Normalmente, se obtiene una línea recta, y el titulo se calcula determinando el volumen relativo de complemento donde Y/T-Y= 1.0 (o 50% de la tisis) Esle valor se divide por el reciproco de la dilución sérica original (1:60 para el suero humanoi para calcular la concentración de complemento sérico que lisa el 50% de las células El título de complemento representa el número de unidades hemoliticas 50% que están presentes en 1.0 mi de suero no diluido (Mayer. 1961: Rapp. 1970). El suero de los conejillos de Indias con déficit de C4 está disponible comercialmente y es de utilidad para determinar la actividad funcional del C4 en una muestra. El método se describe en otras obras (Gaither, 1984). En un número limitado de laboratorios está disponible el suero de humanos y conejillos de

CAPÍTULO 38

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN

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Tabla 38-7 Titulación funcional de la vía alterna (ensayo AH50)

'Si una muestra se suero muestra algún grado de hemolisis (color rojizo), se prepara un sel de lubos adicionales (1 a 5) que contengan suero y amortiguador pero no E A la hora de calcular Y los valores de OD obtenidos con esta sene de lubos se sustraen de aquellos de las diluciones del suero de la muestra que están mezclados con E EGTA GVBS+ = salmo isotónico tamponado con Veronal con gelatina, EGTA y MgCI.; E = eritrocitos; EDTA-GVBS— = salino isotónico tamponado con Veronal con EDTA; CB = E solo con lampón; CL = E con agua destilada (lisis completa). :

Indias con délicil de C2 y el de conejos con déficit de C6. Estos sueros son una aceptable alternativa al empleo de intermediarios celulares para titular los componentes individuales, ya que solo tienen la pérdida de una proteína del complemento, Ensayo de la vía alterna

inmunodifusión. Existen disponibles equipos de inmunodifusión radial para todos los componentes de la vía clásica y alternativa. Estos equipos consisten en cristales cubiertos de una tina capa de agarosa al 2% que contienen anticuerpos monoespecíficos. El suero proteico estándar (un pool estabilizado de suero humano normal) se suministra, normalmente, en soluciones prediluidas. Cada solución estándar contiene una cantidad específica de la proteína que se está midiendo para su uso en la construcción de la curva de referencia.

En este ensayo, el suero humano (normalmente diluido primero a 1:5) se diluye seriadamente y se añade a eritrocitos de conejo que no están sensibilizados con un anticuerpo específico en un tampón que contiene iones magPrueba de fijación del complemento nesio y ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) para quelar los iones calcio (los Se dispone de una descripción detallada de este ensayo (Mayer. 1961), y iones calcio son necesarios para la activación de la via clásica, no para la actiaquí no se detallará. Sin embargo, ya que las reacciones de fijación del comvación de la via alternativa) (Pangburn, 1988) (Tabla 38-7). El título de la vía alternativa se denomina AH50 y representa la dilución final del suero humano plemento son de gran importancia en el diagnóstico clínico, se tratarán brevemente. La técnica de la prueba depende de la capacidad del complemento en el ensayo que lisa el 50% de los eritrocitos de conejo. Se crea una gráfica del suero fresco de interaccionar con complejos antígeno-anticuerpo. En la similar a la descrita para la litulación del complemento hemolítico total para primera etapa de la reacción, el complemento es incubado con los materiales determinar el AH50. El suero humano puede poseer a veces anticuerpos que pueden contener el antigeno y el anticuerpo. Si se forman complejos antí"naturales" para un carbohidrato expresado ampliamente en las células de otras especies diferentes de los humanos y de los primates. Si se mezcla una geno-anticuerpo, interaccionan con el complemento del mismo modo que los complejos de anticuerpo sobre el antigeno de superficie celular interaccionan alta concentración de suero con los eritrocitos de conejo se puede inducir la con el complemento. El complemento es activado, los componentes son fragaglutinación, que puede alterar la interpretación del titulo de AH50 (Tomlinson, mentados, y el complemento es "utilizado" o "fijado". En la segunda etapa, se 1997). Por lo tanto, puede ser útil absorber el suero con concentrado de eritrocitos de conejo lavados en hielo durante 15 a 30 minutos para extraer una añaden las células de oveja sensibilizadas (EA). y la mezcla se incuba a 37 C durante una hora. Si el suero de la prueba contiene el anticuerpo contra el cierta proporción de anticuerpos naturales, disminuyendo asi la aglutinación antígeno utilizado, el complemento se lija y por lo tanto no está disponible pacelular en el ensayo. ra lisar el EA. Por ello, la ausencia de lisis indica una reacción positiva, y la lisis completa indica un resultado negativo. Niveles del complemento mediante Hay dos aproximaciones generales de las pruebas de fijación del compleensayos antigénicos mento. En la primera, el suero concentrado es el que proporciona el complemento, y la cantidad de complemento fijado se determina por la titulación del Para utilizarla en ensayos antigénico, la muestra (ya sea suero o plasma) suero antes y después de la fijación. En la segunda, se emplea una dilución se almacena congelada (20°C o menos). La contaminación bacteriana puede suero que proporciona suficiente complemento para la lisis de EA o poco de originar la desnaturalización o la fragmentación de las proteínas, mientras que el hielo y el deshielo no tienen un electo adverso importante sobre los más del suficiente (tres a cinco unidades CH50) En este caso, se añaden las células sensibilizadas sin dilución posterior de la cantidad de complemento. niveles antigénicos. En ciertos ensayos del complemento, la muestra se diluLa incubación del material del test con el complemento puede hacerse a 37 C ye en salino para obtener el índice corréelo de concenlración para la adecuadurante una hora o toda la noche en frió. En general, la incubación en frió orida cuantificación. gina títulos mayores. El complemento puede activarse por un número de Los análisis antigénicos de las proteinas del complemento hacen uso de agentes diferentes de los complejos antígeno-anticuerpo como las bacterias, una de las muchas técnicas de precipitación inmune. La inmunodifusión radial endotoxinas y y-globulinas agregadas. Por lo tanto, son necesarios los consimple (RID) utilizando el método ya sea de Fahey o de Mancini es el métotroles pata demostrar que ni el suero ni el antígeno aislados fijarán el comdo empleado más frecuentemente para calcular una cuantificación específica plemento. El test de fijación del complemento es de particular valor en tanto de una proteína. En ambos métodos, el antígeno se añade a los pocilios en que no necesita que los antigenos o los anticuerpos estén presentes en su un gel que contiene anticuerpo, y se forman anilos de precipitación. El métoforma altamente purificada. Pueden utilizarse tanto antígenos solubles como do de Fahey emplea un anticuerpo que no está en exceso. El tiempo de difuparticulados, y se pueden medir tanto los antígenos como los anticuerpos. sión al que los resultados son leídos es por ello crítico. Los puntos de difusión finales no se alcanzan y pueden levar a mediciones inadecuadas de los nive-Una aproximación alternativa al test de fijación del complemento es el empleo de ensayos con ELISA que miden los productos de fragmentación de las proles del complemento antigénico. El método de Mancini utiliza un exceso de teínas del complemento o de los complejos formados tras la activación del anticuerpo en un gel y es más sensible y exacto. El método de Mancini se uticomplemento, como se discutió previamente. De cualquier modo, estos ensaliza por muchas firmas comerciales para la preparación de los cristales de

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

yos utilizan equipos comerciales que generalmente son caros comparados con la prueba de fijación estándar.

CININAS Y SISTEMA DE GENERACIÓN DE CININAS El sistema de generación de cininas es una vía mediadora secundaria presente en el plasma y activa en las superficies celulares que controla la generación de péptidos que son importantes en la respuesta inflamatoria. Aquí será descrito brevemente. Para más detalles, se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Kozin. 1992: Sharma. 1990: Vio. 1998; Margolius. 1995). El péptido biológicamente activo más importante generado por este sistema parece ser la bradicinina, un nonapéptido con potente actividad en muchos sistemas biológicos. Es activa en aumentar la permeabilidad vascular, vasodilatación, hipotensión, inducción del dolor, contracción de muchos tipos de células musculares lisas, y activación del sistema de la fosfolipasa A, con su función de activación del metabolismo del ácido araquidónico celular. Aunque en muchas cosas se parece al sistema del complemento, el sistema de generación de cininas del plasma es más simple debido a que está compuesto solo por cuatro proteínas plasmáticas. Los elementos tisulares también generan cininas. Las principales proteínas del sistema de generación de cininas comprendidas actualmente son el factor de Hageman. el factor de coagulación XI, la precalicreína y el quininógeno de alio peso molecular. El factor XI circula en el plasma como un complejo con el quininógeno de alto peso molecular con una relación molar de 2:1. La precalicreína también circula en un complejo con el quininógeno de alto peso molecular con una relación molar de 1:1. En contraste, el factor de Hageman circula como una proteína plasmática de cadena simple, no formando complejos. Al igual que en la secuencia de activación del complemento, la secuencia de generación de cininas sigue una vía específica. Interaccionando con superficies con carga negativa, como aquellas conseguidas experimentalmente con cristal o naturalmente con muchos materiales activos biológicamente como el lipido A de la endotoxina de las bacterias Gram negativas, el factor de Hageman es degradado y activado. El factor de Hageman degradado (uHFa) tiene actividad proteolítica y después activa y degrada las moléculas del tactor de Hageman adicionales para generar más aHFa. La degradación de la cadena simple del factor de Hageman (peso molecular de 80 kDa) libera las cadenas pesada y ligera (pesos moleculares de 50 y 28 kDa. respectivamente) que permanecen unidas por enlaces disulfuro. El lugar enzimático activo del factor de Hageman reside en la cadena ligera. Muchas enzimas proteolíticas, incluyendo la calicreina. pueden degradar y activar al factor de Hageman. El «HFa mteracciona con el complejo del factor XI y el quininógeno de alto peso molecular para activar el factor XI a factor Xla, originando la activación de la cascada intrínseca de la coagulación. El «HFa también interacciona con el complejo quininógeno de alto peso molecular-precalicreina para degradar la cadena simple de la precalicreína en una molécula de dos cadenas, la calicreina. con las cadenas unidas por puentes disulfuro. La precalicreína degradada tiene actividad enzimática proteolítica localizada en la cadena de menor peso molecular. Todas estas degradaciones ocurren mucho más eficazmente cuando las proteínas se unen a superficies cargadas negativamente, las cuales son críticas para la activación de la cascada. La calicreina activada degrada al qummogeno de alto peso molecular en muchos lugares, liberando bradicinina. La calicreina activa, generada por la degradación de la precalicreína, también es capaz de degradar posteriormente el «HFa a un producto de menor peso molecular con una cadena ligera intacta, la |iHFa. La |iHFa puede degradar y activar al complejo quininógeno de alio peso molecular- precalicreína pero no permanece en la superficie de unión y no interacciona eficazmente con el complejo quininógeno de alto peso molecular-factor XI. La bradicinina tiene una vida media corta ya que se inactiva rápidamente por la carboxipeptidasa-N. la cual elimina la arginina carboxi-terminal para formar des Arg bradicinina. Esta molécula ya no tiene la actividad de la bradicinina de contraer el músculo liso y no puede inducir la salida de líquido vascular cuando es inyectada en la piel Sin embargo, conserva algunos de sus

efectos vasculares. La des-Arg bradicinina entonces es degradada por la enzima convertidora de angiolensma para formar péptidos de bajo peso molecular que pierden su actividad biológica. Los inhibidores del sistema de generación de cininas incluyen el C1 inhibidor, la «,-macroglobulina, y el «.-proteasa inhibidor El Cl inhibidor y la «¿-macroglobulina son los principales inhibidores de la calicreina activa, ejerciendo el C1 inhibidor la influencia más potente. El C1 inhibidor y la «,-proteasa son los dos principales inhibidores del laclor de Hageman activo. El angioedema hereditario resulta de la deficiencia genética o adquirida del C1 inhibidor. Se cree que las características clínicas asociadas con esta enfermedad surgen de la pérdida del control adecuado del sistema de generación de cininas por el C1 inhibidor (Cugno, 1998: Davis. 1998) También existen en el plasma los quminógenos de bajo peso molecular y pueden actuar como sustrato de la bradicinina. Los quminógenos no son fáciles de degradar por la calicreina del plasma, pero las calicreinas tisulares presentes en las células pueden degradar el quininógeno de ba|0 peso molecular a bradicinina con una lisina adicional unida. Presumiblemente, la lisil-bradicinína sufre la misma vía de degradación que la bradicinina, Se ha postulado que la bradicinina juega un papel en una variedad de enfermedades. La bradicinina y la lisil-bradicinina libres se han encontrado en el fluido nasal en la rinitis. También se ha sugerido un papel patogénico para la bradicinina en enfermedades que van desde el asma al angiodema hereditario, asi como otras clases de enfermedades edematosas incluyendo la inflamación. Está claro que no se conoce totalmente el papel exacto del sistema generador de cininas en las enfermedades. Sin embargo, la brad cinina y sus derivados indudablemente son importantes en el edema y el dolor asociados con la inflamación.

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CAPÍTULO 38

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN

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SECCIÖN V

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INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOIOGIA

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C A P Í T U L O

39

Gtocinas y moléculas de adhesión • H. Davis Massey, M.D., Ph.D., D.D.S. • Richard A. McPherson, M.D.

CITOCINAS

914

lnterleucina-14

lnterleucina-1

lnterleucina-15

lnterleucina-2

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lnterleucina-4

lnterleucina-18

lnterleucina-5

Factor transformante del crecimiento |i

lnterleucina-6

Factor de necrosis tumoral

lnterleucina-7

Interferón-y

lnterleucina-8 y las quimiocínas

MOLÉCULAS DE ADHESIÓN CELULAR

lnterleucina-9

Integrinas

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Selectinas

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lnterleucina-11 lnterleucina-12 lnterleucina-13

CITOCINAS La secreción y la unión de las citocinas es el equivalente celular a estar "en línea". El entorno predominante de citocinas en un organismo forma un Internet" de comunicación entre las células. Las señales de las citocinas son recibidas sobre la superficie celular y no sólo como simples mensajes, sino también como combinaciones complejas e imperceptibles sinérgicas y antagónicas que regulan procesos como la respuesta inmune, la migración celular y la cicatrización de las heridas. Para responder a los mensajes específicos de las citocinas, las células despliegan miles de receptores de superficie de citocinas, presentados como múltiples antenas. Utilizando estos receptores, las células seleccionan, procesan y responden a combinaciones de citocinas solubles y de unión a sustratos de manera dependiente de la densidad y el estado de activación de los receptores de superficie. El término "citocina" se refiere a los productos solubles de las "células" en senlido genérico. Muchos tipos celulares son capaces de producirlas, pero para la mayor parte son la célula T y el macrófago las factorías virtuales de citocinas. y por esta razón muchas familias de citocinas se conocen como interleucinas (IL).

PERSPECTIVAS

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BIBLIOGRAFÍA

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lnterleucina-1 La familia de citocinas de la IL-1 contiene tres proteínas: la IL-1r/. y la IL-1|3 (los dos componentes agonistas), y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 RA), un antagonista específico de receptor que ocurre naturalmente (Dinarello, 1998). Los tres genes separados que codifican estas citocinas proinflamatorias han sido mapeados en el brazo largo del cromosoma 2. La IL-1a y la IL-115 son sintetizadas como proteínas precursoras intracitoplasmáticas de 31 kDa que son degradadas para generar las formas biológicamente activas de 17 kDa. La pro-IL-1a es convertida en su forma activa a través de la acción de proteasa extracelulares, aunque la proforma no degradada puede estimular el crecimiento autocrino cuando es liberada por los queratinocitos, por las células T colaboradoras tipo II (Th2) o por los timocitos. La pro-IL-l f5 se convierte intracelularmente en su forma biológicamente activa por la enzima convertidora de IL-1|i (ICE), una enzima asociada a la apoptosis.

Aunque los bioanálisis son a veces el método de referencia para la detección de la actividad de las citocinas, normalmente llevan mucho tiempo y son difíciles de realizar en un laboratorio de hospital. Los equipos de ensayo con enzima fijada a inmunoabsorbente (ELISA) están ampliamente disponibles para muchas de las citocinas descritas en el texto. Las técnicas moleculares (reacción en cadena de la polimerasa [PCRJ. hibridación ¡n situ) se emplean en laboratorios más modernos para identificar la presencia de citocinas con alta sensibilidad y para localizar más precisamente una citocina de un tipo celular particular.

Se han descrito dos receptores de IL-1: un receptor tipo I de 80 kDa ampliamente expresado {IL-1 Rl) que transduce la señal cuando se une tanto a IL-1 a como a IL-1 p, y un receptor tipo II de 67 kDa más restringido (para neutrófilos, monocitos y células B) (IL-1RII). El II1-RII no transduce la señal intracelular, incluso cuando se une a su ligando preferido, la IL-1 (5, y por lo tanto se ha descrito como un receptor "señuelo" que actúa como un "escondite" para las moléculas de IL-1 (i Una vez unido a su ligando el IL-1 Rl se asocia con una proteina accesoria (IL-1 RAcP). Juntos señalizan el núcleo a través de muchas vías de cinasas de proteínas asociadas a macrotúbulos (MAP) que activan los factores de transcripción nuclear incluyendo el factor nuclear (NF) K(Í. entre otros (O'Neill, 1996). La molécula antagonista IL-IRA es capaz de unir IL-1RI y IL-1 RH. pero no inicia la señal de transducción intracelular.

En los años recientes la lista de citocinas se ha ampliado, pero sólo se presentan aquellas para las que se conoce suficiente información.

Como regulador primario de las respuestas inmunes e inflamatorias, la IL-1 exhibe miles de efectos biológicos (Rosenwasser, 1998). Optimiza el

CAPÍTULO 39

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CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN

complejo mayor de histocompatibilidad antígeno.'receptor de células T (MHC/TCR) mediando la activación de las células T como un componente importante de señal no conocida, y aumenta la actividad de las citocinas derivadas de la célula T como la IL-2 a través de la regulación a la alta del receptor de IL-2. La IL-I estimula la proliferación de la célula progenitora hematopoyética (CPH) en sinergia con los factores estimulantes de colonias hematopoyéticos, y cuando se administra aislada moviliza neutrofilia derivadas de la médula ósea. Las evidencias indican un papel para la IL-1 en promover el crecimiento y proliferación de algunas lineas celulares leucémicas, pero es citotóxica directamente para algunas células mlecladas por virus y para algunas células tumorales. La capacidad de la IL-1 de estimular el metabolismo del ácido araquidónico empleando eicosanoides como la prostaglandina E, y los leucotnenos como intermediarios, y su capacidad para inducir la producción y liberación de cantidades de otras citocinas explica gran parte de su actividad proinflamatoria. En los lugares de inflamación, la IL-1 origina una regulación a la alta de los receptores de moléculas de adhesión sobre el endotelio vascular y estimula la producción de quimiocinas conduciendo a la acumulación local de leucocitos. En situaciones de alergia como la hipersensibilidad Tipo 1, la IL-1 puede aumentar la liberación de histamina de los basófilos y eosinófilos, contribuyendo esto a la broncoconstricción al estimular al músculo liso vascular. La IL-1 es responsable de la producción de reactantes de fase agua por el hígado (p. ej.. complemento, péplido C reactivo) a expensas de proteínas transportadoras como la albúmina. Para pagar el coste de los aminoácidos de la síntesis masiva de péptidos, la IL-1 promueve la ruptura muscular, acontecimiento que explica la mialgia que acompaña a algunas enfermedades. La IL-1 contribuye a la dilatación vascular y a la hipotensión en el choque séptico a través de la inducción de óxido nítrico (NO) en las células endoteliales. y también puede ser un significativo mediador del choque cardiogénico. En el sistema nervioso central (SNC). la IL-1 promueve la fiebre, la añorexia, el sueño de ondas lentas y la letargia, así como la liberación de corticoïdes del hipolálamo. En los lugares articulares, la IL-1 promueve la proliferación de células sinoviales. el depósito de colágeno, la resorción del cartílago y el hueso; acciones que tienen implicaciones en enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide (AR). Cuando se administra en humanos en dosis bajas, la IL-1 origina profundas reacciones febriles y hipotensoras similares a las inducidas por las dosis bajas de endoloxinas. Hay un leve aumento acompañante de la hematopoyesis, que puede disminuir el punto más bajo y acortar el periodo de supresión medular en los que reciben quimioterapia supresora medular (lizumi. 1991). Sin embargo, el efecto beneticioso de la administración de IL-1 está limitado por su profunda toxicidad. Un nivel elevado de IL-IRA puede ser más sensible como marcador de actividad de enfermedad que las elevaciones de cualquier isoforma de IL-1. El aumento de los niveles de IL-1 RA se observa tras el infarto de miocardio, los procedimientos de cirugía general, y en personas asintomáticas que tienen el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Además, la severidad de la enlermedad a menudo es mejor indicada por los niveles de IL-1 RA que por los niveles de IL-1. Esto puede ser cierto en enfermedades del hígado, en estados autoinmunes y en enfermedades infecciosas (Dinarelio, 1996,1998). La elevación del IL-1 RA puede representar un importante esfuerzo para minimizar los intensos efectos tóxicos de los niveles sistémicos aumentados de IL-1: la inyección de IL-1 RA en ratones justo antes de darles endotoxina intravenosa aumentó la supervivencia. La IL-1 RA administrada a pacientes con choque séptico produjo una mejora de la mortalidad dosis-dependiente medida al día 28, pero este efecto no se observó uniformemente en ensayos posteriores más grandes (Fisher, 1994). El mejor éxito con la terapia con IL-1 RA se obtuvo en un gran estudio doble ciego completado en pacientes con artritis reumatoide. Los resultados indicaron una reducción dependiente de la dosis de IL-1 RA en el edema articular, y una reducción significativa en las nuevas erosiones óseas (Bresnihan, 1998). Otros ensayos clínicos que evaluaban la eficacia de la administración de IL-1 RA en la enfermedad injerto contra huésped (EICH) cortico-resistente mostraron una mejora en la mayoria de los sujetos (Anlin. 1994).

915

lnterleucina-2 La IL-2 es una glicoproteina de 15.5 kDa, con 1 3 3 aminoácidos, miembro de la familia de las citocinas de cuatro hélices-!/ (Bazam, 1990), con dos puentes disulfuro en su eslructura tridimensional Su gen codificador ha sido secuenciado en el cromosoma 4. La activación de las células T y la liberación de la IL-2 resulta de la interacción entre el TCR y el anligeno presentado en asociación con las moléculas de MHC sobre las células presentadoras de antigeno (APCs) (Fraser, 1991). El receptor para la IL-2 (IL-2R) es un complejo de membrana tripartito compuesto por una cadena o de 55 kDa, una cadena |5 de 70 a 75 kDa y una cadena y de 64 kDa (Waldmann. 1998). El IL-2R existe en tres formas moleculares: un complejo de alta afinidad para las subunidades a. [J. y y. un complejo de afinidad intermedia de las subunidades |i y y, y un receptor de baja afinidad hecho solo de IL-2Ru. Solo el IL-2R, DR1] (Sinnot, 1991). Este haplotipo es común, particularmente en el sur de Europa, y tiene una frecuencia en caucásicos de Boston por encima de 0,01. En todas las formas de deficiencia de 21-hidroxilasa, la mayoría de haplotipos de MHC no están extendidos y hay una gran variedad de complotipos, lo que sugiere que muchas mutaciones independientes han provocado una deleción o una alteración del gen CYP21B. De estas observaciones, se pueden extraer algunos principios generales para la posible aplicación a estas enfermedades de herencia y patogénesis desconocidas que presentan asociación o ligamiento con MHC. Primero, si un gen de susceptibilidad para una enfermedad se produce en un haplotipo extendido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarán asociaciones positivas con la enfermedad. Y al contrario, si esto no ocurre en un haplotipo extendido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarán una asociación negativa con la enfermedad. Como los haplotipos extendidos tienen fijación al ADN en eiemplos independientes de haplotipo extendido asociado a enfermedad, y son comunes, las personas sanas deben transportar genes de susceptibilidad. Todos los marcadores de enfermedad de MHC, y particularmente los haplotipos extendidos, muestran un alto grado de especificidad en la población, Es por tanto particularmente importante en estudios de marcadores de MHC para la enfermedad comparar alelos de enfermedad y haplotipos (los de pacientes) con aquellos controles cuidadosamente emparejados étnicamente. Idealmente, el apareamiento étnico debería incluir regiones específicas de origen o subgrupos étnicos.

Deficiencia de C4 Hay una alta incidencia de alelos nulos C4 en la población general. El treinta y cinco por ciento de individuos de todas las razas no expresan un gen C4A o C4B (esto es, portan C4A'Q0 o C4B'Q0), del 8% al 10% portan dos alelos nulos, y menos del 1% no expresan tres alelos. Las deficiencias completas de haplotipos C4 (Irans C4A'Q0. C4B'Q0) son extremadamente raras y pueden detectarse en heterocigotos sólo con estudios de familia. En contraste con la deficiencia de C2, la deficiencia de C4 se ha descrito en al menos nueve haplotipos MHC diferentes, incluyendo aquellos con tipos BF diferentes, lo que sugiere que la deficiencia surge de un número de mutaciones diferentes. C4A'O0 y C4B'O0 proceden de deleciones de genes, codones finalizadores

Enfermedades de etiología y patogénesis desconocidas Se han descrito un gran número de enfermedades que muestran asociaciones con MHC. Estas alteraciones son muy diferentes de unas a otras y, aunque la mayoría tienen al menos algún aspecto inmunológico, otras pocas no. Hay muchos problemas que impiden comprender los mecanismos por los que se producen estas enfermedades, y los análisis de marcadores de MHC en pacientes y sus familias han clarificado el panorama sólo secundariamente. El origen más importante de confusión es un fenó-

956

SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

meno denominado penetrancia incompleta. Se ha observado más claramente en gemelos homocigóticos que presumiblemente tienen genes idénticos. Si uno de estos gemelos tiene una de estas enfermedades (p. ej., diabetes mellitus tipo I). el otro gemelo no tiene necesariamente la enfermedad. Para la diabetes tipo I. la relación de concordancia no es superior al 50°c (Ftubinstein. 1977). Esto sugiere que la penetrancia de una enfermedad en un huésped completamente susceptible es incompleta: aunque hay una importante razón para considerar a los genes en el MHC como determinantes de la susceptibilidad para la diabetes tipo I. sólo el 15% de los hermanos con MHC idéntico de los pacientes tienen diabetes insulinodependiente. La diferencia entre el 50% y el 15% muestra la influencia de los genes en un segundo locus (o locu) no ligado a MHC, y también sugiere un factor o factores ambientales en la susceptibilidad determinante. La penetrancia incompleta hace difícil la asignación de una forma especifica de herencia y provoca que la probabilidad de encontrar familias con más de un miembro afectado en una o más generaciones sea ba]a. Normalmente se utilizan las lamilias para determinar las formas de herencia. Otros factores que complican la situación son la incapacidad para determinar si se está estudiando un grupo de pacientes homogéneos en términos de determinación genética. Casi el 5% al 6% de las familias seleccionadas al azar con un miembro diabético tipo I tendrá un segundo niño afectado. De estas parejas hermanas, aproximadamente el 60% tendrá un MHC idéntico, el 35% serán haploidénticos, y un pequeño porcentaje no compartirá haplotipos MHC. Este patrón sugiere una herencia recesiva de un gen de susceptibilidad ligado a MHC para la enfermedad. Esta conclusión también se basa en los resultados de los análisis de distribución de homocigotos y heterocigotos para BF'F1 entre 1.100 diabéticos tipo I (Raum. 1981). Sin embargo, todavia se ha de explicar la desviación del 100% de identidad MHC de hermanos afectados. Entre las explicaciones que se barajan están el entrecruzamiento del locus de susceptibilidad y el MHC, genes impenetrantes en padres susceptibles, y heterogeneidad en la forma de herencia, incluyendo penetrancia variable en homocigotos comparado con heterocigotos. Esto ha conducido a un vasto número de modelos de enfermedad sin encontrar una manera de hacer distinción entre ellos. Al menos, sin embargo, los estudios de familia proporcionan datos de haplotipos muy útiles y generalmente permiten la asignación de homocigosidad para un marcador HLA en los individuos de prueba. También se ha establecido que la asociación MHC está basada en un ligamiento entre un gen de susceptibilidad y el MHC. Se desconoce todavia el número de alelos de susceptibilidad diferentes para una enfermedad en una población específica. Con respecto a esto, los haplotipos extendidos pueden ser útiles porque, si están aumentados en los pacientes, probablemente representan un alelo único de susceptibilidad que pudiera estar en cualquier lugar en la región de fijación. Sin embargo, algunos pacientes presentan sólo porciones de esos haplotipos y esto proporciona indicios para localizar la participación de los alelos específicos. Otro indicio puede ser el reparto de alelos específicos por dos o más haplotipos extendidos diferentes.

Enfermedades especificas sin evidencia de herencia mendeliana y con asociaciones MHC La Tabla 41-3 enumera algunas enfermedades asociadas a MHC y sus marcadores. Esta lista no es exhaustiva y sólo se tratarán algunas de ellas. La aplicación de los métodos de análisis ya citados sólo ha permitido entender unas pocas de estas alteraciones. Existe una asociación marcadamente potente entre HLA-S27 y espondilitis anquilosante (EA) en poblaciones caucasoides. orientales y africanas (Khan, 1992). Entre los pacientes con EA, artropatías reactivas y uveitis aguda anterior, alrededor del 90% de los pacientes caucásicos, comparado con un 5% o 10% de los controles sanos, tienen HLA-B27(Rubin. 1994). La asociación de B27 con estos síndromes en cuatro grupos raciales (caucásicos, negros, japoneses, indios americanos) sugiere que B27 por sí mismo o un gen estrechamente ligado a B27 está involucrado en la patogénesis de estas enfermedades. Las diferencias en la prevalencia regional de EA se relaciona también con la frecuencia de HLA-B27. Entre los individuos HLAB27 positivos en la población en general, sólo el 2% desarrolla EA Si hay

una historia familiar de la enfermedad, la prevalencia entre los parientes HLA-B27positivos es aproximadamente del 20%. Se han descrito al menos 14 alelos de HLA-B27, HLA-B'2705 es el alelo que se encuentra más comúnmente en los sujetos normales. Se ha propuesto que la presencia de HLA-B40o HLA-B39en el otro haplotipo HLA. incrementa más la susceptibilidad a EA. lo que corrobora la hipótesis de que los alelos no-B27contribuyen a una susceptibilidad aumentada de EA. Las proteínas bactenanas que muestran homología estructural con HLA-B27 incluyen una secuencia de seis aminoácidos entre los residuos 72 y 77 del HLA-B'2705 y los residuos 188 y 193 de una nitrogenasa reductasa de Klebsiella pneumoniae, y entre las posiciones 71 y 75 de los subtipos mayores HLA-B27 y una secuencia de cinco aminoácidos de un plásmido de una cadena atrilogénica de Shigella flexnerii (Stieglitz, 1989). De todas las enfermedades ligadas al MHC. la diabetes mellitus tipo I es la que más se ha estudiado (Lernmark. 1999; Nepom, 1991; Thorsby, 1992; Winler, 1993). La contribución de HLA a la diabetes tipo I no se ha explicada adecuadamente. Existen considerables aumentos en el HLA-DR3y DR4 en pacientes caucásicos. En muchas pero no en todas las poblaciones de pacientes caucásicos con diabetes tipo I hay un exceso de heterocigotos DR3/DR4 por encima del número de homocigotos DR3 o DR4 predecibles por el equilibrio Hardy-Weinberg. Las razones de esto no están claras. Por análisis del ADN. el aumento en DR4 se encuentra ante todo en el subgrupo de DR4 en desequilibrio de ligamiento con DOBT0302. Aunque actualmente se considera que el último gen es un marcador principal y quizás un determinante primario de la susceptibilidad a la diabetes tipo I, existe sólo en el 70% de los pacientes caucásicos, e incluso en aquellos que lo transportan, hay una variabilidad en el nesgo relativo para diabetes: DRBV0401. DOBV0302 y DRBV0402 DOBV0302 están asociados en gran medida con la enfermedad, mientras que DRBV0404, DOB1'0302\o están menos. Además, se ha observado que los pacientes HLA-DR1/DR4 transportan el alelo DOBV0302 en el haplotipo DR4. Por lo tanto, parece probable que haya múltiples contribuciones de la región clase II a la susceptibilidad a diabetes DQA 1'0301 esta presente en todos los haplotipos Dispositivos, transporten DOB1 '0302 o no. y es posible que pueda contribuir al nesgo. Por otra parte, DQ6 se encuentra negativamente asociado a la diabetes tipo I. Los individuos heterocigoticos para DRBV1501 que también transportan un gen de susceptibilidad para la diabetes tipo I en el otro haplotipo no sufren riesgo en absoluto para la enfermedad (prolección dominanle), como se espera en una alteración recesiva. Un modelo recientemente propuesto para la diabetes tipo I que asume que DOB1 es un determinante directo de la susceptibilidad, sugiere una jerarquía de afinidades entre las diferentes moléculas clase II que compiten por unirse al mismo péptido de diabetes tipo I (no identificado). La susceptibilidad sucede si un producto del gen (por ej., DQBV0302) se une y presenta el péptido. En presencia de un competidor de alta afinidad {DRBI'1501). esto no ocurre. El sinergismo (DR3/DR4) podría explicarse por la unión de un péptido de alta almidad a un dímero clase II frans-asociado. Un nesgo relativo diferente (DR1/DR4 o diferentes haplotipos transportando DOBV0302) puede explicarse por diferentes afinidades de aquellas moléculas por el péptido. Otro modelo propone que un ácido aspártico en el codón 57 de la cadena DOS protege (rente a la diabetes tipo I. La presencia excesiva en pacientes de un aminoácido dilerente. más frecuentemente valina o serina. en esa posición en haplotipos transportando HLA-DR3 o DR4 respalda este concepto. Varios estudios han confirmado este hallazgo en caucásicos pero no en diabéticos orientales. Otros estudios proyectan la hipótesis de que la presencia de arginina en la posición 52 del DQA1 es otro factor genético. Se ha propuesto que la combinación del ácido no aspártico en la posición 57 de DOB1 y arginina en la posición 52 de DQA 1 es un importante determinante de susceptibilidad para la diabetes tipo I mediada por genes DOB1. Existe datos significativos respecto a la asociación entre marcadores MHC y artritis reumatoide (AR) (Auger. 1998: Nepom, 1992: Ollier, 1992). Para la mayoría de las poblaciones estudiadas, el marcador asociado primario es HLA-DR4. En los caucásicos, por ejemplo, los alelos DR4 más comunes asociados con AR son DRBV0401, 0404 y 0408. y en pacientes japoneses, israelíes y chinos, es DRBV0405. Otras especificidades HLADR también se asocian con AR: DR1 se ha descrito en asociación con AR en pacientes caucásicos, japoneses, españoles, griegos e israelíes: DR3

CAPITULO 41

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD

957

Tabla 41-3 Ejemplos de asociación entre HLA y enfermedad' Enfermedad Enlermedad de Behcet Enfermedad celiaca

Etnia Japoneses Chinos Caucásicos británicos

Caucásicos italianos

Antígeno HLA B51 B51 DRB1-0301 DQB1*0201 DQAV0501 DRB 1-0301 DQB1*0201

Caucásicos checos

Enfermedad de Graves

Caucásicos germanos Japoneses Caucásicos sardos Chinos de Singapur

Tiroidilis de Hashimoto

Caucásicos húngaros

infección VIH

Caucásicos canadienses Caucásicos británicos Caucásicos europeos

Progresor rápido"

Progresor lento Enfermedad de Hodgkin Nefropatia membranosa idiopatica

Caucásicos (Europa/América) Caucásicos británicos

Japoneses

Síndrome nelrótico idiopatico

Caucásicos franceses Caucásicos germanos

Esclerosis múltiple

Caucásicos franceses Caucásicos europeos

Narcolepsia

Japoneses

Caucásicos canadienses

Artritis reumatoide

Caucásicos franceses

Indios asiáticos Chinos Japoneses

79 3.4 26.7 51 8 139 6.9 368

DQ Al'0501 10.9 DRB 1 "0701 4 DQA1-0201 67 DRB t '0301 12.2 11 DOAt-0501 DRB1-0701 3.1 DQA 1-0201 2.9 DR3. B8. Cw7 3.?-5.5 DOAt'0102 9.2 A2 2.9 DPB1-0501 5.3 DRBT1601 2,3 DRB 1 -0301 3,5 DR5? 7,3 DR52 3.4 DR53 4.1 DOA1-0301/0302 DQBV0201 3.6 DQA 1 "0301/0302 DQB 1 '0301 9.7 Cw7 1.5 DQB 1 '0601 2,2 B7 3,4 B35 2.5 Cw7 2,1 DQB 1-0605 9,2 DPB 1'0301 1,95 DRB3-0101 5.5 DRB 1 "0301 9.8 DQB 1-0201 21.6 DQA 1'0501 6.7 DRB1M501 14,2 DQB 1-0602 16,8 DQAV0102 7,1 DR7 6,4 5,3 DQA 1-0201 DR7 2,8 DQA 1-0201 3.3 DRBT1501, DQB 1*0602. DQAT010? 3.0 Uno de DQAr010?/0103 o 0501 mas uno de DQB1 0602/ 13.0 0603/0604/0302/ o 0303 DRB T1501 1 030 DRB5-0101 1 263 DR15 384 DQB 1 '0602 1 468 DQAT0102 537 DRBV1501 93.5 DR15 13.2 DQB 1-0602 85.4 DQA 1-010? 28.6 DRB 1'01 3,5 DRB t-0401 4,1 DRB1'0404 107 DR1 34 DRBI-IOOt 3.8 DR1 6.8 FB-FS 3.1 3.6 DRB 1-0405

'Individuos infectados con VIH que transportan el haplotipo [HLA-B8. SC0I. DR3] tienen un d( (Véase Stool CM. Ludían CA. Beatson. D. y col: HLA haplolype Al B8 Dr3 as a risk for HIV re Datos extraídos de Tsuii K. Aizawa M. Sasa/uki T (eds) HLA 1991 Proceedings of the 11'" Inter 1992

en kuwaitíes; Dfl6en indios Yakima americanos; DR9 en chilenos, y DflfOen pacientes españoles, griegos e israelies. Para explicar este amplio espectro de diferentes asociaciones HLA-DR con AR. se ha propuesto que la secuencia de un péptido DRB1 compartido está involucrada en conceder

Riesgo relativo

ledad mas rapido t 1988: 1:1185). id Conference New York. Oxford University Press,

susceptibilidad a AR. Los alelos asociados con AR comparten una secuencia de aminoácidos muy bien conservada en su tercera región hipervariable (aminoácidos 70 a 74). Estos residuos podrían afectar a la unión de péptídos y a su presentación a las células T. Así. sí existe un péptido artri-

958

SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA

togénico. puede unirse preferentemente a moléculas con la secuencia DRB1 de la AR. Por el momento, no se ha identificado tal péplido. Una explicación alternativa puede involucrar un mimetismo molecular entre el DRB1 de la AR compartido y secuencias antigénicas de un patógeno que pueda inducir AR. Se ha encontrado una homología de secuencia entre la secuencia compartida de AR y una HSP de 70 kDa de Escherichia Coli. Varios artículos han demostrado una relación entre la gravedad de la AR y la frecuencia HLA-DR4 en aumento, en particular con DRBV0401. Se ha detectado que los pacientes HLA-DR4-positivos con AR tienen una evolución grave de la enfermedad, y los pacientes homocigóticos HLA-DR4 tienen más probabilidad de sufrir una AR mas grave. También es posible que la producción de factor reumatoide esté asociada con DR4 El riesgo asociado con DRBV04 generalmente es mayor que el alribuible a DRBI'01 o DRBV10. La AR se diferencia clínicamente de la artritis reumatoide juvenil (ARJ). En contraste con la asociación con DR4 en la artritis reumatoide. las asociaciones HLA con ARJ son bastante diferentes. Además, otras asociaciones HLADR varían con los subgrupos clínicos de ARJ (Stastny. 1993). Por ejemplo, se ha descrito que el haplotipo HLA-DRB1'0801. DQAV0401. DQBV0402 está aumentado en todo el grupo pauciarticular y en pacientes con la forma persistente pauciarticular. El haplotipo HLA-DRBV1301. DRB3'0101. DOA1 '0103. DQB1 '0603 también se asoció con pacientes con ARJ pauciarticular persistente (Fernández-Vina, 1994). Otras especificidades asociadas con la ARJ pauciarticular persistente son DRBV1104 y DPBV0201. La ARJ pauciarticular que pasa a la forma poliarticular se ha asociado con: DRBI'01. DRBV0801. DRBV1401. DQBV0501, DQBV0503. DQAV0101 y DPB1'0201. La ARJ pauciarticular con iritis crónica muestra una fuerte asociación con DRBV1104. DR8y DR6. Además de las asociaciones Clase II, se ha observado un aumento significativo en HLA-A2 en pacientes con ARJ pauciarticular. Los pacientes varones con comienzo después de los ocho años tienen una frecuencia marcadamente aumentada de HLA-B27. En pacientes con ARJ poliarticular y factor reumatoide negativo, DRBV0801 y DPBI'0301 han mostrado asociación con la enfermedad. Teniendo en cuenta que la forma poliarticular de ARJ es un caso de AR en la juventud, el DRBV0401 muestra una fuerte asociación. En caucásicos, los dos haplotipos extendidos suponen más del 60% de los haplotipos en pacientes con enteropatía sensible al gluten (ESG) (Goggins, 1994; Marsh, 1992): [HLA-B8. SC01. DR3] y [HLA-B44. FC-31. DR7). De manera análoga a la diabetes, existe un aumento en HLA-DR5/7. Tanto HLADR3 como DR7 están en desequilibrio de ligamiento con HLA-DQ2 (DQBV0201. DQAV0501). Esta combinación de genes DQB y DQA se encuentra en el 98% de los pacientes con enfermedad celíaca (EC). El péptido gliadina, que previamente se ha visto que exacerba la lesión EC in vitro e ¡n vivo, parece que se unía a DQ2, aportando más credibilidad a su posible papel en la patogénesis de EC (Shidrawi, 1998). Este hallazgo sugiere que HLA-DQ2 podría presentar al péptido gliadma a las células T para su reconocimiento inmune. Diferentes estudios han apuntado la posibilidad de la existencia de alelos específicos HLA-DP asociados con ESG: DPBV01 y DPB1'03en el sur de Europa, y DPB1'03y DPBV04 en el Norte de Europa. El aumento en DBP'01 se encuentra asociado con HLA-DR3. lo que indica que el haplotipo extendido [HLA-B8, SC01. DR3] a menudo se extiende a través de DP en EGS. Los determinantes de susceptibilidad DP y DQ comparten un residuo cargado positivamente alrededor del codón 71 de la cadena-(5. pero su papel específico aún no está claro. Otro marcador MHC recientemente asociado con ESG es el alelo de 8,5 kb del gen HSP70-2. que se conoce por estar ligado de forma inestable con haplotipos transportadores de HLADR3 (Partanen, 1998). ESG y la dermatitis herpetiforme (DH) comparten algunos rasgos clínicos y marcadores MHC. Los pacientes con DH han aumentado la frecuencia de los mismos haplotipos extendidos asociados a ESG. Sin embargo, comparando el halotipo. es evidente que las dos alteraciones son diferentes: los genes de susceptibilidad para ESG están dentro o cerca de la región HLA-DR/DQ. mientras que los de DH parecen estar entre el complemento y la región HLA-DR/DQ. más cercanos a la región del complemento (Ahmed. 1993a). El pénligo vulgar (PV) se ha asociado a dos tipos de haplotipos HLADR4. DQ8 entre los pacientes judíos [HLA-B38. SC31. DR4. DQ8] y [HLA635, SC31. DR4. DQ8] y un haplotipo HLA-DR6. DQ5 [HLA-B55. SB45.

DR6. DQ5] en pacientes no judíos. Estos hallazgos indican que dos mutaciones dieron origen a genes de susceptibilidad MHC para el pénfigo vulgar. Uno, quizá el más antiguo, surgió en un precursor de [HLA-B38/35. SC2I/31. DR4. DQ8] en una población judia y se difundió a poblaciones no judías. El otro, más reciente, parece haber surgido sobre [HLA-B55. SB45. DR14(6). DQ5] en el sur de Europa o en Asia y se difundió a otras poblaciones (Ahmed, 1991). La presencia de autoantícuerpos PV (desmogleina 3) ha mostrado una fuerte evidencia de ligamiento con DRB1'1404, DQB1 '0503. DQA V0101 (Delgado. 1997). El cuarenta y ocho por ciento de los parientes de los pacientes con PV que comparten los haplotipos de susceptibilidad tienen bajos niveles de anticuerpo PV. Asi. la enfermedad parece producirse en individuos susceptibles con bajos niveles de anticuerpo cuando un segundo factor, genético o ambiental, induce niveles altos, suficiente para producir vesículas (Ahmed, 1993b). La evidencia que establece un papel directo de los genes HLA en PV surge de estudios que muestran que un péptido de 15 residuos, idéntico a un segmento de la desmogleina 3. se une a un punto de un DRB1'0402 {Bho\. 1995). En el penfigoide cicatricial (PC), HLA-DRBT04 y DQBV0301 se han asociado con la forma ocular de la enfermedad (Ahmed, 1991). La forma oral de PC también está asociada con DQBV0301 (Delgado. 1996). Estos resultados indican que DQBV0301 es un marcador común para ambas formas, oral y ocular, de PC, lo cual puede formar un espectro de una sola enfermedad. Los análisis de la secuencia de aminoácidos presentes en los alelos DQB1 en los pacientes con formas ocular y oral de PC mostraron que comparten residuos comunes en las posiciones 57 y de la 71 a la 77, y es posible que puedan ser también marcadores para esta enfermedad (Yunis, 1994). El MHC se ha asociado con una variedad de enfermedades infecciosas En la malaria, ambas moléculas HLA clase I y clase II se han asociado con la prolección de la enfermedad grave en Gambia (Hill, 1991). Un alelo especifico, HLA-DQBV0503. se ha asociado con la tuberculosis clínica progresiva (Goldfeld, 1998) Esta asociación es particularmente intrigante, ya que el alelo DQBV0503 codifica un cambio en la posición 57 del aminoácido de la cadena [i (|i57), que afecta a la carga existente en el bolsillo de la unión al péptido putativo. P9. de la molécula DQ. Se sabe que este bolsillo contiene residuos hidrofóbicos. El alelo DOS V0503 codifica el ácido aspártico negativamente cargado en |557 en lugar del aminoácido valina más común, sin carga e hidrofóbico Es posible que la presentación de péptidos restringida a MHC por los macrófagos infectados de tuberculosis esté afectada en el grupo de pacientes que expresan este bolsillo en particular. El bolsillo de unión a P9 cargado negativamente puede unirse a antigenos de tuberculosis con menos efectividad o puede obtener una respuesta inmunogénica disminuida. HLA-DRBV0901 esta más representado en pacientes tuberculina (PPD) positivos en comparación con pacientes TB anérgicos. DfíBJ '0901 es el único alelo que codifica un cambio en la posición 9 del aminoácido de la cadena (i (|}9). que influye en la carga en el bolsillo de unión al péptido putativo. P9. de la molécula DR El alelo DRBV0901 codifica el aminoácido lisina cargado positivamente en (59 en lugar del ácido glutámico más común y cargado negativamente Es posible que la respuesta restringida a MHC a los péptidos PPD esté aumentada en el grupo de pacientes que expresan este bolsillo particular. El bolsillo de unión a P9 cargado positivamente puede unirse a residuos de PPD con más eficacia o puede obtener una respuesta inmunogénica aumentada Los antígenos HLA-B. B-27. B51 y B57 se han asociado a la falta de progresión del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) (Kaslow. 1996) Las moléculas HLA-B pueden ser clasificadas por la presencia de un epitopo molecular Bw4 o Bw6 o especificidad pública, que está definida por los residuos 79 a 83 en el extremo carboxi-terminal de la hélice a, (Salter, 1989). El autor ha encontrado recientemente que la profunda supresión de la viremia por el virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-1). en ausencia de terapia antiviral con fármacos, está significativamente asociada con la homocigosidad para alelos HLA-B que comparten el epítopo HLA-Bw4 (Flores-Villanueva, comunicación personal). Estos datos sugieren que los péptidos que se unen a los alelos HLA-Bw4 pueden mostrarse útiles en el desarrollo de vacunas basadas en péptidos. Los polimorfismos de genes HLA clase III se han asociado a enfermedades. Se han estudiado varios sistemas de alelos TNFy HSP-70 y micro-

CAPÍTULO 41

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COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD

satélites en relación con los haplotipos extendidos (Tabla 41-4). El polimorfismo en la región promotora TNF-ot, localizada en el nucleótido -308 afín al lugar de comienzo de la transcripción, se relacionó con una aumentada susceptibilidad a la malaria cerebral (McGuire, 1994), espondilitis anquilosante (McGarry, 1999), mortalidad por choque séptico (Mira, 1999) y leishmaniasis mucoculánea (Cabrera, 1995). Los microsatélites del TNF d3 y b4 y la vanante HSP-70-1 9.0 fueron encontrados en frecuencias más altas en dos poblaciones distintas con agranulocitosis inducida por clozapma (Corzo, 1995; Turbay, 1997). Otros sistemas de microsatélites se han asociado con artritis reumatoide (Mu. 1999) y lupus eritematoso sistémico (Sturfelt. 1996).

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA ASOCIACIÓN O CORRELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LOS MARCADORES GENÉTICOS Polimorfismo genético El polimorfismo genético se define como la existencia en la misma población de dos o más alelos en un gen. cada uno con una frecuencia importante. La frecuencia se ha determinado de forma arbitraria como mayor que el 1%. Hay dos grupos de polimorfismo genético; equilibrado o estable y transitorio. Un polimorfismo equilibrado se produce cuando dos o más alelos se mantienen en una población por selección. La ventaja heterocigótica es el clásico ejemplo de polimorfismo equilibrado. El polimorfismo transitorio representa una fase de cambios alélicos conducida por deriva genética o por selección. El polimorfismo de un gen puede ser estable en una población y transitorio en otra, dependiendo del efecto de la selección.

959

Es posible calcular la frecuencia del gen (g) sin conocer el tipo de herencia usando la fórmula: ¡7 = i-v7

Fuerza de la asociación Se han ideado varios métodos para detectar el grado de asociación de los marcadores genéticos con los hipotéticos genes para la susceptibilidad a la enfermedad. Uno es calcular el riesgo de enfermedad entre individuos que transportan un alelo especifico de un sistema polimórfico. En este cálculo, el riesgo relativo (RR) o relación de probabilidad (odds ralio) calcula el riesgo de transportar un marcador en una población de individuos enfermos comparado con una población control. Más interesante, pero más dificil de estimar, es el riesgo de tener una enfermedad en un individuo que transporta el marcador (Tabla 41-5, véase también Tabla 41-3). Esta fuerza de asociación es el A de Bergston y Thomson (Svejgaard. 1983), que es lo mismo que la fracción etiológica (FE) (Miettinen. 1976). Si. en una población de pacientes, individuos a transportan el carácter especifico pero individuos ó no y. en la población normal (control), individuos c transportan el carácter, la información puede ser escrita convenientemente en la tabla 2x2:

Paciente Control

Carácter positivo

Carácter negativo

a c

b d

La frecuencia del carácter en esta población de pacientes (l\) es

Para determinar el polimorfismo genético es necesario encontrar una muestra representativa de la población, valorar los individuos, contar los genes y estimar el número de genes contenidos en la población total. Por ejemplo, asumiendo que se ha estudiado una población de 100 individuos para un rasgo genético particular o alelo en un determinado gen, se puede definir la frecuencia de fenotipo como el número de individuos que transportan el rasgo o la variante genética. Para calcular la frecuencia (/) de cada alelo, se suman las frecuencias de cada alelo, y luego se divide entre el número total de alelos analizados:

f(x)+t(i'iiii: I I K L I la célula VIOIT-4 Sislenia lie ili'li'ccii'in: l-pnuciiiu A

Figura 43-4. Ensayo de immunotranslerencia de autoanticuerpos comunes observados en enfermedades reumáticas. En la banda 1 la zona de nitrocelulosa fue investigada en un suero humano normal (control negativo), no apreciándose ninguna reactividad, tal y como se esperaba. Las siguientes 3 bandas muestran distintas franjas obtenidas por sueros controles positivos mezclados conteniendo especificidades conocidas. La banda 2 representa reactividades con las nbonucleoproteinas (RNP) SSA (52 y 60 kOa), SSB (48 kDa), Sm (B/B\ 28 kDa, y D. 14 kDa) y U1-nRNP (la proteína de 70 kDa y una franja tenue alrededor 0e 19 kDa. el antigeno C; la proteína A. con 32 kDa y también reconocida de modo característico por anticuerpos U1- nRNP. no se ve en este experimento). La banda 3 muestra las franjas obtenidas usando los prototipos de antisueros humanos frente a Jo-1 (52 kDa), Ku (dos bandas alrededor de las regiones de 70 y 80 kDa) y RNP ribosomal (15, 18 y 37 kDa). La pequeña franja por encima del antígeno de 52 kDa no está identificada. La banda 4 presenta las Iranias vistas más comúnmente utilizando sueros de pacientes con esclerodermia, por ejemplo, anti-ADN topoisomerasa I (Scl-70. 95 kDa), y anticuerpos anticentrómero (16 kDa. CENP-A, y 80 kDa. CENP-B). A la derecha, se pueden ver posiciones en kilodaltons del amplio rango de pesos moleculares estándares. (De von MUhlen CA. Tan EM Autoantibody specificities m autoimmune rheumatic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994: 34:173, con permiso.)

RESUMEN

Hay muchos tipos de autoanticuerpos trente a antigenos intracelulares y nucleares en las diversas enfermedades reumáticas sistémicas. Normalmente, se considera importante no sólo detectar la presencia y cantidad del autoanticuerpo intracelular y nuclear en el paciente, sino también identilicar la especificidad inmunológica. Estudios anteriores han mostrado que distintos perfiles diagnósticos de los autoanticuerpos se observan en muchas de las enfermedades reumáticas. Algunas de las enfermedades se caracterizan por la presencia o ausencia de un anticuerpo especifico, o por diferencias en el nivel cuantitativo o titulo del anticuerpo. Se ha progresado mucho en mejorar la sensibilidad, especificidad y control de calidad de las diversas pruebas de laboratorio para la detección de autoanlicuerpos frente a antígenos intracelulares y nucleares. Los biólogos moleculares han utilizado muchos de los anticuerpos como sondas biológicas y han aclarado las lunciones biológicas de varios de los autoantígenos. Se ha progresado mucho en el conocimiento de la patogénesis y mecanismos inmunes en las enfermedades reumáticas.

BIBLIOGRAFÍA

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988

SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

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CAPÍTULO 43

•

EVALUACIÓN CLÍNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMÁTICAS SISTÉMTICAS

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C A P Í T U L O

44

Vasculitis Rex M. McCallum, M.D. David J. Bylund, M.D.

CLASIFICACIÓN

990

PATOGÉNESIS DE LA VASCULITIS

990

PERSPECTIVAS SOBRE EL USO DE PRUEBAS CLÍNICAS DE LABORATORIO

RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SÍNDROMES VASCULÍTICOSIDIOPÁTICOS Poliarteritis nodosa

991

Variantes de PAN

Pruebas de rutina

Síndrome de Churg-Strauss

Pruebas especiales

Síndrome mixto de poliangeítis

Algunos patrones de prueba en vasculitis

Granulomatosis de Wegener Granulomatosis linfomatoide

ANTICUERPOS ANTINEUTRÓFILOS CITOPLASMÁTICOS

993

992

Púrpura de Henoch-Schónlein

Métodos de detección

Arteritis de células gigantes (temporal)

Especificidad antigénica

Arteritis de Takayasu

Asociaciones con enfermedad

Angeítis primaria del sistema nervioso central

Interpretación de la prueba

Enfermedad de Kawasaki

Las manileslaciones clínicas y patológicas de la vasculitis necrotizante sistémica son proteicas. Los clínicos se enfrentan a un paciente que presenta una serie amplia de síntomas y/ o signos confusos y contradictorios. El diagnóstico de un síndrome vasculitico necrotizante sistémico requiere una evaluación minuciosa que relacione la historia de un determinado paciente y la exploración física con los datos de laboratorio. Aunque la vasculitis se puede producir en cualquier zona del cuerpo, se han definido patrones distintos de la enfermedad y su tipificación apunta hacia alteraciones determinadas. El diagnóstico específico es importante porque el Iratamiento y el pronóstico dependen de los lugares y patrones de la afectación del órgano (Langford. 1995). La vasculitis necrotizante sistémica puede definirse patológicamente como una inflamación causante de lesiones vasculares. Estas lesiones pueden incluir la proliferación de células íntimas dentro de la luz de los vasos, estrechando o incluso cerrando ese espacio y causando isquemia y un posible infarto de estructuras anatómicas distales al lugar del daño vascular. También, la pared del vaso puede debilitarse hasta formarse un aneurisma o la ruptura del vaso. La vasculitis idiopática (primaria) se produce cuando el daño inflamatorio vascular es el principal hallazgo clinicopatológico y no hay enfermedad subyacente. La vasculitis secundaria se produce cuando las lesiones vasculares acompañan a una enfermedad subyacente (Tabla 44-1). El foco de este capítulo es la vasculitis idiopática y aquellas pruebas clínicas de laboratorio útiles para su diagnóstico y tratamiento. Como los métodos de diagnóstico y tratamiento en los sucesos vasculares secundarios se centran en las enfermedades subyacentes, se tratan en los capítulos correspondientes de este libro. Sin embargo, los comentarios relacionados con la valoración de laboratorio del daño en el órgano distal en la vasculitis idiopática están relacionados con la vasculitis secundaria.

RESUMEN

998

BIBLIOGRAFÍA

998

CLASIFICACIÓN No existe un sistema de clasificación estándar ampliamente aceptado para las afecciones vasculares idiopáticas. Históricamente, su clasificación se ha basado en varias combinaciones de hallazgos clínicos y patológicos (Jennelte, 1998, 1997). aunque en los últimos años las clasificaciones activas han mejorado debido a los resultados en la nomenclatura estándar (Hoffman. 1998; Hunder, 1990; Jennette, 1994). El esquema de clasificación que aparece en la Tabla 44-2 está modificado a partir del utilizado en los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (Langford, 1995).

PATOGÉNESIS DE LA VASCULITIS Ni la etiología ni la patogénesis de las afecciones vasculares se conocen excepto en los ejemplos de daño directo en los vasos sanguíneos por infección vascular, o vasculitis secundaria. La mayoría de las alecciones vasculares idiopáticas se atribuyen a daños vasculares mediados por la inmunidad inducidos por alguno de varios mecanismos, incluyendo: 1) depósitos inmunocomplejos; 2) autoanticuerpos directos ligados o a estructuras de las paredes de los vasos (p. ej., endotelio o antígenos de la membrana basal) o a neutrófilos cuando la vasculitis está asociada con el anticuerpo antineutrófilo citoplasmático (ANCA); y 3) inflamación mediada por células T. Los efectos patogénicos de todos estos mecanismos se unen en una vía final común de daño vascular que activa los mediadores humorales y celulares de la inflamación. Las moléculas de adhesión que están involucradas en la respuesta inmune normal parecen intervenir en las respuestas inmunes patológicas

CAPÍTULO 44

Tabla 44-1

•

Afecciones vasculares necrotizantes sistémicas secundarias

Vasculitis relacionada con medicamentos Vasculitis relacionada con proteínas extrañas Vasculitis asociada con infección Vasculitis en neoplasias malignas Granulomatosis linlomatoido Vasculitis urticarial hipocomplementémica Púrpura hipergammaglobulinémica Vasculitis cnoglobulinémica Vasculitis por radiación Vasculitis por trasplante (rechazo vascular) Vasculitis asociada a enfermedades del tejido conectivo Artritis reumatoide Lupus eritematoso sistèmico Síndrome de Sjogren Esclerodermia Dermatomiositis/ polimiosilis Sarcoidosis Policondritis recidivante Síndrome del anticuerpo anlilosfolipido Enfermedad de Behcet Adaptado de Langford CA, McCallum RM Idiophatic vasculitis. In Belch JJF Zurier RB (eds): Connective Tissue Diseases London. Chapman & Hall, 1995 pag 179. con permiso

observadas en la vasculitis. Se observan anormalidades cuantitativas y cualitativas en la producción de citocinas en la vasculitis sistémica. Se han descrito niveles aumentados de interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-6. factor a de necrosis tumoral (TNF-(x) y TNF-J5 (Arimura, 1993: Grau, 1998), asi como una producción aumentada de TNF-u por las células mononucleares circulantes (Deguchi, 1990). Estos mediadores inician la infiltración de células inflamatorias, la activación del complemento y cascada de la coagulación, y la regulación ascendente de otras moléculas inflamatorias (Conn, 1993: Niles. 1995: Snellen 1997).

PERSPECTIVA SOBRE EL USO DE PRUEBAS CLÍNICAS DE LABORATORIO

VASCULITIS

Tabla 44-3

991

Anticuerpos a s o c i a d o s con vasculitis

Anticuerpo ANCA (generalmente c-ANCA) ANCA (c-ANCA o p-ANCA) Anticuerpos anli C1q

Asociación con e n f e r m e d a d

Prueba principal Métodos

Granulomatosis de Wegener Poliarteritis microscópica

IFM. ELISA IFM, ELISA

Vasculitis urticarial unión C1 q hipocomplementémica Anticuerpos antihepatilis B PAN asociado a hepatitis B ELISA Anticuerpos antinucleares Lupus eritematoso sistemico IFM. ELISA (ANA) Crioglobulmas mezcladas Vasculitis cnoglobulinémica Cnoprecipitación, IEP.IF SSA (Flo). SSB (La) Sindrome de S|ógren IFM. ELISA, ID Factor reumatoide Artritis reumatoide LA, ELISA ANCA = autoanticuerpos antineulróMos citoplasmaticos; c-ANCA = ANCA otoplasmáticos ELISA • ensayo inmunosorbente ligado a enzimas: GBM • membrana basal glomerular. ID = inmunodilusion, IEP = inmunoelectroforesis; IF = inmunofijación IFM = microscopía de inmunoflorescencia indirecta; LA • aglutinación del látex. p-ANCA = ANCA perinuclear; PAN = poliarteritis nodosa.

mente, la confirmación histológica o angiográfica de la vasculitis debería obtenerse de una biopsia de tejido o angiografia para el diagnóstico definitivo previo a la terapia (Mandell. 1994). Las pruebas clínicas de laboratorio tienen un valor limitado en el establecimiento de un diagnóstico específico de la vasculitis (Mandell. 1994), aunque los clínicos usan estas pruebas como ayuda en la identificación de los patrones de la implicación del órgano característico de la vasculitis, evaluando el alcance y la gravedad del daño en el órgano final, diferenciando la vasculitis idiopática de las formas alternativas secundarias y estableciendo los valores básales para su tratamiento. La asociación de ANCA con ciertas afecciones vasculares idiopáticas se ha convertido en una importante ayuda en el diagnóstico y tratamiento. Los ANCA se tratan con detalle a continuación. Cuando se evalúa a un paciente cuyo diagnóstico diferencial incluye vasculitis, resultan útiles los siguientes principios relativos al uso e interpretación de las pruebas clínicas de laboratorio.

Pruebas de rutina Cuando se evalúan pacientes con una enfermedad multisístémica complicada, el objetivo del clínico es el diagnóstico correcto hasta un nivel que permita un tratamiento adecuado. Como no existe una clínica patognomónica ni rasgos de laboratorio de la vasculitis, el clínico debe utilizar combinaciones de hallazgos clínicos y de laboratorio para reconocer los patrones de la enfermedad. Esto puede permitir un diagnóstico específico o, más comúnmente, la clasificación de la enfermedad del paciente como una dentro de un grupo de trastornos vasculíticos con tratamiento similar, incluso cuando no se identifica ninguna entidad específica. Decidir si un paciente tiene vasculitis basándose estrictamente en los síntomas clínicos conlleva riesgos debido al amplio número de posibilidades de diagnóstico diferencial y la falta de hallazgos patognomónicos. Consecuente-

Tabla 44-2

Afecciones vasculares necrotizantes sistémicas idiopáticas (primarias) Vasculitis de pequeños vasos Granulomatosis de Wegener Púrpura do Henoch- Schónlem Angeitis primaria del sistema nervioso central Vascuhlis de vasos medianos Síndrome de Churg- Strauss Poliarteritis nodosa Enlermodad de Kawasaki Vasculitis de vasos grandes Arteritis de células gigantes (temporal) Arteritis de Takayasu

Los pacientes cuya historia y exploración física sugieren vasculitis idiopática a menudo presentan una serie confusa de dolencias multisistémicas que han venido sucediendo durante algún tiempo. Las pruebas de primer orden que hay que considerar incluirían las siguientes: cultivos para agentes infecciosos, si el paciente tiene fiebre; recuento completo de sangre (CBC) con recuento diferencial; velocidad de sedimentación globular (VSG); análisis de orina: panel químico de la sangre; y pruebas para la función de un órgano específico, como el hígado.

Pruebas especiales Las pruebas especiales ayudan a diferenciar la vasculitis idiopática de las alternativas en el diagnóstico diferencial activo. Las pruebas relevantes de laboratorio incluirían aquellas que identifican los auloanticuerpos circulantes que se enumeran en la Tabla 44-3 e inmunocomplejos. La biopsia tisular dirigida para la confirmación histológica de la vasculitis y/o la angiogralía se consideran las pruebas definitivas para la vasculitis idiopática.

Algunos patrones de prueba en vasculitis Son útiles ciertos patrones de resultados de pruebas clínicas de laboratorio: • El hallazgo de leucopenia y/o trombocitopenia en afecciones vasculares idiopáticas es raro y sugiere diagnósticos alternativos tales como lupus eritematoso sistémico (LES), neoplasia, alteraciones de la médula ósea, granulomatosis linfomatoide o hiperesplenismo (Mandell. 1994). • VSG. aunque es un hallazgo no específico, está típicamente elevada en afecciones vasculares idiopáticas. Si la VSG no está elevada antes del tra-

992

SECCIÓN V

•

INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

tamienlo, el diagnóstico no es arteritis de células gigantes (temporal) o granulomatosis de Wegener (WG). • Puede verse vasculitis con rasgos histológicos de poliarteritis nodosa (PAN) asociada con pancitopenia en pacientes con leucemia de células peludas (Mandell, 1994). Anemia con hemoglobina por debajo de 9 g/dl se produce por circunstancias distintas que la anemia de la enfermedad crónica, tal como la hemolisis, el sangrado oculto o la enfermedad renal (Mandell, 1994). Cuando se sospecha PAN, deberían realizarse las pruebas para la función hepática, virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV) y citomegalovirus (CMV) (Golden, 1994; Mandell, 1994). De forma similar, son apropiadas las pruebas serológicas para los virus de la hepatitis B y C cuando un paciente tiene crioglobulinas, vasculitis leucocitoclástica o biopsia cutánea y / o enfermedad renal. 1

1

Creatina-cinasa (CK) en sangre elevada puede indicar miositis o isquemia muscular (Mandell, 1994). Las pruebas para los anticuerpos antinucleares (ANA) y el factor reumatoide (FR) son útiles sólo cuando se sospecha enfermedad del tejido conectivo o artritis. Pacientes con vasculitis reumatoide tienen un alto título de FR. La eosinofilia en sangre periférica se produce en una amplia variedad de alteraciones inflamatorias. Alrededor del 15% al 20% de los pacientes con PAN o WG pueden tener eosinofilia pero no con los altos niveles vistos en el síndrome de Churg- Strauss (CSS). La identificación de ANCA citoplasmático (c-ANCA) apoya el diagnóstico de WG en pacientes con hallazgos clínicos de WG (Mandell, 1994). Pacientes con WG no tratados no tienen leucopenia En la primera orina de la mañana, tanto antes como después de la centrifugación, se deberían examinar cuidadosamente las proteínas, hematuria, células y cilindros que acompañan a la glomerulonefritis que se puede producir en las afecciones vasculares. Si la amiloidosis renal está en el diagnóstico diferencial, existe de forma típica proteinuria sin células.

ANTICUERPOS ANTINEUTROFILOS CITOPLASMATICOS Los ANCA reaccionan con antígenos neutrófilos citoplasmáticos (Jennette, 1993). La identificación de ANCA se ha convertido en un importante accesorio para el diagnóstico de la vasculitis sistémica necrotizante (Niles, 1993). En los últimos años, ha habido también un gran interés en cómo ANCA puede ser importante en la patogénesis de WG y otras afecciones vasculares sistémicas (Jennette, 1993,1994).

Métodos de detección Existen varios métodos de laboratorio incluyendo la microscopía de fluorescencia indirecta (IFM), enzimoinmunoanálisis (ELISA), radioinmunoanálisis. transferencia western. transferencia en marcha, citometria de flujo e inmunoprecipitación que se han utilizado para detectar ANCA (Roberts. 1992; Wieslander, 1991). IFM y ELISA son los métodos de prueba usados más comúnmente con este fin. El IFM es el método más sensible para la detección de ANCA.

Figura 44-1. Patrón de anticuerpo citoplasmàtico antineutrófilo citoplasmático (c- ANCA). La mayoría de los neutrófilos fijados con etanol muestran una fluorescencia citoplasmàtica finamente granular con acentuación central No hay tinción nuclear (x 400).

demuestran tinción citoplasmática y 3) no especificidad por los neutrófilos (p. ej., los linfocitos en el portaobjetos no deberían teñir cuando el verdadero ANCA está presente) y 4) granularidad citoplásmica heterogénea (Roberts, 1992; Saviage, 1998). El p-ANCA se caracteriza por la tinción del área perinuclear (Fig. 44-2). aunque la tinción nuclear mimetizando ANA puede producirse cuando existen títulos altos de este autoanticuerpo (Niles, 1993). El patrón de tinción perinuclear que define p-ANCA está causado por la redistribución de los antigenos diana desde el citoplasma neutrófilo hasta la región nuclear cuando se usa etanol para preparar neutrófilos humanos como sustrato (Jennette, 1993). Cuando se utiliza formalina antes que alcohol para fijar neutrófilos. el antigeno diana se inmoviliza, y el patrón de tinción inmunofluorescente entonces es citoplasmático (Jennette, 1993). El papel del uso de neutrófilos fijados con formalina para detectar ANCA en la labor diagnóstica de rutina sigue siendo una controversia (Chowdhury, 1999).

Especificidad antigénica La especificidad antigénica de c- ANCA se ha identificado como una serín proteasa nuclear de 29 kDa, proteinasa 3 (PR-3), situada dentro de granulos primarios de neutrófilos y lisosomas de monocitos (Niles, 1993; Roberts, 1992). El p-ANCA en vasculitis se debe generalmente a anticuerpos frente a mieloperoxidasa ¡MPO-ANCA) (Falk, 1988). De manera interesante, muchos p-ANCA no se dirigen hacia MPO pero bastantes se dirigen a otros

IFM se realiza utilizando neutrófilos humanos normales aislados como sustrato. Estos neutrófilos son citocentrifugados frente a portaobjetos de cristal multiperforado, fijados con un 99% de etanol, y después incubados con diluciones de sueros de pacientes. Los neutrófilos también pueden sujetarse a los portaobjetos por adherencia, frotis o técnicas de gota (Roberts, 1992, 1990). Los portaobjetos son teñidos con un conjugado de inmunoglobulina (Ig) poliespecífica marcada con fluoresceína; el conjugado poliespecífico se recomienda porque se producen IgM e IgA c-ANCA (Roberts, 1992). Los portaobjetos se leen en un microscopio de fluorescencia. Usando IFM. hay dos patrones principales de tinción de neutrófilos; c-ANCA y ANCA perinuclear (p-ANCA). El c- ANCA se caracteriza por una tinción finamente granular de citoplasma neutrófilo con una acentuación central entre los lóbulos nucleares; el núcleo por sí mismo no liñe (Fig 44-1). Los criterios útiles para diferenciar c- ANCA de tinciones citoplasmáticas no específicas debidas a otros autoanticuerpos incluyen los siguientes: 1) ausencia de acentuación central; 2) menos del 95% de los neutrófilos

Figura 44-2. Patrón de anticuerpo antineutrólilo citoplásmico perinuclear (p-ANCA). La mayoría de los neutrófilos fijados con etanol muestran fluorescencia perinuclear y nuclear sin tinción citoplasmática ( x 400).

CAPÍTULO 44

•

enzimas ciloplasmáticos neutrófilos incluyendo elaslasa, laclolernna. lactoperoxidasa, lisozíma, azurocidma o catepsma G (Hoffman. 1998: Jennette. 1993; Niles. 1993). Los ELISA para detectar autoanticuerpos (rente a PR-3 (PR-3-ANCA) muestran una buena correlación con la presencia de c-ANCA cuando observadores experimentados realizan IFM (Niles. 1993; Robeds, 1992). Un ELISA para detectar PR-3 ANCA debe ser validado cuidadosamente, lijándose de modo especial en el uso de técnicas conocidas en la preparación del antígeno en fase sólida y utilizando un control tanto de los pasos previos como de pasos específicos en la absorción para enlaces no específicos de inmunoglobulina a la fase sólida (Niles, 1993; Roberts, 1992: Wang, 1997). En Europa se han hecho esfuerzos para estandarizar ELISA en fase sólida (Hagen, 1996,1998). Existen en el mercado disponibles ELISA autorizados tanto para PR-3 como para MPO. La mayoría utilizan un recubrimiento de antigeno estándar directo de placas microperforadas de poliestireno para que la pureza del antígeno sea de vital importancia en la definición de la sensibilidad y especificidad analítica (Niles. 1993; Roberts, 1992). Son importantes los intentos para conservar la conformación del antigeno natural, ya que los ANCA frente a PR3 están dirigidos contra los epitopos conformacionales (Hoffman, 1998). La correlación entre p-ANCA y la detección de mieloperoxida en ELISA, sin embargo, no es buena (Roberts, 1992). Varios autoanticuerpos incluyendo ANA, elastasa antineutrófila o ANA granulocito-especificos (GS-ANA) pueden producir un patrón p-ANCA en IFM. Así los sueros que producen fluorescencia nuclear en IFM requieren una prueba adicional para confirmar MPO-ANCA. MPO-ELISA se recomienda para confirmar la especificidad anti -MPO porque se sabe que los verdaderos ANA o GS-ANA y MPOANCA se producen simultáneamente. IFM usando células Hep-2 no hace esta distinción adecuadamente porque ANA y MPO-ANCA pueden producirse juntos, y GS-ANA puede ser negativo en células Hep-2 (Robeds. 1992; Specks. 1994). ELISA tiene limitaciones por lo que. por último, cada laboratorio debe verificar cuidadosamente las informaciones de un fabricante para que el clínico pueda recibir información sobre las características de la realización Esto adquiere especial importancia en las situaciones clínicas confusas donde puede haber discrepancias entre la presentación clínica y los resultados de laboratorio y/o resultados discordantes entre IFM y pruebas ELISA.

Asociaciones con enfermedad Vasculitis Tanto PR-3 ANCA (c-ANCA) como MPO-ANCA (p-ANCA) están asociados con WG, PAN incluyendo poliarteritis microscópica. CSS, glomerulonefritis idiopática necrotizante pauciinmune y progresiva y síndromes de superposición de poliangitis (Cohén, 1991; Niles, 1993). PR-3-ANCA se identifica en alrededor del 90% de los pacientes con WG activa mientras que MPO-ANCA se identifica en menos del 10% de estos pacientes. El ochenta por ciento de los pacientes con poliarteritis microscópica activa tienen o PR3-ANCA o MPO-ANCA más o menos con la misma frecuencia. MPO-ANCA se identifica en pacientes con CSS o glomerulonefritis pauciinmune en el 70% al 80% de pacientes con enfermedad activa; raramente, este último grupo de enfermedades puede asociarse con PR-3-ANCA antes que con MPO-ANCA. Se ha descrito la coexistencia de ANCA y anticuerpos antiglomerulares de la membrana basal (anti- GBM) (Niles, 1993; Bonsib. 1993).

Enfermedad inflamatoria de los tractos gastrointestinal y hepatobiliar Se han publicado vanos artículos sobre la asociación de ANCA con enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal (Gl) y hepatobiliar (Jennette, 1993). Los p-ANCA se han descrito en aproximadamente el 75%-80% de los pacientes con colitis ulcerosa activa o colangitis esclerosante primaria (Ellerbroek. 1994; Klein, 1991: Lo, 1993), alrededor del 75% de los pacientes con hepatitis crónica activa; alrededor del 30% de los pacientes con cirrosis biliar primaria (Kallenberg. 1992: Mulder. 1993) y el 20% de los pacientes con enfermedad de Crohn (Jennette, 1993: Roberts, 1992). Las especificidades del

VASCULITIS

993

antigeno diana en la enfermedad inflamatoria intestinal no se han definido plenamente, aunque se han descrito autoanticuerpos contra lactoperoxidasa. proteina bactericida del aumento de la permeabilidad (Hoffman. 1998), lactoferrina (Peen. 1993) o catepsina G (Jennette, 1993).

Otras

enfermedades

Los ANCA también se han descrito en otras enfermedades incluyendo lupus eritematoso inducido por medicamentos, LES. síndrome de Felty y artritis reumatoide. síndrome de Siógren, polimiositis y dermatomiositis. artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, policondritis recidivante, síndrome del anticuerpo antifosfolipido. síndromes mielodisplásicos. virus de inmunodeliciencia humana (VIH), cromomicosis, amebiasis invasiva, endocarditis subaguda bacteriana, fibrosis quíslica y ciertas neoplasias (Choi, 2000; Hoffman. 1998; Jennette, 1993: Peter. 1993). En las alteraciones del tejido conectivo, los ANA que mimetizan p-ANCA deben ser excluidos Muchos pacientes tratados con hidralazina parecen desarrollar MPO-ANCA (Roberts. 1992). Vasculitis asociada a propiltiouracilo se ha asociado con ANCA positivo (Hoffman, 1998).

Interpretación de la prueba La interpretación de las pruebas de ANCA debería considerar vanos factores (Hagen. 1998; Hoffman. 1998: Vassilopoulos.1999): • Las pruebas ANCA no deberían utilizarse como pruebas de detección sistemática en grupos de pacientes no seleccionados donde la prevalencia de vasculitis es baja (Langford. 1998). • Las pruebas de ANCA son más valiosas cuando se ordenan selectivamente en situaciones clínicas donde alguna torma de vasculitis asociada a ANCA sea una posibilidad seria. • El patrón de inmunofluorescencia c-ANCA deberia confirmarse usando PR3 ELISA (Savige. 1999). • La reactividad anti- PR3 se ve más a menudo en WG activo o PAN pero puede verse en glomerulonefritis idiopática progresiva o CSS. • c-ANCA en WG se considera altamente sensible al señalar la enfermedad sistémica activa (67% a 97%) según Vassilopoulos y Hoffman (1999). • El valor predictivo de un título aumentado de c-ANCA como presagio de una recidiva de WG está controvertido, pues no todas las elevaciones en el titulo de c-ANCA se siguen de un empeoramiento de WG (Specks, 1994). • El patrón p-ANCA en IFM no es específico desde el punto de vista diagnóstico. • Los sueros p-ANCA positivos deberían probarse con ELISA para MPOANCA (Savige, 1999) • MPO-ANCA se ve más a menudo en PAN, glomerulonefritis idiopática progresiva o CSS; sin embargo, puede verse en WG. • Ni un diagnóstico de la vasculitis sistémica necrotizante ni una decisión para tratar debería basarse sólo en un resultado de la prueba ANCA positivo. • Un ANCA negativo no debería usarse para excluir la enfermedad Los autores consideran un c-ANCA positivo como posible WG y una señal para una evaluación más exhaustiva. Por último, la interpretación de una prueba para ANCA depende de la filosofía y experiencia de los clínicos individuales que tratan las vasculitis (Jennette, 1998).

RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SÍNDROMES VASCULÍTICOS IDIOPÁTICOS Poliarteritis nodosa Epidemiología PAN. como todas las afecciones vasculares, es una enfermedad poco común. Las estimaciones de la prevalencia de PAN han vanado desde 4.6 por 1.000.000 en Inglaterra, hasta 9.0 por 1.000.000 en el Condado de Olmstead. en Minnesota, y hasta 77 por 100.000 en una población de esquí-

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

males de Alaska hiperendémica para hepatitis B (Langford. 1995: Conn, 1993). PAN puede producirse en cualquier género y a cualquier edad, pero es más común en hombres (relación varones/hembras = 2:1) entre 40 y 60 años de edad (Langtord. 1995). No se ha observado predilección racial (Conn.1993).

Rasgos clínicos PAN es una vasculilis sistémica necrotizante que afecta predominantemente a arterias de pequeño a mediano calibre. Las manifestaciones clínicas de la PAN clásica son muy variables. Los pacientes a menudo presentan síntomas no específicos como fiebre, pérdida de peso y malestar. La hipertensión es habitual y puede ser una importante clave diagnóstica. Aunque la PAN puede producirse prácticamente en cualquier órgano, la afectación sintomática de la piel, articulaciones, nervios periféricos, tracto Gl y ríñones normalmente dominan el cuadro clínico (Conn, 1993). Las pruebas que indican una función hepática anormal sugieren la posibilidad de una infección por hepatitis B concurrente (Langford. 1995). La afectación pulmonar en la PAN clásica es rara e incluso controvertida. Aunque algunos investigadores piensan que la PAN pulmonar se produce (Lie, 1989), otros creen que estos pacientes tienen CSS o WG, donde la enfermedad pulmonar es habitual (Langford, 1995: Fauci, 1998). La evolución de la PAN se caracteriza por remisiones, recidivas y, si no se trata, alia mortalidad (Faucí, 1998).

Hallazgos clínicos de laboratorio Los resultados de las pruebas clínicas de laboratorio, aunque no específicas diagnósticamente, refleja la naturaleza sistémica inflamatoria de la PAN. Típicamente, se encuentra una anemia normocrómica, leucocitosis neutrofílica. hipoalbuminemía. hipergammaglobulinemia y una VSG marcadamente elevada. La medida de la creatinina sérica y el nitrógeno de urea en sangre (BUN) junto con un análisis de onna para controlar la proteinuria. hematuria y sedimento anormal son importantes para evaluar la función renal normal. El ANA positivo o FR encontrado en el 10% al 40% de estos pacientes puede estar asociado con niveles disminuidos de componentes de complemento C3 y C4. En todos los pacientes con PAN deberían obtenerse pruebas serológicas para el antigeno de superficie y anticuerpo de la hepatitis B (Langford. 1995; Conn. 1993). Con poca frecuencia se ve eosinofilia en sangre periférica y, cuando está presente en altos niveles, esto debería conducir a considerar un CSS (Fauci, 1998).

Diagnóstico La PAN puede ser difícil de diagnosticar, por su presentación no específica, el potencial para la afectación de diversos órganos de forma difusa, y la baja prevalencia. Sin embargo, una vez que se sospecha, el diagnóstico de PAN se basa en la angiografía y/o la demostración histológica de PAN en la biopsia tisular de la(s) zona(s) sinlomática(s), como músculo, nervio, riñon y testículos. Patológicamente, la PAN es una arteritís necrotizante focal pero panmural de arterias musculares de pequeño y mediano tamaño, que preferentemente se produce en los puntos de ramificación de los vasos. La inflamación necrotizante de célula mixta con necrosis fíbrinoide, circunferencial o segmentaria en la pared del vaso, es la lesión que marca una PAN activa. La dilatación aneurismática o microaneurismática también son características de la fase aguda de la PAN. El proceso inflamatorio se cura con librosis que puede conducir a una endarteritis proliferativa. Un rasgo característico de la PAN es una mezcla de lesiones activas y/o lesiones en curación adyacentes a segmentos normales de vasos sanguíneos (Langford, 1995). La angiografía puede ser especialmente valiosa para identificar anormalidades Gl o cuando una posible biopsia de una zona sea inasequible. En particular, se debería considerar una angiografía antes de intentar una biopsia hepática o renal cerrada con aguja en pacientes con sospecha de PAN, debido a la predilección por aneurismas en estos lugares que aumenta el riesgo de sangrado grave (Langford. 1995).

Tratamiento y pronóstico Los pacientes con PAN se tratan con glucocorticoides. El objetivo del tratamiento con glucocorticoides es el control de la enfermedad sin complicacio-

nes significativas por la medicación en si. La ciclofosfamida puede utilizarse para pacientes con PAN grave (afectación Gl, cardíaca y del sistema nervioso central [SCN]), aquellos en los que fracasan los corticoides solos, y para restringir esteroides en pacientes que presentan efectos adversos significativos a estos (Langford, 1995). El pronostico para pacientes con PAN ha mejorado en gran medida con el uso de glucocorticoides. atendiendo la media de supervivencia de cinco años del 13% al 50% y al 60%. La mayoría de los fallecimientos se producen durante el primer año, pero ya sea antes o después de un año de enfermedad, la mortalidad se produce sobre todo o por infección o por complicación del tratamiento o por secuelas de la obliteración del vaso, como el infarto de miocardio o idus (Langlord. 1995).

Variantes de PAN Dos importantes variantes de la PAN son la PAN cutánea y la PAN asociada con hepatitis B. La PAN cutánea es una vasculitis necrotizante de las arterias pequeñas musculares en el tejido subcutáneo. Por definición, este es un proceso localizado que no afecta a arterias viscerales y por consiguiente, no es una vasculitis sistémica. El diagnóstico se establece por hallazgos histológicos caracteristicos en biopsia de piel con una evaluación sistémica negativa. Las lesiones cutáneas histológicamente idénticas pueden verse en la PAN sistémica; por lo tanto la PAN cutánea puede considerarse un diagnóstico de exclusión. Como regla, la PAN cutánea sigue un curso benigno, no progresa a enfermedad sistémica y tiene un excelente pronóstico a largo plazo (Langford, 1995). La positividad del antigeno de superficie de la hepatitis B se ha encontrado en hasta un 54% de los pacientes con PAN. Hay indicios que indican que la hepatitis C también se asocia con PAN, aunque actualmente se conoce poco del espectro clínico de la enfermedad. La identificación del intervalo entre la infección con hepatitis B y el establecimiento de la PAN ha variado desde meses hasta años, en parte porque los pacientes tienen frecuentemente hepatitis B subclínica, sin diagnosticar, hasta que se diagnostica la hepatitis B asociada a PAN. Sin embargo, no se ha reseñado ninguna asociación entre la actividad inflamatoria en el hígado y la vasculitis. Los pacientes con hepatitis B asociada a PAN tienen una mayor incidencia de pruebas de función hepática elevadas y aneurismas que aquellos con PAN no relacionada con hepatitis pero por otra parte son clínicamente similares. Desgraciadamente, la presencia de hepatitis B complica el tratamiento inmunosupresor, porque la replicación viral puede dar lugar a un riesgo aumentado de la enfermedad hepática progresiva durante el tratamiento e incluso la hepatitis tulminante cuando cesa la inmunosupresión. A pesar de estas cuestiones, la terapia corlicoidea es importante, ya que los pacientes con PAN asociada a hepatitis B no tratada tienen una alta tasa de mortalidad. La terapia antiviral con interterón-a debería utilizarse en todos los pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Guillevin, 1997). El intercambio de plasma puede ayudar a eliminar inmunocomplejos y mejorar el tratamiento de algunos pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Langford, 1995: Guillevin, 1997).

Síndrome de Churg-Strauss Epidemiología Se piensa que CSS es una condición clínica rara; no hay datos epidemiológicos amplios disponibles (Conn, 1993). El CSS comienza típicamente entre las edades de 15 y 69 años, siendo los 38 años la media de edad para el establecimiento de la vasculilis (Langford. 1995).

Rasgos clínicos El CSS. también llamada angeítis alérgica y granulomatosís, es una vasculitis necrotizante sistémica caracterizada por una inflamación granulomalosa vascular y extravascular, afectación múltiple de órganos, y asociaciones con rinitis alérgica, asma grave e hipereosinofilia (Fauci, 1998; Langford, 1995). Las manifestaciones clínicas de CSS pueden recordar a las de la PAN en muchos aspectos pero difieren en que la enfermedad pulmonar es típica y

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la enfermedad renal es poco común, generalmente menos grave en CSS que en PAN (Faucí, 1998). El curso clínico de CSS a menudo se divide en tres lases distintas, aunque en realidad, estas tres lases no siempre se identifican o pueden superponerse (Langford, 1995): 1) una fase prodrómica caracterizada por enfermedad respiratoria alérgica; 2) una fase eosinofílica caracterizada por hipereosmolilia en sangre periférica y tejido: y 3) una fase vasculítica. La afectación cardíaca, bien carditis eosinofílica transmural o vasculitis coronaria, se produce en el 25% al 62% de los pacientes con CSS y es la principal causa de muerte (Langford. 1995).

Hallazgos clínicos de laboratorio Un signo característico del CSS es la notable eosinofilia en sangre perifonea, que puede verse en cualquier fase de la enfermedad. El recuento de eosinófilos en sangre periférica alcanza los 1.000 eosinófilos por microlitro en el 80% o más de los pacientes con CSS (Conn, 1993); sin embargo, la eosinofilia no puede encontrarse en todos los pacientes debido a los previos tratamientos con esferoides para el asma o a la amplia y rápida fluctuación que se puede producir en el recuento de eosinófilos en esta enfermedad. La normalización del recuento de eosinófilos en respuesta al tratamiento con esteroides es un rasgo de CSS. distinguiéndolo del síndrome hipereosinofílico en el cual la eosinofilia puede ser resistente a corticoides El grado de eosinofilia puede relacionarse con la actividad de la enfermedad vasculítica en algunos pacientes. Otros hallazgos de laboratorio en CSS son no específicos. La anemia, leucocitosis y aumento de la VSG frecuentemente acompañan a la enfermedad vasculítica. Los niveles de IgE en suero pueden estar elevados. El FR en suero puede ser identificado, pero el titulo es generalmente bajo. El complemento en suero está descrito como normal (Conn. 1993). A diferencia de la PAN, no se ha descrito ninguna asociación entre CSS y hepatitis B (Langford, 1995).

Diagnóstico Históricamente, el diagnóstico de CSS se realiza exclusivamente con la demostración histológica de la vasculitis eosinofílica necrotizante. infiltración eosinofílica del tejido, y granuloma extravascular. En la práctica, sin embargo, pocas muestras de biopsia contienen todos estos hallazgos. Para aumentar la probabilidad de la identificación y el diagnóstico de CSS. se puede dar menos importancia a estos indicadores clínicos e incluir rasgos clínicos. Un estudio ha recomendado los siguientes criterios: 1. Asma 2. Eosinofilia de sangre periférica por encima de 1,5 x1 o células u7l 3. Vasculitis sislémica incluyendo dos o más órganos extrapulmonares (Conn, 1993) 3

El diagnóstico delinitivo todavía requiere la demostración de la vasculitis comprobada con biopsia. Una biopsia abierta de pulmón frecuentemente no confirma todos los rasgos histológicos de CSS pero debe considerarse antes del establecimiento de la terapia, si se teme una posible infección. Cuando los síntomas clínicos así lo indican, las muestras de biopsia útiles se obtienen la mayoría de músculo, nervio safeno, próstata y riñon. El diagnóstico diferencial de CSS incluye PAN, WG y el síndrome hipereosinofílico (Langford. 1995).

VASCULITIS

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entre el establecimiento del asma y el establecimiento de la vasculitis se considera un signo pronóstico desfavorable.

Síndrome mixto de poliangeítis El síndrome mixto de poliangeítis se produce en un grupo heterogéneo de pacientes que. por definición, tienen una vasculitis sistémica necrotizante pero no manifiestan la enfermedad de forma que se sitúen claramente dentro de una categoría específica de diagnóstico. Los pacientes con el síndrome mixto de poliangeítis pueden tener los rasgos combinados de varias enfermedades vasculíticas, signos patológicos mezclados de modo similar, o síntomas atípicos que no encajan con una enfermedad/síndrome especifico (Langford, 1995). El síndrome mixto de poliangeítis tiene la capacidad de afectar a múltiples sistemas de órganos. Aunque el pronóstico para el síndrome mixto de poliangeítis no está establecido, existe la posibilidad de daño visceral serio y enfermedad potencialmente mortal. Tanto desde el punto de vista diagnóstico como terapéutico, estos pacientes deberían tratarse como sí tuvieran un síndrome vasculítico bien definido. Una historia cuidadosa, una exploración física y una evaluación de laboratorio deberían permitir definir el alcance de su afectación sistémica. El diagnóstico del síndrome mixto de poliangeítis debería demostrarse mediante biopsia o angiografía. Una vez que se ha descubierto la presencia de una vasculitis sistémica necrotizante. y se han descartardo otros diagnósticos, específicamente la infección, el tratamiento debería iniciarse con corticoides y considerar el uso de agentes inmunosupresores adicionales, como la ciclofoslamida (Langford, 1995).

Granuiomatosis de Wegener Epidemiología No existe una incidencia anual detallada disponible ni datos de prevalencia para WG, pero se estima que WG es menos común que PAN. La WG se produce en personas de cualquier edad, raza o sexo, aunque se manifiesta predominantemente en caucasianos y tiene un cierto predominio en los varones (Conn, 1993). La edad media de comienzo son los 41 años (Langford, 1995).

Rasgos clínicos WG es un síndrome clínicopatológico de naturaleza desconocida caracterizado patológicamente por una inflamación granulomatosa necrotizante de los tractos respiratorios superior e inferior, glomerulonefritis focal segmentaria, y una vasculitis necrotizante que afecta predominantemenle a las arterias medianas y pequeñas. La WG se manifiesta en las regiones de oido/naríz/garganla con sinusitis, obstrucción nasal o ulceración, otitis media o pérdida de audición (Fauci. 1998: Lie. 1989). El cuarenta y cinco por ciento de los pacientes con WG tienen afectación pulmonar al principio, y el 85% manifiestan una enfermedad pulmonar en algún momento durante el curso de su enfermedad. Las manifestaciones habituales del pulmón incluyen infiltrados pulmonares, nodulos pulmonares, hemoptisis o pleuritis (Faucí, 1998). Aunque sólo alrededor del 18% de estos pacientes sufren inicialmente fallo renal, el 80% manifiestan glomerulonefritis en algún momento en el curso de WG (Faucí. 1998). Otros signos habituales de la enfermedad sistémica incluyen exantema cutáneo, artralgias. liebre, manileslaciones oculares y pérdida de peso (Faucí. 1998: Lie. 1989). Aunque se han descrito pacientes con WG limitado al tracto respiratorio sin afectación renal ("WG limitado"), por encima del 50% de los pacientes con esta enfermedad al inicio desarrollan con el tiempo una enfermedad más generalizada (Langford, 1995).

Tratamiento y pronóstico Los corticoides son la base del tratamiento de CSS. La utilidad de la lerapia mmunosupresora con azalioprina y ciclofosfamida no está bien estudiada (Langford. 1995). El diagnóstico precoz de CSS y corticoides ha llevado a estos pacientes a tener una tasa de supervivencia de cinco años del 62%. La insuficiencia cardiaca congestiva y el infarto de miocardio causan el 48% de todas las muertes en CSS. La hemorragia cerebral, fallo renal, perforación o hemorragia Gl. estado asmático e insuficiencia respiratoria también causan fallecimiento de los pacientes con CSS. Todos estos rasgos deberían llevar a considerar el uso de una terapia con un agente citotóxico (ciclofosfamida) en combinación con corticoides (Langlord. 1977). La poca duracón del intervalo

Hallazgos clínicos de laboratorio Los hallazgos clínicos de laboratorio típicos de WG incluyen leucocitosis moderada sin eosinofilia acusada, anemia normocrómica leve y trombocitosis (Conn. 1993. Langford, 1995). No se ha observado leucopenia en los pacientes no tratados y, asi, esto ayuda a distinguir WG de otros trastornos. La presencia de c-ANCA apoya el diagnóstico. Los inmunocomplejos circulantes, determinados por enlaces Clq. se pueden encontrar junto con niveles normales de complemento e hipergammaglobulinemia: a menudo están elevadas las cantidades de subclase IgA (Conn, 1993; Langford. 1995). Los indicado-

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

res de afectación glomerular incluyen hematuria microscópica o gruesa, proteinuria, cilindros de hematíes y/o creatinina sérica elevada y BUN. Más del 50% de estos pacientes son FR positivos, pero los ANA están generalmente ausentes (Fauci, 1998; Langford, 1995). Las pruebas serológicas para autoanticuerpos anti-GBM son negativos. Previo al tratamiento, el 80% de estos pacientes presentan una VSG elevada.

Diagnóstico Aunque los hallazgos clínicos y de laboratorio pueden ser sugerentes. el diagnóstico de WG debería hacerse solo con una biopsia probada, confirmación histológica o cuando se ha comprobado la existencia de c-ANCA en el paciente con sinusitis, infiltrado pulmonar o nodulo y glomerulonelrilis (Langford, 1998). El tejido pulmonar obtenido mediante biopsia abierta de pulmón olrece la mejor oportunidad para hacer un diagnóstico certero (Langford, 1995). La biopsia transbronquial no proporciona el tejido adecuado para el diagnóstico más del 90% del tiempo. Aunque el tejido de cabeza y cuello es directamente más accesible, los rasgos patológicos característicos se encuentran en menos del 23% de estas muestras de biopsías El tejido útil desde el punto de vista diagnóstico de cabeza y cuello que mejor se obtiene, según orden decreciente de frecuencia, es el de los senos paranasals, tejido nasal y región subglótica. Los cambios glomerulares en el tejido de la biopsia renal, aunque sugerentes de WG, son raramente diagnósticos (Langford, 1995). Aunque el espectro morfológico de WG es amplio, el marco de la lesión patológica en WG es la vasculitis granulomatosa y necrolizante. Los vasos afectados experimentan necrosis fibrmoide con infiltración precoz por leucocitos polimorfonucleares seguidos de células mononucleares. El tejido pulmonar puede revelar cualquier combinación de necrosis, vasculitis, e inflamación granulomatosa. aunque las muestras de biopsia no incluyen lodos estos rasgos característicos. El hallazgo más habitual en la biopsia renal es la glomerulonefritis necrotizante segmentaria presente en diversos grados en el 80% de las muestras. La vasculitis renal no relacionada con el glomérulo es poco común y está presente sólo en el 8% de las biopsías. Muchas alteraciones pueden imitar la WG, incluyendo las enfermedades granulomatosas infecciosas o no infecciosas. CSS. síndrome de Goodpasture, granuloma idiopático de media linea, granulomatosis Imfomatoide y neoplasias de las vías respiratorias altas o pulmones (Fauci, 1998). De estos, la infección es una consideración importante, ya que un diagnóstico erróneo puede tener fatales consecuencias cuando se trata de forma equivoca con terapia inmunosupresora (Langford, 1995).

Tratamiento y pronóstico Un régimen de ciclofosfamída oral diaria y corticoides es la terapia de elección para la WG. Utilizando este régimen, el Instituto Nacional de la Salud publicó el logro de una marcada mejora o remisión parcial en el 91% de los pacientes, con remisión completa en el 75%. Se observó una tasa de mortalidad global del 20%, el 13% de la cual podría atribuirse de forma completa o parcial a la WG. A pesar de esta marcada mejora en la supervivencia y la remisión comparada con el 100% de mortalidad en los pacientes no tratados, se observaron recidivas y morbilidad tanto de la enfermedad como del tratamiento. La mitad de las remisiones completas fueron seguidas de una o más recidivas, que se produjeron entre tres meses y 16 años después de alcanzarse la remisión (Langford. 1995) El metotrexato es una alternativa a la ciclofosfamída en pacientes que no sufren de enfermedades en las que peligra la vida (Langford, 1997). Durante el primer año de WG. el alcance de la enfermedad renal es el factor más estrechamente relacionado con el pronóstico. Después, la afectación del pulmón se convierte en el indicador de pronóstico más importante, y la glomerulonefritis no parece afectar significativamente al pronóstico.

pulmones, donde clínicamente imita a la WG. Sin embargo, los hallazgos histológicos característicos incluyen la infiltración marcada de vasos sanguíneos ("angiocénlrica") y la destrucción imitando a la vasculitis, pero la morfología celular es más sugerente de linfoma o alteración linfoproliferativa (Langford, 1995). No hay pruebas clínicas de laboratorio especificas.

Púrpura de Henoch-Schónlein Epidemiología La púrpura de Henoch-Schónlein (HSP) se produce principalmente e n niños de edades comprendidas entre los 4 y los 11 años (Conn. 1993) pero también aleda a algunos adultos. La HSP se presenta más habitualmente e n primavera y generalmente sigue a una infección de las vías respiratorias superiores (Conn. 1993). La HSP tiene un predominio en los varones de 3:2 (Langford, 1995).

Rasgos clínicos La HSP. llamada a veces púrpura anafiladoide. es una vasculitis sistémica de pequeños vasos clasificada como un subgrupo de la vasculitis de hipersensibilidad. No se conoce la etiología de HSP. Los hallazgos clínicos típicos en HSP incluyen púrpura palpable no trombocitopénica, artralgias, lesión renal y anormalidades del tracto Gl (Langford. 1995). El 70% de los pacientes con HSP manifiestan signos y síntomas gastrointestinales incluyendo dolor abdominal espasmódico asociado con nauseas y vómitos, sangre o moco en heces, hemorragia Gl potencialmente mortal, e invaginación (Langford. 1995). La enfermedad renal asociada se caracteriza por glomerulonefritis focal proliferativa que tiene una expresión clínica variable que va desde la hematuria aislada con cilindros de hematíes, hasta insuficiencia renal aguda, y Iracaso renal crónico raro (Fauci. 1998; Langford, 1995; Lie, 1989).

Hallazgos clínicos de laboratorio Los estudios clínicos de laboratorio en HSP son no específicos y resultan especialmente útiles para excluir otras alteraciones y buscar evidencia de afectación renal. Se pueden observar leucocitosis y VSG elevada. Las pruebas de CBC con recuento de plaquetas y de coagulación son importantes en la evaluación de púrpura cutánea; en HSP. las púrpuras no son de trombocitopenia. Deberían realizarse coprocultivos intermitentemente para buscar evidencia de pérdidas de sangre oculta. Los niveles de complemento en suero generalmente son normales, aunque se ha descrito una asociación entre HSP y la ausencia congenita del componente del complemento C2 (Conn, 1993). Se deberían realizar análisis de orina y medidas de creatinina en suero al comienzo de la enfermedad y dos veces a la semana hasta que los signos sislémicos hayan cesado (Langford, 1995).

Diagnóstico La dificultad para diagnosticar HSP es rara, excepto cuando la afectación de otros lugares principales precede a la aparición de púrpura palpable. A diferencia de otras vasculitis necrolizantes, el diagnóstico es clínico, con estudios de laboratorio que se utilizan para excluir otras alteraciones. La biopsia renal, que demuestra glomerulonefritis proliferativa, no es propiamente necesaria para el diagnóstico, aunque se utiliza para valorar la gravedad de la enfermedad y estimar el pronóslico Las alteraciones que se han de considerar en el diagnóstico diferencial de HSP incluyen cualquiera que cause abdomen agudo, nefritis o púrpura (Langford, 1995).

Tratamiento y pronóstico Granulomatosis linfomatoide La granulomatosis linfomatoide (GL) está considerada como una alteración linfoproliferativa poco habitual que puede evolucionar a un linfoma maligno en aproximadamente el 50% de los pacientes. La GL afecta pnncipalmente a los

El tratamiento de HSP es de sostén y no existe un tratamiento especifico de beneficio probado para la nefritis de HSP. Aunque los glucocorticoides pueden ser útiles para disminuir el edema, el dolor de articulaciones y el malestar abdominal, la terapia de mantenimiento c o n glucocorticoides no es beneficiosa, ya que no disminuye el nesgo de enfermedad recurrente o mejora el diagnóstico renal (Langlord. 1995). Los analgésicos no sali-

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cilatos pueden suavizar el malestar de las articulaciones y tejidos blandos. La terapia para adultos se parece a la de los niños, aunque la hipertensión en adultos debe ser controlada cuidadosamente (Langford. 1995). El pronóstico para esta enfermedad generalmente autolimitada, que dura de 6 a 16 semanas, es bueno (Conn, 1993). La tasa de mortalidad está alrededor del 1% al 3% (Langlord. 1995). y el Iracaso renal es la causa principal de muerte (Langford, 1995). Aquellos que tienen una presentación nefrítica aguda, particularmente con síndrome nefrótico. tienen el peor desenlace, con menos del 50% que recuperen la función renal y los análisis de orina normales en dos años El porcentaje de glomerulos semilunares puede ser también un indicador de pronóstico útil: sin embargo, es importante tomar conciencia de que el curso de HSP puede ser extremadamente variable. Los pacientes con anormalidades graves clínicas o histológicas pueden recuperarse totalmente, y aquellos con cambios benignos pueden evolucionar a insuficiencia renal. La enfermedad se repite en el 25% al 40% de los pacientes y consiste en su mayor parte en manifestaciones cutáneas. El deterioro o la mejora puede ser más notable durante los primeros dos o tres años tras la resolución del episodio agudo, aunque también se han observado cambios significativos con más posterioridad. Es extremadamente importante una revisión regular con medidas de presión sanguínea y análisis de orina durante al menos los cinco primeros años siguientes a un episodio de HSP. (Langford, 1995).

Arteritis de células gigantes (temporal) Epidemiología La arteritis de células gigantes (GC) es una alteración relativamente común. Los estudios epidemiológicos han demostrado una incidencia creciente con la edad. Un estudio que incluía arteritis GC probadas con biopsia demostró una tasa de incidencia anual de 23,3 por 100.000 personas mayores de 50 años (Conn. 1993). Casi todos los casos de arteritis GC empiezan después de la edad de 50 años.

VASCULITIS

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ción de la vista que sigue a la ceguera secundaria a la arteritis GC. incluso con una terapia de corticoides rápida a altas dosis.

Arteritis de Takayasu Epidemiología Como muchas de las alecciones vasculares idiopáticas. la arteritis de Takayasu es poco habitual, y la epidemiología de esta enlermedad no se conoce exactamente. Esta alteración es más prevalente en adolescentes y mujeres jóvenes en edades comprendidas entre los 10 y 30 años; en realidad, entre el 80% y el 90% de los casos se produce en mujeres. Aunque es más común en Japón, esta enlermedad no tiene limitaciones probadas raciales o geográficas (Conn, 1993: Fauci, 1998).

Rasgos

clínicos

La arteritis de Takayasu es una vasculitis granulomalosa de las arterias elásticas medias y grandes que causa estenosis vascular u oclusión; existe una fuerte predilección por la arteria aórtica y sus grandes ramas, incluyendo las arterias pulmonares (Fauci, 1998; Langford. 1995). Esta enlermedad se llama a veces síndrome de la arteria aórtica o arteritis granulomalosa idiopática. Los pacientes presentan síntomas sistémicos agudos que incluyen fiebre, malestar, sudores nocturnos y pérdida de peso. La isquemia en los órganos que reciben el aporte vascular a través dellos vaso/s afeclado/s causa señales y síntomas órgano-específicos. En la fase crónica obliterante, las pulsaciones de las arterias están disminuidas o ausentes en las arterias implicadas (Langford, 1995), más habitualmente en la arteria subclavia (Fauci. 1998). Son habituales los soplos vasculares y la hipertensión (Langford. 1995). Otros hallazgos incluyen la regurgitación aórtica, cardiomegalia secundaria a hipertensión aórtica o pulmonar, e ictus (Fauci, 1998). La arteritis de Takayasu puede progresar lentamente, puede estabilizarse, o puede causar la muerte rápidamente (Fauci, 1998)

Hallazgos clínicos de laboratorio Rasgos clínicos La arteritis GC es una entermedad sistémica caracterizada por una inflamación vascular granulomalosa que afecta a las arterias medianas y grandes. Aunque las arterias afectadas pueden estar en múltiples lugares, la arteritis GC clásicamente afecta a la arteria temporal y/o otras ramas de la arteria carótida (Faucí. 1998) Las manifestaciones clínicas incluyen fiebre, cefalea y claudicación mandibular en pacientes con más de 50 años La neuritis óptica isquémica puede provocar una ceguera repentina, particularmente en pacientes no tratados (Faucí, 1988). La arteritis GC está estrechamente asociada con la polimialgia reumática, que se caracteriza por rigidez y dolor cervical, de hombros, zona inferior de la espalda, caderas y muslos que es peor por la mañana y mejora con la actividad del día (Fauci, 1998).

Hallazgos clínicos de laboratorio Los hallazgos clínicos de laboratorio incluyen una VSG elevada y anemia normocrómica La fosfatasa alcalina en suero está habitualmente elevada. Se ha descrito una hipergammaglobulinemia, asi como niveles elevados de complemento e inmunocomplejos (Fauci, 1998).

Diagnóstico El diagnóstico se basa en la identificación de las manifestaciones clínicas típicas y una VSG alta en un paciente anciano que puede o no tener también síntomas de polialgia reumática (Fauci. 1998). El diagnóstico se confirma por biopsia de la arteria temporal.

Tratamiento y pronóstico La arteritis GC se trata con glucocorticoides. y la respuesta clínica a esta terapia es generalmente llamativa. El pronóstico clínico es bueno, pues la mayoría de los pacientes consiguen y mantienen una remisión completa Iras la terapia corticoidea (Fauci, 1998). Desgraciadamente, es rara la recupera-

Los estudios de laboratorio de la arteritis de Takayasu definen una alteración inflamatoria sistémica (Langford. 1995). La VSG está elevada en el 75% al 100% de los pacientes, que tiende a volver a la normalidad a lo largo del tiempo. Se cree que la VSG es un índice fiable de actividad inflamatoria y se ha utilizado como herramienta para monitorizar la eficacia de la terapia. El poder de resolución de la enlermedad. tanto sintomática como angiográficamente. se ha visto que está correlacionado con la disminución de la VSG. Los estudios hemalológicos muestran con frecuencia una anemia normocrómica de leve a moderada y/o leve leucocitosis. El FR y ANA son generalmente negativos. Puede haber hipergammaglobulinemia, hiperfibrinogenemia e hipoalbuminemia (Conn, 1993). Los inmunocomplejos circulantes pueden estar presentes en hasta un 50% de estos pacientes pero no parecen relacionarse con la actividad de la enfermedad.

Diagnóstico La arteritis de Takayasu se diagnostica por los datos correlacionados de la historia, la exploración física y la angiografia. La enfermedad debería considerarse como una posibilidad diagnóstica en cualquier mujer joven que carezca o tenga una frecuencia de pulso periférico marcadamente disminuida o que presente variaciones en la presión sanguínea yo soplos arteriales (Fauci. 1998). Los hallazgos angiográficos característicos ayudan a confirmar el diagnóstico clínico. La biopsia del tejido de diagnóstico para la confirmación raramente se requiere o se hace (Fauci, 1998). La predilección de este síndrome por mujeres jóvenes es un rasgo importante que a veces lo separa de otras consideraciones diagnósticas, particularmente de la arteritis GC (Langford, 1995).

Tratamiento y pronóstico En pacientes con entermedad activa, la terapia corticoidea es el tratamiento inicial de elección. Si la enlermedad activa persiste a pesar de los corticoi-

998

SECCIÓN V

•

INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGIA

des, se pueden administrar ciclofosfamida o metotrexato. Los vasodilatadores, anticoagulantes y antiinflamatorios no esteroideos se utilizan para el alivio sintomático. Puede ser necesana la intervención quirúrgica para la estenosis vascular sintomática o la oclusión (Langford. 1995). El curso clínico de la arteritis de Takayasu es variable. Aunque se produce la remisión espontánea, la mayoría de los pacientes requieren tratamiento. El pronóstico parece estar relacionado con la presencia y gravedad de las complicaciones. Las principales complicaciones incluyen la retinopatia de Takayasu. hipertensión secundaria, insuficiencia de la válvula aórtica y aneurisma aórtico/arterial (Langford, 1995). La supervivencia desciende con el paso del tiempo, a medida que aumenta el número y gravedad de estas complicaciones. Las muertes relacionadas con la enfermedad generalmente se producen por complicaciones vasculares, como insuficiencia cardiaca congestiva, ictus, infarto de miocardio y rotura de aneurisma (Langford, 1995).

Angeítis primaria del sistema nervioso central Epidemiología La angeítis primaria del sistema nervioso central (PACNS) es una situación rara donde la dificultad para hacer un diagnóstico definitivo impide los estudios epidemiológicos. PACNS es ligeramente más habitual en hombres que en mujeres (4:3) y comienza a una edad media de 43 años (Langford, 1995),

dificultad para obtener un diagnóstico certero de esta enfermedad, la biopsia es igual de importante para descartar otras posibles etiologías. Histológicamente, existe una inflamación segmentaria mixta con necrosis que afecta predominantemente a arterias craneales de pequeño y mediano tamaño. La inflamación por granulomatosis puede estar presente. A menudo se detecta trombosis; las arterias extracraneales raramente se afectan (Langford, 1995; Rhodes, 1995). Por eso, deben realizarse en todos los casos diagnósticos dilerenciales cuidadosos para decidir las pruebas apropiadas tanto para apoyar un diagnóstico de PACNS como para descartar otros procesos. La combinación de la resonancia magnética (RM) y LCR normales tiene un fuerte valor predictivo negativo y excluye la consideración de PACNS en la mayoría de las situaciones clínicas (Calabrese, 1997).

Tratamiento y pronóstico El tratamiento intensivo está indicado para los pacientes donde se han descartado otras alteraciones, el diagnóstico de PACNS se mantiene, y hay evidencia de dificultades neurológicas progresivas (Calabrese, 1997). Se defiende la terapia combinada de corticoides y ciclofosfamida diarias; sin embargo, el pronóstico de PACNS es malo, con un 60% a un 70% de pacientes que fallecen por la enfermedad antes de un año desde el diagnóstico (Langford. 1995).

Enfermedad de Kawasaki Rasgos clínicos Los pacientes con PACNS presentan cefaleas; déficit focales neurológicos, y estado mental alterado, paraparesia. cuadriparesia. neuropatías craneales, ataques y ataxia (Calabrese, 1997; Fauci. 1998). Los síntomas iniciales están más generalizados y los signos y síntomas focales generalmente se desarrollan más tarde en el curso de la enfermedad (Langford. 1995). El quince por cíenlo de los casos tienen afectación de la médula espinal (Calabrese. 1997). El curso puede ser progresivo rápidamente o crecer y decaer durante un largo periodo de tiempo. Los síntomas sistémicos son raros.

Hallazgos clínicos de laboratorio Los estudios de laboratorio no son útiles para hacer un diagnóstico de PACNS, pero juegan un importante papel en la exclusión de otras enfermedades. La VSG está elevada en la mayoría, pero no en todos, estos pacientes. Solamente se ha visto anemia en el 17% de ellos, y otros parámetros hematológicos son generalmente normales. El FR, ANA y ANCA están ausentes típicamente. Sin embargo, el liquido cefalorraquídeo (LCR) es generalmente anormal con hallazgos que incluyen presión de apertura aumentada, proteínas elevadas y pleocitosis linfocítica. Como el LCR puede ser completamente normal, estas pruebas no siempre excluyen la posibilidad de vasculitis (Langford. 1995).

Diagnóstico El diagnóstico de PACNS continúa siendo de exclusión. Los criterios diagnósticos propuestos han incluido la disfunción del SNC que no se explica por exploración clínica, de laboratorio o neurologica: documentación por angiograma y/o biopsia de una arteritis dentro del SNC; y ausencia de una vasculitis sistémica u otra condición para la cual los rasgos angiográficos o patológicos podrían ser secundarios. Debido a la inevitable dificultad en cuanto al último criterio y el pobre poder discriminatorio de la angiografía en cuanto a la enfermedad vascular inflamatoria frente a la no inflamatoria (Calabrese, 1997), las biopsias de SNC están infrautilizadas. El papel de la biopsia cerebral en el diagnóstico de PACNS permanece en controversia, aunque algunos defienden que esta biopsia es esencial para hacer un diagnóstico definitivo (Calabrese, 1997). La exclusión de una biopsia cerebral como método generalizado se debe no sólo a la naturaleza invasiva sino también por la incapacidad de demostrar la vasculitis histológica debido a la naturaleza heterogénea del proceso. El rendimiento de la biopsia puede aumentarse mediante la obtención de muestras de vasos tanto de parénquima como de la leptomeninge. Por la

La enlermedad de Kawasaki o síndrome linfonodular mucocutáneo es una forma de vasculitis que aféela a arterias de pequeño y mediano calibre. La enfermedad se produce típicamente en niños que presentan linfadenitis cervical y alteraciones en piel y mucosas. La enfermedad de Kawasaki generalmente es autolimitada. pero la arteritis provoca aneurismas coronarios en el 25% de los pacientes. La muerte se produce en hasta un 3% de los pacientes, generalmente por vasculitis coronaria. Los autoanticuerpos de células anliendoteliales han sido determinados en pacientes con enfermedad de Kawasaki (Fauci, 1995).

RESUMEN El diagnóstico de las afecciones vasculares sistémicas necrotizantes requiere un alto grado de sospecha y puede ser difícil debido al amplio número de consideraciones de diagnóstico diferencial. No existen pruebas clínicas de laboratorio patognomónicas en pacientes con afecciones vasculares sistémicas necrotizantes. pero estas pruebas son útiles para definir el alcance y los patrones de la afectación del órgano. Los ANCA y sus asociaciones con la vasculitis sistémica necrotizante. particularmente la asociación de c-ANCA con WG. se han convertido en una prueba serológica importante utilizada en la evaluación de estos pacientes. Sin embargo, los médicos y técnicos de laboratorio que usan esta prueba deben entender a fondo las características operativas, incluyendo limitaciones, de la misma cuando la realizan en su laboratorio, La biopsia de tejido del lugar(es) sintomático(s) con confirmación histológica de vasculitis necrotizante continúa siendo el procedimiento de laboratorio más importante para el diagnóstico de las afecciones vasculares necrotizantes sistémicas.

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4 5

Enfermedades autoinmunes organoespecíficas David J. Bylund, M.D. Robert M. Nakamura, M.D.

MÉTODOS DE DETECCIÓN

1000

Microscopía de inmunofluorescencia indirecta PIEL

1001

1011

Diabetes mellitus 1013

Anemia perniciosa Enteropatia sensible al gluten SISTEMA NERVIOSO

1013

Miastenia gravis Esclerosis múltiple 1006

Neuropatías Autoanticuerpos contra proteínas neuronales

Enfermedades hepáticas 1009

Enfermedades tiroideas

Autoanticuerpos contra gangliósidos neuronales OTROS ÓRGANOS

Autoanticuerpos RIÑON

PÁNCREAS

TRACTO GASTROINTESTINAL

Autoanticuerpos GLÁNDULA TIROIDES

1011

Enfermedad de Addison

Pénfigo Penfigoide Epidermólisis ampollosa adquirida y lupus eritematoso ampolloso Dermatitis herpetiforme Dermatosis IgA lineal Lupus eritematoso Vasculitis HÍGADO

GLÁNDULA SUPRARRENAL

1014

Corazón 1010

Glomerulonefritis Enfermedad por anticuerpos contra la membrana basal glomerular

Las enfermedades autoinmunes pueden clasificarse como sistémicas o enfermedades específicas de órgano. En este capitulo se tratan la mayoría de las enfermedades autoinmunes organoespecíficas enumeradas en la Tabla 45-1. La principal característica clínica de estos trastornos autoinmunes es la inflamación crónica, que generalmente se localiza en un único órgano específico en cada enfermedad. Dentro de este grupo de enfermedades autoinmunes, aparece con cierta Irecuencia un agrupamiento familiar. Los autoanticuerpos más relevantes pueden ser específicos de la especie o no serlo, pero si exhiben especificidad por un antígeno presente en el tejido u órgano dañado. En este capitulo también se incluyen algunas enfermedades con autoanticuerpos y lesiones inflamatorias restringidas a uno o varios órganos, que combinan las características clínico-patológicas de los dos tipos de trastornos, las enfermedades autoinmunes sistémicas y las específicas de órgano. Como ejemplo de éstas encontramos enfermedades autoinmunes hepáticas como la cirrosis biliar primaria (CBP) o la hepatitis autoinmune (AiH). Si excluimos los autoanticuerpos antireceptores tiroideos, la implicación de los autoanticuerpos en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes específicas de órgano aún no ha sido demostrada.

MÉTODOS DE DETECCIÓN La microscopía de inmunofluorescencia indirecta (IFID), descrita brevemente más adelante, es el método que se utiliza con mayor Irecuencia para

Músculo RESUMEN

1014

BIBLIOGRAFÍA

1014

detectar la presencia de autoanticuerpos circulantes dirigidos contra órganos o tejidos específicos. Sin embargo, gracias a la mejora de los aspectos técnicos, los laboratorios clínicos utilizan con mayor frecuencia los ensayos ELISA (análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas).

Microscopía de inmunofluorescencia indirecta Este procedimiento es esencialmente el mismo para las distintas pruebas, excepto por los suslratos utilizados como objetivo para los autoanticuerpos. El procedimiento general es el siguiente: 1. Preparar diluciones para el cribado o diluciones seriadas de los sueros de los pacientes, y de los controles apropiados con fosfato salino tamponado (PBS). 2. Incubar en cámara húmeda durante 20 a 30 minutos las diluciones de los sueros de los pacienles y los controles sobre secciones de tejido criopreservadas sobre portas de cristal multiporo. No permitir que se sequen los portas. 3. Sacar los portaobjetos de la cámara húmeda. Lavar brevemente y con cuidado cada portaobjetos, dos o tres veces, usando para ello PBS a temperatura ambiente. Después lavar los portaobjetos en PBS durante 15 minutos, cambiando la solución de lavado una vez en este tiempo.

CAPÍTULO 45

•

1001

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS

Tabla 45-1 Enfermedades autoinmunes organoespecíficas E n f e r m e d a d del ó r g a n o Glándula tiroides Tiroiditis aulommune

M é t o d o / s de d e t e c c i ó n

Autoanticuerpos

Enfermedad de Graves

Receptor de TSH

ELISA. IFID sobre tiroides de mono no lijada IFID sobre tiroides de mono fijada en metanol; hemaglutinación pasiva, aglutinación en látex Ensayo de unión al radiorreceptor, bioensayo do cAMP

Glándula suprarrenal Enfermedad de Addison

Adrenocortical

IFID en corteza adrenal de mono o humana no fijada

Glandula parattroides Paratiroides

Proteínas endoteliales paratiroideas

IFID sobre glándula paratiroides bovina no lijada

Células del islote Asociados a insulina Anti-decarboxilasa de á c i d o glulámico

IFID sobre páncreas humano no lijado, grupo sanguíneo O

PM-1. Jo-1

ELISA; inmunodifusión

Células parietales gástricas Factor intrínseco Células de conductos salivares Células panetalos gástricas

Páncreas Diabetes mellitus dependiente de insulina Músculo Dermatomiositis/polimiosilis Tracto gastrointestinal Gastritis atròfica Anemia perniciosa

Peroxidasa tiroidea Tiroglobulma

Radioinmunoprecipitación ELISA. RÍA. inmunotransferencia

Colitis ulcerosa

Colon; lipopolisacárido; asociado a p-ANCA

Enfermedad de Crohn Enfermedad celiaca

Reticulina Transglutammasa tisular IgA de endomisio Gliadina Reticulina

IFID en estómago/riñón de ratón Ensayo de unión a vitamina B,. radiactiva IFID en glándula salival humana no fijada IFID en sustrato de mucosa gástrica humana, de mono, de ratón o de rala IFID sobre colon humano o de rata, hemaglutinación IFID en neutrófilos fijados en elanol IFID sobre riñon de ratón ELISA IFID sobre e s ó f a g o de mono ELISA IFID sobre n ñ ó n de ratón

Cirrosis biliar primaria Colangitis esclerosante primaria

Músculo liso Microsomas hepáticos y renales ANA Mitocondrial ( M 2 ) p-ANCA

IFID en estómago/riñón de ratón IFID on oslómago/riñón de ralón; ELISA Células Hep-2 IFID en estómago/nñón de ratón, ELISA IFID sobre neutrófilos fijados en elanol

Neurológicas Miastenia gravis

AChR

Inmunoprecipitaaón de AChR conjugado con la-bungarotoxina (músculo esquelético humano); ELISA

Hígado Hepatitis autoinmunc

,26

Enfermedades desmielinizantes (a saber, esclerosis múltiple)

Mielina; lubulina, proteina básica de la mielina; FID sobre m é d u l a espinal de mamitero; ELISA; glucoproleina asociada a mielina inmunotransferencia

Ríñones Enfermedad por anticuerpos anti-GBM Piel Pénfigo Penfigoide Dermatitis herpetiforme

Membrana basal glomerular y pulmonar

Espacios intercelulares (desmogleinas) BMZ (proteínas de hemidesmosomas) Transglutaminasa tisular IgA de endomisio ICS y BMZ

Pénfigo paraneoplásico IgA BMZ Dermatosis lineal por IgA IgA ICS Pénligo por IgA

ELISA

IFD sobre muestra de biopsia de piel. IFID sobre e s ó f a g o de mono o cobaya IFD sobre biopsia de piel; IFID sobre esófago de mono ELISA IFID sobre e s ó l a g o de mono IFD sobre biopsia de piel; IFID sobre epitelio de ve|iga de rata IFD sobre biopsia de piel humana. IFID sobre esófago de mono IFD sobre biopsia de piel humana; IFID sobre esófago de mono

AChR = receptor de acetilcolina; BMZ = zona de memprana basal; IFD = microscopía de inmunofluorescencia directa; ELISA • ensayo de inmunoabsorción ligado a onzima; ICS = espacios intercelulares IFID - microscopía de Inmunofluorescencia indirecta; p-ANCA • anticuerpos perinucleares anticiloplasma de neutrófilos; RÍA = radioinmunoensayo. TSH = hormona estimulante de litoides

4. Ir sacando cada portaobjetos por separado del baño de PBS. secar el exceso de líquido de cada portaobjetos, y colocarlos de nuevo en la cámara húmeda. Dispensar en cada pocilio la dilución de conjugado marcado con fluoresceína. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 minutos. No permitir que se sequen los portaobjetos. 5. Lavar los portaobjetos con PBS y azul de Evans como colorante de contraste durante 10 minutos. 6. Montar los cubreobjetos. 7. Observar los portaobjetos al microscopio de fluorescencia. 8. Almacenar los portaobjetos en la oscuridad a 4°C.

PIEL La detección de autoanticuerpos es muy útil en el estudio de las enfermedades cutáneas ampollosas. En pacientes con enfermedades autoinmunes de la piel, los autoanticuerpos incluyen aquellos dirigidos contra la zona de membrana basal (BMZ), los espacios intercelulares (ICS) o los vasos sanguíneos dérmicos, como se recoge en la Tabla 45-2. Se encuentran disponibles algunas revisiones técnicas excelentes que detallan el uso de la inmunofluorescencia para el examen de la piel (Flotte, 1995; Crosby, 1993).

1002

SECCIÓN V

•

INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Tabla 45-2 Enfermedades autoinmunes de la piel H a l l a z g o s inmunológicos esenciales para el diagnóstico Espacios intercelulares epidérmicos Péntigo Pénligo paraneoplásico Zona de membrana basal Penligoide Penligoide gostacional Epidermólisis ampollosa adquirida Dermatosis lineal por IgA Dermatosis ampolloso crónica de la inlancia Papilas dérmicas ± zona de membrana basal Dermatitis herpetilorme Hallazgos inmunológicos útiles para el diagnóstico Manifestaciones cutáneas en enfermedades reumáticas sistémicas Dermatomiositis/polirniosilis Lupus eritematoso Enfermedad mixta del tejido conjuntivo Policondritis recurrente Sindrome de Sjogren Esclerosis sistèmica Vasculitis

tóxica, lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia grave (MG), penligoide y liquen plano. Raramente se observan en individuos sanos ( 3.0 < 3.0 Globulinas séricas totales, globulinas o IgG (x nivel superior normal) >2.0 1,5-2.0 1.0-1.5 1 80 1 80 1.40 1:20 1:10 o 1:20 < 1 10 SMA >1:20 1:20 90%) inferiores a 1:1.000 (Burek, 1995). Para localizar anti-Tg, se realiza una IFID utilizando secciones de tejido criopreservadas de glándula tiroides de mono. Se requiere la fijación para impedir la pérdida de tiroglobulina durante las etapas de lavado. Se describen tres patrones de ¡nmunofluorescencia cuando están presentes los anti-Tg (Burek, 1995): 1) patrón flocular; 2) espacios coloidales en sombra pero fluorescencia periférica brillante; y 3) mareaje difuso, brillante, uniformemente marcado en un patrón de "vidrio molido" atribuido a la reacción de anti-Tg con CA2 (Burek, 1995). CA2, denominado segundo antígeno coloidal, se detecta como único marcador serológico de las tiroiditis autoinmunes en el 5% y el 8% de los pacientes que son positivos por IFID pero negativos para anti-Tg y antiTPO utilizando otros métodos (Bigazzi, 1992).

Autoanticuerpos contra el receptor de la hormona estimulante de tiroides Los autoanticuerpos anti-TSHR constan de dos grupos de autoanticuerpos que pueden tanto estimular como bloquear los TSHR, causando respectivamente hipertiroídísmo o hipotiroidismo. Los autoanticuerpos anti-TSHR que se unen a estos receptores y estimulan la producción de hormonas se denominan inmunoglobulinas estimulantes del tiroides (TSI), mientras que los autoanticuerpos anti-TSHR que se unen a los receptores y bloquean la unión y (unción de TSH se denominan inmunoglobulinas inhibidoras de la unión de TSH (TBII) (Brunt, 1995, fvlooij, 1993). Los TSI son probablemente la causa del hipertiroidismo en la enfermedad de Graves (Bigazzi, 1992; Brunt, 1995: Wilkin. 1990). Su prevalencia varia desde un 55% hasta un 95%, dependien-

do del método de detección (Bigazzi. 1992; Brunt, 1995). Los TSI. que suelen ser de la clase IgG, estimulan la producción de hormonas tiroideas activando el sistema de adenilato ciclasa tras su unión al TSHR (Patrick, 1993). Los ensayos para anti-TSHR son útiles para confirmar la enfermedad de Graves en pacientes hipertiroideos con resultados equívocos en los estudios habituales de laboratorio (Bigazzi, 1992). Adicionalmente, se puede utilizar un ensayo de anti-TSHR para monitorizar la terapia de sustitución hormonal del paciente o para diagnosticar la tirotoxicosis neonatal (Bigazzi, 1992). Existen dos clases principales de ensayos para anti-TSHR, denominados bioensayos y ensayos de unión; los aspectos metodológicos son revisados en otros trabajos (Bigazzi, 1992; Patrick, 1993; Gupta, 1988). Nuevos ensayos con el suero del paciente basados en la estimulación de adenosin monofosfato cíclico (cAMP) en células de tiroides de rata, mantenidas en cultivo tisular, pueden confirmarse como una mejora sobre las dificultades técnicas de los bioensayos (Burek. 1995). Los TSI son analizados en bioensayos que determinan el aumento de actividad mediado por TSHR por la medida del cAMP liberado o bien por la medida de la captación de yodo por células tiroideas mantenidas en cultivo (Brunt, 1995). Los TBII son analizados por la determinación de la inhibición de la unión de TSH marcada radiactivamente a su receptor o utilizando bioensayos con cAMP (Brunt, 1995).

RIÑON

GLOMERULONEFRITIS La glomerulonefritis es la principal causa de enfermedad renal primaria. Se piensa que los mecanismos mediados por inmunidad juegan un papel importante en la patogénesis de la glomerulonefritis, aunque la confirmación experimental de dichos mecanismos autoinmunes aún no ha sido llevada a cabo. La IFD tiene un papel importante en el estudio y diagnóstico de la glomerulonefritis. Los patrones de reactantes inmunes pueden ser divididos a grandes rasgos en aquellos que causan depósitos granulares o lineales en el glomérulo u otras estructuras del riñon examinadas con IFD. Los depósitos granulares se han atribuido a complejos inmunes (IC) que abandonan la circulación o se forman in situ (McCIuskey, 1995). Los patrones de IFD de depósitos inmunes asociados con las principales enfermedades glomerulares se resumen en la Tabla 45-5. Se encuentran disponibles revisiones minuciosas de estos trastornos en varios textos (McCIuskey, 1995; Heplinstall, 1992). Sin embargo, para esta exposición, sólo se presentan en mayor detalle los autoanticuerpos contra la membrana basal glomerular (anti-GBM).

f Tabla 45-5 Hallazgos por ¡nmunofluorescencia directa en las principales enfermedades glomerulares Patrón de ¡nmunofluorescencia y enfermedad Reactivos inmunes Depósitos granulares, mesangiales y en GBM Glomerulonefritis aguda postestreptocócica Nefritis lúpica proliferativa difusa Glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN. tipo I) Glomerulonefritis idiopática en semilunas por complejos inmunes Enfermedad de depósitos densos (MPGN tipo II) Infecciones crónicas (p.ej. endocarditis bacteriana)

C 3 ± IgG difuso, IgM IgG, IgA, IgM, C 3 C 3 , IgG. IgM IgG. C 3 ± IgM C 3 (globular) ± IgM IgG. IgM. C 3

Granulares, predominancia mesangial Nefritis lúpica Mesangial Proliferativa focal Púrpura de Henoch-Schónlein Nelropatía IgA

IgG, C 3 , generalmente IgM e IgA IgG, C 3 , IgA; depósitos focales en el asa capilar Predominantemente IgA; IgG. IgM, C 3 predominantemente IgA: a menudo IgG. IgM. C 3

Granulares, predominantemente GBM Nefritis lúpica membranosa Crioglobulinemia mixta

IgG C 3 . IgA. IgM IgM IgG C 3 , masas mtravasculares

Lineal, en GBM Nefritis por anti-GBM Nefropatía por cadenas ligeras

IgG, C 3 ; IgA e IgM poco frecuentes Generalmente cadena ligera K, tal vez en TBM. vasos sanguíneos, intersticio

GBM = membrana basal glomerular; TBM = membrana basal tubular. Modificado a partir de McCIuskey RT, Collms AB, Niles JL Kmdney. En Colvin RB, Bhan AK, McCIuskey (eds): Diagnoslic Immunopatthology, 2> ed. New York, Raven Press. 1995, pág 109. con permiso. ...

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CAPÍTULO 45

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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS

Enfermedad por anticuerpos contra la membrana basal glomerular La presentación clínica en pacientes con enfermedad por anticuerpos antiGBM varía en cuanto que cerca de un 50% tienen enfermedad limitada al riñon mientras que el otro 50% tiene síntomas tanto renales como pulmonares. Esta última presentación es denominada frecuentemente síndrome de Goodpasture. Raramente los pacientes con enfermedad por anticuerpos antiGBM pueden tener enfermedad limitada a los pulmones (Wilson, 1987). El diagnóstico de la enfermedad por anticuerpos anti-GBM requiere la detección de autoanticuerpos anti-GBM contra el dominio NC1 del colágeno tipo IV (McCIuskey. 1995), el denominado antígeno de Goodpasture. Los métodos para la detección de anticuerpos anti-GBM incluyen IFID. ELISA y radioinmunoensayo (RÍA) (McCIuskey, 1995: Wilson, 1987): algunos investigadores han desarrollado adicionalmente un test sensible de transferencia western (McCIuskey, 1995). Debido a que la IFID es difícil de estandarizar y requiere experiencia para realizarse, los métodos para la detección se han centrado, en lugar de esto, en la validación de RÍA o ELISA cuantitativos. Actualmente se encuentra disponible un kit ELISA con licencia comercial para la determinación de anticuerpos anti-GBM. Este ensayo determina los valores del paciente a partir de una curva estándar y permite dar resultados como rangos negativos, dudosos limitantes o positivos. La mayoría de los pacientes con enfermedad por anticuerpos anti-GBM activa parecen tener valores superiores a 100 unidades. Aunque se pueden obtener valores dudosos limitantes tanto en enfermedad por anticuerpos anti-GBM activa como latente, también hemos observado estos valores en pacientes con trastornos renales que no son enfermedad por anticuerpos anti-GBM. La coexistencia de anticuerpos contra el citoplasma de neutródlos (ANCA) ha sido documentada en algunos pacientes con glomerulonefritis rápidamente progresiva (RPGN) (McCIuskey, 1995). La coexistencia de estos dos autoanticuerpos varía desde un 0% hasta 40% de los pacientes con RPGN. lo que se acompaña por alguna evidencia de que la presencia de ANCA en pacientes con enfermedad por anticuerpos anti-GBM proporciona un pronostico renal mejor (McCIuskey, 1995).

GLÁNDULA SUPRARRENAL Enfermedad de Addison La insuficiencia adrenocortical crónica no tuberculosa, o enfermedad de Addison, tiene una prevalence estimada de entre З у б casos por 100.000 personas (Muir, 1993). Del 65% al 70% de estos pacientes tienen autoanti­ cuerpos circulantes contra los microsomas y la membrana plasmática de las células adrenocorticales. demostrable utilizando IFID sobre secciones congeladas de corteza adrenal humana (Patrick, 1993; Burek. 1995; Muir. 1993). La 21 -hidroxilasa y la 17-t/hidroxilasa son dos autoantigenos que se han identificado como reactivos con autoanticuerpos adrenocorticales (Song, 1994). No se han encontrado autoanticuerpos adrenocorticales en la enfermedad de Addison causada por tuberculosis u otros agentes exógenos (Patrick, 1993). De manera destacable, cerca del 45% de los individuos asintomáticos con autoanticuerpos adrenocorticales desarrollan trastornos de la función adrenocortical en 2,5 años tras la identificación del autoanticuerpo (Muir, 1991). La enfermedad de Addison asociada con autoanticuerpos es la que se diagnostica más frecuentemente en personas entre 20 y 50 años y es de dos a tres veces más frecuente en mujeres cuando se diagnostica después de los 30 años (Patrick. 1993; Muir. 1993). Las pruebas de laboratorio muestran acidosis metabólica. hiperpotasiemia. hiponatremia y bajos niveles de cloruro y bicarbonato séricos. Los niveles de Cortisol plasmático están disminuidos y los niveles de hormona adrenocorticotropa elevados (VanArsdel, 1993). Consecuentemente, la terapia consistirá en el reemplazo de glucocorticoides y mineralocorticoides (Patrick, 1993). La enfermedad de Addison asociada con autoanticuerpos puede ocurrir por sí misma, pero es más común que esté acompañada por otras enfermedades autoinmunes como parte de un síndrome autoinmune poliglandular (APS) (Muir. 1993). Estas enfermedades acompañantes pueden incluir tiroiditis autoinmune. anemia perniciosa o diabetes mellitus insulino-dependiente (Patrick, 1993).

1011

Además de los autoanticuerpos adrenocorticales. se han detectado otros autoanticuerpos en pacientes con enfermedad de Addison, incluyendo autoanticuerpos contra las células esteroideas y autoanticuerpos que se unen a los receptores de la hormona adrenocorticotropa (Muir, 1993).

PÁNCREAS Diabetes mellitus (véase Cap. 11) Diabetes mellitus es el término diagnóstico aplicado a un grupo de trastornos metabólicos que comparten la hiperglucemia como nexo común (Eisenbarth, 1995). El que la DM sea un diagnóstico serio está documentado por el hecho de que las complicaciones agudas y crónicas multiorgámcas justifican un 15% del total del gasto económico del sistema sanitario en EE.UU. (Schatz, 1995). Sin embargo, se ha hecho un progreso significativo en el cuidado de los pacientes diabéticos gracias al conocimiento de que un control agresivo de la glucosa en sangre disminuye el riesgo de desarrollo y progresión de complicaciones vasculares (Schatz, 1993).

Subtipos

clínicos

Existen dos subgrupos principales de DM: el tipo 1. DM msulino-dependienle (DMID); y el tipo 2, DM no insulino-dependiente (NIDDM) (Eisenbarth, 1995). La DM tipo 2 ocurre con más frecuencia en individuos obesos mayores de 30 años. Estos pacientes tienen insulina plasmática, pero en concentración insuliciente para prevenir la hiperglucemia (VanArsdel. 1993). Algunos pacientes tipo 2 tienen autoanticuerpos asociados a insulina en su suero (VanArsdel, 1993). Los pacientes tipo 2 carecen de la mayoría de las otras características autoinmunes observadas en pacientes tipo 1, aunque la diferencia entre tipo 1 y tipo 2 no siempre es tan fácil (Eisenbarth, 1995). Los pacientes tipo 2 se tratan por medio del control del peso y con medicaciones que estimulen la producción de insulina (VanArsdel, 1993). La DM tipo 1 se considera una enfermedad autoinmune crónica que aparece en individuos genéticamente susceptibles y está causada por la destrucción de las células p productoras de insulina en los islotes de Langerhans pancreáticos (Harrison, 1990). Esta destrucción de las células |5 da lugar con el tiempo a una deficiencia de insulina e hiperglucemia crónica. En los Estados Unidos, la DMID aparece en 1 de cada 300 personas (esto es, una incidencia media anual de 15 por 100.000 personas) (Eisenbarth, 1995). Existe un sólido soporte para concluir que la DMID es una enfermedad crónica autoinmune (Harrison, 1990; Eisenbarth, 1995: Schatz, 1995). La detección de autoanticuerpos circulantes precediendo a la manifestación clínica de DMID refuerza esta conclusión y proporciona una información importante respecto a la evolución natural de la DMID y la capacidad para predecir su aparición (Schatz. 11995). Los principales tipos de autoanticuerpos circulantes en DMID son los siguientes: autoanticuerpos contra las células de los islotes, autoanticuerpos contra el ácido glutámico descarboxilasa, autoanticuerpos contra insulina y autoanticuerpos asociados a insulinoma-2 y 2|i.

Autoanticuerpos contra las células de los islotes La IFID es el método clásico para la detección de anticuerpos contra las células de los islotes (ICA) (Atkinson, 1993). Se utilizan secciones congeladas de páncreas humano como tejido de sustrato para detectar fluorescencia citoplasmática, finamente granular y especifica en todas las células de los islotes pancreáticos (Fig. 45-10). Se recomienda sangre humana del grupo O como sustrato para reducir las interferencias de fondo no específicas debidas a isohemaglutininas ABO. Utilizando IFID, los ICA son detectables en cerca del 80% de los pacientes con DMID delectada de novo, entre el 3% y el 4% de parientes no diabéticos de pacientes con DMID. y sólo en el 0.5% de sujetos clínicamente normales (Atkinson, 1994). Los ICA consisten en autoanticuerpos que incluyen aquellos específicamente reactivos con autoanticuerpos contra la descarboxilasa de ácido glutámico (GADA), asi como aquellos que son ICA reactivos con anticuerpos no GADA (Atkinson, 1993; Kaufman, 1992).

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGIA

identificar individuos con riesgo de DMID está siendo evaluado para determinar la necesidad de estudios metabólicos que aseguraren la intolerancia a la glucosa subclinica y demanda de inmunoterapia en la fase preclinica de la DMID (Maclaren, 1992). La determinación de GADA utilizando ELISA puede mejorar finalmente la viabilidad de la difusión del cribado de este autoanticuerpo. Además de los autoanticuerpos sobre los que se ha disculido antes, los pacientes con DMID también pueden tener autoanticuerpos anti-TPO, contra células parietales y anti-adrenocorticales, por lo que debe realizarse un cribado de estos autoanticuerpos en pacientes con DMID al menos una vez (Maclaren. 1992).

TRACTO GASTROINTESTINAL Figura 45-10. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos contra las células de los islotes utilizando como sustrato páncreas humano de grupo sanguíneo O (x 400).

Anemia perniciosa La anemia perniciosa (PA) se caracteriza por aclorhidria rápida resistente a histamina, hipergastrinemia y déficit de vitamina B (Brown, 1995). El comienzo gradual de los síntomas neurológicos y el desarrollo de anemia megaloblástica son características típicas del curso clínico de PA (Patrick, 1993). Morfológicamente, la biopsia de mucosa del cuerpo del estómago contiene evidencias de grastritis atrófica crónica. tt

Los ICA deben ser titulados en las unidades de la Juvenile Diabetes Foundation (JDF) en referencia a un suero estándar de 80 unidades del Immunology of Diabetes Workshop; títulos superiores a 20 unidades JDF parecen tener significado pronóstico (Maclaren, 1992). Se encuentran disponibles ensayos comerciales para ICA con sustrato de primate.

Autoanticuerpos contra insulina Se han identificado autoanticuerpos contra insulina (IAA) en cerca del 50% de los pacientes con DMID en el momento del diagnóstico y antes de empezar con la terapia insulínica (Atkinson, 1994). Los IAA se suelen determinar utilizando ensayo de radioinmunoprecipítacíón competitiva técnicamente exigente. Este ensayo no puede distinguir entre IAA de aparición espontánea de aquellos que aparecen como resultado de la terapia con insulina. Por tanto, se debe realizar el ensayo para IAA antes de que la insulina sea administrada.

Autoanticuerpos contra la descarboxilasa de ácido glutámico Los GADA se detectan en la mayoría de pacientes recién diagnosticados de DMID y en cerca del 80% de parientes de primer grado, prediabétícos, de pacientes con DMID (Hagopian, 1993. Schatz, 1995). Los dos autoantígenos GAD, clasificados por peso molecular, se denominan GAD65 y GAD67 (Atkinson, 1993). Los GADA en pacientes con DMID son dirigidos en primer lugar contra la isoforma GAD65, que se encuentra principalmente en los islotes pancreáticos y en el sistema nervioso central (SNC), donde actúa como una enzima responsable de la formación del neurotransmisor inhibidor ácido y-aminobutírico (Barmeier, 1992; Luhder, 1994; Maclaren. 1988; Kaufman. 1992). La forma GAD67 predomina en los nervios periféricos (Falorni, 1994; Atkinson. 1993).

La PA está asociada con autoanticuerpos circulantes contra células parietales (APC) en el 90% de los pacientes y contra el factor intrínseco (anti-IF) en entre el 60% y 75% de los pacientes, aunque los anti-IF pueden ser más específicos para PA(Burek. 1995; Brown, 1995). Los APC son detectados por IFID llevada a cabo sobre bloques de tejido de estómago/riñón de ratón. Este bloque de tejido combinado permite la identificación del mareaje específico de células parietales cuando no hay mareaje concomitante de túbulos renales como se vería en presencia de AMA(Fig. 45-11). Los anti-IF son detectados más frecuentemente por RÍA. De los dos tipos conocidos de anti-IF, los anti-IF tipo 1, o autoanticuerpos bloqueantes, impiden la unión de IF a la vitamina B. , y los de tipo 2, o autoanticuerpos de unión, reaccionan con la vitamina B, libre o complejada para inhibir la acción de IF (Karen. 1994; Patrick, 1993). Los anti-IF tipo 1 están considerados más sensibles y específicos para el diagnóstico de PA (Karen, 1994). Sin embargo, la identificación de APC o de anti-IF no es necesaria para el diagnóstico de PA, La PA puede ocurrir en asociación con otras enfermedades autoinmunes como la liroiditis autoinmune o enfermedad de Addison y puede formar parte tanto de APS 1 como de APS 2 (Patrick, 1993). ;

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Enteropatía sensible al gluten La enteropatía sensible al gluten (GSE), o esprúe no tropical, es una enfermedad del intestino delgado caracterizada por malabsorción de la grasa gastrointestinal, que puede estar infradiagnosticada en Estados Unidos

Los GADA también están asociados al raro síndrome del hombre rígido (Eisenbarth, 1995). De manera a destacar, un alto porcentaje de estos pacientes tiene DMID.

Interpretación y utilidad clínica de los autoanticuerpos en DMID Los autoanticuerpos ICA. GADA, IAA e IA-2 se usan frecuentemente como marcadores predíctivos para DMID. Los ICA son un marcador específico asociado con un riesgo elevado de desarrollar DMID, pero los ICA no persisten. Los GADA se detectan generalmente antes del diagnóstico de DMID y generalmente disminuyen su titulo tras el comienzo de la clínica de DMID (Schatz, 1994). Los GADA e IA-2, tanto separados como juntos, parecen ofrecer la mejor utilidad predictiva para el cribado (Schatz, 1995). La identificación de autoanticuerpos contra los islotes puede ser utilizada para confirmar la autoinmunidad en pacientes con DMID aguda, lo que diferencia la DMID de tipo 1 de la de tipo 2. El uso de estos marcadores para

Figura 45-11. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos contra células parietales gástricas utilizando estómago/riñón de ratón como suslralo (x 400).

CAPÍTULO 45

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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECÍFICAS

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(u-BTx) en RÍA competitivo para medir las diferentes formas de anti-AChR (Barna. 1995). La M-BTX es una proteina de veneno de serpiente que se une irreversiblemente a AChR, pero se une al receptor de Ach en un sitio diferente del lugar de unión de los anti-AChR (Rose, 1995). Los AChR se obtienen a partir de extractos de músculo esquelético humano denervado, como puede ser a partir de amputaciones diabéticas, o a partir de cultivo tisular. Para la determinación, se marcan los AChR con u-BTx y después son incubados con el suero del paciente para permitir que cualquier autoanlicuerpo anti-AChR presente se una a los AChR en los sitios cercanos al lugar de unión de u-BTx. Tras la incubación, los complejos radiomarcados son precipitados por inmunoglobulina anti-humana polivalente, y se procede a detectar la radiactividad en el precipitado lavado, después de la corrección de las uniones inespecíficas. El grado de radioactividad en el precipitado es directamente proporcional a la cantidad de anti-AChR en el suero del paciente.

Figura 45-12. Inmunofiuorescencia indirecta de autoanticuerpos IgA contra endomisk) utilizando estómago de mono como sustrato (x 400)

(Ferguson, 1997). La hipersensibilidad al gluten, o derivados del gluten, es la causa de GSE (Brown, 1995). La biopsia de intestino delgado de un paciente con GSE es anormal de forma variable, pero los cambios característicos incluyen la atrofia vellosilaria, elongación de las criptas, lintocitos intraepiteliales y mitosis en las criptas. Los pacientes con GSE manifiestan varias alteraciones inmunes humorales. Es interesante que los niveles de IgA en suero están generalmente elevados en pacientes con GSE, excepto en aquellos con un déficit de IgA, lo que ocurre en pacientes con GSE más frecuentemente que en individuos normales (Brown, 1995). Los pacientes con GSE pueden tener autoanticuerpos IgA circulantes antiendomisio, antireticulina o antigliadina. Los autoanticuerpos IgA antiendomisio se detectan por IFID utilizando esófago de mono como tejido sustrato (Fig. 45-12). La transglutaminasa tisular (ttg) es probablemente el autoantígeno del endomisio (Dietench. 1997). Su identificación está considerada sensible y específica para el diagnóstico de GSE o bien GSE asociada con DH (GSE-DH) (Talal, 1997). La medición del título de autoanticuerpo IgA antiendomisio puede ser utilizada para monitorizar la adherencia de un paciente a una dieta libre de gluten (Karen, 1994). Los autoanticuerpos antirreticulina son detectados por IFID sobre un bloque de tejido combinado de estómago/riñón de ratón. Estos autoanticuerpos son detectables en adultos (40%), asi como en niños (60%) con GSE y también en adultos con GSE-DH (20%). Sin embargo, los autoanticuerpos antirreticulina no son específicos para el diagnóstico, pudiendo estar presentes también en pacientes con enfermedad de Crohn, miastenia gravis, síndrome de Sjógren. y otras enfermedades del tejido conectivo. Los anticuerpos antigliadina son deteclados por ELISA en casi todos los pacientes con GSE o GSE-DH (Brown, 1995). El antígeno diana, la gliadina, se purifica a partir de gluten y es utilizado en la fase sólida del ELISA para detectar estos autoanticuerpos. Como los autoanticuerpos IgA antiendomisio, los autoanticuerpos antigliadina pueden ser utilizados para monitorizar la adherencia de un paciente a una dieta sin gluten.

SISTEMA NERVIOSO Miastenia graves La MG es un trastorno neuromuscular caracterizado por debilidad muscular asociada al ejercicio, fatiga y presencia de autoanticuerpos contra el receptor de acetilcolina (anti-AChFt). El AChFt, localizado en las membranas postsinápticas de las fibras musculares esqueléticas, une acetilcolina (ACh) que proviene de las terminaciones nerviosas, lo cual causa una contracción muscular cuando se ha liberado una cantidad suficiente de Ach (Naparstek, 1993: Rose. 1995). Los autoanticuerpos anti-AChR interfieren en esta función neuromuscular, provocando debilidad muscular y fatiga. Los autoanticuerpos anti-AChR se detectan en casi el 90% de pacientes con MG (Rose. 1995). Se utiliza u-bungarotoxina marcada radiactivamente

Se pueden utilizar modificaciones de este ensayo de unión para identificar autoanticuerpos anti-AChR bloqueantes y moduladores. En un ensayo de bloqueo, se permite que el suero del paciente, que contiene anti-AchR. incube con AChR antes de la adición de a-BTx. La base de esta técnica es la premisa de que los anti-AChR capaces de bloquear la unión de r/.-BTx también bloquean la unión de Ach a AChR (Rose. 1995). La cantidad de radiactividad en el precipitado es, por tanto, inversamente proporcional a la cantidad de anti-AChR en el suero del paciente. Se piensa que los autoanticuerpos anti-AChR moduladores aceleran la degradación de AChR, pero su determinación en el laboratorio clínico es técnicamente difícil y no está ampliamente instaurada.

Esclerosis múltiple La MS es una enfermedad desmielinizante relativamente corriente que involucra a la sustancia blanca del cerebro y la médula espinal. La MS ocurre más frecuentemente en mujeres que en hombres (razón de 2:1) y se manifiesta generalmente durante las primeras etapas de la edad adulta con una amplia variedad de manifestaciones clínicas posibles. Cerca del 50% de estos pacientes experimenta periodos alternantes de enfermedad activa y remisiones, mientras que el resto sigue un curso progresivo crónico (Steinman, 1993; McFarland, 1995). El diagnóstico de MS deriva de los hallazgos clínicos y la exclusión de cualquier otro trastorno. Aunque la causa de MS es desconocida, se considera a los mecanismos autoinmunes como importantes en la patogénesis de esta enfermedad (McFarland, 1995). Sin embargo, no hay ningún autoanlicuerpo circulante lo suficientemente característico en la MS como para ser aceptado como diagnóstico en las determinaciones de rutina del laboratorio clínico. Sin embargo, el examen de laboratorio de liquido cefalorraquídeo (LER) proporciona información importante que ayuda al diagnóstico de MS en un marco clínico apropiado (Barna, 1987). La síntesis de IgG se incrementa anormalmente en el SNC de pacientes con MS, de tal forma que la determinación del índice de IgG y la tasa de síntesis de IgG proporciona resultados útiles, pero no específicos (McFarland, 1995; Zweiman, 1991; Karen. 1994: Valenzuela. 1987). La determinación de bandas oligoclonales en el LCR es también útil en un marco clínico apropiado, ya que son identificadas en más del 90% de los pacientes con MS: sin embargo, su presencia no es especifica, puesto que pueden ser detectadas en pacientes con diversos trastornos como neurosífilis, vasculitis SNC, enfermedad de Lyme. panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Guillain-Barré y neoplasias (Karen, 1994). La electroforesis de proteínas séricas también debe realizarse para asegurar que las bandas oligoclonales del LCR no son debidas a filtración en el LCR desde el suero. Las bandas oligoclonales en el LCR se determinan generalmente por electroloresis de alta resolución en gel de agarosa con LCR concentrado (Karen. 1994).

Neuropatías El centro de la atención más reciente es un grupo de síndromes neurológicos que afectan tanto al SNC como al sistema nervioso periférico y están asociados con autoanticuerpos (Naparstek. 1993). Estos autoanticuerpos son detectados por ELISA. IFID o inmunohistoquímica. La importancia de la iden-

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

tílicación de dichos autoanticuerpos se incrementa indudablemente si los estudios clínicos correlacionan su presencia con una enfermedad particular o un beneficio terapéutico. Sin embargo, hasta la fecha, estos autoanticuerpos no son específicos de una enfermedad y pueden incluso aparecer después de un trauma al sistema nervioso. Los autoanticuerpos contra componentes primarios neurales incluyen aquellos contra proteínas neuronales o contra gangliósidos neuronales (Zeballos, 1992).

Autoanticuerpos contra proteínas neuronales Un subgrupo de pacientes con degeneración cerebelosa paraneoplásica (PCD) tienen autoanticuerpos anti-Yo que generalmente son detectados al mismo tiempo que es descubierta la neoplasia maligna. Los anti-Yo son detectables como fluorescencia citoplasmática en las células de Purkinje utilizando IFID sobre tejido cerebeloso humano. La identificación de anticuerpos anti-Yo en un paciente sin malignidad conocida debe iniciar una evaluación minuciosa en busca de una neoplasia maligna (Zeballos, 1992). Los anticuerpos anti-Ri son autoanticuerpos específicos de neurona, cuya identificación parece limitada a pacientes con carcinoma de mama y opsoclonus paraneoplásico (Zeballos. 1992). Los anti-Ri son caracterizados por fluorescencia en el núcleo neuronal por IFID. Los anticuerpos anti-Hu también son visibles como fluorescencia nuclear neuronal con IFID. Estos autoanticuerpos pueden ser identificados en pacientes con carcinoma de pulmón de células pequeñas y encefalomíelitis paraneoplásica (Zeballos, 1992).

Autoanticuerpos contra gangliósidos neuronales Los gangliósidos son componentes glicolipídicos que se encuentran en las membranas extemas de las células nerviosas periféricas (Naparstek, 1993). Las neuropatías motoras periféricas pueden producirse en pacientes con gammapatías monoclonales IgM, cuya paraproteína IgM reacciona con los gangliósidos GM. o GD,„ (Zeballos, 1992). Aunque los anticuerpos anti-GM, o anti-GD„ pueden ser identificados en una amplia variedad de síndromes neurológicos, su presencia en altos títulos es más característica de enfermedad de neurona motora que otras alternativas (Zeballos, 1992).

OTROS ÓRGANOS Corazón Autoanticuerpos

contra

miocardio

Los autoanticuerpos contra miocardio se han descrito como parte de varias condiciones que dañan el músculo estriado cardíaco, incluyendo infarto de miocardio, después de cirugía cardiaca, y miocardiopatía, aunque su identificación puede ayudar a diferenciar la miocardiopatía mediada por inmunidad de otras causas de miocarditis (Naparstek, 1993; Burek, 1995). Se utiliza la IFID sobre secciones congeladas de corazón de mono para detectar autoanticuerpos contra miocardio. El mareaje específico de miocardio también puede determinarse excluyendo la reactividad de músculo esquelético no cardíaco. Desgraciadamente, los AMA o autoanticuerpos heterófilos pueden causar mareaje fluorescente que puede ser confundido con el que es debido a autoanticuerpos contra miocardio.

Músculo Autoanticuerpos contra músculo esquelético Los autoanticuerpos contra músculo esquelético tienen una aplicación clínica limitada. Se pueden observar títulos bajos (1:60) de autoanticuerpos contra músculo esquelético en pacientes con MG. los ensayos de anti-AChR tienen mayor utilidad clínica en el diagnóstico o monitorización de MG. Los autoanticuerpos contra músculo esquelético se detectan por IFID sobre secciones congeladas de músculo esquelético de los muslos de mono.

RESUMEN Los autoanticuerpos tienen un papel importante en el estudio de las enfermedades autoinmunes organoespecíficas. La detección de dichos autoanticuerpos puede ser importante en el diagnóstico de algunas enfermedades autoinmunes organoespecíficas, como la enfermedad de Graves, pero más a menudo sirven como soporte más que como elemento esencial para el diagnóstico. De manera similar, aunque algunos de estos autoanticuerpos están directamente involucrados en la patogénesis de una enfermedad, por ejemplo el pénfigo. a menudo su presencia es un marcador de daño inmunológico subyacente atribuible a otro mecanismo de enfermedad, como es el caso de la DMID. Técnicas más recientes de biología molecular han revelado y continuarán haciéndolo, la naturaleza específica de muchos antígenos diana de estos autoanticuerpos. Se espera que este trabajo llegue a elucidar los mecanismos de enfermedad subyacentes, permitiendo la mejora de las pruebas diagnósticas y. tal vez. de nuevas direcciones en las terapias. Los avances técnicos en los ELISA han hecho de ésta una tecnología asequible para la mayoría de los laboratorios clínicos, de manera que muchos ensayos para la determinación de autoanticuerpos específicos de órgano se encuentran disponibles donde la IFID no es factible.

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CAPITUIO 45

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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECIFICAS

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MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA

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Regulación de la síntesis de IgE: influencias genéticas e interacciones celulares Características estructurales de la IgE

Anticuerpos IgE alérgeno-específicos: métodos de determinación, calificación de resultados y utilidad clínica Pruebas para mediadores de reacciones de hipersensibílídad inmediata y para anticuerpos IgE alérgeno-específicos

Liberación de mediadores desde las células efectoras sensibilizadas a IgE EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES ALÉRGICAS

Proteína IgE: métodos de determinación, valores normales y utilidad clínica

BIBLIOGRAFÍA

1026

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La prevalencia global de enlermedades alérgicas en los Estados Unidos excede el 20%, y los síntomas y signos de la alergia son con frecuencia difíciles de distinguir clínicamente de otras etiologías (Huang. 1993). Por estas razones, los médicos con frecuencia consideran la alergia (hipersensibilidad inmediata) como una posible etiología de enfermedad en pacientes que se presentan con diversos signos y síntomas. Cuando se seleccionan apropiadamente, las pruebas de laboratorio son útiles para evaluar pacientes con enfermedades alérgicas, pero el conocimiento de los mecanismos básicos de la hipersensibilidad inmediata y el conocimiento de las relaciones empíricas entre los resultados de las pruebas y su valor diagnóstico predictivo son necesarios para optimizar la eficacia de las pruebas de laboratorio. Este capítulo aborda estos lemas, empezando con una perspectiva general de los mecanismos básicos de la hipersensibilidad inmediata y procediendo a una descripción detallada de las pruebas de laboratorio aplicadas a los modos de cribado y diagnóstico para evaluar diferentes tipos de enfermedades alérgicas. Se ha hecho una mención específica de las aplicaciones de las pruebas de laboratorio que no son rentables o que pueden conducir a conclusiones clínicas incorrectas.

MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA Regulación de la síntesis de IgE: influencias genéticas e interacciones celulares Las investigaciones básicas a linales de los años 60 conducen a la descripción de una clase distinta de inmunoglobulinas en humanos, la inmunoglobulina E (IgE). con potentes propiedades reactivas (sensibilidad cutánea) (Ishizaka, 1966a. 1966b, 1966c). Este resultado marcó el comienzo de la era actual de investigación en cuanto a los mecanismos moleculares de las enfermedades alérgicas. Hasta ahora, se sabe mucho sobre los procesos que acontecen dentro de las membranas celulares de las células efectoras sensibilizadas por IgE, que conducen a la liberación de mediadores vasoactivos. Estos mediadores causan directamente los signos y síntomas de la enfermedad alérgica (véase más adelante). Las investigaciones en este tema se han

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enfocado considerablemente en dos áreas: estudios dirigidos al descubrimiento de genes que influyen en el desarrollo del fenotipo alérgico, y estudios celulares y moleculares dirigidos al descubrimiento de mecanismos genéticos y biológicos que influyen en la síntesis y secreción de la proteína IgE y los anticuerpos IgE. Como el nivel de la proteína IgE en sangre se correlaciona fuertemente con la presencia de signos y síntomas de enfermedad alérgica, estas dos áreas de investigación se solapan. Es bien sabido que las influencias genéticas afectan a la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad alérgica (Meyers. 1998). Los individuos predispuestos genéticamente a menudo se conocen como atópicos, un sinónimo para el fenotipo alérgico clínico. Los resultados de los estudios epidemiológicos genéticos sugieren que los niveles en suero de la proteína IgE están influidos por lo menos por dos genes, y esa herencia recesiva o codominante de alelos (aún no definida) sobre esos locus influye en el nivel basal de la proteína IgE en suero (Meyers, 1991). El fenotipo IgE elevado está caracterizado por niveles de proteína IgE en suero varias veces mayor que el fenotipo IgE bajo (Martínez. 1994). Como es lógico, los niveles elevados de IgE en suero se asocian a un fenotipo alérgico con aumento en la prevalencía de enfermedades alérgicas, particularmente el asma. A nivel estructural, se han propuesto varios genes candidatos que podrían actuar para determinar el fenotipo alérgico (Tabla 46-1). Los estudios analíticos de enlace han identificado las localizaciones aproximadas de estos genes candidalos a nivel cromosómico. y los estudios posicionales de clonación corroboran la relación de los genes putativos con genes conocidos para moléculas mmunorreguladoras incluyendo receptores de citocina, antigenos leucocitos humanos y factores de transcripción nucleares (Caraballo. 1999). Una región del cromosoma 5q incluye genes de diversas atocinas que se sabe influyen en la producción de IgE por células inmunocompetentes o reactividad bronquial incluyendo interleucma (IL)-3. IL-4. IL-5. IL-9 e IL-13 y el receptor (5-adrenérgico. respectivamente (Caraballo. 1999). El cromosoma 6p contiene el complejo del antígeno leucocitario humano (HLA) (véanse Caps. 40 y 41). Diversos haplotipos HLA están asociados con el fenotipo alérgico, más marcadamente con el HLA-DR específico y haplotípo DQ. Los productos genéticos de estos locus juegan un importante papel en la determinación de respuestas inmunes a proteínas alergénicas a través de un papel en la presentación del antigeno (véase mas adelante). Otros diversos cromosomas contienen genes que pueden jugar un papel en determinar el fenotipo alérgico: el cromosoma 11q contiene un gen para el receptor de alta afinidad de IgE (F B|. el cromosoma 12q contiene genes para interferón-yy el factor de ere-

CAPÍTULO 46

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ENFERMEDADES ALÉRGICAS

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El modelo descrito anteriormente explica los mecanismos comunes que provocan la síntesis de anticuerpos específicos IgG e IgE. pero ciertos mecanismos son particularmente pertinentes para la respuesta de IgE. Estos mecanismos originan la expansión clonal de linfocitos B-lgE y el cambio de isotipo con la expresión de transcnptores maduros más que de líneas germinales. Los linfocitos B requieren por lo menos de dos señales activadoras para iniciar la síntesis de anticuerpos específicos (Vercelli. 1989a). Una señal es emitida como resultado de una interacción afín entre células T complementarías y linfocitos B que muestran los antígenos procesados. Estos linfocitos B, sin embargo, requieren de señales adicionales para iniciar la transcripción del C Í ' mRNA reordenado. En el caso de las IgE. se emiten señales importantes por IL-4 e IL-13. citocinas producidas por un subpoblación de linfocitos Th. Sin embargo, estas señales solas no son suficientes para inducir la síntesis de anticuerpos IgE maduros. cimiento basotilo. y el cromosoma 14q contiene genes para el receptor antigeno de células T y NF-KB1 (Caraballo. 1999). Se necesitan estudios adicionales para determinar la extensión del polimorfismo de estos locus y los efectos de diferentes alelos de estos locus candidatos sobre el fenotipo alérgico. La habilidad de un individuo de responder a un anlígeno exógeno sintetizando anticuerpos específicos está determinada genéticamente por genes de la región HLA-D (véase Cap. 40). Los productos genéticos de estos locus altamente polimórficos —moléculas de DR, DQ y DP de células presentadoras de antigenos— son responsables del proceso de unión al antígeno procesado para presentarlo a los linfocitos T inmunocompetentes. e iniciando por tanto una respuesta de anticuerpos (Bach. 1985; Korman, 1985; Trowsdale. 1985). La síntesis de anticuerpos específicos (incluyendo IgE) para antígenos Tdependientes resulta de una sene de interacciones celulares que incluye la señal relacionada (contacto célula a célula) y no relacionada entre células. Varios pasos están implicados. Inicialmente. el antígeno es metabolizado por una célula presentadora del antígeno, por ejemplo, una célula dendrítica o macrófaga, y el antigeno "procesado" se muestra en la superficie de la célula en una hendidura configurada para el antígeno constituida por moléculas superficiales de la región HLA-D y Iragmentos procesados de un antigeno nativo. La interacción afín entre el complejo antígeno procesado-HLA-D de una célula presentadora del antígeno y los receptores antígenos específicos en una población complementaria de linfocitos T colaboradores/inductores (células Th) origina la activación de las células Th, secreción de citocinas y expansión clonal de la respuesta de los linfocitos (Unanue. 1987). El mismo antigeno puede estar unido a anticuerpos expresados constitutivamente en las membranas plasmáticas de linfocitos B específicos de antígeno; y estas células que procesan el antígeno internalizando el complejo antígeno-anticuerpo también son capaces de metabolizar y presentar el antígeno procesado. De nuevo, después de la interacción afín y la secreción de citocinas. se produce una expansión clonal de linfocitos B antígeno-específicos seguida de la síntesis y secreción de anticuerpos específicos (Fig. 46-1).

Figura 46-1. Interacciones reconocidas y no reconocidas de células presentadoras de antigenos (APC). Células T colaboradoras /inductoras y células B originan la activación y la expansión clonal de las células IgE-B (véase texto para explicación).

La IL-4. junto con IL-13. IL-3 e IL-5, se produce por un subpoblación de linfocitos T llamadas células T2 (Mosmann. 1986: Parronchi. 1991) Los electos de IL-4 e IL-13 son antagonizados por el interferón-y. que junto con la IL-2 se produce en una segunda subpoblación de linfocitos T llamadas células TI. Los productos de citocina de esas dos subpoblaciones T influyen de forma opuesta en la síntesis de IgE. Otras citocinas también influyen en la síntesis de IgE (véase Cap. 39). Las citocinas IL-5 e IL-6 originan la síntesis de anticuerpos IgE por linfocitos B comprometidos, pero ninguna es suficiente para emitir un señal "activadora" para desviar un isotipo relacionado con la producción de transcriptores C, reordenados (Vercelli. 1989b). Como se anotó previamente, en el curso de una respuesta inmune caracterizada por la producción de anticuerpos IgE. los linfocitos B deben diferenciarse a células plasmáticas que producen más IgE que IgM (o IgD). Este proceso, llamado desviación de isotipo. incluye el reordenamiento de los genes inmunoglobulinas a nivel del ADN. No se conocen todos los mecanismos asociados a la desviación del isotipo. pero se conocen mejor muchos de los requerimientos para la desviación del IgE. Un elemento importante es el ajuste del CD40 a los linfocitos B por el ligando CD40 en los linfocitos T. Si no existe ajuste del CD40, los linfocitos B expuestos a IL-4 e IL-13 en presencia de las células presentadoras de antígenos y los linfocitos T producirán transcriptores C, de la línea germinal. Los esludios experimentales sugieren que los efectos del ajuste de CD40 están mediados intraceluiarmente por la familia Src de tirosina cinasas. que están implicadas en distintos niveles de la activación transcripcional (Vercelli. 1998)

Características estructurales de la IgE La primera evidencia de que los anticuerpos IgE humanos poseen actividad reagínica y son diferentes de otras inmunoglobulinas fue de los Ishizakas (Ishizakas, 1966a, 1966b, 1966c). Estos investigadores cultivaron antisuero de ratón con una fracción aislada de inmunoglobulina rica en reagina aislada del suero de un paciente atópico. Después de la absorción con inmunoglobulinas purificadas de todos los isótopos conocidos (IgG. IgA. IgM e IgD), el antisuero aún reaccionaba con la globulina-y. presente en el suero de pacientes alérgicos. Después de la inmunoprecipitación con este antisuero, se suprimió la actividad sensibilizadora cutánea del suero de diferentes pacientes atópicos La evidencia definitiva de la singularidad inmunoquimica y la actividad reagínica de IgE fue obtenida algo tarde cuando se descubrió que las proteínas del mieloma humano reaccionaban con el antisuero antes mencionado (Bennich. 1969). Los experimentos realizados con fragmentos de inmunoglobulina aislados preparados por digestión enzimática de proteínas IgE de mieloma indicaron definitivamente que la actividad sensibilizadora cutánea requería de una región F, intacta y que los determinantes antigénicos únicos para moléculas de IgE se encontraban en el fragmento F, (Bennich, 1969). Las propiedades fisicoquímicas y las funciones inmunologicas de diferentes regiones de la molécula IgE. determinadas por experimentos llevados a cabo con proteínas IgE de mieloma humano purificadas y fragmentos de inmunoglobulina preparados por digestión enzimática. están resumidas en la Tabla 46-2. La estructura de la IgE humana se muestra en un diagrama en la Figura 46-2. Los anticuerpos IgE humanos sensibilizan la piel para liberar histamina, un fenómeno llamado anafilaxis cutánea pasiva. La actividad sensibilizadora

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

eos IgE de superficie celular (homocitotrópica). receptores de alta almidad para IgE (F , Rl) localizados difusamente en las membranas plasmáticas de las células efectoras. La unión de los anticuerpos IgE a F, Rl es reversible pero de muy alta afinidad (K = 10" M ') (Wank, 1983). Mientras que los anticuerpos IgE en sangre tienen una vida media de sólo dos o tres días, la vida media de los anticuerpos IgE en la piel delimitados por F„ Rl en mastocitos se estima que es superior a los 10 días. Se eslima que el número de receptores por célula oscila entre 40.000 y 500.000. Mayores números de receptores se encuentran en cultivos de basófilos en presencia de IgE, posiblemente reflejando la sobrerregulación de F., Rl expresada por IgE. F, Rl es un receptor multimétnco. compuesto por subunidades a, |i. y y como las siguientes; (/.,. |i, y y . Los anticuerpos IgE están delimitados por la subunidad-u; las subunidades -|i y -y contienen regiones transmembrana que funcionan en la señalización transmembrana (Ravetch, 1991).

Tabla 46-2 P r o p i e d a d e s fisicoquímicas d e la ¡nmunoglobulina E

(

Cadena clase H Fórmula molecular Coeficiente(s) de sedimeniación Peso molecular Carbotndralo (%) Determinantes antigénicos Fijación complementaria (clasica) Vida media en suero (días) Transferencia placentaria Actividad reaginica

E

E -L¡, 8 190 000 11,7 D,. D..2. D,3 Ninguna 2 Ninguna 4+; Los fragmentos que contienen Fe son inhibidores de la actividad sensibilizadora de la piel de IgE nalrvo. pero los fragmentos con Fab. no 2

a

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/

cutánea de la IgE es lábil al calor; calentando a 56C durante dos horas se modifican irreversiblemente los dominios C,3 y C,4 de la molécula IgE y se suprime la actividad sensibilizadora de la piel (Ishizaka, 1967). La aglutinación de células electoras también se suprime por la reducción y alquilación de los puentes disulfuro entre las cadena-,. Los agregados de IgE humano no se fijan al complemento por la vía clásica, y no hay paso placentario significativo de IgE humano.

Liberación de mediadores desde las células efectoras sensibilizadas a IgE Los mastocitos y basófilos son las células electoras principales de las reacciones de hipersensibilidad inmediata. Ambos tipos de células contienen histamina en granulos citoplasmáticos que se tiñen marcadamente con tintes básicos metacromáticos (Siraganian, 1988). Los mastocitos y basófilos se desarrollan en la médula ósea a partir de células madre pluripotenciales. un proceso que se estimula por IL-3 (Schrader, 1986). Los basólilos que circulan en la sangre tienen una vida corta, y están bien diferenciados, mientras que los mastocitos que se encuentran en tejidos próximos a los vasos sanguíneos y en tejidos conectivos adyacentes al epitelio del tracto respiratorio, del tracto intestinal y de la piel son células con una vida larga capaces de prolilerar en respuesta a estímulos mitógenos. Los mastocitos son heterogéneos pero contienen normalmente 10 veces más del total de histamina por célula que los basólilos. El mecanismo primario de liberación de histamina desde los mastocitos y basófilos incluye la señal transmembrana mediada por anticuerpos específi-

Las moléculas de F, Rl son móviles dentro de las membranas plasmáticas de las células sintetizadas, como indican estudios llevados a cabo con anticuerpos anti-lgE conjugados con fluorescencia. Esta movilidad para distancias cortas se cree que es importante en la liberación de mediadores desde mastocitos y basófilos. Otros estudios más amplios con basófilos y mastocitos sensibilizados In vitro con proteínas de mieloma IgE o con anticuerpos específicos IgE han mostrado que la formación de puentes de receptores IgE ocupados por antígenos multivalentes o por anticuerpos anti-lgE intactos o sus fragmentos F(ab')^ desencadena la liberación de histamina. pero haptenos univalentes o fragmentos Fab de anticuerpos anti-lgE no. La importancia de la formación de puentes de receptores también se ha demostrado por estudios llevados a cabo con anticuerpos obtenidos de F Rl. Los anticuerpos intactos de F„ Rl causan la liberación de histamina. pero los fragmentos Fab no. Tomando en conjunto estos resultados se propone que los puentes entre los receptores adyacentes son importantes en la iniciación de la liberación de histamina (Siraganian. 1975). De acuerdo con la "hipótesis puente", los anticuerpos IgE juegan un papel pasivo en la producción de la liberación de mediadores vasoactivos. La señal inicial para la liberación de mediadores está proporcionada por los puntes cruzados de F„ Rl por un alérgeno multivalente, con IgE sirviendo como puente. u

A pesar de los ensayos en los sistemas modelo, las criticas rutas moleculares que siguen al puente de F.,. Rl y que permiten la liberación de histamina de las células sensibilizadas no están bien definidas. Con respecto a este tema, es suficiente mencionar que la señalización transmembrana mediada por F Rl en los mastocitos y basófilos probablemente implica vanos pasos, incluyendo la movilización de Ca-' desde los depósitos intracelulares y desde fuentes extracelulares a través de la formación de canales de Ca •; activación de proteínas aglutinadas de guanosin-trifosfato (GTP) unidas a moléculas de F , Rl, que permiten la activación de proteínas cmasas y metil-translerasas unidas a F,., Rl; activación de adenil ciclasa con el aumento de la producción intracelular del adenosin monofosfato cíclico; e hidrólisis de fosfolípidos que contienen inositol por activación de fosfolipasas A, y C, que generan diacil-glicerol y, seguido de nuevas hidrólisis, ácido araquidónico (Bradlord, 1998). Q

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Estos pasos son importantes por dos razones: muchas señales son importantes para la liberación de mediadores desde los mastocitos y basófilos. y el tratamiento farmacológico de las enfermedades alérgicas a menudo implica el uso de fármacos que interfieren con estos mecanismos de señalización. Por ejemplo, la cromolma usada en el tratamiento de asma interfiere con la liberación de mediadores desde los mastocitos bloqueando la formación de canales de Ca^, y los corticoides interfieren con la señalización mediada por F Rl inhibiendo la hidrólisis de fosfolípidos mediada por la enzima (Mazeruk. 1984). Además, se sabe que el ácido araquidónico liberado por los basófilos y mastocitos tras la activación de las fosfolipasas celulares es el sustrato para las enzimas de las rutas metabólicas 5-lipoxigenasa y ciclo-oxigenasa, que conducen, respectivamente, a la síntesis y secreción de mediadores de inflamación leucotrienos y prostaglandinas (Fig. 46-3) (Lewis, 1981). El leucotrieno B.,. y prostaglandina D producen el movimiento de leucocitos, incluyendo eosinódlos. y ellos estimulan la agregación, liberación enzimática. y generación de superóxido en los neutrófilos. Los leucotrienos C , D y E, son liberados por muchos tipos de células, incluyendo mastocitos pulmonares, perifonéales y de la médula ósea, y leucocitos macrófagos. eosinófilos y basófilos. Estos mediadores causan broncoconstricción. aumentan la permeabilidad vascular en vénulas poscapilares y aumentan la secreción de moco. Estos u

?

4

Figura 46-2. La estructura de la IgE humana.

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CAPÍTULO 46

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ENFERMEDADES ALÉRGICAS

1019

Figura 46-3. Metabolismo del ácido araquidónico por las rutas de 5-lipoxigenasa y ciclooxigenasa.

también pueden mediar la pérdida reversible de capacidad pulmonar observada en el asma humano. Desde el punto de vista molar, los leucotrienos son muchas veces más potentes que la histamina. siendo estos los principales mediadores de los efectos inflamatorios que caracterizan las reaccionas de hipersensibilidad inmediata (Samuelsson, 1983). Otro mediador lípido de la inflamación, llamado factor activador plaquetario (PAF). es un sustituto derivado del glicerol generado a partir de fosfolípidos tras la activación celular. El PAF produce anafilaxia cuando se administra en pequeñas dosis a animales, y el análogo en humanos se cree que es liberado por neulrófilos y macrófagos alveolares. Los efectos biológicos del PAF que ocurren durante la anafilaxia incluyen la agregación y degranulación de plaquetas, contracción del músculo liso y aumento de la permeabilidad capilar (Barnes, 1988).

EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES ALÉRGICAS La enfermedad alérgica es un problema de salud pública significativo. Como antes se comentó, más del 20% de los adultos sufren alguna de las formas crónicas de la enfermedad alérgica. Como muchos individuos atópicos desarrollan alergias durante la infancia, la prevalencia de enfermedades alérgicas en niños proporciona otra estimación de la magnitud de la totalidad de este problema médico. El asma afecta aproximadamente al 5% de los niños en edad escolar, y otras enfermedades alérgicas menos incapacitantes como la rinitis alérgica y el eczema, afectan aproximadamente un 15% y un 5% de los niños, respectivamente. Según una revisión, las enfermedades alérgicas menores afectan a casi el 40% de todos los niños de Estados Unidos. De forma rutinaria los médicos apenas utilizan unas pocas pruebas de laboratorio para la evaluación de enfermedades alérgicas. Las pruebas para proteina IgE y para anticuerpos IgE alérgenos específicos son los pilares. Antes de tratar los detalles de estas pruebas, es importante apuntar que la utilidad de cada prueba viene determinada por el contexto clínico en el que se aplica. En el campo de la alergia clínica, las pruebas para proteína IgE y anticuerpos IgE se piden principalmente para el diagnóstico y menos frecuentemente para la valoración pronostica, o como una ayuda en el tratamiento terapéutico. La utilidad de los resultados de la prueba en cada situación está determinada empíricamente por si es difícil o no establecer un diagnóstico

preciso de enfermedad alérgica o decidir un solo régimen terapéutico determinado en el campo práctico. En niños y adultos, la hipersensibilidad inmediata puede ser el primer mecanismo de la enfermedad o un factor contribuyente; y mientras que en el campo práctico es posible establecer un diagnóstico de presunción de una enfermedad alérgica, a menudo el diagnóstico definitivo y el tratamiento requieren de la identificación inequívoca del alérgeno(s) en particular. Esto es particularmente importante en casos de enfermedad alérgica grave que se produce en individuos sin un antecedente atópico o un antecedente familiar de enfermedad alérgica. La palabra atopia (o atópico) se utiliza sobre todo en la bibliografía médica de la alergia para referirse a los individuos con una historia familiar de enfermedad alérgica que tienen sensibilidad demostrable a una variedad de alérgenos. Estos individuos se incluyen aquí por tener un fenotipo alérgico. Los individuos no atópicos pueden también sufrir enfermedades alérgicas y pueden desarrollan clínicamente reacciones de hipersensibilidad inmediata significativas a alérgenos que se encuentran repetidamente en su entorno. La característica que distingue a los individuos atópicos es su tendencia a desarrollar sensibilidad a una variedad de alérgenos encontrados en condiciones ambientales rutinarias (Hoekelman. 1974). La atopia clínica existe asociada a la normalidad. No se puede explicar la utilidad de las pruebas de laboratorio en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades alérgicas sin mencionar las pruebas ín vivo de la hipersensibilidad inmediata, particularmente la prueba cutánea y las pruebas de provocación órgano-especificas. Históricamente, se consideraban las pruebas in vivo como un criterio de diagnóstico preciso y fiable. La capacidad de reproducir una reacción alérgica específica por un mecanismo in vivo todavía se considera por muchos alergólogos como la técnica más sensible para demostrar la presencia de hipersensibilidad inmediata y para definir su especificidad. Las pruebas cutáneas se realizan por la inyección inlradérmica y por los métodos de pinchazo cutáneo (Bousquet, 1993). La respuesta a la inyección intradérmica de un extracto alérgeno se gradúa determinando el diámetro del grano y por la reacción eritematosa inmediatamente después de la inyección. Una reacción con 1+ se corresponde con un grano de 5 mm a 10 mm. Una respuesta de esta magnitud habitualmente se considera como evidencia de una sensibilidad específica a un alérgeno. Los individuos altamente sensibles a menudo desarrollan granos de diámetros mayores de 15 mm con seudópodos. Las pruebas cutáneas realizadas mediante un pinchazo utilizan un alér-

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

geno exaclo más concentrado, a concentraciones 1.000 veces superiores a las utilizadas en las pruebas intradérmicas. y su gradación a menudo se omite. El diámetro medio del grano en milímetros se apunta como un indicador del grado de sensibilidad. Se puede obtener una estimación más cuantitativa de la sensibilidad a un determinado alérgeno mediante una técnica de ajuste final. Esta técnica es una modilicación de los métodos mtradérmicos y de pinchazo cutáneo. De forma senada se utilizan diluciones con 10 veces el extracto alérgeno estandarizado empezando con la solución más diluida. El objetivo de la sensibilidad se define como la mayor dilución que produce una reacción 1+.

12.0(M)

Las pruebas de provocación a determinados órganos son útiles en la práctica clínica y con propósitos de investigación. Las adaptaciones de esta técnica incluyen la prueba de provocación bronquial en el diagnóstico de asma: la prueba de provocación rinoconjuntival en el diagnóstico de rinitis alérgica: la eliminación de comida y prueba provocación en el diagnóstico del asma inducido por comida, urticaria y malabsorción: y la provocación de una picadura en el diagnóstico de sensibilidad anafiláctica al veneno de insectos (Naclerio. 1993). La aplicación de pruebas de provocación en situaciones clínicas rutinarias está limitada por la necesidad de un alérgeno exlraído bien caracterizado de potencia definida y por el número limitado de alérgenos que pueden ser probados en un individuo en una única ocasión. Como ejemplo, la eliminación de comida y procedimientos de provocación que requieren de períodos de abstinencia de varios dias. durante los cuales el consumo inadvertido de un alimento determinado puede invalidar la prueba. Un obstáculo importante para el diagnóstico exacto en el campo de la alergia clínica es la falta de extractos de alérgeno disponibles de potencia uniforme y composición definida (Bousquet, 1995). Salvo en ejemplos seguros, como las conocidas hierbas, céspedes, ácaros y mohos, los constituyentes químicos que provocan reacciones alérgicas no están caracterizados para muchos alérgenos reconocidos. A pesar de los esluerzos de los fabricantes por producir materiales estandarizados, a menudo los diferentes lotes del mismo alérgeno varian en potencia por apenas una sene de medidas. Se han utilizado diversas técnicas para cuantificar la potencia de alérgenos en el uso clínico, incluyendo medidas del contenido de nitrógeno de proteínas, pruebas cutáneas de ajuste específico, análisis inmunoquimicos con antisuero animal específico, e inhibición de la aglutinación de anticuerpos IgE específicos por alérgenos solubles m w'fro (Gleich. 1974). La inhibición de la aglutinación de anticuerpos IgE específicos por alérgenos en solución acuosa es un método excelente para comparar extractos de alérgenos. La potencia de un extracto alérgeno está inversamente relacionada con la dosis de alérgeno soluble requerida para inhibir la aglutinación de los anticuerpos IgE en un control positivo de suero a una cantidad fija de alérgeno ajustado en fase sólida. La semejanza cualitativa y antigénica de los diferentes lotes de alérgeno y la cantidad de alérgeno presente se pueden estimar comparando las pendientes y ED,„ de las curvas dosis-inhibición. Los diferentes lotes de alérgenos que contienen la misma mezcla cualitativa de constituyentes alergénicos provocan lineas dosis-inhibición paralelas cuando el porcentaje de inhibición se traza frente a la dosis de un extracto alérgeno soluble. El método de inhibición in vilro es útil para comparar la potencia y las características antigénicas tanto de alérgenos puros como de mezclas.

Proteína IgE: métodos de determinación, valores normales y utilidad clínica Existen una variedad de métodos inmunoquimicos disponibles comercialmente para determinar el IgE en suero, incluyendo desplazamiento competitivo e inmunoanálisis sandwich y nefelometría (Homburger. 1993). Los métodos no isotópicos son los más populares. Cada uno de estos inmunoanálisis es capaz de detectar IgE en suero a concentraciones tan bajas como 0,5 U/ml (1,2 ng/ml). Los métodos sandwich de inmunoanálisis utilizan una aproximación analítica común; un anticuerpo anti-lgE policlonal o monoclonal, unido covalentemente a una fase sólida, se incuba con una proporción de suero o estándar, y la IgE unida se detecta mediante incubación con el anticuerpo anti-lgE marcado, purificado de afinidad, o monoclonal. La concentración de IgE en muestras de suero se calcula comparándola con una curva estándar. La máxima sensibilidad analítica se consigue en el rango de 7,5 a 50 U IgE /mi. Las concentraciones menores pueden determinarse por métodos sandwich.

pero la habilidad de detectar pequeños cambios de concentración en el rango de 0,5 a 4 U /mi disminuye comparada con concentraciones más elevadas (Fig. 464). Se han realizado numerosos estudios clínicos de las concentraciones de IgE en suero en sujetos sanos (no alérgicos). En todos los estudios, hay tendencias estrictas en el desarrollo de niveles de IgE con la edad y con distribuciones de frecuencia de concentraciones de IgE observadas en adultos sanos sin tener en cuenta los métodos analíticos (Homburger. 1986). La distribución de la frecuencia de las concentraciones de IgE en adultos sanos se angula positivamente con los límites de percentil 95 y con un número exagerado de valores baios de IgE. Al calcular el percentil 95 de los limites normales, la mayoría de los investigadores han tratado sus datos con transformación logarítmica, produciendo por lo tanto límites superiores a lo normal que son al parecer muy elevados cuando se comparan con las medias aritméticas (Barbee. 1981). Como se comentará más tarde, estos limites superiores de lo normal sirven para reducir la sensibilidad diagnóstica de la prueba de IgE en suero como una prueba de despistaje clínico de alergia cuando el límite superior al normal se usa como valor de corte. La síntesis de IgE en el feto humano se produce incluso a las 11 semanas de gestación en el tejido fetal pulmonar y hepático, aunque el cordón umbilical contiene IgE virtualmente no detectable. La concentración media del cordón umbilical es menor de 1 U/ml (Kimpen. 1989). Las concentraciones de IgE en el suero materno y en el cordón umbilical no se correlacionan, indicando que no hay paso placentario apreciable de IgE materna. La existencia de anticuerpos IgE específicos para la leche de vaca en el cordón umbilical, pero no en el suero materno, indica que puede existir una sensibilización intrauterina y apoya la conclusión de que la proteína IgE detectada en el cordón umbilical tiene un origen fetal. Las concentraciones de IgE en suero de niños aumentan lentamente con el desarrollo o alcanzan los niveles adultos aproximadamente a los cinco a los siete años de edad (Homburger, 1986a). Varios estudios clínicos han mostrado un promedio un tanto más alto de la concentración de IgE en suero en niños de edades entre los 10 y los 14 años que en adultos de 20 años. El significado clínico de este descubrimiento no está claro. No se han observado diferencias entre los niveles de IgE en niños y niñas de edades similares. En individuos mayores de 70 años de edad, hay una tendencia a un promedio de niveles de IgE más bajo que en los adultos jóvenes menores de 40 años de edad. La determinación de la proteina IgE en suero ha sido evaluada a fondo por su utilidad clínica en el diagnóstico de vanas enfermedades alérgicas, por su valor predictivo como un indicador de la probabilidad del desarrollo de enfermedad alérgica en bebés y niños asmtomálicos. y como indicador pronóstico en adultos con algunos tipos de enfermedad alérgica crónica. La determina-

CAPÍTULO 46

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ENFERMEDADES ALÉRGICAS

ción de IgE también es valiosa en la valoración de pacientes en los que se sospecha que puedan tener enfermedades de inmunodeficiencia. enfermedades parasitarias o el raro síndrome hiper-lgE. El síndrome hiper-lgE fue descrito primero en 1972 por Buckley y col., que publicaron dos casos de pacientes con niveles altamente elevados de IgE en suero, dermatitis difusa, furunculosis recidivante y neumonía con neumatoceles secundarios a Staphylococcus aureus. Las publicaciones posteriores de pacientes con este trastorno definen este síndrome clinico: las elevaciones de los niveles de IgE en suero son extremas (de 2.000 a 50.000 U / mi), y los pacientes tienen eosinofilia en sangre y tejidos y un habón fuertemente positivo inmediato y reacciones enlematosas a alérgenos inhalados, pólenes, alimentos, y antígenos bacterianos y de hongos. A pesar de estos descubrimientos, el asma no es común en pacientes con el síndrome hiper-lgE (Buckley, 1978). La síntesis de IgE, como se refleja en los niveles de suero, se ha estudiado en pacientes con un sinfín de enfermedades ¡nmunodeficientes primarias Se han descrito niveles elevados de IgE asociados con deficiencias incompletas de la inmunidad celular, incluyendo el síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome parcial DiGeorge y alinfoplasia timica (síndrome de Nezelof) (Buckley. 1975). Las inmunodeficiencias en las que hay ausencia completa de síntesis de mmunoglobulinas G, A y M, como la enfermedad inmunodeficienle aguda (SCID), muestran característicamente una disminución de la síntesis de IgE y niveles de IgE marcadamente disminuidos en suero. Los niveles de IgE en suero son variables en pacientes con deficiencia de IgA: los pacientes con ataxia telangiectasia típicamente tienen niveles disminuidos, pero los pacientes con deficiencia aislada de IgA pueden tener niveles normales o moderadamente aumentados (Buckley, 1975). La enfermedad alérgica no es común en pacientes con inmunodeficiencias, a excepción de los individuos con deficiencia de IgA selectiva que tienen niveles de IgE elevados en suero. La síntesis elevada de IgE en pacientes con síndrome hiper-lgE o con deficiencias parciales de inmunidad celular posiblemente manifiestan una secreción de IgE aumentada producida por los linfocitos B que escapan del control regulador de los linfocitos T. La infiltración parasitaria del tracto gastrointestinal o órganos parenquimatosos estimula intensamente la síntesis de IgE, y los estudios de laboratorio con animales sugieren que los anticuerpos IgE específicos son importantes en la defensa del huésped frente a parásitos como el Nippostrongylus brasillensis y Schistosoma mansoni (Mulligan, 1965). Las concentraciones de IgE en suero superiores a 1.000 U/ml se encuentran de forma habitual en niños en áreas de infestación endémica con parásitos. Se sabe que existen otras enfermedades parasitarias asociadas a niveles de IgE en suero aumentados, incluyendo la larva visceral migratoria (Toxocara cams), capilariasis intestinal (Capillana philippinensis). esquistosomiasis. anquilostomiasis y equinococosis. En pacientes con enfermedad parasitaria intestinal, se han evidenciado niveles de IgE en suero disminuidos considerablemente después de seguir un tralamienlo exitoso con fármacos antiparasitarios. Al revisar la utilidad de los niveles de IgE en suero como prueba diagnóstica para la enfermedad alérgica, es importante tratar su uso en niños y adultos por separado. Los niveles de IgE en suero elevados al nacer o durante la

Tabla 46-3

1021

lactancia sucede a menudo antes del desarrollo de la alergia clínica (Kjellman, 1984). Se observaron niveles de IgE en suero por encima del percentil 95 para la edad en el 75% de los niños con antecedentes de ambos padres de enfermedad alérgica; y entre los niños sanos con niveles de IgE mayores de 1 SD por encima de la media para una edad determinada, la incidencia de desarrollo de enfermedad alérgica durante los siguientes 18 meses aumentaba en 10 veces más en comparación a un grupo con niveles de IgE más bajos. Aunque prevén el desarrollo de una futura enfermedad alérgica, estos datos aportan relativamente poca información sobre cómo basar decisiones clínicas especificas. El diagnóstico de enfermedad alérgica en los laclantes es complicada debido a que la rinorrea es la manifestación más común de alergia en este grupo de edad, pero las infecciones respiratorias son comunes durante la lactancia y puede ser imposible distinguirlas de la rinitis alérgica en la práctica clínica. Sin embargo, como la enfermedad alérgica de inicio precoz parece estar asociada con manifestaciones clínicas más agudas, es importante establecer el diagnóstico de alergia lo antes posible {véase más adelanté). El valor principal de las determinaciones de IgE en niños parece ser la alerta para el médico de una posible enfermedad alérgica cuando el diagnóstico clínico de sospecha es diferente. Los niveles de IgE en suero superiores a 20 U/ml en estos casos apoyan el diagnóstico de enfermedad alérgica, pero un nivel normal de IgE no excluye el diagnóstico de enfermedad alérgica durante la infancia o en la vejez. Los resultados de otras pruebas diagnósticas, incluyendo pruebas para anticuerpos IgE, pueden tomarse en consideración en el diagnóstico de exclusión de enfermedad alérgica. En esas situaciones clínicas donde los signos de enfermedad alérgica son inequívocos, por eiemplo eczema y rinitis en un niño con antecedente familiar de atopia, el nivel de IgE en suero proporciona una pequeña información adicional. La situación es bastante similar en niños mayores. La determinación de la proteína IgE en suero tiene una sensibilidad diagnóstica limitada para la enfermedad alérgica cuando el limite superior del rango normal se utiliza como una cota diagnóstica. En general, los niños con hipersensibihdad a varios alérgenos diferentes y múltiples enfermedades alérgicas presentan niveles en suero elevados, y aquellos con hipersensibilidad a menos alérgenos y afectación limitada a un órgano a menudo tienen niveles normales (Berg. 1969). Este detalle se ilustra en los datos de la Tabla 46-3. La sensibilidad diagnóstica es mayor en pacientes con sensibilidad clínica a un numero de alérgenos diferentes. En niños atópicos, la presencia de enfermedad cutánea y manifestaciones gastrointestinales aumenta la probabilidad de que los niveles de IgE en suero estén elevados (Havnen, 1973). También hay evidencias que apuntan que la frecuencia de los niveles elevados de IgE en suero es mayor en niños con hipersensibilidad a los alimentos y a alérgenos del polen que en niños con hipersensibilidad a alérgenos de polvo o moho (Berg. 1969). Los niños con enfermedad alérgica que afecta a varios órganos también suelen tener elevaciones en IgE en suero de mayor magnitud que aquellos con enfermedades más limitadas; las elevaciones extremas ocurren más a menudo en pacientes con manifestaciones cutáneas. La especificidad diagnóstica de un nivel elevado de IgE para la enfermedad alérgica es excelente. La asociación es tan fuerte, que los

Incidencia de c o n c e n t r a c i o n e s e l e v a d a s de IgE en s u e r o en n i ñ o s alérgicos de e d a d e s de d o s a 16 a ñ o s con diferentes c o m b i n a c i o n e s d e e n f e r m e d a d e s alérgicas

Diagnostico

№ de n i ñ o s en cada grupo

Sólo asma

№ de niños con IgE en suero e l e v a d o

Incidencia de IgE en suero elevado (%)

3

14

Asma y rinoconjuntivitis

33

13

39

Asma y dermatitis atópica más otras enfermedades de hipersensibilidad

70

41

58

Asma y urticaria más oirás enfermedades de hipersensibilidad

75

46

61

12

50

11

84

Asma y urticaria y dermatitis atópica más otras enfermedades de hipersensibilidad Asma y alergia gastrointestinal más otras enfermedades de hipersensibilidad

13

1022

SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

niños asinlomálicos con niveles elevados de IgE a veces se califican como prealérgicos, asumiendo que desarrollarán signos de alergia clínica en el futuro. La determinación de la proteina IgE en suero tiene una utilidad diagnóstica moderada en la mayoria de los adultos con sospecha de padecer una enfermedad alérgica. Los resultados de estudios clínicos de alergia respiratoria adulta indican que aproximadamente el 50% de los adultos con asma extrínseca y menos del 5% de adultos con la denominada asma intrínseca (no atópica) tienen elevados niveles de IgE en suero (Wittig. 1980). Los adultos asmáticos con hipersensibilidad a un número limitado de alérgenos habitualmente tienen niveles normales. Los mayores niveles de IgE en adultos característicamente ocurren en aquellos pacientes con hipersensibilidad a diversos alérgenos y combinaciones de asma, dermatitis atópica y rinitis. Al igual que en los niños, la sensibilidad diagnóstica limitada de los niveles de IgE en suero limita la utilidad clínica de las determinaciones de IgE en aquellas situaciones donde el diagnóstico de enfermedad alérgica es más incierto (Klink, 1990). Esto no quiere decir, sin embargo, que la IgE en suero no pueda determinarse en estos casos, pues un nivel elevado tiene un alto valor predictivo de enfermedad alérgica.

de estas características, la prueba de liberación de histamina leucocitaria presenta aplicaciones limitadas en la práctica clínica. Aproximadamente el 15% de los individuos tienen leucocitos que no liberan histamina in vitro. Aunque se han desarrollado sistemas automatizados para la determinación de histamina, este análisis es incómodo de realizar y caro. La prueba requiere de células sanguíneas frescas y sólo se pueden analizar un número limitado de alérgenos utilizando una muestra única de sangre. Actualmente, la prueba de histamina liberada se utiliza más en investigación que en la práctica clínica.

Los niveles de IgE en suero han recibido una atención particular en niños y adultos con dermatitis atópica. Los mecanismos relacionados con la patogénesis de la dermatitis atópica se desconocen por completo, pero el descubrimiento de niveles muy altos de IgE en la mayoría de los pacientes con dermatitis atópica y enfermedad activa ha provocado diversas investigaciones de la relación entre la actividad de la enfermedad y los niveles de IgE. Aunque no hay un consenso, algunos estudios indican que las fluctuaciones en la gravedad de las manifestaciones cutáneas paralelas cambian análogamente al nivel de IgE en suero (Wuthrich. 1978). Las relaciones causales, si existen, permanecen ocultas.

Las concentraciones reales de anticuerpos IgE no se determinan con precisión con estas técnicas. En el suero de algunos individuos alérgicos, las concentraciones de anticuerpos IgE exceden la capacidad aglutinante de los alérgenos inmunoabsorbentes, y los sobrenadantes incubados en la primera fase contienen cantidades residuales de anticuerpos IgE específicos. En un rango un tanto limitado de concentraciones, la aglutinación de anticuerpos en la segunda fase incrementa en proporción directa a la concentración de anticuerpos IgE en suero y se puede obtener alguna cuantificación. Sin embargo, la aglutinación final refleja cantidades y afinidades de los anticuerpos presentes (Schellenberg, 1975).

La aspergilosis broncopulmonar alérgica también se asocia a una marcada elevación del nivel de IgE en suero. Esta enfermedad ocurre típicamente en pacientes con asma extrínseca, generalmente de larga duración. Los niveles de IgE en suero están elevados en casi todos los pacientes con aspergilosis alérgica cuando existe una infiltración pulmonar aguda, pero los niveles de IgE pueden fluctuar considerablemente durante el curso de la enfermedad. Un nivel normal de IgE en un paciente con enfermedad pulmonar activa excluye prácticamente este diagnóstico (Imbeau, 1978).

Como inicialmente describieron Wide y col. (1967). la prueba del anticuerpo IgE empleaba alérgenos unidos covalentemente a gotas de Sephadex. Una variedad de otros materiales de fase sólida se han utilizado con posterioridad, incluyendo partículas de celulosa, gotas de agarosa. discos de filtro de papel y placas de microtítulaciones de poliestireno. Muchos de estos materiales de soporte pueden activarse químicamente a formas intermedias lábiles que reaccionan con alérgenos en solución acuosa para formar inmunoabsorbentes unidos covalentemente. La aglutinación de alérgenos en las placas de microtítulaciones se realiza por absorción no covalente. Para la aplicación clínica, la fase sólida alérgeno inmunoabsorbente puede contener todos los constituyentes alergénicos presentes en el extracto alérgeno liquido, en las mismas proporciones que el extracto alérgeno original. Aunque es posible controlar la unión de todas las proteínas a inmunoabsorbentes, existen pocos datos disponibles para determinar si todas las proteínas alergénicas relevantes se han fijado a algunos sistemas alergénicos clínicamente importantes.

Anticuerpos IgE alérgeno-específicos: métodos de determinación, calificación de resultados, y utilidad clínica Las pruebas cutáneas y de provocación a un órgano son procedimientos establecidos para la detección de anticuerpos IgE in vivo, como se comentó previamente. También existen métodos in vitro para detectar anticuerpos IgE en suero y en los granulocitos basófilos; los métodos principales son la prueba del anticuerpo IgE específico y la prueba de liberación de histamina leucocitaria, respectivamente. La prueba de liberación de histamina leucocitaria lúe descrita por primera vez hace más de 50 años. Los leucocitos aislados de sangre periférica por sedimentación de dextrano se lavan y se suspenden de nuevo en un tampón que contiene iones Ca y Mg \ Entonces, se añaden concentraciones variables de un extracto alérgeno a un número determinado de leucocitos lavados, y la mezcla se incuba a 37°C durante una hora. La reacción se para congelando los tubos a 4°C, y las células se separan por centrifugación. La histamina secretada por los basófilos como consecuencia de la interacción del alérgeno con las células unidas a anticuerpos IgE se libera en el líquido sobrenadante y se aisla por extracción con butanol ya ácido. La concentración de histamina en el extracto se mide de forma fluorométrica o por inmunoanálisis específico. El procedimiento fluorométrico. realizado manualmente, detecta aproximadamente 1 ng de histamina. El método de inmunoanálisis es un poco más sensible. Los resultados se expresan como un porcentaje del total de histamina celular liberada; la histamina total se determina en los usados ácidos de leucocitos no expuestos al extracto de alérgeno (Lichtenstein. 1964), 2,

2

Los resultados de la prueba de liberación de histamina leucocitaria definen la especificidad de los anticuerpos IgE ligados a células e indican la integridad funcional de los mecanismos mediadores de liberación. A pesar

La prueba de anticuerpo IgE. inicialmente conocida como prueba radioalergoabsorción (RAST), es un inmunoanálisis sandwich análogo en principio a la prueba de Coombs indirecta. Se mezcla la muestra de suero en la que se quieren determinar los anticuerpos IgE con un alérgeno unido a un material en fase sólida. Después de la incubación inicial, los componentes que no son anticuerpos se retiran, y el alérgeno inmunoabsorbente se incuba en una segunda fase del análisis con anticuerpos anti-lgE monoclonales o cromalografia marcada purificada. Los anticuerpos IgE específicos fijados en la primera fase del análisis se detectan con anticuerpos anti-lgE marcados unidos a la fase sólida del complejo alérgeno (Gleich. 1975).

Existe un amplio rango de alérgenos disponible para la prueba de anticuerpo IgE. Es posible adquirir los reactantes en kits o se puede enviar el suero a un laboratorio de referencia para su análisis. Las diversas clases de alérgenos disponibles incluyen epitelio animal; alimentos; pólenes de árboles, céspedes y hierbas; mohos; hongos: venenos de insectos; fármacos; y alérgenos ocupacionales. La mayoría de las drogas son compuestos de bajo peso molecular que no pueden fijarse fácilmente en una fase sólida por los métodos químicos habituales. Algunas drogas macromoleculares, como la insulina, pueden unirse para producir reactivos satisfactorios. En el caso de la penicilina, el grupo peniciloil puede conjugarse a la polilísina o a la proteina transportadora, que así puede fijarse a una fase sólida apropiada para utilizarse en la prueba de anticuerpo IgE (Wide, 1971). No hay reactantes análogos disponibles para detectar anticuerpos IgE de los conocidos determinantes antigénicos menores de penicilina, responsables de algunas reacciones anafilácticas agudas a esta droga. No hay un acuerdo unánime para notificar resultados de las pruebas de anticuerpos IgE. Varios métodos comerciales utilizan un sistema de puntuación que obtiene los resultados de las muestras de pacientes a partir de la comparación con la curva dosis-respuesta de referencia obtenida de una serie de diluciones de un control positivo (Fig.46-5). En un intento de maximizar la sensibilidad analítica de estos métodos, se consideran positivos aquellos resultados superiores a 0,35 KU/L (unidades Killa por litro) estándar. La concentración de anticuerpos IgE puede expresarse tanto en KU / L

CAPÍTUIO 46

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ENFERMEDADES ALÉRGICAS

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do. Sin embargo, en la mayoría de los esludios clínicos los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE se han comparado con los resultados de las pruebas de diagnóstico in vivo y los antecedentes de enfermedad alérgica. Está claro según estos estudios que la sensibilidad diagnóstica varia considerablemente dependiendo del tiempo transcurrido desde la exposición a un alérgeno y la prueba, la clase de alérgeno examinado, la edad del paciente y los órganos diana afectados (Homburger, 1986a). En los objetivos de este capitulo, es útil considerar las siguientes aplicaciones clínicas por separado: enfermedad respiratoria alérgica, alergia a alimentos, sensibilidad al veneno de insecto y alergia a lármacos u ocupacional.

2(1.0(10

0.35 0,7

3.5

17,5

50 100

Concentración (kU-1) Figura 46-5. Curva dosis-respuesta para la determinación de anticuerpos IgE por inmunoanálisis de enzima fluorescente comercial. FU = unidades fluorescentes.

como en clases numeradas del O al V o VI. La mayoría de los médicos están más familiarizados con los sistemas de puntuación basados en clases. Sin tener en cuenta el sistema usado para expresar los resultados, debería tenerse en cuenta que la mayoría de los resultados son semicuantitativos. Los resultados dudosos o débilmente positivos pueden deberse a la variabilidad analítica (Jacob, 1982). El suero con niveles de proteina IgE marcadamente elevados también pueden producir resultados falsos positivos, debido a una unión incrementada no específica de IgE. Este fenómeno habitualmente no ocurre a no ser que la concentración de IgE exceda de 1.000 KU / L, lo que puede ocurrir en pacientes con dermatitis atópica o enfermedades alérgicas múltiples. Los resultados de falsos negativos causados por la inhibición de la unión de anticuerpos IgE puede ocurrir en algunos sistemas analíticos debido a la competición por lugares de unión a alérgenos por anticuerpos IgG. Estos anticuerpos tienen afinidades similares a los anticuerpos IgE y habitualmente se encuentran en concentración de microgramo por mililitro en el suero de pacientes tratados con inmunoterapia alérgena (Paull. 1978). Como las determinaciones de anticuerpos IgE no son útiles en pacientes tratados para determinar si existe sensibilidad clínica residual, se entiende que este problema habitualmente ocurre cuando la prueba de anticuerpo IgE se usa mapropiadamenle. La sensibilidad analítica de una prueba de anticuerpo IgE en parte está determinada por el anticuerpo anti-lgE marcado utilizado en la segunda fase del análisis. Los anticuerpos anti-lgE comerciales con afinidad purificada y marcados funcionan bien como proteínas detectoras y permiten la determinación de cantidades en nanogramos de anticuerpos IgE específicos. Los anticuerpos anti-lgE monoclonales marcados también están disponibles comercialmente. Las recomendaciones para el uso clínico de la prueba de anticuerpo IgE se basan en los resultados de estudios clínicos donde los resultados de la sensibilidad del anticuerpo IgE fueron comparados con oirás pruebas diagnósticas. En algunos casos, la decisión de identificar los alérgenos específicos responsables de los signos clínicos está moderada al saber que la terapia no será diferente si se identifican los alérgenos agresores. Este último punto es importante en muchos pacientes cuyo tratamiento está basado en el uso de fármacos que inhiben la liberación de mediadores inflamatorios, producen broncodilatación o suprimen la inflamación. Sin embargo, en la mayoría de los individuos alérgicos, el conocimiento de los alérgenos agresores es clínicamente útil para decidir qué tipo de alérgenos deben usarse en un régimen de inmunoterapia, como en pacientes con rinitis alérgica o sensibilidad al veneno de insectos, o para conseguir evitar un alérgeno en casos de sensibilidad anafiláctica a alimentos o fármacos. Es difícil definir la sensibilidad diagnóstica absoluta y específica de los resultados de anticuerpo IgE porque no hay un método de referencia umversalmente aceptado para definir la sensibilidad hacia un alérgeno determina-

Como los anticuerpos IgE asociados a células median en la enfermedad respiratona alérgica, es razonable tener en cuenta los resultados de las pruebas de provocación a un órgano específico como un criterio para determinar la sensibilidad hacia un alérgeno determinado. Diversos estudios en adultos con asma o rinitis alérgica han mostrado una excelente relación general entre los resullados de pruebas de provocación y las pruebas de anticuerpo IgE llevadas a cabo con alérgenos inhalados, incluyendo pólenes de árboles, céspedes y hierbas, mohos y ácaros. Los resultados de las pruebas cutáneas y pruebas de anticuerpo IgE también concuerdan en la mayoría de los casos. La mayoría de los resultados discordantes fueron pruebas cutáneas débilmente positivas en pacientes con pruebas de anticuerpo IgE negativo (Wide, 1967). En niños con enlermedad alérgica, los estudios epidemiológicos recientes han aportado un secuencia de desarrollo de signos y síntomas de enfermedad que se acompañan de una secuencia predecible de sensibilización a diferentes clases de alérgenos (Bergmann, 1997). Esta denominada marcha alérgica a menudo empieza con alergia a alimentos en niños menores de tres años asociada a manifestaciones gastrointestinales y dermatitis atópica seguida de enfermedad respiratoria incluyendo asma y rinitis causadas por sensibilidad a alérgenos inhalados. La secuencia de detección de anticuerpos IgE que es paralela al desarrollo de manifestaciones clínicas avanza con la edad de la siguiente forma: los anticuerpos IgE de proteínas de alimentos especialmente huevo y leche se detectan primero sobre los tres años de edad, luego anticuerpos de alérgenos inhalados, empezando con alérgenos internos incluyendo epitelio animal y ácaros de polvo sobre los cinco años de edad; y al final de la infancia, los alérgenos inhalados externos incluyendo pólenes. El desarrollo de sensibilidades en esta secuencia tiene implicaciones obvias para las pruebas clínicas en niños. Entre los niños con enfermedad respiratoria alérgica, los estudios clínicos han mostrado que los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE y las pruebas de provocación concuerdan en muchos casos. De nuevo, la mayoría de los resultados discordantes se han observado en niños con pruebas de provocación positivas hacia extractos alérgenos altamente concentrados. Se observó una concordancia importante en niños con alergia moderada o aguda, y en niños con pruebas de provocación negativas. Como muestran estos resultados, la sensibilidad diagnóstica de estas pruebas de anticuerpo IgE hacia alérgenos inhalados varia directamente con la magnitud de sensibilidad clínica en pacientes con alergias respiratorias (Berg, 1974). También es oportuno preguntarse si concuerdan bien los resultados de anticuerpo IgE con las pruebas cutáneas en casos de sospecha de alergia respiratoria. En los estudios previamente mencionados, si los resultados de pruebas cutáneas realizados con el método del pinchazo se utilizaron para definir la sensibilidad hacia un alérgeno, se obtuvieron muchos más resultados discordantes. La prueba de anticuerpo IgE fue negativa en pacientes con pruebas cutáneas débilmente positivas, pero se obtuvieron resultados positivos casi en el 90% de los pacientes con pruebas cutáneas fuertemente positivas. En general, las mejores correlaciones se observaron con alérgenos de polen y alérgenos purificados, mientras que se observaron menores grados de correlación con alérgenos de polvo y moho. Los partidarios de la prueba cutánea defienden que datos como éstos indican que la prueba cutánea es un método diagnóstico más sensible, mientras los partidarios de la prueba de anticuerpo IgE señalan que un alto porcentaje de las pruebas cutáneas débilmente positivas no son validadas por pruebas de provocación positivas. El argumento es un tanto teórico; cualquier método diagnóstico es fiable en pacientes con sensibilidad marcada a un alérgeno y ninguno es completamente fiable para identificar ligeras discordancias de sensibilidad clínica. En este último caso, los dos métodos pueden proporcionar información diagnóstica complementaria.

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Las pruebas para anticuerpos IgE tienen ciertas ventajas comparadas con las pruebas cutáneas. No presenta riesgo para el paciente, y los resultados no están influidos por tratamientos concomitantes con antihistamínicos o broncodilatadores. Además, la prueba de anticuerpo IgE puede ser mejor que la prueba cutánea en ciertos grupos de pacientes, como los bebés, pacientes con dermografismo o pacientes con dermatitis generalizada. También hay desventajas. La prueba serológica es cara si se hace indiscriminadamente, y los resultados no son inmediatos. Recientemente, la prueba de anticuerpo IgE multíalérgeno realizada con inmunoabsorbentes que tienen más de un alérgeno acoplado a su superficie se ha mostrado que es una prueba de detección sistemática sensible y eficaz en coste para la alergia por inhalación. Se necesitan nuevos esludios para documentar la utilidad de esta prueba como una prueba de detección sistemática en otras situaciones clínicas (Ownby, 1984). Como se comentó previamente, la sensibilidad a alimentos sucede precozmente en niños atópicos y se manifiesta con una variedad de signos clínicos en bebés, niños y adultos, incluyendo eczema y dermatitis, rinitis y broncoespasmo, angioedema, urticaria, y rara vez anafilaxia. La determinación de anticuerpos IgE puede ser útil en estos casos, pero existen posibles riesgos al interpretar los resultados de estas pruebas que deberían conocerse. En la determinación total excepto de la sensibilidad anafiláctica a determinados alimentos, el uso de provocación con un alimento a doble ciego se considera el diagnóstico estándar (Bock, 1980). Sin embargo, las pruebas para anticuerpos IgE son útiles para seleccionar alérgenos para pruebas de provocación a doble ciego y para confirmar el antecedente. Los resultados IgE positivos se supone que son clínicamente significativos si los resultados están apoyados fuertemente por la historia clínica. Sin embargo, a diferencia de las alergias por inhalación, la incidencia de resultados falsos positivos (anticuerpos IgE a comida detectables no parece que se asocien a signos clínicos) es considerable, particularmente en niños. Los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE pueden utilizarse para predecir los resultados de la prueba de provocación a alimento (Sampson, 1997). Los resultados negativos rara vez se asocian a provocación a alimento positiva: mientras que los resultados fuertemente positivos pueden evitar la necesidad de pruebas de provocación. Se necesitan nuevos estudios clínicos para definir los límites apropiados para anticuerpos IgE a diferentes alimentos. A menudo se considera la sensibilidad a alimentos en el diagnóstico diferencial de enfermedades cutáneas, enfermedad gastrointestinal o enfermedad respiratoria en bebés y niños jóvenes. Los anticuerpos IgE específicos a alimentos más comúnmente encontrados en bebés y niños pequeños son para proteínas alérgenas en la leche de vaca y al huevo. Las principales proteínas alérgenas en la leche de vaca son la w.-lactalbúmina, p-lactoglobulina, albúmina bovina, y caseína. La relación entre los anticuerpos IgE hacía estas proteínas y las manifestaciones de la alergia a leche de vaca está establecida, pero existen anticuerpos IgE medióles en muchos niños atópicos que toleran la leche de vaca. La prueba de anticuerpos IgE a leche de vaca no puede establecer un diagnóstico de intolerancia a la leche debido a mecanismos distintos de la hipersensibilidad (Liebman, 1981). Los resultados de pruebas para anticuerpos IgE son mucho más específicos y tienen valores predictivos positivos mayores en casos de sensibilidad anafiláctica o angioedema causados por alérgenos alimentarios, por ejemplo, alergia al pescado o a frutos secos. En un estudio publicado, los autores encontraron al menos un resultado de anticuerpo IgE positivo en el 100% de niños con sensibilidad anafiláctica alimentaria, 96% de niños con asma, y 92% de niños con angioedema. En estos casos, la prueba de anticuerpo IgE es más útil porque la historia clínica a menudo incrimina a alimentos particulares como alérgenos (Hoffman, 1974). La prueba de anticuerpo IgE se utiliza comúnmente para investigar la especificidad de la sensibilidad a alérgenos alimentarios en pacientes con dermatitis atópica. Como se citó anteriormente, las pruebas cutáneas pueden ser imposibles de realizar en pacientes con enfermedad cutánea difusa o dermografismo. La interpretación de los resultados de las pruebas en pacientes con dermatitis atópica es complicada por el hecho de que estos individuos a menudo tienen asma y rinitis concomitantes con elevaciones extremas de IgE en suero. En estos casos, no es infrecuente encontrar niveles bajos de anticuerpos IgE a una diversidad de alérgenos. Las especificidades clínicamente importantes se definen por resultados positivos varias clases superiores al

nivel inferior de resultados positivos. A menudo es posible definir la especificidad del alérgeno en estos pacientes mediante un proceso minucioso de eliminación alimenticia combinada con una prueba de anticuerpo IgE. La prueba de anticuerpo IgE es útil en el diagnóstico de sospecha de sensibilidad a veneno(s) de himenóptero. Los individuos sensibles a los venenos de abejas de miel, abejas, avispones o avispas típicamente manifiestan signos de anafilaxís después de un picadura: después puede producirse urticaria, angioedema, broncoespasmo o colapso cardiovascular. La mortalidad publicada por reacciones sistémicas inducidas por picadura es de 30 a 40 casos anuales, pero esta cantidad probablemente subestima la incidencia real. La evolución natural de sensibilidad al veneno no tratada no se conoce completamente. En muchos pacientes con sensibilidad anafiláctica documentada, es posible obtener una historia clínica de reacciones progresivamente más graves a sucesivos episodios de picadura. Por otro lado, la sensibilidad al veneno aparentemente mejora en algunos individuos. La decisión de tratar a un paciente con inmunoterapia al veneno se basa en la evaluación clínica del riesgo de anafilaxia en posibles picaduras futuras. El indicador más fiable de la sensibilidad al veneno es la respuesla a una provocación con una picadura controlada (Parker, 1982). Sin embargo, generalmente no se realiza esta prueba y raramente se requiere en pacientes previamente no tratados para establecer el diagnóstico de sensibilidad al veneno. Las pruebas cutáneas al veneno y pruebas de anticuerpo IgE son útiles para confirmar la impresión de que existe sensibilidad clínica y para definir su especificidad. En esta situación clínica, la mayoría de los esludios indican que la prueba cutánea es la modalidad diagnóstica más sensible (Sobotka. 1978). Las pruebas de anticuerpo IgE al veneno son útiles ante todo para confirmar los resultados de pruebas cutáneas y para definir la especificidad alérgena de la hipersensibilidad al veneno. Excepto cuando se provoca la picadura, no hay pruebas in vilro o in vivo que realmente anuncien la respuesta clínica a una picadura de insecto en un paciente tratado después de inmunoterapia al veneno. Aunque los niveles de anticuerpos IgG en suero aumentan marcadamente con la inmunoterapia al veneno, no se ha definido un nivel límite que pueda utilizarse para identificar a los pacientes que ya no son de riesgo. Las estimaciones semicuantitativas de anticuerpos IgE no son útiles clínicamente, y los niveles de anticuerpos IgE después de tratamiento muestran que no hay relaciones consistentes con el estatus clínico. Medidas de anticuerpos IgE han sido también aplicadas al diagnóstico de hipersensibilidad a fármacos. Aunque muchos fármacos y sus metabolitos son capaces de provocar la síntesis de anticuerpos, sólo hay datos clínicos y resultados de determinaciones de anticuerpo IgE disponibles para la penicilina y sus metabolitos. La penicilina y su isómero, el ácido penicilinico, se combinan con proteínas del suero mediante uniones amidas. El conjugado peniciloil-proteína es el mayor determinante antigéníco, y el conjugado ácido penicilinico-proteina es el menor determinante antigéníco (Fig. 46-6). Los niveles medióles de anticuerpos IgM e IgG específicos para el determinante peniciloil se obtienen comúnmente en pacientes tratados con penicilina, y aunque persisten títulos elevados de estos anticuerpos en plasma durante periodos relativamente cortos, a menudo pueden detectarse títulos inferiores después del tratamiento (Sheperd, 1991). Los intentos realizados en el diagnóstico de hipersensibilidad a la penicilina han contado con pruebas cutáneas con penicilina, peniciloil-polilisina y una mezcla menor de antígenos. Los resultados positivos de pruebas cutáneas ocurren infrecuentemente, especialmente cuando la prueba se realiza mucho después del tratamiento con penicilina. Menos del 30% de los pacientes con posibles antecedentes de hipersensibilidad inmediata a la penicilina tienen pruebas cutáneas positivas, y las reacciones de hipersensibilidad inmediata a la terapia con penicilina son raras en pacientes con pruebas cutáneas negativas. Cuando se utilizan los resultados de las pruebas cutáneas como una referencia diagnóstica, los estudios clínicos han encontrado anticuerpos IgE medióles al determinante peniciloil casi en el 100% de los pacientes con pruebas cutáneas positivas. Los anticuerpos antipeniciloil son indetectables en sujetos control. Según estos datos, es razonable recomendar las pruebas in vitro para anticuerpos IgE-peniciloil sólo en pacientes con antecedentes de reacciones de hipersensibilidad reciente. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir inmediatamente después de reacciones mediadas por IgE y, aunque la mayoría de los datos

CAPITULO 46

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ENFERMEDADES ALÉRGICAS

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Figura 46-6. Metabolitos de penicilina, determinantes antigénicos mayor y menor. (De Rose NR, De Macano EC, Fahey JL. et al [eds¡: ManualotClinical Laboratoy Inmunoiogy. 4' ed. Washington DC. American Society tor Microbiology, 1992, pág. 719. con autorización.)

publicados indican que los resultados falsos negativos son raros, la ausencia de anticuerpos específicos de peniciloil-polilisina no excluye completamente la posibilidad de significado clínico de los anticuerpos IgE a otros metabolitos de penicilina (Weiss, 1988). Las enfermedades alérgicas, particularmente el asma, también pueden deberse a una gran variedad de alérgenos encontrados en el lugar de trabajo. El asma puede resultar tanto de mecanismos alérgicos como no alérgicos. La lista de agentes etiologicos relacionados con el asma alérgico ocupacional es larga e incluye los siguientes: proteínas animales, enzimas, proteínas de plantas, legumbres, anhídridos, sales metálicas, tintes, diisocianuros y polvo de la madera. Existen pruebas de anticuerpos IgE disponibles para varios de estos alérgenos. Recientemente, se ha puesto una especial atención en las gomas de látex como un alérgeno en el cuidado de la salud laboral y en ciertos pacientes, por ejemplo, pacientes con espina bifida que han sufrido diversos procedimientos quirúrgicos. La prueba de anticuerpo IgE a la goma de látex es útil para identificar individuos sensibles (Yunginger, 1994). Para finalizar esta sección respecto a la prueba de anticuerpo IgE. es apropiado resumir algunos de los puntos principales marcados anteriormente. La determinación de anticuerpos IgE es útil y puede recomendarse en las siguientes situaciones clínicas: 1) la evaluación de niños con un antecedente lamiliar de enfermedad alérgica importante y signos clínicos de enfermedad precoces: 2) la evaluación de niños y adultos sospechosos de tener enlermedad respiratoria alérgica para establecer el diagnóstico y definir la especificidad de la sensibilidad alérgena a pólenes, polvo, antígenos fungióos y alimentos: 3) para confirmar la expresión clínica de sensibilidad a alimentos específicos en pacientes con sensibilidad anafiláctica o con asma y angioedema: 4) para evaluar la sensibilidad a alérgenos de veneno de insectos, particularmente como una ayuda en la definición de la especificidad de veneno en aquellos casos donde las pruebas cutáneas sean confusas; 5) para confirmar el diagnóstico de hipersensibilidad a la penicilina en pacientes con sensibilidad anafiláctica; y 6) para confirmar la presencia de anticuerpos IgE a ciertos alérgenos ocupacionales, por ejemplo, goma de látex. La prueba de anticuerpos IgE no es útil como una prueba de detección sistemática para enfermedad alérgica, excepto si se realiza por un método analítico multialérgeno; y los resultados no son útiles para evaluar los efectos de

la mmunoterapia o excluir el diagnóstico de sensibilidad anafiláctica a venenos de insectos en pacientes tratados. Las pruebas para anticuerpos IgE están indicadas sólo en pacientes a los que se les ha realizado una historia médica y exploración (¡sica completa.

Pruebas para mediadores de reacciones de hipersensibilidad inmediatas y para anticuerpos IgG alérgeno-específicos Previamente, se han mencionado varios mediadores de reacciones de hipersensibilidad inmediata, incluyendo la histamina y los mediadores lípidos llamados leucotrienos y factores activadores de plaquetas. Cada uno de estos mediadores causan inflamación en enfermedades alérgicas humanas o en modelos animales de alergia y analilaxia. Estos mediadores inducen muchos de los efectos biológicos característicos de las reacciones alérgicas A pesar de estos descubrimientos, las determinaciones de los mediadores en líquidos corporales tienen una utilidad limitada clínicamente en el diagnóstico diferencial de enfermedades alérgicas. Las determinaciones de histamina en plasma u orina pueden ser válidas en pacientes con analilaxia cuando las pruebas se realizan inmediatamente después del episodio anafiláctico (Friedman, 1989), pero se requiere tener cuidado para obtener una muestra apropiada. La hemolisis puede provocar niveles de histamina falsamente elevados en la sangre y los alimentos ricos en histamina o colonización bacteriana pueden conducir a niveles falsamente elevados en orina. Una prueba muy útil en este entorno clínico es la determinación de triptasa en sangre (Schwartz, 1987,1989). La triptasa es una proteasa de suero de 134 kDa formada por cuatro subunidades unidas no covalenlemente y se encuentra en mastocitos y granulocitos basófilos. La liberación de triptasa desde las células sensibilizadas provoca una relación cruzada de anticuerpos IgE citofilicos. Tras la anafilaxia, los niveles de triptasa en sangre aumentan rápidamente (30 minutos a 1 hora) y permanecen elevados durante 12 horas. Por comparación, la histamina se aclara rápidamente de la sangre con una vida media de minutos. Los leucotrienos y factores activadores de plaquetas se activan localmenle y se encuentran en concentraciones mínimas en los líquidos corporales (Lewis, 1984).

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SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Otra clase de mediadores de la inflamación de interés en la alergia son los péptidos anafilatóxicos del complemento. C3a. C4a y C5a. producidos durante activación de la cascada del complemento (véase Cap. 38). El papel de estos péptidos como mediadores de la inflamación en la enfermedad alérgica no está bien establecido. Las anafilatoxinas humanas probablemente no se producen por interacción del alérgeno y anticuerpos IgE. Sin embargo, como el C5a provoca la contracción del músculo liso y aumenta la permeabilidad vascular, hay razones para una nueva investigación de las anafilatoxinas complementarias como mediadores inflamatorios en síndromes de anafilaxia. Los anticuerpos del isotipo IgE sensibilizan basófilos humanos y mastocitos durante largos periodos de tiempo, al menos 24 horas, y estos anticuerpos median directamente la liberación de histamina inducida por antígeno. como se comentó anteriormente. En diversas especies de animales, los anticuerpos IgG de una o más subclases también se ligan a células efectoras y originan la liberación de histamina. No está bien establecido el papel análogo de los anticuerpos IgG humanos. Algunos datos experimentales sugieren que los anticuerpos IgG humanos de la subclase lgG4 se ligan a leucocitos basófilos y pueden mediar en la liberación de histamina, y a menudo la concentración de la proteina lgG4 en suero se encuentra por encima de lo normal en adultos con asma (Homburger. 1986b). Sin embargo, los estudios clínicos no han podido demostrar un papel de la determinación de la proteina lgG4 o anticuerpos lgG4 en el diagnóstico o evaluación pronostica en pacientes con asma.

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CAPÍTULO 46

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ENFERMEDADES ALÉRGICAS

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C A P Í T U L O

47

ai Diagnóstico y tratamiento del cáncer mediante marcadores tumorales serológicos James T. Wu, Ph.D.

NEOPLASIA Y REGULACIÓN DEL CRECIMIENTO

1028

TIPIFICACIÓN DE MARCADORES TUMORALES

1030

EFECTO DE LOS ANÁLISIS DISEÑADOS

Respecto a la proliferación celular

Formato sandwich

Respecto a la diferenciación celular

Anticuerpo monoclonal frente al policlonal

Respecto a las metástasis

Anticuerpo heterófilo

Respecto a otros procesos asociados al tumor

MARCADORES TUMORALES PARTICULARES

Respecto a la transformación maligna

a- fetoproteína

Mutaciones heredadas

Moléculas de adhesión

Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales específicos APLICACIONES CLÍNICAS

1031

1037

Factores angiogénicos P -microglobulina ?

Examen colectivo

CA19-9. CA50yCA19-5

Diagnóstico

CA125

Monitorización del tratamiento

CA15-3

Detección de recidiva

CA 72-4

Pronóstico

Calcitonina

RECOMENDACIONES EN LA PETICIÓN DE MARCADORES TUMORALES

1036

Unión competitiva

Antigeno carcinoembrionario 1033

Oncoproteína c-erbB-2 (HER-2/neu)

Nunca se base en los resultados de una sola prueba

Cromogranina A

Cuando se piden pruebas consecutivas, asegúrese de pedir todas las pruebas al mismo laboratorio utilizando el mismo equipo de análisis

CYFRA21-1

Asegúrese de que el marcador tumoral seleccionado para controlar la recidiva esté elevado en el paciente antes de la cirugía Valore la vida media del marcador tumoral cuando se interprete el resultado de la prueba

Ciclinas Receptores de estrògeno y receptores de progesterona Gonadotropina coriónica humana LASA-P Enolasa neuronal específica p53

Valore cómo se elimina o metaboliza el marcador tumoral desde la circulación sanguínea

Proteína pS2

Trate de pedir múltiples marcadores para mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnóstico

Antígeno prostético específico

Pida marcadores no específicos para ahorrar costes y para una mayor sensibilidad Controle la posibilidad de efectos falseados Controle la presencia de marcadores tumorales ectópicos Existe un gran número de marcadores tumorales en la circulación sanguínea. Como el nivel sanguíneo de marcadores tumorales por lo general refleja el volumen de células tumorales y la actividad tumoral. la determinación de los marcadores tumorales en suero se ha convertido en un medio atractivo para la detección y el diagnóstico de enfermedades neoplásicas. incluso para el control de su evolución, especialmente durante el tratamiento La facilidad en la extracción de sangre y la sensibilidad de estos análisis de marcadores tumorales no invasivos también hace que las pruebas serológicas sean muy superiores respecto a otras exploraciones clínicas basadas en métodos físicos.

Hormona paratiroidea relacionada con péptidos PSA libre Carcinoma de células escamosas Antígeno polipéptido tisular BIBLIOGRAFÍA

1041

NEOPLASIA Y REGULACIÓN DEL CRECIMIENTO Para aprender cómo identificar, seleccionar y utilizar marcadores tumorales para el diagnóstico de cáncer y para el tratamiento de pacientes con cáncer, es imprescindible que uno esté familiarizado con los fundamentos de los procesos neoplásicos (véase Cap. 64). Es importante tener en mente que hay dos importantes procesos involucrados en el crecimiento celular, diferenciación y proliferación. En células normales, ambos procesos se encuentran bien

CAPÍTULO 47

•

DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIÓGICOS Tumor

1029

-l marcadores inmorales

Figura 47-1. Ilustración de cómo la pérdida de regulación en cé'ulas cancerígenas genera diferentes marcadores tumorales y cómo estos procesos tienen que ver con las dos importantes reacciones en el crecimiento celular.

regulados y bajo un estncto control. Cuando alguno de estos procesos pierde su regulación, aumenta el riesgo para las células normales de convertirse en células tumorales (Fig, 47-1). De hecho, cada vez que se produce un crecimiento tisular nuevo, es importante diferenciar entre dos posibles causas del nuevo crecimiento: hiperplasia o neoplasia. La mayor diferencia entre estos dos procesos similares también se relaciona con el control del crecimiento La hiperplasía tiene un propósito útil y está controlado por estímulos, mientras que la neoplasia no está regulada y no sirve a ningún propósito. Por tanto, se puede entender que la proliferación no regulada es una característica fundamental de todas las células neoplásicas, sin reparar en si el tumor es benigno o maligno. El resultado de la proliferación incontrolada nos llevará a la formación de una masa anormal de tejido, conocido como tumor. Seguidamente, el tumor continuará creciendo de forma irregular incluso después de retirar el

Figura 47-3. Ilustración de cómo los tumores están compuestos de células heterogéneas. Cada tipo de célula puede producir un marcador tumoral diferente. Los tumores de diferentes tejidos también son diferentes en cuanto a su composición celular pero pueden compartir células similares. Las bañas de la derecha enseñan la importancia del tratamiento de los múltiples marcadores tumorales para conseguir una sensibilidad del 100%. También indica que un patrón especifico de múltiples marcadores puede estar asociado con un tipo especial de tumor.

estimulo que provoca el cambio. Los tumores benignos se quedarán en esta primera fase y presentarán menos riesgo para el huésped. Los tumores benignos también tienen más posibilidades de curarse mediante una extirpación completa. No obstante, la inestabilidad genética asociada a las células tumorales las hace más susceptibles a mutaciones adicionales, que pueden llevar eventualmente a una enfermedad maligna (Fig. 47-2). Los tumores malignos habitualmente se asocian a diagnósticos erróneos y poca supervivencia debido a su capacidad y tendencia para extenderse y metastatizar por vía linfática y sanguínea. En general, todos los tumores benignos se encuentran bien diferenciados. Las neoplasias malignas, por otro lado, varían desde bien diferenciadas hasta indiferenciadas. Aparentemente, el control de la proliferación y diferenciación se pierde en los tumores malignos. Algunos de los tumores malignos parecen tener la escasa diferenciación fetal y producir sustancias similares a aquellas encontradas en tejidos fetales, las comúnmente conocidas como proteínas carcinoembriogénicas (Figs. 47-1 y 47-2). Las células malignas también pueden producir enzimas proteolíticas que facilitan su escape de su entorno inicial.

Figura 47-2. Ilustración de cómo células normales, después de múltiples mutaciones, se convierten en células malignas. Los marcadores tumorales tienen dilerente capacidad de pronóstico para las células tumorales y diferentes estados de desarrollo.

El cáncer en el ser humano habitualmente se desarrolla a partir de clones mulantes de células como resultado de transformaciones neoplásicas. La mayoría de los cánceres tienen origen monoclonal, pero se requieren múltiples mutaciones para producir células malignas. Las múltiples mutaciones que suceden en los tumores pueden provocar el desarrollo de la heterogeneidad celular del tumor. Es interesante observar que los tumores no eslan compuestos de células homogéneas; normalmente están constituidos por subpoblaciones celulares con fenotipos claramente diferentes (Schnipper, 1986). El proceso de evolución y progresión tumoral puede también generar diversidad biológica dentro y en los diferentes focos melastásicos. Una célula obtenida de un determinado tumor puede ser distinta por varios factores:

SECCIÓN V

1030

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

tasa de crecimiento, receptores superficiales celulares, inmunogenicidad. expresión de marcadores tumorales (Fig. 47-3). capacidad de invasión y metástasis, y respuesta a drogas citotóxicas (Fidler, 1982).

TIPIFICACIÓN DE MARCADORES TUMORALES A pesar de que el cáncer se origina por una transformación maligna de una célula normal, hay pocas diferencias en cuanto a la expresión fenotípica entre una célula cancerígena y una célula normal. Las mutaciones inducidas por el cáncer no parecen alterar ninguna de las expresiones genéticas o lenolípicas excepto en las regulaciones del crecimiento celular. En consecuencia, en los últimos años los esfuerzos para identificar un marcador tumoral especifico o un epítopo tumoral específico no han tenido éxito. Por otro lado, cualquier producto celular como enzimas, proteínas séricas, metabolitos, receptores, proteínas carcinoembríonarias, oncoproteínas y proteínas codificadas por genes supresores puede utilizarse como marcador tumoral siempre que tenga relación con algún proceso durante la formación o el crecimiento tumoral. así como en la transformación maligna, proliferación, diferenciación y metástasis. La evaluación clínica de algún marcador tumoral determinado dependerá de la intención de su utilidad clínica y de la especificidad y sensibilidad del marcador tumoral. El uso de marcadores tumorales como factores pronósticos o factores de riesgo también ha ganado más y más popularidad en estos últimos años. La determinación de los factores de riesgo es muy valiosa en la valoración de la agresividad de un tumor y útil en la selección de las estrategias de tratamiento (Fig. 47-4).

Respecto a la proliferación celular Muchas hormonas ¡gonadotropina coriónica humana (hCG)). proteínas séricas, enzimas (lactato deshidrogenasa [LD], fosfatasa alcalina [АР]) y sus metabolitos (ácido vanilmandélico [VMA], acido homovanílico [HVA], ácido 5hidroxiindolacético [5-HIAA]) pueden llegar a estar elevadas en los tumores debido a la alia velocidad de proliferación de las células tumorales. Sus concentraciones en suero aumentan incluso a concentraciones mayores cuando un tumor benigno se convierte en maligno y metastatiza. Como las enfermedades benignas y no malignas también pueden tener niveles de marcadores altos, no es conveniente el uso de estos marcadores para la detección sistemática ni para el diagnóstico de cáncer debido al gran número de falsos positivos. Estos marcadores se utilizan para monitorizar a los pacientes durante el tratamiento. Cáncer de inania

Respecto a la diferenciación celular Las proteínas carcinoembnonanas encontradas en ambos tejidos, letal y tumoral, pero no en el tejido adulto normal, normalmente carecen de alguna función fisiológica conocida y presentan niveles de concentraciones en sangre de milímetros por nanogramo (Figs. 47-1 y 47-2) Por tanto, las determinaciones de las proteínas carcinoembríonarias en sangre se deben realizar mediante inmunoanálisis. La especificidad y sensibilidad asociadas a estas proteínas, aunque no son del 100°», si son mucho mayores que otras enzimas y metabolitos utilizados como marcadores tumorales en el pasado. La concentración serológica de estas proteínas carcinoembríonarias no sólo se correlaciona bien con la actividad tumoral sino que también se utiliza para predecir el pronóstico. En general, las proteínas carcinoembríonarias no son convenientes en el examen colectivo: primero, los anticuerpos policlonales contra estas proteínas a menudo tienen reacciones cruzadas con otras proteínas normales, y segundo estas proteínas carcínoembrionarias no aparecen lo suficientemente pronto en la sangre de pacientes con cáncer. Sin embargo, se han utilizado como pruebas complementarias de diagnostico de cáncer y son extremadamente útiles para controlar el éxito del tratamiento y para detectar recidivas.

Respecto a las metástasis Las metástasis tumorales tienen varios pasos importantes (Liotta, 1987). Primero, las células tumorales tienen que penetrar en zonas cercanas, después invadirán el torrente sanguíneo o los vasos linfáticos. Entonces, las células tumorales viajan a zonas distantes, hasta que se alojan en lechos venosos o capilares de órganos distantes. En este nuevo entorno, estas células tumorales han de penetrar de nuevo por las paredes vasculares para crecer en este nuevo lugar. Todos los productos celulares liberados y sintetizados durante estos pasos son posibles factores de nesgo. Su aparición en el tejido tumoral o en la circulación sanguínea indica el riesgo o la aparición de metástasis o un pobre pronóstico. Las determinaciones de muchos de estos marcadores, sin embargo, están aún limitadas a tejidos tumorales o citosoles de tejidos tumorales.

Respecto a otros procesos asociados al tumor Aparentemente, las actividades enzimáticas de varias glucosiltransferasas órgano-específicas están alteradas en células tumorales. Algunas de las glucosiltransferasas elevadas se han utilizado como marcador tumoral. La secuencia del azúcar y la composición de parte del hidrato de carbono de muchas glucoproteínas séricas, incluidas sustancias del grupo sanguíneo y mucinas como CA 19-9. son marcadores tumorales resultantes de la alteración de la glucosiltransferasa. La AFP (alfa-fetoproteína) aislada en pacientes con hepaloma primario tiene una fucosa adicional comparada con la AFP de enfermedades benignas hepáticas, un ejemplo de la fucosiltransferasa alterada en células del hepatoma (Wu. 1990).

Respecto a la transformación maligna

Figura 47-4. Ilustración de cómo la afectación ganglionar determina el riesgo de las pacientes con cáncer de mama y del propio tratamiento. Actualmente se utiliza un panel con varios nuevos marcadores pronósticos determinados en el citoplasma del tumor junto con la determinación de ganglios para proporcionar una valoración más correcta de los riesgos para las pacientes con cáncer de mama.

Los oncogenes, que codifican proteínas que funcionan en todos los niveles de regulación del crecimiento, juegan un importante papel en la transformación celular (Druker. 1989). Estas oncoproteínas son similares a los productos normales de los protooncogenes excepto en que han perdido la tuerza reguladora de su actividad y no necesitan señales de activación externas para originar una proliferación celular. La determinación de la expresión tisular de estas oncoproteínas se ha utilizado para el pronóstico. Una de las oncoproteínas más extensamente estudiadas, llamada, proteina c-erbB-2 (p185), se ha detectado en el suero por inmunoanálisis. Una investigación posterior descubrió que el dominio extracelular del c-eroB-2 podría fraccionarse y liberarse a la circulación sanguínea. El dominio extracelular del p185 parece que se relaciona no sólo con la cantidad de p185 expresado en la membrana de la célula tumoral, sino también con el cambio de la concentración de muchos importantes marcadores tumorales séricos (Wu. 1995). Como la transformación maligna es un acontecimiento especifico en la carcinogénesis. cualquier producto celular asociado a este evento tiene la posibilidad de ser un marcador tumoral específico más. Es posible que otros receptores transmembrana reía-

CAPÍTULO 47

•

DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIÓGICOS

1031

Tampoco se necesita la caracterización e identificación completa de la molécula que lleva el epitopo. Un hibridoma se puede preparar inyectando a un ratón una fracción enriquecida de la membrana de la célula tumoral o incluso toda la célula tumoral. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales de interés se seleccionan para el procedimiento posterior de detección sistemática. Una vez concretado el hibridoma, se obtendrá un número ilimitado y consistente de anticuerpos monoclonales para diferentes utilidades. La especificidad tanto de los anticuerpos como del inmunoanalisis esta bien definida y es reproducible. Muchos de los problemas relacionados con los análisis que utilizan anticuerpos policlonales. como la reducción de una gran parte de la variación del anticuerpo e inconsistencias del análisis, desaparecerán o se reducirán sobremanera.

Figura 47-5. Ilustración de cómo se detinen e identifican los epítopos situados en la superficie de una gran molécula del marcador lumoral mediante anticuerpos monoctonales. Las diferentes moléculas pueden compartir los mismos epítopos. pero la composición global o el modelo de múltiples epítopos en distintas moléculas particulares pueden diferir entre ellas.

cionados con la transformación celular puedan comportarse similarmente y ser útiles como marcadores tumorales o indicadores de pronóstico. Se necesitan amplios estudios detallados sobre el c-erbB-2 y otras proteínas codificadas por oncogenes para evaluar completamente el potencial de las oncoproteínas en el diagnóstico y tratamiento de pacientes con cáncer.

También han fracasado las tentativas para identificar epítopos específicos tumorales usando anticuerpos monoclonales. Como sucede con los marcadores tumorales identificados por anticuerpos policlonales, sólo hay epítopos asociados al tumor (Fig. 47-5). No obstante, se ha demostrado que las pruebas para definir los marcadores tumorales para un tumor definido tienen una sensibilidad y especificidad más alta que otros que utilizan anticuerpos policlonales. Por ejemplo. CA 19-9. CA 125 y CA 15-3 son mucho más sensibles y especificas que el antígeno carcinoembrionario (CEA) en el carcinoma pancreático, ovarico y de mama, respectivamente. Estos marcadores (Tabla 471) están recomendados para reemplazar la prueba del CEA policlonal en el diagnóstico y tratamiento de pacientes con los carcinomas previamente mencionados. Muchos epítopos asociados al tumor comparten con varios marcadores tumorales derivados de diferentes tumores. Por eiemplo. CA 19-9, CA 15-3. y CA 125 se expresan en casi todos los carcinomas de distintos grados. Además de la participación de unos epítopos determinados en más de un carcinoma, también es posible que una sola molécula exprese más de un epitopo (Yu, 1991); por ejemplo, como sucede cuando CA 15-3 y CA 125 son expresados por la misma molécula de mucina en el suero.

Mutaciones heredadas Aparte de los oncogenes, pero igualmente importantes, está un grupo de genes supresores que han sido descubiertos incluso más recientemente. Las proteínas codificadas por genes supresores son responsables de la supresión del crecimiento celular. Estos genes supresores pueden sufrir supresiones o mutaciones resultando en la producción de productos del gen inactivos, que fueron encontrados en familias con alto riesgo de cáncer. Se han identificado los distintos genes supresores y las proteínas que codifican. Por ejemplo, la p53 se ha investigado considerablemente por su papel en distintos cánceres. Los genes supresores y sus productos son potencialmente útiles como marcadores tumorales para el examen colectivo e identificación de familias o individuos de alto riesgo. El descubrimiento de dos genes susceptibles (o genes supresores tumorales) para el cáncer de mama, llamados BRCA1 y BRCA2. ha generado recientemente un tremendo interés (Miki, 1994; Wooster. 1994). Los estudios (Easton. 1993) sugieren que las mutaciones en el BRCA1 son responsables de aproximadamente la mitad de todos los casos de cáncer de mama hereditario. Además, los portadores de las mutaciones del BRCA 1 también provocan un incremento del riesgo de cáncer de ovario, colon y próstata (Futreal, 1994). El BRCA2, segundo gen susceptible para el cáncer de mama, se cree que se encuentra en casi el 70% de casos de cáncer de mama hereditario que no se debe a mutaciones del BRCA1 y está relacionado con un aumento de nesgo en el cáncer de mama en hombres. El desarrollo de inmunoanalisis para la determinación de las proteínas que codifican BRCA1 y BRCA2 está en proceso y debería servir para la identificación de individuos de alto riesgo y sus familias.

Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales específicos El desarrollo de la tecnología del hibridoma ha tenido mucho impacto en la identificación de marcadores tumorales. Antes de conocer una molécula completa de una estructura proteínica conocida, actualmente es posible centrarse en una pequeña área de superficie, un epitopo o determinante antigénico mediante anticuerpos monoclonales (Fig. 47-5). Ya no se necesita purificar el antigeno para la preparación de anticuerpos policlonales en animales.

APLICACIONES CLÍNICAS Es esencial que se entienda el significado de las pruebas de sensibilidad y de especificidad de los marcadores tumorales antes de hablar sobre las aplicaciones de los marcadores tumorales (von Kleist, 1988; Sell, 1990). De hecho, la utilidad clínica de un marcador tumoral depende casi totalmente de la especificidad y la sensibilidad del marcador tumoral. Cuando el análisis de un marcador tumoral se dice que tiene una sensibilidad del 100%. significa que el análisis puede detectar a todos los pacientes con ese tipo concreto de cáncer, mientras que un análisis con una especificidad del 100% significa que el análisis identificará solamente a los pacientes con ese tipo especifico de tumor y no aquellos con enfermedad benigna o no maligna. En consecuencia, la sensibilidad es una medida de los verdaderos positivos y se calcula con la siguiente fórmula;

% Verdaderos positivos Sensibilidad = (% Verdaderos positivos + % Falsos negativos) Por otro lado, la especificidad es una medida de los falsos positivos y se calcula con la siguiente fórmula; % Verdaderos negativos Especificidad = (% Verdaderos negativos + % Falsos positivos)

Tabla 47-1

Determinación de m a r c a d o r e s tumorales mediante anticuerpos m o n o c l o n a l e s

M a r c a d o r tumoral

E n f e r m e d a d maligna importante

CA 125 CA 19-9

Carcinoma ovárico Carcinoma pancreatico

CA 15-3 CA 72-4

Carcinoma de mama Carcinoma gástrico

1032

SECCIÓN V

•

INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

Teniendo en cuenta esta información, se puede comenzar a hablar de las siguientes aplicaciones clínicas de los marcadores lumorales.

Examen colectivo El primer intento por parte de Gold (1965) en detectar el carcinoma colorrectal en hombres mediante radioinmunoanálisis (RÍA) de CEA en suero llevó al autor a la comprensión de que ninguno de los marcadores tumorales descubiertos tenía la especilicidad y la sensibilidad para el examen colectivo. En la actualidad no se recomienda el examen colectivo, especialmente en una población asintomática. Además de la carencia deseada de especificidad y sensibilidad de los marcadores tumorales, la baja prevalencia del cáncer y la baja sensibilidad y especificidad de los marcadores tumorales en general también se opone al examen colectivo de los cánceres. Se temia que la naturaleza no específica de la mayoria de los marcadores tumorales examinados pudiera crear demasiados falsos positivos y causar de forma innecesaria una alarma o preocupación en la población general. Por otro lado, hay excepciones donde el examen colectivo del cáncer está comprobado usando marcadores tumorales. El examen colectivo del hepatoma primario en China mediante el tratamiento de la AFP en suero es un buen ejemplo de estas excepciones debido a la alta incidencia de cáncer hepático en esta área del mundo (Wu, 1987). La posibilidad del examen colectivo de cáncer de ovario en mujeres con la determinación en suero del CA 125 sigue en proceso de investigación. El diagnóstico de cáncer oválico depende en principio de la cirugía. Sin embargo, en la mayoria de los casos, en el momento de la detección del tumor, éste se encontrará en estadio avanzado, donde la posibilidad de curación es baja. La recomendación de la identificación sistemática de cáncer de próstata mediante la determinación del antigeno especifico prostático (PSA) en suero junto con el tacto rectal digital (DRE) se debe a la especificidad del tejido para el PSA (Wu. 1994) y a la alta prevalencia del cáncer de próstata en hombres a partir de los 50 años de edad. Está especialmente recomendado en hombres afroamericanos, debido a que el porcentaje de incidencia para este grupo es casi el doble que para la población general, y el porcentaje de mortalidad es Ires veces superior. El examen colectivo permite el tratamiento confinado al órgano, potencialmente curable del cáncer de próstata descubierto en hombres con una esperanza de vida superior a 10 años. La combinación de la prueba del PSA y del DRE proporciona el mínimo coste considerado para la detección precoz del cáncer de próstata (Littrup, 1993).

Diagnóstico Los problemas tanto de la especificidad como de la sensibilidad asociados a la mayoría de los marcadores tumorales excluyen su determinación en el diagnóstico del cáncer. La frecuencia de detección de niveles elevados de marcadores tumorales en enfermedades no malignas y la coexistencia observada entre las concentraciones normales y las concentraciones de marcadores tumorales en pacientes con cáncer se oponen a su uso en el diagnóstico. La mayoría de los marcadores tumorales usados en la actualidad no pueden distinguir las enfermedades malignas de las benignas. Los marcadores tumorales, no obstante, siguen utilizándose con éxito como prueba complementaria para la detección del cáncer. Se han propuesto recientemente varios abordajes para mejorar la especificidad diagnóstica de muchos marcadores lumorales. El uso de múltiples marcadores es un abordaje que ha tenido gran aceptación. Los patrones específicos de múltiples marcadores tumorales parecen estar relacionados con determinadas enfermedades malignas. Los principales inconvenientes para el uso de múltiples marcadores tumorales son el coste y los rigores de la propia selección de los marcadores tumorales para incluirlos en el panel. Otro abordaje para mejorar tanto la especificidad como la sensibilidad de un marcador tumoral. como en el caso de la prueba de PSA en suero, implica la medida de la velocidad (porcentaje de aumento en la concentración de PSA en el tiempo) y la densidad (p. ej.. dividiendo la concentración de PSA en suero entre el volumen de la glándula prostética, determinado por ecogralía transrectal) (Benson, 1992). Un ligero aumento del nivel de PSA en suero asociado con una glándula prostética pequeña puede indicar cáncer, mientras que la misma valoración en un paciente con una glándula grande puede indicar sólo una hiperplasia prostética benigna (HPB).

Monitorización del tratamiento Una de las dos aplicaciones más útiles de los marcadores tumorales implica el control del curso de la enfermedad, especialmente durante el tratamiento. En la Figura 47-6 se muestra el cambio en los niveles en suero de diversos marcadores tumorales durante el curso de un cáncer ovárico en una paciente. El nivel en suero de los marcadores tumorales refleja bien el éxito de la cirugía o la eficacia de la quimioterapia. Cuando se detectan niveles elevados de un marcador tumoral después de la cirugía, esto puede indicar una extirpación incompleta del tumor recidiva, o la presencia de metástasis. La determinación de los marcadores tumorales en suero durante la quimioterapia también aporta una indicación de la elicacia del citostálico utilizado y una guía para la selección de los medicamentos más efectivos para cada caso en particular.

Detección de recidiva La segunda aplicación más útil de los marcadores tumorales es controlarlos para la detección de recidiva después de la extirpación quirúrgica del tumor. Se sabe que la aparición de la mayoria de los marcadores tumorales circulantes tiene un "tiempo de adelanto" de vanos meses (de tres a seis meses) antes de cualquier procedimiento físico utilizado en la detección del cáncer. La facilidad de su detección en sangre y la sensibilidad de los marcadores tumorales hacen que este proceso de control no invasivo sea aceptado de forma generalizada en la actualidad. La especificidad de los marcadores tumorales no presenta un problema para esta aplicación.

Pronóstico La estimación de la agresividad tumoral y el pronóstico para la evolución del paciente con cáncer han ganado creciente popularidad en estos últimos años. El conocimiento de la agresividad lumoral también ayuda al desarrollo de una terapia apropiada para el paciente. Por ejemplo, la detección de marcadores tumorales. altamente asociada con malignidad y metástasis, apuntará un tratamiento más riguroso y sistémico. La mayoría de los marcadores tumorales se elevan cada vez más cuando el tumor metastatiza. Desdichadamente, muy pocos marcadores tumorales tienen un límite bien definido entre estadios benignos y malignos. Los (actores de riesgo asociados al proceso de metástasis tumoral, como proteasas y moléculas de adhesión, son habitualmente mejores marcadores para predecir el pronóstico. Sin embargo, la mayoria de estos marcadores aún se determinan en tejidos tumorales y citoplasmas. El hallazgo del dominio extracelular de la proteína c-eroB-2 en el suero y la correlación entre el dominio extracelular del suero con los niveles de otros marcadores tumo-

Día Figura 47-6. Ilustración del cambio de los niveles en suero de CA 125 en el transcurso de la enfermedad en una paciente con cáncer ovárico. También se acentúa el hecho de que múltiples marcadores pueden aumentar o descender conjuntamente. Los niveles de los marcadores tumorales se normalizan dividiéndolos por sus cotas superiores normales.

CAPÍTULO 47

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DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS

rales en suero es alentadora. Se espera que en un futuro cercano sea posible la determinación en la circulación sanguínea de estos factores de riesgo para el pronóstico.

1033

tardarán 30 días para disminuir a un rango no detectable después de un éxito quirúrgico.

Valore cómo se elimina o metaboliza el marcador RECOMENDACIONES EN LA PETICIÓN DE MARCADORES TUMORALES Cuando se solicitan marcadores tumorales como prueba diagnóstica complementaria y para el tratamiento de los pacientes con cáncer, se deben considerar las siguientes recomendaciones para evitar equivocaciones en los resultados de las pruebas.

Nunca se base en los resultados de una sola prueba Debido a que la mayoría de los marcadores tumorales no son específicos, es difícil diferenciar entre enfermedades malignas y otras enfermedades benignas o no malignas basándose en los resultados una sola prueba. La mayoría de las elevaciones encontradas en las enfermedades no malignas son frecuentemente transitorias, mientras que en el cáncer los niveles se mantienen elevados o aumentan continuamente. La petición de pruebas consecutivas puede ayudar a detectar falsos niveles de elevación debidos a elevaciones transitorias. El mejor ejemplo es la AFP en suero. La AFP elevada en suero puede detectarse en pacientes con hepatoma primario o con enfermedades hepáticas. Sin embargo, en una segunda prueba dos semanas más tarde la AFP en suero permanecerá elevada en pacientes con cáncer, mientras que en pacientes con enfermedades hepáticas la AFP en suero volverá a un nivel normal.

Cuando se piden pruebas consecutivas, asegúrese de pedir todas las pruebas al mismo laboratorio utilizando el mismo equipo de análisis Cada equipo comercial distinto puede generar diferentes resultados aunque todos estén diseñados para el mismo marcador tumoral. Cuando se piden desde el mismo laboratorio también se garantiza una mayor seguridad en la ejecución. Es importante asegurarse de que algunos cambios observados durante el proceso controlado se deben al cambio del volumen tumoral o a otras actividades tumorales y no a la variabilidad de laboratorio (Fig. 47-6).

Asegúrese de que el marcador tumoral seleccionado para controlar la recidiva esté elevado en el paciente antes de la cirugía Como ninguno de los marcadores tumorales tiene una sensibilidad del 100% en la detección de un determinado cáncer, para estar seguro es importante que el marcador tumoral concreto para detectar la recidiva esté elevado antes de la cirugía. De lo contrario, se deberían detectar múltiples marcadores antes de la cirugía para seleccionar el marcador tumoral más elevado que pueda controlar la actividad de la enfermedad.

Valore la vida media del marcador tumoral cuando se interprete el resultado de la prueba Estime el tiempo requerido para que el nivel determinado antes de la cirugía disminuya al nivel normal o. en el caso del PSA, a un nivel indetectable basándose en el conocimiento de la vida media de los marcadores tumorales. Es importante que la determinación de las concentraciones de marcadores tumorales para determinar el éxito de la extirpación quirúrgica de ese determinado tumor no se realice antes de las dos semanas del postoperatorio. Sería preferible esperar todo un mes debido al tiempo necesario para que los niveles de marcadores tumorales preexistentes en suero desciendan a niveles más bajos. Por ejemplo, la vida media del PSA en suero es de aproximadamente tres a cuatro días; por tanto, 50 ng/'ml de PSA en suero

tumoral desde la circulación sanguínea A menudo se detectan marcadores tumorales elevados en suero en pacientes con enfermedad renal o hepática, dependiendo de si el marcador tumoral se elimina por filtración glomerular o se metaboliza por el hígado. Por ejemplo, el CEA en suero a menudo se eleva en pacientes con enfermedades hepáticas porque el hígado dañado es incapaz de eliminarlo eficazmente de la circulación sanguínea, mientras que una |J-microglobulina (|i2M) elevada a menudo se detecta en pacientes con fracaso renal, donde hasta la pequeña molécula (Í2M tiene dificultad para atravesar la membrana glomerular de una manera normal. 2

Trate de pedir múltiples marcadores para mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnóstico Como se ilustra en la Figura 47-3, los tumores están formados por células heterogéneas. Algunas pueden incluso ser células normales y otras pueden ser células tumorales heterogéneas como resultado de una secuencia diferente de múltiples mutaciones. Cada tipo de célula puede expresar un único marcador o un numero de marcadores tumorales característico. El mismo marcador puede también ser producido por diferentes tipos de células. Puede que algunas células nunca produzcan un solo marcador. Como se ilustra en la Figura 47-3, los distintos tumores que derivan del mismo tipo de tumor aparentemente pueden incluso ser heterogéneos en su composición celular. Igualmente, se necesita más de un marcador tumoral para proporcionar una sensibilidad en la detección del 100%. La heterogeneidad en la composición celular y el porcentaje de la distribución celular de cada tumor explican por qué se necesita un número de marcadores tumorales para alcanzar el 100% de sensibilidad de detección y por qué la sensibilidad de un marcador en particular también es diferente entre pacientes con cáncer. En la Tabla 47-2 se detallan múltiples marcadores tumorales relacionados con enfermedades malignas particulares: la aparición de marcadores tumorales característicos en varias neoplasias se detalla en la Tabla 47-3. Esto explica por qué ninguno de los marcadores tumorales utilizados actualmente tiene una especificidad y sensibilidad del 100%. y por qué el uso de múltiples marcadores mejorará la sensibilidad de detección. Sin embargo, un único patrón de múltiples marcadores puede identificarse en tumores derivados de los mismos tejidos. Por tanto, al pedir múltiples marcadores tumorales también se mejorará la especificidad. Por ejemplo, un patrón específico puede estar asociado a carcinomas de colon, de mama, de ovario y de páncreas cuando los cuatro marcadores tumorales determinados por anticuerpos monoclonales, como CEA. CA 19-9, CA 15-3 y CA 125, se miden simultáneamente. Esta información es clínicamente importante, ya que más del 60% de los cánceres que se tratan son carcinomas derivados del epitelio celular (Wu, 1989). Se desarrollaron múltiples marcadores para una estrategia de detección precoz mas especifica para el cáncer ovárico. Se vio que el uso de CA 15-3 y TAG72 junto con CA 125 puede aumentar la especificidad aparente de los análisis de CA 125 para distinguir enfermedades malignas de benignas (Bast, 1991). Se debería tener en cuenta que durante la selección de los múltiples marcadores tumorales, sólo se deberían de seleccionar los marcadores que son complementarios unos con otros. Aquellos numerosos marcadores tumorales que van paralelos a la actividad tumoral no deberían seleccionarse para este propósito.

Pida marcadores no específicos para ahorrar costes y para una mayor sensibilidad Si el único objetivo es controlar la eficacia del tratamiento, debería considerarse el uso de marcadores tumorales no específicos (Tabla 47-4). Aunque estos marcadores no específicos carecen de especificidad para el diagnóstico y, en lo que respecta a algunos tipos específicos de tumores, sus concentraciones son sin duda muy sensibles a algunos cambios en la actividad tumo-

Tabla 47-2

INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA

SECCIÓN V

1034

Marcadores tumorales s e r o l ó g i c o s relacionados con enfermedades malignas particulares

Tumores pituitarios acromegálicos Tumores pituitarios suprarrenales Leucemia de lintocitos B crónica Linlocitos B malignos Cáncer de vejiga

Hormona del crecimiento Cortisol TdT B2M

Cáncer de hueso Tumor cerebral Cáncer de mama

Foslatasa alcalina Desmesterol CA 15-3

Carcinoma broncogénico Tumores carcinoides Cáncer cervical Conocarcinoma Cáncer colorrectal Leucemia mieloide crónica Síndrome de Cushing Tumores pancreáticos endocrinos Carcinoma gástrico

Prolactina

Gastrinoma Glucagonoma Leucemia de células peludas Tumores de cabeza y cuello Carcinoma hepatocelular Hipercalcemia maligna Enfermedad de Hodgkin Insulinoma Cáncer de duodeno Tumores renales Leucemia

Gastnna Glucagón Receptor IL-2 SCC AFP Péplido relacionado con PTH

Cáncer de pulmón Lmfoma Cáncer medular de tiroides Antigeno de melanoma Microadenomas (pituitaria) Mieloma múlliple Mesotelioma Microadenomas Neoplasias endocrinas múltiples Tumor testicular no seminomatoso Neuroblastoma Tumores no-islotes Cáncer microcítico Osteosarcomas Carcinoma ovárico Carcinoma pancreático

Tumores de islotes pancreáticos Cáncer tiroideo papilar y folicular Tumores paratiroideos Feocromocitoma Tumores pituitarios Tumores placentarios Leucemia de células plasmáticas Carcinoma prostálico Carcinoma de células renales Sarcoma Seminoma Tumores de bazo Cáncer de células escamosas Cérvix Pulmón Cabeza y cuello Cáncer de estómago Teratoblastoma Cáncer testicular no seminomatoso Cáncer uterino Vipoma (páncreas)

Otros marcadores

Marcador importante

Enfermedades malignas

SCC hCG CEA TdT ACTH Polipéptido pancreático CA 72-4

IGF-I Catecolaminas libres, DEA, 17-cetoesteroides, prolactina B2M en suero. LASA-P LD Antígeno-T, inhibidor de urocinasa, CEA, TPA. citoqueratinas, glucosammoglucosas Protema de Bence Jones, hidroxiprolma. calcio en suero Poliaminas CEA, calcitonina. CA 549, CA M26. CK-BB. termina, B-hCG. LASA-P, prolactina, proteína P 21, PS-2 Histamina, ADH, bradicmina Anticuerpos AG-4. CA 125, CEA, TPA CA 19-5, CA 19-9, CA 72-4, CK-BB, NSE Endorfina. lípotropina CA 19-9, CA 50, CEA, ferritina, CK-BB. hCG. LASA-P, pepsinógeno II, prolrombina

CEA, ferritina, rGT, ALP. TPA, y-glutamiltranspeptidasa LASA-P. ferritina

Insulina ADH CEA TdT

Péptido-C, proteina I aglutinante IGF-I

NSE ALP, ß2M, ferritina, LDH. protema mielina básica. NSE adenosine deaminasa, PNP ACTH, CK-BB, calcitonina. CA 72-4. CEA, AFP, lerritina. LASA-P. TPA B2M TdT. Ki-67, LASA-P Calcitonina NSE LASA-P relacionado con melanoma, i-dopa NSE, catecolaminas plasmáticas Prolactina Inmunoglobulina densa de cadena ligera y densa Proteína de Bence Jones. ß2M. IgA Ácido hialurónico Prolactina Cromogranma A AFP hCG VMA HVA. NSE. cistationina, ferritina, metanefrinas Insulina como factor de crecimiento ACTH, ADH, CEA, CK-BB, NSE, bombesina, calcitonina ALP UGF, inhibina. AFP, isoenzima amilasa, CEA. CK-BB. CA 125 hCG, galactosiltransferasas, LDH. TPA CA 19-5. CA 50. CA 72-4, CEA, CK-BB, ADH. ALP. CA 19-9 ferritina. isoenzima II galactosiltransferasa. Y-glutamiltranspeptidasa, PAP Insulina Tiroglobulina PTH íntegro Cromogranma A, catecolaminas plasmáticas Metanetnna FSH, LH, prolactina, TSH othCG libre hCG a-hCG libre TdT PSA PAR ALP, CEA, CK-BB, TPA Renina, eritropoyetina, interleucina-4, prostaglandina A. CA 15-3, hormona paratiroidea, NSE, prolactma B2M NSE Ferritina SCC SCC SCC CA 72-4 AFP hCG AFP SCC VIP

CYFRA 21-1 Ferritina CEA, NSE hCG. ferritina ß-hCG, LDH

La labia continúa en la siguiente página

CAPÍTULO 47

Tabla 47-2

DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS

1035

M a r c a d o r e s tumorales serológicos relacionados c o n e n f e r m e d a d e s m a l i g n a s particulares (continuación)

E n f e r m e d a d e s malignas Enfermedad de Waldenstrom Síndrome de Zollinger-Ellison

M a r c a d o r importante

Otros marcadores

Inmunoglobulinas IgM Gastrina

2M

ACTH = hormona adenocorticolropa: ADH = hormona antidiurética; AFP • -letoproteina; ALP = tosfatasa alcalina; AMF = tactor de motilidad autocrino; 2M = beta microglobulina; HPB = hiperplasia prostática benigna; CEA = antlgeno carcinoembrionario; CK-BB = isoenzima BB creatina cinasa; DEA = dehidroepiandrosterona. FDP = productos de degradación de fibrina; FSH = hormona lollculo-estimulanle: Gl = gastrointestinal; GT = gamma-glutamil Iransferasa; hCG = gonadolropina orlonica humana. HVA = ácido homovanilico; IGF-I = factor de crecimiento insulinico I: IL-2 = interleucina; LASA-P = ácido siálico relacionado con lipidos: LD = laclato deshidrogenasa: LH = hormona lutemizante; NSE = enolasa especílica neuronal PAP = fosfatasa ácido prostático: SCC = antigeno de células escamosas óe carcinoma. TdT = deoxinucleotidol transferasa terminal; TPA = antlgeno de tejido polipéptido; TSH = lirotropina; VIP • pohpéptido intestinal vasoaclivo. VMA = ácido vanilmandélico.

Tabla 47-3

E n f e r m e d a d e s m a l i g n a s relacionadas con m a r c a d o r e s t u m o r a l e s s e r o l ó g i c o s particulares E n f e r m e d a d e s m a l i g n a s asociadas

Marcador tumoral"

Enfermedades menos importantes

Enfermedades importantes

AFP -hCG. cadena libre 2M

Carcinoma hepatocelular primario Tumores pituitarios Neoplasias de linfocilos B

CA 15-3 CA 19-9 CA 72-4 CA 125 -hCG Proteína de Bence Jones Bombesina CA 549 CA M26 Calcitonina CEA c-erbB-2 oncoproteína Cromogranina A

Cáncer de mama Carcinoma pancreático y gástrico Carcinoma gástrico Carcinoma ovárico Coriocarcmoma Mieloma multiple Cáncer microcítico Cáncer de mama Cáncer de mama Carcinoma medular Carcinoma colorrectal Cáncer de mama Feocromocitoma. neuroblastoma

CYFRA 21-1 Desrnesterol DEA ADN Ferritina

Carcinoma de células escamosas del pulmón Tumores cerebrales Cáncer adrenal/pituitaria Carcinoma cervical Leucemia mieloide aguda

Galactosillranslerasa Isoenzima II galactosillranslerasa Gastrina Histaminasa hCG

Cáncer de ovario Cáncer pancreático Gastrinoma Cáncer medular/tiroideo Coriocarcinoma

Linfoma de Hodgkin, neuroblastoma y vanos carcinomas, leraloblastoma

Ácido hialurónico IgA IGF-I Receptor IL-2 Inmunoglobulinas

Mesotelioma Mieloma múltiple Cáncer hipofisario Leucemia Mieloma múltiple

Carcinoma gástrico, ovárico y de mama, tumores trofoblásticos o de células germinales, cáncer testicular

Inhibiría Insulina como factor de crecimiento Catacalcina 17-cetoesteroides LASA-P Antígeno relacionado con melanoma Metanefrinas Enolasa neuronal especifica Polipéptido pancreático Proteina P 21 Catecolaminas plasmáticas PNP POA PSA PAP Proteína PS-2 SCC

Tumores de célula granulosa Tumores de células no-islotes Cáncer medular de tiroides Cáncer adrenal/pituitaria

Linfoma mediterráneo, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma maligno

TdT Tiroglobulma TPA TAG 72 Inhibidor de urocinasa VIP

Leucemia Cáncer tiroideo No especifico Carcinoma gástrico Tumores de vejiga Vi poma

'Véase Tabla 47-2 para abreviaturas.

Melanoma Feocromocitoma Carcinoma microcítico de pulmón Tumor endocrino Cáncer de mama Feocromocitoma Leucemia Cáncer pancreático Cáncer de próstata Cáncer de próstata Cáncer de mama

Teratoblastomas de ovarios y testículos Mieloma múltiple, linfoma de linlocitos B. leucemia linlocítica de linfocilos B crónica y células reticulares, sarcoma enfermedad de Waldenstrom Carcinomas varios Carcinomas vanos Carcinomas varios Carcinomas varios Cánceres testiculares (no seminomatosos). tumores trolobláslicos

Cáncer de tiroides, cáncer de hígado, cáncer renal Carcinomas varios Carcinomas varios Neoplasias endocrinas múltiples, cáncer microcítico de pulmón, tumores carcinoides

Síndrome de Zollmger-Ellison

Insulinoma

Carcinomas varios, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin Neuroblastoma, ganglioneuromas Neuroblastoma, tumores renales

Hipertrolia prostática benigna (HPB) Algunas leucemias Carcinoma de células escamosas del útero, cérvix, SCC de pulmón y de cabeza y cuello

Carcinomas varios Cáncer colorrectal, de pulmón, pancreático y de ovario

SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA

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Tabla 47-4 M a r c a d o r e s t u m o r a l e s n o específicos* Antlgeno Tennessee CEA (policlonal) Antigeno del tepdo polipéplido

B2M

Ácido siálico relacionado con llpidos •Véase Tabla 47-2 para abreviaturas.

El Colegio Americano de Médicos también ha publicado las directrices clínicas en lo que se refiere a la detección precoz del cáncer de próstata. Subrayan la importancia de la identificación sistemática del PSA y de la realización del DRE en la detección precoz del cáncer de próstata. Aunque el DRE no es tan sensible como el de la identificación sistemática del PSA, detecla el cáncer que de otro modo podría no detectarse con el PSA (Coley, 1997a b).

EFECTO DE LOS ANÁLISIS DISEÑADOS ral. Muchos de ellos son económicos y fáciles de determinar y son. por tanto, útiles para controlar la terapia y para detectar una recidiva en pacientes con diagnóstico conocido. Por eiemplo. el ácido siálico P asociado a lípidos (LASA-P) puede cuantificarse con un procedimiento de calorimetría simple, rápido y económico y su concentración en suero está estrechamente relacionada con las concentraciones en suero de muchos marcadores tumorales de alta especificidad.

Controle la posibilidad de efectos falseados Uno de los inconvenientes del popular inmunoanálisis de tipo sandwich es la capacidad para provocar efectos engañosos (Wu. 1991). El efecto trampa que tiene lugar en un inmunoanálisis tiende a dar un valor falsamente bajo cuando la concentración del marcador tumoral en la muestra sube por encima de una muy elevada concentración. El nivel exacto de marcador tumoral donde puede producirse un efecto trampa depende del diseño de la prueba y de la concentración de anticuerpos utilizada en el análisis. El uso de la misma muestra para dos diluciones distintas (sin diluir y dilución de 1:10) revelará el efecto trampa. La muestra diluida 1:10 normalmente producirá un valor 10 veces menor que otra muestra no diluida. Si hay un efecto trampa, la muestra diluida 10 veces producirá un valor más alto que la muestra original (después corregir con el factor de dilución). El análisis del marcador tumoral deberá repetirse con una muestra diluida 10 veces cuando el resultado de un inmunoanálisis de tipo sandwich sea demasiado bajo para equiparar la gravedad clínica del paciente.

Controle la presencia de marcadores tumorales ectópicos La expresión de marcadores tumorales tiene una regulación genética. Para tumores benignos, los marcadores producidos por el tumor normalmente son específicos para células y están relacionados con los productos celulares normales en una elevada concentración (Figs. 47-1 y 47-2). Cuando el tumor benigno se convierte en agresivo y más maligno, las células comienzan a perder el control y se convierten en autónomas. Las proteínas que normalmente se encuentran en un estado fetal precoz, y no se expresan en el tejido adulto normal, empiezan a aparecer en el tumor como resultado de la pérdida de la regulación de la expresión genética. Esta es la razón por la que las proteínas carcinoembrionarias y los marcadores tumorales ectópicos normalmente se expresan en enfermedades malignas avanzadas. En otras palabras, la aparición de marcadores tumorales ectópicos se asocia a un mal pronóstico o metástasis. Por ejemplo, las concentraciones elevadas de AFP en suero pueden detectarse en pacientes con cánceres del tracto gastrointestinal con metástasis, aunque las pruebas de luncion hepática sean normales. En la Tabla 47-5 se muestran algunos de los marcadores ectópicos conocidos y las enfermedades malignas asociadas. Hay que tener en cuenta las recientes directrices sobre el uso de marcadores lumorales gastrointestinales y de mama publicados por la Sociedad Americana de Oncología Clínica (Smith, 1999). Ellos recomiendan que se deberia realizar una autoexploración mamaria mensual, mamografia anual de la mama conservada y de la contralateral, y una historia clínica detallada y exploración física cada 3 ó 6 meses durante dos años, y después anualmente. No recomiendan el uso de marcadores tumorales. como son CEA, CA 15-3 y CA 27.29. para el examen colectivo. Ni tampoco recomiendan de forma habitual la gammagrafia ósea, la radiografía de tórax, el recuento hematológico sanguíneo, la ecografia hepática o las imágenes de tomografía computarizada.

El impacto del diseño de una prueba, incluida la selección de anticuerpos, no sólo afecta a la sensibilidad y especificidad de la prueba y al porcentaje de concentración, sino que también afecta al nivel de marcador tumoral donde aparece el electo trampa y si un resultado falso negativo o falso positivo provocará interferencias.

Unión competitiva El primer RÍA desarrollado se basó en el formato de unión competitiva. La combinación de una prueba de unión competitiva con un antigeno marcado radiactivamente aportaba la sensibilidad necesaria para cuantificar muchos marcadores tumorales circulantes, especialmente las proteínas carcmoembrionarias, en los rangos de concentración de nano y picogramo por mililitro. La base de este formato de prueba incluye la competición entre una cantidad fija de antigeno marcado radiactivamente y del antigeno en la muestra con una cantidad limitada de anticuerpo. Después de la separación del compuesto antígeno-anticuerpo del antigeno libre, la medida de la radiactividad del compuesto permitirá la estimación de la cantidad de antigeno presente en la muestra. En la Figura 47-7 se presentan dos formatos de prueba diferentes, uno para RÍA y uno para el enzimommunoanálisis absorbente (ELISA). No obstante, algunas sustancias que interfieren en la unión entre antigeno y anticuerpo provocarán un resultado falsamente elevado. Lo que no se tuvo en cuenta es el hecho de que la misma sustancia que interfiere y que está presente en un análisis empleando el mismo antigeno y anticuerpo en formato sandwich producirá un resultado falsamente negativo (Wu. 1983). En la década de los 80 se mostró que los dos sistemas importantes comercializados de CEA, uno de Abbott empleando un formato sandwich y uno de Roche usando el formato de unión competitiva, no producían el mismo resultado de CEA de las mismas muestras cuando las muestras contenían sustancias que interferían, como las giucosaminoglucanos.

Formato sandwich El ELISA, usando el formato sandwich, se ha convertido en el método más popular para la cuantificación de marcadores tumorales. En este caso, un anticuerpo específico es adsorbido a la tase sólida. Después se añade una solución del antigeno y se deja que se una. Después del tiempo suficiente de incubación y lavado, se añade un anticuerpo marcado con enzimas en la lase sólida y se deja incubar. El anticuerpo marcado que no esta unido se retira y el resto de la fase sólida contiene el antigeno "en sandwich" entre el anticuerpo adsorbido a la fase sólida y el anticuerpo marcado. Luego se

Tabla 47-5

M a r c a d o r e s tumorales ectópicos*

AFP Calcitonina

C'omo(jr;irun;i A

rx-hCG libre hCG

Tiroglobulina

Carcinoma Gl. renal, de pecho, de vejiga y de ovario Carcinoma de pulmón, de células no-islolos. carcinoide. de mama, medular y de ovario. feocromocitoma Para tumores endocrinos (carcinoma medular de tiroides, adenoma de adenohipófisis. carcinoma de células de islotes pancreáticos) Carcinoma colorrectal y tumores pancreáticos endocrinos Carcinoma gástrico y pancreático, hepatoma, adenocarcinoma ovárico tumores de células germinales de los testículos Carcinoma tiroideo diferenciado

"Véase Tabla 47-2 para abreviaturas

CAPÍTUIO 47

•

DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS

Aglutinación competitiva

Formato sandwich

1037

rando por tanto una respuesta analítica falsa. Se conoce que entre el 15% y el 40% de los individuos puede tener uno o mas anticuerpos heterófilos. El método estándar para reducir la interferencia de anticuerpos heterófilos es incluir en el análisis mucho suero de ratón o inmunoglobulmas de ratón no especificas en el inmunoanálisis.

MARCADORES TUMORALES PARTICULARES cx-fetoproteína Figura 47-7. Ilustración de las diferencias importantes entre los dos formatos de prueba importantes de mmunoanáiisis. La interferencia en la aglutinación competitiva produce un valor falsamente elevado; en un formato sandwich produce un resultado falsamente bajo.

añade el sustrato enzimático y el desarrollo colorimétrico resultante es proporcional a la cantidad de antigeno en la solución de la prueba. Aunque se disponen de otros marcadores distintos de enzimas, la enzima sigue siendo el marcador más popular. La sensibilidad de ELISA puede acercarse a la del RÍA, especialmente cuando se usa un sistema de amplificación biotina-avidinalEngvall, 1971). Recientemente, el formato de prueba de la unión competitiva ha desplazado al procedimiento de sandwich. A pesar de las muchas ventajas asociadas al nuevo formato, puede persistir el problema de los efectos trampa al obtenerse un valor falsamente bajo de una muestra que contiene una concentración altamente elevada de marcadores lumorales. Por ejemplo, se produjeron valores falsamente bajos de CA 19-9 en el equipo Centocor, empleando un formato sandwich, con muestras que contenían niveles altamente elevados de CA 19-9. Sin embargo, cuando se utilizó el equipo de RÍA Biomira, basado en un principio de aglutinación competitiva, se pudieron evitar completamente los valores falsamente bajos de CA 19-9. La utilización del equipo de RÍA Biomira también reduce el número de repeticiones debido a que el nivel de CA 19-9 en la muestra puede aproximarse por la canlidad de radiactividad (Wu. 1991).

Anticuerpo monoclonal frente al polielonal

La AFP es una proteína fetal importante del suero y también una de las más importantes proteínas carcinoembrionarias (Wu, 1987). La AFP se parece a la albúmina en muchas propiedades fisicoquímicas. En el feto, la AFP es sintetizada por el saco vitelino y por los hepatocitos fetales y en menor grado por el tracto gastrointestinal fetal y el riñon. La AFP elevada puede encontrarse en pacientes con hepatoma primario y en tumores de células germinales derivadas del saco vitelino. La AFP es el marcador serológico más útil para el diagnóstico y tratamiento de carcinoma hepatocelular (HCC). Sin embargo, la AFP también se eleva de forma transitoria durante el embarazo y en muchas enfermedades hepáticas benignas. Debido a la alta prevalencia de cáncer de hígado en China y en otras ciudades en el sudeste de Asia, las pruebas de la AFP se han usado con éxito en el examen colectivo de hepatoma en esa zona del mundo. Las pruebas tanto de AFP como de hCG son útiles para reducir los errores en el estadiaje clínico en pacientes con algunos tumores testiculares y ayudan en el diagnóstico diferencial de varios tumores de células germinales. Como se observó un aumento de la fucosilación de la AFP (de ahí la reactividad de lecitina de lenteja de AFP serológica) en el carcinoma hepatocelular primario, la determinación de la reactividad en suero de lentil lecitina con AFP ha sido útil no sólo para diferenciar entre hepatoma pnmario y enfermedades benignas de hígado, sino también para proporcionar una señal precoz que indique cuándo se puede empezar a desarrollar un hepatoma en pacientes con enfermedades hepáticas.

Moléculas de adhesión Las moléculas de adhesión celulares (CAM) pueden dividirse en cuatro grupos importantes: caderinas. selectinas, una superfamilia de inmunogtobulinas e integrinas (Wu. 1997). Estas moléculas de adhesión, especialmente la E-selectina, pueden contnbuir al crecimiento tumoral y a las metástasis. Las moléculas de adhesión intercelulares solubles pueden encontrarse en el suero de pacientes con enfermedades malignas (Hebbar. 1998).

El desarrollo por Kohler y Milstein (Milstein. 1983) de anticuerpos monoclonales murinos (MAb) con técnicas de hibridación de células somáticas permite un análisis inmunoquímico mucho más detallado y molecular de antigenos asociados al tumor que antaño era imposible. Al combinar los anticuerpos monoclonales con la fase sólida de la prueba en sandwich, se han desarrollado muchos análisis nuevos que han eliminado numerosos problemas relacionados con los análisis pohclonales, que conllevan una escasa reproducibilidad, muchas variaciones, pobre especificidad y reactividad cruzada no especifica (Diamond. 1981). También reduce las diferencias entre los diferentes equipos y amplía el rango de concentración lineal del análisis. Siempre que se disponga de un anticuerpo monoclonal, se recomienda su uso. Para conseguir una mayor sensibilidad de la prueba, parece que el uso de una combinación de múltiples MAb mejora la afinidad entre los múltiples MAb absorbidos en fase sólida y el antígeno soluble.

La angiogénesis es la formación de vasos sanguíneos in situ; incluye la migración ordenada, la proliferación y la diferenciación de células vasculares. La neoformación de vasos sanguíneos también es importante en la patogenia del crecimiento rápido y metástasis de tumores sólidos. Se han identificado muchos factores angiogénicos incluyendo factores de crecimiento fibroblástico ácido y base, angiogenina y factores de crecimiento -o. y -|i transformados (Folkman, 1992; Wu, 1997). Ambos factores angiogénicos y antiangiogénicos se han encontrado en el suero de pacientes con enfermedades malignas (Morelli. 1998).

Anticuerpo heterófilo

|i -microglobulina

El uso de MAb en inmunoanálisis y la creciente aplicación clínica de MAb de ratones para dianas imaginarias y de la mmunoterapia establecen un nuevo problema. Los individuos tratados producen aparentemente anticuerpos heterófilos contra anticuerpos murinos y esto interfiere con muchos de los inmunoanálisis de marcadores tumorales (Nahm, 1990). La interferencia de los anticuerpos heterófilos en suero humano puede aumentar o disminuir los resultados de un inmunoanálisis. Estos anticuerpos reaccionan de un modo similar frente a antígenos en términos de aglutinación a anticuerpos asociados a fase sólida y marcados con una señal. Estos anticuerpos heterófilos se pueden aglutinar en otro lugar distinto que el sitio analizado para la aglutinación, cruzando la señal del anticuerpo mediante el anticuerpo captura y gene-

La [52M es la cadena ligera constante del antigeno del locus antigénico de histocompatibilidad humano (HLA) expresado en la membrana de la mayoría de las células nucleadas. La |J2M sólo tiene un peso molecular de 11,8 kDa. Cuando las células nucleadas son metabolizadas. la cadena ligera (o |)2M) se vierte al líquido extracelular. La |52M es un marcador tumoral no especifico debido a que está elevado no sólo en los tumores sólidos sino también en las enfermedades linfoproliferativas (incluyendo leucemia de linfocitos B crónica, linfoma de no Hodgkin y mieloma múltiple) (Wu. 1986a). La concentración de (32M se correlaciona con la actividad lintocítica y es un buen marcador para las neoplasias de la linea de linfocitos B. Se ha utilizado como un indicador de la respuesta de los pacientes al tratamiento. Los niveles de |Í2M en el liqui-

Factores angiogénicos

2

1038

SECCIÓN V

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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA

po cefalorraquídeo (LCR) es útil para detectar metástasis en el sistema nervioso central (SNC). Se debería saber que las elevaciones sucesivas de en estas situaciones pueden también deberse al deterioro de la función renal, como sucede en el riñon del mieloma.

CA19-9, CA 50 y CA 19-5 El CA 19-9 es el primer marcador tumoral de un grupo de nuevos epítopos. incluyendo CA 125 CA 15-3 y CEA, definidos por anticuerpos monoclonales. Estos nuevos equipos de monoclonales detectan los recién descubiertos epilopos y estaban destinados a sustituir las determinaciones policlonales de CEA en vanos carcinomas (Wu, 1988a). El análisis de CA 19-9 mide un carbohidrato angiogénico determinante expresado en una mucina de alto peso molecular. El CA 19-9 es un epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal 1116NS-199; se define como una lacto-W-fucopentosa II sialilada. La molécula, que transporta el epitopo CA 19-9, aparece como una mucina en el suero de pacientes con cáncer pero como un ganglíósido en las células tumorales. El CA 19-9 también está relacionado con las sustancias del grupo sanguíneo de Lewis y sólo el antigeno serológico de pacientes con cáncer pertenecientes al grupo sanguíneo Le(a b) o Le(ab ) serán positivos para CA 19-9. Además del CA 19-9, también se ha definido otros dos marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales que son sólo ligeramente diferentes del CA 19-9. Son el CA 19-5 y CA 50. El epitopo relacionado a CA 50 es muy similar al de CA 19-9 pero carece de residuo de lucosa, el mismo epítopo encontrado en individuos con Lewis-negativo Le(ab~). Las concentraciones en suero de CA 19-9 no sólo suelen estar altamente elevadas en carcinomas gástricos y pancreáticos sino que son útiles para controlar el éxito de la terapia y para detectar recidiva en estos pacientes de cáncer. Sin embargo, se ha visto que el CA 19-9 y CA 50 se complementan el uno al otro en el carcinoma pancreático y en otros carcinomas: su uso simultáneo mejorará la sensibilidad en la detección de estas enfermedades malignas. El CA 19-5 es detectado por el anticuerpo monoclonal en ratones CC3C-195 y reacciona tanto con el epítopo Le" como con el sialil-Le . El CC3C-195 se aglutina con alta afinidad con el antigeno del grupo sanguíneo Le sialilado, pero exhibe una baja afinidad con la forma no sialilada. Los niveles elevados en suero de CA 19-9, CA 50 y CA 19-5 también pueden verse en pacientes con carcinomas de colon, pancreático y hepatocelular. La elevación encontrada en enfermedades hepáticas benignas puede deberse a coleslasis en estos pacientes (Wu, 1992). -

a

1

CA125

variedad de adenocarcinomas, incluyendo mama, colon, pulmón, ovario y páncreas. El CA 15-3 es un marcador muy sensible y específico para controlar el curso clínico de pacientes con cáncer de mama metastálico. Significativamente más pacientes tienen elevados niveles circulantes de CA 15-3 que de CEA (96.2% frente a 69,8%). En general, el CA 15-3 se correlaciona con la progresión, la regresión, o la estabilidad de la enfermedad en un mayor número de pacientes que el CEA Determinado CEA y CA 15-3 no se mejoran los resultados obtenidos sólo con CA 15-3. Sin embargo, CA 15-3 también puede estar elevado en hepatitis crónica, cirrosis hepática, sarcoidosis, tuberculosis y lupus eritematoso sistémico (Tondini, 1988).

CA 72-4 El análisis de CA 72-4 detecta un antigeno relacionado con adenocarcinoma humano parecido a la mucina, TAG-72, que tiene un alto peso molecular (>10 MW), como la compleja molécula de mucina. Debido a que TAG-72 puede detectarse en el epitelio fetal y en el suero de pacientes con diversos carcinomas, también se considera como una proteina carcinoembnonaria. Sin embargo, sólo se puede detectar CA 72-4 moderadamente elevado en la mayoría de los carcinomas. Actualmente, el CA 72-4 está considerado como el único marcador útil para el tratamiento de pacientes con carcinoma gástrico, a pesar de su baja sensibilidad. El CA 72-4 puede ser útil como uno de los múltiples marcadores para tumores derivados de células epiteliales. Los RÍA de CA 72-4, CA 19-9 y CEA son complementarios unos con otros en la detección de diversos carcinomas (Wu, 1992). I,

Calcitonina La calcitonina es una de las hormonas peptidicas circulantes que pueden llegar a elevarse en pacientes con una tasa de recambio ósea incrementada asociada a metástasis óseas. La calcitonina puede encontrase ectópicamente elevada en carcinomas broncogénicos. También se eleva en el carcinoma medular de tiroides.

Antigeno carcinoembrionario El CEA es una glucoproteina con un peso molecular de aproximadamente 200 kDa. El CEA es la primera de las denominadas proteínas carcinoembrionarias que fue descubierta por Gold y Freedman (1965). El CEA sigue siendo el marcador tumoral más extensamente usado en la actualidad para el cáncer gastrointestinal, pero la mayoría de los análisis de CEA han reemplazado el anticuerpo policlonal por el anticuerpo monoclonal anti-CEA.

El CA 125 es otro determinante angiogénico definido por anticuerpos monoclonales y también está relacionado con glucoproteinas parecidas a mucinas con un alto peso molecular (>200 kDa). El CA 125 se expresa en más del 80% de los carcinomas epiteliales no mucinos ováricos. El CA 125 se encuentra en la mayoría de los carcinomas de ovano serosos, endometriales y de células claras (Jacobs. 1989). Sin embargo, los pacientes sometidos a quimioterapia pueden mostrar un (also descenso del antigeno CA 125, y un resultado negativo no siempre descarta la recidiva del tumor. El CA 125, también se ha utilizado clínicamente en el seguimiento de tumores uterinos (>60% están elevados) y en tumores benignos, incluyendo endometnosis. Recientemente, se está probando la determinación de CA 125 en suero para determinar si puede utilizarse en la identificación sistemática del cáncer ovárico Se ha indicado el uso de múltiples marcadores para mejorar la especificidad y sensibilidad de las pruebas para cáncer ovárico (Wu. 1988b: Jacobs, 1989).

Aunque el RÍA de CEA en suero no cumple con las expectativas iniciales, las intensas investigaciones sobre el CEA en los últimos 20 años nos han enseñado muchas lecciones valiosas que tienen gran beneficio en el campo de los marcadores tumorales. En un principio se pensó que el CEA era un marcador específico para el cáncer colorrectal. pero en nuevos estudios resultó ser un marcador no especifico. Se aprendió en los estudios de CEA que los marcadores tumorales podian utilizarse para seguir a los pacientes durante la terapia y para detectar las recidivas después de una cirugía exitosa. También se descubrió a través de los estudios de CEA una asociación entre una concentración elevada en suero de marcador tumoral con metástasis y mal pronóstico. Como el CEA se metaboliza en el hígado, los daños hepáticos pueden alterar la aclaración del CEA y con ello provocar un aumento de los niveles en la circulación sanguínea. Se han observado concentración elevadas de CEA en algunos pacientes después del tratamiento con radio y quimioterapia (Wu. 1986b).

CA15-3

Oncoproteína c-erbB-2 (HER-2/neu)

El CA 15-3 es un antigeno circulante relacionado con el cáncer de mama identificado por dos anticuerpos monoclonales distintos. El análisis emplea un anticuerpo monoclonal conjugado en fase sólida, MAb 115D8. para capturar el antigeno MAM-6 en el plasma humano y uno denominado MAb DF3 como marcador. MAb 115D8 se preparó contra los glóbulos grasos de leche desnalada humana mientras que MAb DF3 se preparó contra la linea celular MCG-7 del carcinoma de mama. El antigeno CA 15-3 está presente en una

El gen c-eroB-2 (HER-2/neu) es un miembro de la clase de los oncogenes relacionados con la proteina tirosma cinasa. Se ha descrito que el gen c-erbB-2 se encuentra amplificado del 25% al 30% de cáncer humano de mama y ovario. Se ha demostrado que la amplificación del c-eroB-2 es un predictor independíente tanto de la recaída como de la supervivencia global, y es superior a todos los demás factores pronósticos conocidos excepto cuando los ganglios linfáticos son positivos. Recientemente se ha

CAPÍTULO 47

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DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLÓGICOS

1039

deteclado que el c-eroB-2 es un útil marcador para identificar a pacientes con cáncer de mama, que se beneficiarán más de altas dosis de quimioterapia adyuvante (Tandon, 1989: Duffy, 1990). Hay una relación directa entre la amplificación del gen c-erbB-2 y la sobreexpresión de la proleina c-eróB-2. Como consecuencia, se ha visto que tanto la amplificación como la sobreexpresión de c-eroB-2 están relacionadas con un mal pronóstico y con una escasa supervivencia y recidiva en diversos carcinomas.

placenta y es una hormona heterodimérica compuesta por subunidades 23%) normalmente se asocia a HPB, mientras que el cáncer prostético está asociado a un %fPSA bajo (lamydia trachoma­ Chuds JE Sumner JW. Nicholson WL et al Outcome of dagnostc tests using samples from patents with tis m first-void unne J Clin Merobiol 1997 35:2628. culture-proven human monocyte ehrtchiosis: Imptcaten lor sjrveilance J Clin Metot>oi 1999,37:2997 Grayslon JT, Campbel LA. Kuo CC. et al A new respirator pathogen: Chlamydia pneumoniae stran Chomel B8. Abbott RC Kasten RW. et al: Bartonella henselae prevalence in domestic cats in California TWAR J Infect Dis 1990; 161618 Risk factors ano association between bacteremia and antibody tilers. J Clin Microbiol 1995.33 2445 Grayston JT. Wang SP. Kuo CC et al: Current knowledge on Chlamydia pneumoniae, strain TWAR, an impor­ tant cause of pneumonia and other acute respiratory diseases. Eur J Clin Merobial Infect Dis 1989:8:191 Chomel BB. Kasten RW. 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CAPÍTULO 49

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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS. RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

1087

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CAPÍTUIO 50

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medíante la prueba E para determinar su CMI para la penicilina. Asimismo, pueden aparecer resistencias trente a las cefatosporinas de tercera generación; en consecuencia, también debe determinarse la susceptibilidad de los aislamientos frente a estos agentes antimicrobianos. Los ensayos de susceptibilidad deben realizarse con las cepas de estreptococos no hemoliticos (viridans) aisladas de localizaciones estériles del cuerpo, debido a que en estos casos puede existir resistencia a la penicilina. Las especies del género Enterococcus también deben ser analizadas para identificar, en principio, resistencia elevada a penicilina o ampicilina. estreptomicina y gentamicina. y resistencia a la vancomicina (Tenover. 1993).

ción respiratoria. Aunque pueden producirse infecciones de otras partes del organismo por C. diphteriae. las más frecuentemente observadas en EE.UU.son las de la piel. La vía de transmisión de C. diphteriae es por inhalación de gotitas de humedad expulsadas de las vías respiralonas supenores o por contacto con un loco de infección cutánea. Debido a que el resto de corinebacterias forman parte de la microbiota normal presente en la piel y las mucosas, es difícil establecer su papel etiológico. El significado clínico de la detección de una de estas bacterias aumenta si el organismo observado en frotis teñidos por el método de Gram aparece acompañado por leucocitos, si el aislamiento ha tenido lugar a partir de una localización estenl o si ha sido recuperado a partir de muestras múltiples. Corynebactenum jeikeium se ha asociado de forma clara con infecciones que aparecen tras el implante de prótesis (p. ej., válvulas cardíacas. LCR y articulaciones), se ha identificado como responsable de cuadros de endocarditis bacteriana subaguda y ha estado implicado en una gran variedad de infecciones oportunistas. Corynebacterium ureolyticum se ha relacionado con infecciones de las vías urinarias, asi como con bacteriemia. endocarditis e infecciones de las hendas.

Bacilos grampositivos Corynebacterium y Arcanobacterium Características. Las corinebacterias o bacilos "difteroides". como son a veces denominados, aparecen en las extensiones teñidas por el método de Gram como bacilos grampositivos. ligeramente curvados, con los lados no paralelos y. en ocasiones, con los extremos engrosados, lo que confiere una apariencia de maza (Lámina 50-3). Estas bacterias son catalasa positivas. Existen 46 especies dentro del género Corynebacterium. La mayor parte de las mismas raramente son patógenas para el hombre; las excepciones más notables son Corynebacterium diphteriae y las especies o variedades estrechamente relacionadas con ella, como son C. ulcerans y C. pseudotuberculosis. Las especies de interés clínico dentro del género Arcanobacterium son A haemolyticum. A. pyogenes y A. bemardiae. Al microscopio bajo tinción de Gram, estos microorganismos también aparecen como bacilos grampositivos con forma irregular. Las arcanobactenas se diferencian de las corinebacterias por que dan negativa la prueba de la catalasa.

Arcanobacterium haemolyticum ha sido asociado con procesos de laringitis y con infecciones de las heridas y tejidos blandos, mientras que otras especies como A. pyogenes y A. bemardiae son responsables de la formación de abscesos. Diagnóstico de laboratorio. Debido a que la difteria es, en la actualidad, una enfermedad relativamente rara en EE.UU., el diagnóstico clínico puede ser pasado por alto y el laboratono de análisis puede errar a la hora de reconocer los cultivos. Siempre debe proporcionarse al laboratorio un diagnóstico tentativo, de tal forma que los especímenes sospechosos puedan ser manipulados correctamente. Las connebactenas crecen en agar sangre sin mayor problema; sin embargo, el agar sangre cistina-telurito (CT) es el medio de cultivo pretendo para el aislamiento e identificación del microorganismo. En el medio CT, las colonias que forma C. diphteriae tras 48 horas de incubación son de color gris o negro. Las colonias pueden ser tanto grandes como pequeñas y planas convexas. Los medios de Lóffler (con suero coagulado) o de Pai (con huevo coagulado!, que son más deficientes desde el punto de vista nutnctónal. son apropiados para cultivar microorganismos que exhiban morfologías características al microscopio: apariencia pleomórfíca, agrupación en empalizada (los bacilos se disponen adosados lateralmente unos con otros) y presencia de granulos metacromáticos.

Manifestaciones clínicas y patogenia. En el lugar de la infección inicial a nivel de las amígdalas y la orofaringe. C. diphteriae se multiplica sobre las células epiteliales y produce una exotoxina que provoca necrosis celular local e inllamación subsiguiente. Las lesiones exudativas coalescen. formando unas seudomembranas adherentes de color gris-negruzco. La toxina, que es producida solamente por las cepas de C. diphteriae infectadas por un fago lisogénico que contiene el gen que codifica para la toxina, es absorbida y pasa al torrente circulatorio, mediante el que se disemina sistémicamente, produciendo cambios degenerativos en el corazón, sistema nervioso y ríñones. La molécula de la toxina está formada por dos subunidades: el fragmento A, que contiene el sitio enzimáticamente activo, y el fragmento B. en donde se encuentra el dominio que determina la unión a las células del huésped. La toxina diftérica se une a las células a través de la subunidad B. sufre un proceso de escisión y el fragmento A penetra en el intenor de la célula mediante un mecanismo totalmente desconocido. Una vez en el citoplasma, la subunidad A bloquea la síntesis proteica, catalizando la inactivación de la actividad translocadora del ARN de transferencia, impidiendo la interacción de este último con el ARN mensajero y deteniendo la incorporación de nuevos residuos de aminoácidos a la cadena polipeptidica en crecimiento. La toxina puede alectar a cualquier célula del organismo, pero las que resultan dañadas más gravemente son las del corazón, nñón y tejido nervioso. El propio microorganismo y la toxina que sintetiza producen un exudado seroso y un infiltrado celular en la mucosa de la faringe, lo que conduce a la formación de unas seudomembranas de color grisáceo. Aunque se considera que producción de toxina y patogenicidad son términos sinónimos, las seudomembranas también pueden formarse en personas infectadas por cepas no toxigenicas. La extensión de las seudomembranas por arriba hacia la nasofaringe y por debajo hacia la laringe puede ser tan masiva como para producir una obstruc-

Tabla 50-7

1097

BACTERIOLOGÍA MÉDICA

La clasificación de las corinebacterias, o bacilos difteroides. de la piel y la boca es difícil y confusa. Las características diferenciales de algunas especies se muestran en la Tabla 50-7. Existen sistemas comerciales disponibles para la identificación de este grupo de microorganismos. Los aislamientos sospechosos de ser C. diphtenae deben ser analizados para establecer su capacidad de producir la exotoxina. La síntesis de la misma puede ser detectada in vitro mediante la prueba de inmunodifusión de Elek, que consiste en sembrar sobre una tira de papel de filtro impregnada en antitoxina y embebida en la masa del agar del medio de cultivo una única estría en perpendicular del microorganismo que va a ser estudiado, observando al cabo del tiempo de incubación la aparición de lineas de precipitado que se forman con un ángulo de 45 grados en relación con la lira de papel y la estría del crecimiento microbiano. Se han descrito muchas modificaciones de este método, todas las cuales han conducido a la obtención de resultados erróneos, como puede ser la no aparición de lineas de precipitado con cepas genuinamente toxigénicas o la lormación de bandas de precipitación mespecíficas con microorganismos no productores de exotoxina. Varios lactores, como son la concentración del suero antitoxina, la cantidad de inoculo, el tipo de suero de enriquecimiento utilizado en el medio y el tiempo de incubación, pueden afectar el resultado de esla

Características diferenciales d e a l g u n a s e s p e c i e s del g é n e r o C o r y n e b a c t e r i u m y bacterias relacionadas

Prueba Catalasa Hemolisis Gelatinasa Ureasa Reducción de los nitratos Fermentación de la sacarosa + = positivo: - = negativo: v = variable.

C. diphteriae

C. ulcerans

C. pseudotuberculosis

C. jeikeium

+

+ + + +

+

+

+

-

V

V

Arcanobacterium haemolyticum

A rcanobacterium pyogenes

+

+ -

V

V

+

v v

-

SECCIÓN VI

1098

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

prueba. Se han descrito métodos alternativos basados en la PCR que pueden ser de utilidad para detectar el gen que codifica la síntesis de la exotoxina. Las especies de Arcanobacterium son catalasa negativas y (i-hemolíticas en agar sangre. Las colonias que se forman después de una incubación de 48 horas son de pequeño tamaño. Las mismas pruebas bioquímicas que se utilizan para la identificación de las corinebacterias pueden utilizarse también en el caso de las arcanobacterias. La especie A. haemolyticum produce fosfolipasa D, enzima que es responsable de una reacción inversa del cAMP cuando esta bacteria se incuba simultáneamente con otra especie bacteriana, Staphylococcus aureus, en agar sangre. A. haemolyticum inhibe la hemolisis alrededor de la estría de crecimiento de S. aureus, produciendo una zona con lorma triangular en la que no se detecta hemolisis. Sensibilidad a los antimicrobianos. Aunque el suero antitoxina sigue siendo el único método específico para el tratamiento de la difteria, también se administran antibióticos a los pacientes que manifiestan la enfermedad y los portadores asintomáticos de cepas toxigénicas. C. diphteriae es sensible a la penicilina, la eritromicina y la clindamicina. Debido a su elevada eficacia y a que es bien tolerada, la eritromicina es el antibiótico que se utiliza con mayor frecuencia en este contexto; sin embargo, la penicilina-benzatina también puede ser de utilidad en aquellos casos en los que se espera que el paciente coopere en la pauta de administración del antibiótico. La sensibilidad a los anlimícrobianos de otras especies de corinebacterias o bacilos difteroides es bastante menos predecible. Por ejemplo. C. jeikeium es, usualmente. resistente a las penicilinas y cefalosporinas, sensible pero con mucha variabilidad a la mayoría de los restantes antibióticos y sensible casi de manera uniforme a la vancomicina. El tratamiento de las infecciones causadas por estos microorganismos se ve complicado, a menudo, por unas defensas del huésped disminuidas y por la presencia de prótesis implantadas. Las arcanobacterias son sensibles a (5-lactámicos, rifampicina. tetraciclina y macrólidos. Prevención. La prevención de la difteria se basa casi exclusivamente en programas de inmunización activa y pasiva, con administración suplementaria de antibióticos para eliminar el estado de portador de cepas toxigénicas durante las epidemias.

Listeria Características. Las especies del género Listeria son bacilos grampositivos, no ramificados y no esponjados. El crecimiento óptimo de L. monocytogenes, la única especie del género patógena del hombre, tiene lugar entre 30"C y 37°C; sin embargo, esta bacteria puede crecer a 4°C. Las colonias que aparecen a las 24 horas son pequeñas y muestran una estrecha zona de hemolisis [i alrededor en agar sangre. A temperatura ambiente este microorganismo exhibe una movilidad a saltos característica que raramente se observa a 35°C. Esta motilidad dependiente de la temperatura también se aprecia en los medios semisólidos, en los que el crecimiento bacteriano se distribuye en un área cuyo perímetro semeja a un paraguas en la parte superior del tubo. Manifestaciones clínicas y patogenia. Listeria monocytogenes se encuenlra en el suelo, polvo, agua, pasto, aguas residuales y leche entera sin pasteurizar. La transmisión del microorganismo a través de alimentos como las ensaladas de col, cebolla y zanahoria, leche pasteurizada y quesos frescos ha sido la causa de las diversas grandes epidemias que han tenido lugar en Norte América y Europa (Fleming, 1985; Linnan, 1988). De acuerdo con los datos emanados del control microbiológico de los alimentos, L. monocytogenes ha sido detectada en el 2% al 3% de productos lácteos, en un 20% de

Tabla 50-8 y

Características diferenciáis d e Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopatiae

Prueba

L. monocyogenes

B-hemólisis

+

Crecimiento a 4°C Catalasa Movilidad Hidrólisis de la esculina Utilización del gluconate Voges-Proskauer Producción de H-.S en agar TSI

+ + + + + +

E.

rhusiopathiae

-

+

quesos tiernos o frescos y de carnes elaboradas, en un 30% de diversos vegetales (repollos, rábanos) y hasta en un 50% de carne cruda y aves de corral (Broome. 1993). Entre un 2% y un 20% de animales y personas pueden ser portadores transitorios. Es muy posible que alteraciones en el sistema inmunológico del huésped determinen el establecimiento de la enfermedad, ya que la mayor parte de individuos aquejados de listeriosis son inmunodeprímidos. Los macrófagos y los linfocitos T representan los principales mecanismos de defensa del hospedado! frente a la infección por L monocytogenes. La virulencia de este microorganismo está relacionada con la producción de listeriolisina O, una proteína de 52 kDa que liene actividad hemolítica y citotóxica, que es excretada en condiciones de pH ácido y baja concentración de hierro, como las que existen en el interior del fagolisosoma. Se cree que la proteína se une de forma irreversible al colesterol de la membrana del lisosoma. provocando su rotura y permitiendo la multiplicación bacteriana incontrolada en el citoplasma de la célula fagocítica. Las manifestaciones clínicas de la listeriosis son diferentes según se trate de mujeres embarazadas, neonatos y personas inmunodeprimidas, que constituyen los principales grupos de riesgo. Durante el embarazo, generalmente en el primer trimestre del mismo, la listeriosis cursa con unos síntomas semejantes a los de la gripe. La bacteriemia concomitante en la mujer afectada es responsable de la inlección del feto. La infección puede progresar hasta una amnionitis que provoca un parto prematuro o un aborto séptico en el plazo de tres a siete días. La infección en la madre es autolimitada porque la fuente de la misma desaparece con la expulsión del feto infectado y del resto del contenido uterino. La listeriosis neonatal puede tener un comienzo temprano o tardío. En el primer caso, la enfermedad, que se puede manifestar en el mismo momento del nacimiento o unos pocos días después, es consecuencia de la infección en el interior del útero. El recién nacido presenta una temperatura inestable, alteraciones hemodinámícas y problemas respiratorios; también son característicos de la enfermedad los granulomas, que aparecen ampliamente diseminados, afectando sobre todo a la placenta, el tramo posterior de la faringe y la piel, aunque eventualmenle pueden no estar presentes. La enfermedad de inicio tardío, que afecta a los niños nacidos a término de madres con embarazos normales, debe tener su origen en una infección contraída posparto, aunque en la mayor parte de los casos la fuente de la misma es desconocida. En este caso, los síntomas clínicos típicos de una meningitis aparecen tras el nacimiento en un rango de tiempo muy amplio que va desde días hasta varias semanas después. La listeriosis en los adultos aparece generalmente en individuos inmunodeprimidos, aunque en la tercera parte de casos no se ha identificado o asociado un factor de riesgo con la infección. La mitad aproximadamente de estas infecciones cursan como una meningitis; otras formas de listeriosis que afectan al SNC son la cerebritis y los abscesos en el troncoencéfalo y el cordón espinal. La bacteriemia primaria o las infecciones focales en localizaciones diferentes al SNC son muy poco frecuentes. Diagnóstico de laboratorio. Las colonias son pequeñas, de color gris azulado, y rodeadas de una zona o halo estrecho de hemolisis |5 en agar sangre. La prueba que permite diferenciar a L monocytogenes de los estreptococos del grupo B. que pueden formar colonias con una apariencia semejante, es la catalasa, que es positiva en la primera y negativa en los segundos. L monocytogenes es móvil a temperatura ambiente y forma ácidos a partir de glucosa, trehalosa y salicina. Otras características de esta bacteria se indican en la Tabla 50-8. Sensibilidad a los antimicrobianos. L. monocytogenes es sensible, usualmente, a la penicilina, ampicilina, eritromicina, cloranfenicol, tetraciclina y gentamicina. Recientemente, se han identificado plásmidos que confieren resistencia a cloranfenicol, macrólidos y tetraciclinas en varias cepas de origen clínico. Para el tratamiento de las infecciones causadas por esta bacteria se ha utilizado con éxito la ampicilina sola o en combinación con un aminoglucósido. En los pacientes que tienen alergia a la penicilina puede utilizarse como alternativa terapéutica el Irímetoprim-sulfametoxazol.

Erysipelothrix Características. Erysipelothrix rhusiopathiae es un bacilo grampositivo, catalasa positivo, inmóvil, anaerobio facultativo, que no forma esporas y que tiene una distribución mundial. Las bacterias presentes en las colonias lisas son bacilos de pequeño tamaño, rectos o ligeramente curvados, mientras que en las colonias rugosas los microorganismos son bacilos largos y filamentosos.

CAPÍTUIO 50

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA

Manifestaciones clínicas y patogenia. £ rhusiopathiae se transmite de los animales al ser humano mediante heridas en la piel causadas por objetos contaminados o al entrar en contacto con sangre, carne, visceras o heces de animales infectados. £. rhusiopathiae se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza en los animales tanto salvajes como domésticos, pájaros, peces, materia orgánica en descomposición, y causa infección en cerdos, ovejas, conejos, ganado, pájaros y aves de corral. Entre las personas con nesgo de contraer infecciones por esta bacteria se encuentran los carniceros, empleados de mataderos, pescadores y manipuladores de pescado, personal de granjas avícolas y veterinarios. La forma más común de la enfermedad erisipeloide es una infección cutánea local que cursa con dolor, hinchazón y una erupción en la piel, consistente en una zona de color violáceo ligeramente elevada y de progresión lenta, que aparece alrededor del punto en donde tuvo lugar la inoculación del microorganismo. La hinchazón y el eritema migran periféricamente y la lesión involuciona sin producir descamación de la piel. La enfermedad sislémica es rara, aunque existen informes sobre casos de septicemia y endocarditis causadas por E. rhusiopathiae. También son muy poco frecuentes los casos de artritis y abscesos cerebrales. Diagnóstico de laboratorio. La biopsia o los aspirados de tejidos de las lesiones erisipeloides son los mejores tipos de especímenes para el cultivo. Los microorganismos están localizados profundamente en la capa subcutánea del borde externo de la lesión; por tanto, el material recogido de la superficie de la piel con un hisopo no es de utilidad para intentar el aislamiento. E. rhusiopathiae crece en agar sangre o agar chocolate, pero puede necesitar hasta siete dias de incubación para desarrollarse. Los medios convencionales para hemocultivo son adecuados para el aislamiento de la bacteria a partir de sangre. E. rhusiopathiae es oxidasa y catalasa negativo y produce, típicamente. H,S en agar TSI (agar triple azúcar-hierro). Es inmóvil, no reduce los nitratos a nitritos y fermenta la glucosa y la lactosa. Un rasgo muy característico de esta bacteria es el aspecto de su movilidad en un medio con gelatina, inoculado en picadura e incubado a 22 O que semeja a un «desatascador de tuberías». £ rhusiopathiae se distingue fácilmente de las especies del género Listeña (véase Tabla 50-8). Sensibilidad a los antimicrobianos. £ rhusiopathiae es sensible a las penicilinas, cefalosporinas, imipenem. eritromicina, clindamicina, cloranfenicol. tetraciclinas y fluoroquinolonas. pero resistente a las sulfonamidas, aminoglucósidos y vancomicina.

Gardnerella Características. Gardnerella vaginalls es una bacteria Gram variable y pleomórfica. ya que puede aparecer en forma de bacilos delgados o cocobacilos. Es inmóvil y catalasa negativa. El crecimiento se observa mejor tras 48 horas de incubación en una atmósfera enriquecida con un 5% de CO . Las colonias son pequeñas y producen hemolisis (} en agar con sangre de conejo o sangre humana. Manifestaciones clínicas y patogenia. Este microorganismo se ha asociado con la vaginosis bacteriana, aunque probablemente no sea el único agente etiológico de esta enfermedad. Ha sido aislado a partir de la sangre de pacientes con fiebre posparto y también puede causar infecciones en los recién nacidos. G. vaginalls forma parte de la microbiota del recto y el ano en adultos sanos de ambos sexos, así como en niños, y de la microbiota endógena de la vagina en mujeres en edad fértil. Diagnóstico de laboratorio. El diagnóstico de la vaginosis bacteriana no requiere cultivo, sino que se lleva a cabo mediante examen directo de las secreciones vaginales para detectar la presencia de las células clave, que son células epiteliales con el borde recubierto de bacterias, la existencia de bacilos pequeños y cocobacilos gramnegativos, la ausencia de lactobacilos (bacilos grampositivos delgados), un valor de pH superior a 4,5 y un olor a aminas (a pescado) que aparece cuando se añade una solución a la secreción de KOH al 10%. Cuando se observa en cultivo. G. vaginalls puede ser identificado presuntivamente en base a la hemolisis que produce en agar de dos capas con sangre humana y Tween tras 48 horas de incubación. Sensibilidad a los antimicrobianos. No existe una recomendación expresa sobre la realización de pruebas de susceptibilidad de G. vaginalls a los antimicrobianos. por lo que no existe un protocolo específico para llevar a cabo este análisis. El metronidazol es la sustancia de elección para el tratamiento de la vaginosis bacteriana. Las infecciones sistémicas causadas por

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este microorganismo pueden tratarse con ampicilina, porque no se ha encontrado que tenga capacidad de producir [Mactamasa.

Bacillus Características. Las especies del género Bacillus son bactenas aerobias estrictas o anaerobias facultativas, de morfología bacilar, formadoras de esporas, catalasa positivas y grampositjvas. Con la única excepción de Bacillus anthraos. todas las especies son móviles por medio de flagelos laterales o pentncos. Algunas cepas se tiñen como gramnegativas y, debido al carácter variable de la prueba de la oxidasa, pueden contundirse con bacilos gramnegativos. La característica diagnóstica más fiable es la capacidad que tienen las especies del género para formar endosporas, proceso que tiene lugar de manera óptima en condiciones aeróbicas entre 25' C y 30 C en una gran variedad de medios de cultivo. En las extensiones teñidas por el método de Gram, las esporas aparecen como zonas o huecos no teñidos en el interior de las células. Las endosporas pueden teñirse por vanos procedimientos específicos. Manifestaciones clínicas y patogenia. Entre las numerosas especies del género Bacillus. B. anthracls es la única que es fuertemente patógena de forma consistente. Deben extremarse las precauciones a la hora de manipular muestras y materiales en los que se sospeche la existencia de este microorganismo. Las manipulaciones deben ser realizadas en cabinas de bioseguridad por personal inmunizado y protegido con guantes, ropas apropiadas y máscaras; las superficies de trabajo deben desinfectarse con hipoclorito o con fenol (ambos al 5%); al finalizar, todos los materiales y equipos utilizados deben ser descontaminados. Existen tres formas clínicas de la enfermedad que produce B anthraos. el ántrax: cutáneo, pulmonar e intestinal. En su forma cutánea, el ántrax se caractenza por la aparición de una lesión macular rojiza de pequeño tamaño que evoluciona hasta formar una vesícula que termina por necrosarse. formando una escara negra. Junto con estos síntomas, también puede haber linfadenopatia regional y septicemia. Sin tratamiento, la mortalidad en esta forma de la enfermedad está alrededor del 20%. La inhalación de las esporas de B. anihracis puede producir bronconeumonia aguda, mediastinitis y septicemia («enfermedad de los esquiladores»). La mortalidad en los casos diagnosticados de esta variedad del ántrax está próxima al 100%. La forma intestinal aparece como consecuencia de la ingestión de alimentos contaminados y cursa con náuseas, vómitos y diarrea. En algunos casos aparecen hemorragias intestinales, seguidas de postración, shock y muerte. En las tres formas del ántrax puede haber septicemia, que puede conducir a una meningitis purulenta de pronóstico fatal Un factor de virulencia determinante de la capacidad patogénica del microorganismo es la presencia de una cápsula formada por un polipéptido neo en ácido glutámico que inhibe la fagocitosis: los anticuerpos especílicos frente al antígeno capsular no tienen efecto protector contra la enfermedad. La bacteria produce, además, una compleja toxina formada por tres componentes (factor edematoso, antígeno protector y factor letal) que es la responsable de los síntomas del ántrax. Los seres humanos se infectan al entrar en contacto con animales infectados o sus cadáveres o al ingerir o inhalar subproductos derivados de los mismos. El ganado vacuno, ovejas, caballos y cabras son los animales que se infectan más frecuentemente y constituyen una fuente inmediata de formas vegetativas de la bacteria que esporulan y perpetúan la contaminación en el ambiente. Otras especies del género pueden causar también enfermedad, aunque habitualmente sean formas saprofitas. En este contexto, Bacillus cereus se ha asociado con infecciones del oído, neumonía, infecciones de heridas oculares postraumáticas, septicemia y endocarditis. Los pacientes con neumonía y septicemia están afectados, frecuentemente, por algún proceso de inmunosupresión. Esta especie puede ocasionar bacteriemia asociada con el uso de drogas por vía intravenosa o de dispositivos mtravasculares contaminados. Existen dos formas de gastroenteritis relacionadas con las especies del género Bacillus. La intoxicación alimentaria causada por Bacillus puede producirse entre una y seis horas después de la ingestión de alimentos contaminados con B. cereus que contienen preformada una toxina termoestable que el microorganismo ha sintetizado in situ. Los síntomas principales de esta intoxicación alimentaria son náuseas, vómitos, retortijones y, ocasionalmente, diarrea. Clásicamente, esta forma de gastroenteritis es el resultado de la elaboración, en gran cantidad, de alimentos que no necesitan ser recalentados antes de servirse. La cepa de fi. cereus tipo 1 crece particularmente bien en

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

arroz írílo y es más resistente al calor que otros tipos, por lo que esta forma de gastroenteritis se manifiesta con mucha frecuencia asociada al consumo de arroz frito en los restaurantes chinos. La segunda forma de gastroenteritis causada por fl. cereus es consecuencia de la contaminación de platos de carne y vegetales y cursa con retortijones y diarrea que aparecen entre 8 y 16 horas después de la ingestión del alimento contaminado. En este caso los síntomas están causados por una enterotoxina termolábil. Diagnóstico de laboratorio. En los casos en los que se sospeche la existencia de la forma cutánea del ántrax, debe recogerse el líquido de las vesículas, asi como material del borde de la escara, con un hisopo para realizar extensiones para la observación al microscopio y para el cultivo. Si hay sospecha de ántrax pulmonar, hay que obtener muestras de esputo para los frotis y el cultivo. En el caso de la forma intestinal hay que llevar a cabo un coprocullivo. En el caso de que pueda tratarse de una meningitis deben realizarse observaciones microscópicas y cultivos a partir del LCR. En la fase septicémica deben realizarse hemocultivos. La detección de bacilos grampositivos grandes y con los bordes rectos (aspecto denominado boxear) en los frotis realizados a partir de cualquiera de los especímenes indicados en el párrafo anterior tiene valor diagnóstico. La microscopía de fluorescencia, disponible en algunos laboratorios de análisis y en el CDC. permite llevar a cabo un diagnóstico presuntivo rápido. Las especies de Bacillus crecen bien en agar con sangre de oveja. Las colonias de 8. anthracis son habitualmente planas, con bordes irregulares (forma que se denomina "cabeza de Medusa"), blancuzcas con la superficie áspera (aspecto de cristal esmerilado) y, usualmente. no hemolíticas. Cuando se tocan con el asa de inoculación, las colonias son pegajosas y se levantan como la clara de huevo batida. B. cereus y otras especies del género también forman colonias con forma de cabeza de Medusa. El bacilo del ántrax es inmóvil, tanto por la prueba de la gota pendiente como en medio semisólido, mientras que las restantes especies son móviles. La determinación de la movilidad por la técnica de la gota pendiente es una prueba útil para diferenciar B anthracis de 8. cereus, pero debe hacerse con cultivos jóvenes de ambos microorganismos. El resto de pruebas bioquímicas y características adicionales que pueden utilizarse para identificar los aislamientos a nivel de especie han sido recopiladas por Logan y Turnbull (Logan, 1999). Las pruebas de virulencia se llevan a cabo inyectando subcutánea o mtraperitonealmente en ratones una suspensión ligeramente turbia de las bacterias, que se prepara resuspendiendo en solución salina las colonias crecidas en medio sólido. No debe utilizarse un cultivo en medio líquido para los ensayos de virulencia debido a los productos toxigénicos que otras especies de Bacillus pueden formar en caldo nutritivo. La muerte del ratón tiene lugar entre 24 y 72 horas después de la inyección, y es posible detectar los microorganismos en frotis realizados a partir de muestras de sangre del corazón, hígado y bazo. No es posible llevar a cabo de modo fiable el diagnóstico de la gastroenteritis causada por 8. cereus mediante coprocultívo. porque este microorganismo puede formar parte de la microbiota autóctona del intestino. Por tanto, el diagnóstico depende del cultivo cuantitativo realizado a partir del alimento sospechoso de estar contaminado. La presencia de un número igual o superior a 10 unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo en el alimento sospechoso constituye una evidencia presuntiva de contaminación alimentaria por 8. cereus (Logan, 1999). 5

Sensibilidad a los antimicrobianos. Aunque el agente causal es sensible a varios agentes antimicrobianos. la terapia con antibióticos del ántrax se centra en el uso de la penicilina sola o en combinación con estreptomicina. Ambos antibióticos son muy activos frente a 8. anthracis. aunque algunas cepas producen una |5-lactamasa. La susceptibilidad de otras especies de Bacillus a las penicilinas y cefalosporínas es extremadamente variable. Sin embargo, la mayor parte de especies son inhibidas por tetraciclinas, aminoglucósidos y cloranlenicol a bajas concentraciones. Prevención. La prevención del ántrax en el hombre depende del control de los animales infectados. La rápida detección de los animales enfermos, su aislamiento y tratamiento, y la incineración de los cadáveres son procedimientos indicados cuando se detectan brotes epidémicos esporádicos. En las áreas enzoóticas se utiliza la vacunación con preparados de esporas no encapsuladas. Aquellas personas que por su profesión puedan tener riesgo de quedar expuestas también deben inmunizarse.

La enfermedad diarreica aguda producida por 8. cereus se puede prevenir mediante la cocción correcta y la refrigeración de los alimentos preparados en grandes cantidades, para prevenir la proliferación de las formas vegetativas de las bacterias y la formación de la enterotoxina.

Nocardia Características. En los frotis de muestras clínicas teñidos por el método de Gram. las especies de Nocardia aparecen como bacilos grampositivos largos y delgados, formando rosarios de células o ramificados (Lámina 50-4). La característica más destacable de las nocardias es que son parcialmente ácido-alcohol resistentes: las células se tiñen positivamente con una modificación de la tinción de ácido-alcohol resistencia (Zielh-Neelsen o Kmyoun), lo que diferencia a estas bacterias de las del género Actinomyces. que pueden tener una apariencia semejante cuando se observan bajo tinción de Gram. La ácido-alcohol resistencia parcial puede ser difícil de demostrar y puede visualizarse mejor si se hace crecer al microorganismo en el medio de Middlebrook 7H10 o en leche tornasolada. La mayor parte de las infecciones están causadas por Nocardia asteroides, seguida por N. brasiliensis y con mucha menor frecuencia por N. olitidis caviarum. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las nocardias se encuentran en el suelo y en la materia orgánica, tienen distribución mundial y causan enfermedades en animales y peces. La infección en humanos es ligeramente superior en el hombre que en la mujer. La infección se contrae usualmente por inhalación del microorganismo, aunque también puede tener lugar por contaminación de las heridas con tierra, o cuando las bacterias penetran en el organismo a través del tubo digestivo cuando un material contaminado entra en contacto con una zona ulcerada de la mucosa digestiva. En los pulmones, las nocardias son fagociladas por los macrólagos alveolares, multiplicándose en el interior de los mismos, lo que desencadena una respuesta inflamatoria mixta (neutrófilos, linfocitos y macrófagos) que eventualmente da como resultado la formación de abscesos y. ocasionalmente, de granulomas. Los estudios realizados in vitro sobre los mecanismos de defensa del hospedador frente a las nocardias sugieren la implicación de los neutrófilos, los macrólagos activados y las células T citotóxicas. Aunque los neutrófilos son incapaces de destruir las especies virulentas de Nocardia. inhiben su crecimiento, deteniendo el avance de la infección hasta que los macrófagos están totalmente activados Si la infección no queda limitada al pulmón, los microorganismos pueden extenderse por crecimiento hasta otros tejidos adyacentes, produciendo empiema, afectación de la pared costal y senos drenantes, o diseminarse hemalógenamente formando abscesos, especialmente en el cerebro, tejidos subcutáneos y ríñones. El principal factor relacionado con el hospedador, y que implica un riesgo elevado de contraer nocardiosis. es una disfunción en la inmunidad celular, aunque muchas personas infectadas por Nocardia spp. no tienen problema reconocido alguno en su inmunidad celular y humoral (Wilson. 1989) La enfermedad pulmonar es la manifestación más frecuente de la nocardiosis y se caracteriza por una serie de síntomas como fiebre, anorexia, pérdida de peso, tos, disnea y dolor pleural. La infección en la piel y el tejido subcutáneo puede dar lugar a pioderma, celulilis, formación de abscesos (uno o múltiples), una afección linfocutánea semejante a la esporotricosis y aparición de nodulos. En América Central y del Sur. la infección primaria de la piel con N. brasiliensis puede producir un actmomicetoma (una masa granulomatosa indurada y localizada con conductos fistulosos por los que mana pus y los denominados granulos de 'azufre"), generalmente en las extremidades inferiores. La enfermedad diseminada casi siempre está causada por N. asteroides. en la mayor parte de los casos tiene su origen en el pulmón, y se manifiesta típicamente en forma de abscesos múltiples que afectan al sistema nervioso central. La piel es la segunda localización más común del cuerpo para la diseminación de las bacterias, seguida por el nñón, el hígado y los ganglios linfáticos Diagnóstico de laboratorio. Las especies del género Nocardia crecen aeróbicamente en la mayor parte de medios no selectivos como agar con sangre de oveja y agar chocolate, agar Sabouraud-dextrosa sin cloranfenicol o medio Middlebrook. Estas bacterias también pueden ser cultivadas en el medio BCYE (medio tamponado que contiene sangre, carbón vegetal, y extracto de levadura), utilizado para el aislamiento de Legionella spp. Es importante indicar que las especies de Nocardia no siempre sobreviven a los procesos de descontaminación de las muestras que se aplican en los protocolos para el

CAPÍTULO 50

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA

aislamiento de micobacterias. La incubación en una atmósfera que contenga un 10% de CO¡ favorece el crecimiento de estos microorganismos. Las especies de Nocardia pueden crecer en 48 horas, aunque normalmente las colonias tardan en aparecer entre 5 y 20 días, y pueden presentar aspecto cerúleo, una superficie muy irregular o un aspecto rugoso aterciopelado, generalmente pigmentadas con tonalidades que van del amarillo al anaranjado. La observación de formas filamentosas que se tiñen exclusivamente con un método modificado de tinción de ácido-alcohol resistencia distingue a las especies de Nocardia de las micobacterias. Las nocardias se diferencian de la mayor parte de los actinomicetos aeróbicos comprobando la resistencia a la lísozima (las especies de Nocardia son resistentes, mientras que las de los géneros Streptomyces. Rhodococcus. Gordona y Aclinomadura son sensibles a la enzima). Las especies de Nocardia se distinguen atendiendo a su capacidad para hidrolizar caseína, hipoxantina, tirosina y xantina. Sensibilidad a los antimicrobianos. Las sulfonamidas son usualmente los agentes antimícrobianos de elección: sin embargo, la terapia antimicrobiana óptima depende de la especie de Nocardia presente, del patrón de resistencia o sensibilidad de la cepa en particular y del tipo de infección. Otros agentes antimícrobianos de utilidad potencial son el trimetoprim-sulfametoxazol. la amicacina y el imipenem.

Otros

actinomicetos aerobios

Otros géneros del grupo de los actinomicetos que incluyen especies de interés clínico para el hombre son Rhodococcus. Gordona. Tsukamurella. Actinomadura y Streptomyces. Otro miembro de este grupo, Trophyrema whippelii. es un microorganismo no cultivable que es el agente causal de la enfermedad de Whípple. Manifestaciones clínicas y patogenia. Los miembros de este grupo de microorganismos son ubicuos y se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, habiendo sido aislados del suelo, aguas dulces y marinas y materia orgánica. Rhodococcus equies la única especie del género Rhodococcus patógena para el hombre. Es un patógeno oportunista que afecta a individuos con un grado de inmunodepresión profundo, en los que causa una neumonía granulomatosa de progresión lenta. El microorganismo puede aislarse a partir de la sangre de los pacientes infectados. La infección se adquiere probablemente por vía respiratoria, posiblemente como consecuencia de la exposición a animales mlectados. La capacidad del microorganismo para sobrevivir en el interior de los macrófagos y, en último término, causar su destrucción parece ser la responsable de su poder patógeno. Las infecciones causadas por las especies de los géneros Gordona y Tsukamurella son muy poco frecuentes. Las especies de Tsukamurella son patógenas solamente cuando concurren ciertas condiciones clínicas (p. ej.. inmunosupresión, presencia de cuerpos extraños o infecciones crónicas activas, como tuberculosis). Las especies del

Tabla 50-9

Diagnóstico de laboratorio. Los actinomicetos aeróbicos son de crecimiento lento y pueden necesitar entre dos y tres semanas de incubación para formar colonias. Estos microorganismos crecen en la mayor parte de medios no selectivos utilizados para aislar bacterias, micobacterias y hongos. Las especies de Rhodococcus crecen como cocobacilos dispuestos en zigzag. En los medios líquidos se observan formas filamentosas con ramificaciones rudimentarias. Las colonias pueden ser rugosas, lisas o mucosas y presentan pigmentos de color marrón claro, coral, anaranjado y rosa intenso, que aparecen tras varios días de incubación. Las colonias de R. equi son de color rosa o amarillo pálidos, o coral, y pueden tener una textura viscosa. Las especies del género Gordona forman colonias lisas y mucosas que se adhieren al medio o secas y elevadas. Los pigmentos que producen tienen colores que van del beige al salmón Las especies del género Tsukamurella son levemente acidoalcohol resistentes cuando se tiñen mediante una modificación del método de Kinyoun. Aparecen como bacilos largos que se fragmentan en tres trozos y no forman hitas aéreas. Las colonias son circulares, con los bordes enteros o rizados. Pueden tener una textura seca o mucosa con pigmentos de color blanco a anaranjado. Las colonias rugosas aparecen tras siete días de incubación. Las especies del género Actinomadura forman colonias con apariencia cerebriforme, cerúleas, duras, membranosas, con pigmentos de color blanco, amarillo, rosa o rojo. Las colonias del género Streptomyces son secas, con una textura que tiene una apariencia de tiza o terrea, con aspecto amontonado o plegado, con pigmentos de color blanco-grisáceo a amarillo y con un olor que recuerda al de los sótanos con humedad. Producen una amplia variedad de pigmentos que dan color tanto a las hilas como al sustrato donde crecen éstas. Algunas especies no forman hitas aéreas.

Bacterias gramnegativas Enterobacteriaceae Características. Las enterobactenas son bacilos gramnegativos. aerobios o anaerobios facultativos, no formadores de esporas, inmóviles o móviles por flagelos perítricos, oxidasa negativos, que producen ácidos por vía fermentativa a partir de la glucosa y reducen los nitratos a nitritos. Los géneros incluidos en este grupo son los siguientes: Budvicia. Buttiauxella. Cedecea. Qtrobacter. Edwar-

Medios selectivo y diferenciales para enterobacterias

Medio

A g e n t e bacteriostático para g r a m p o s i t i v o s

Eosma-azul de metileno (EMB) MacConkey

Eosina Y Azul de metileno Cristal viólela Sales biliares Sales biliares

Xilosa-lisinadesoxicolato (XLD) Hektoen entérico (HE)

Sales biliares

Salmonella-shigella (SS) Sulfilo de bismuto (BS) Tiosullato-citrato-saies biliares-sacarosa (TCBS)''

Sales biliares Verde brillante Sales biliares, pH 8 6

' D = diferencial, S = selectivo Fórmula de Levine. # Las saínemelas que producen H,S forman colonias negras Utilizado para el aislamiento de especies del género Vibrio :

v

noi

género Actinomadura son una causa frecuente de micetomas actinomicóticos. la mayor parte de los cuales aparecen en países tropicales y subtropicales, donde caminar descalzo incrementa las posibilidades de exposición a los microorganismos a través de pequeñas heridas punzantes en la planta de los pies. Tradicionalmente se ha considerado que las especies del genero Streptomyces tienen una escasa relevancia clínica: sin embargo, una de las especies, S. somaliensis, ha sido identificada como un agente causal de micetomas actinomicóticos. Las restantes especies del género tienen importancia médica sólo muy ocasionalmente.

Carbohidrato fermentable Lactosa' Lactosa Xilosa Lactosa Sacarosa Salicina Lactosa Sacarosa Lactosa Glucosa Sacarosa

Color de las colonias Categoría"

Indicador Fermentador

No termentador

Eosina Y Azul de metileno Rojo neutro

Rojas o negras con brillo Rojas

incoloras

S, D

incoloras

S, D

Rojo lenol

Amarillas

Rojas

S. D

Azul de bromotimol

Amarilloanaranjadas

Verdes, azul verdosas

S, D

Rojo neutro Sulfito de bismuto Azul Ge timol Azul de bromotimol

Rojas # Amarillas

Incoloras n Incoloras

S S S. D

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

siella. Enterobacter. Escherichia. Ewingella. Hafnia. Klebsiella, Kluyvera. Leclercla, Leminorella. Moellerella. Morganella. Obesumbactenum, Pragia, Panloea. Pholorhabdus, Proleus. Providencia. Rahnella. Salmonella. Serralia. Shigella. Tatumella. Trabulsiella. Xenorhabdus. Yersinia y Yokenella. Solamente unos pocos de estos géneros serán objeto de análisis en este capítulo. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las bacterias de la familia Enterobactenaceae se encuentran presentes en las plantas, el suelo, las aguas y el intestino del hombre y de los animales. Se han asociado con una gran diversidad de infecciones clínicas que incluyen abscesos, neumonía, meningitis, septicemia e infecciones de las vías urinarias. Los microorganismos que están implicados con mayor frecuencia en las infecciones en el hombre son Escherichia coii y varias especies incluidas en los géneros Klebsiella, Proteus, Enterobacter. Salmonella, Shigella, Serralia. Citrobacter y Providencia. Las especies E. coli. Proteus mirabilis y Klebsiella pneumoniae son las que se encuentran con una mayor frecuencia en las vías urinarias. K. pneumoniae es el responsable que con mayor frecuencia se encuentra asociado a las neumonías causadas por bacilos gramnegativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Las especies causantes de bacteriemias son E. coli. K pneumoniae y P. mirabilis. Los miembros pertenecientes a los géneros que exhiben una acusada resistencia a los antibióticos, como Citrobacter, Enterobacter y Serratia, son los responsables más probables de las infecciones nosocomiales atribuidas a esta familia. Las enterobacterias asociadas con procesos diarreicos son diversas especies incluidas en los géneros Shigella. Salmonella. Yersinia y las cepas enterohemorrágicas, enteropatógenas. enterotoxigénicas. enteromvasivas y enteroadherentes de la especie E coli. Las especies del género Shigella se aislan muy raramente de una localización que no sea el tracto gastrointestinal, mientras que las del género Salmonella se aislan con mayor frecuencia de otras fuentes como sangre y orina. Las endoloxinas, que están presentes como componentes estructurales de la membrana externa de la pared celular de las enterobacterias. asi como en otros bacilos gramnegativos. son responsables en gran medida de la morbilidad y mortalidad asociadas a las infecciones causadas por estas bacterias. Las endotoxinas están formadas por una parte lipidica y otra polisacarídica. con un componente minoritario de naturaleza proteica. Estos componentes de la célula bacteriana pueden producir fiebre, escalofríos, hipotensión, granulocitosis. trombocitopenia. coagulación intravascular diseminada y activación del complemento por las dos vías, clásica y alternativa. El shock endotóxico es el resultado de una septicemia por bacterias gramnegativas, donde la endotoxina reacciona con los macrófagos, leucocitos, plaquetas, complemento y otras proteínas del suero para incrementar los niveles séricos de ciertas proteínas proteoliticas y de sustancias vasoactivas. con la consiguiente estasis sanguínea, incremento de la vasoconstricción periférica y disminución del gasto cardiaco. Debe quedar claro que los efectos letales de las endotoxinas dependen de la activación y respuesta de los macrófagos. y que la producción de caqueetma por los macrófagos activados desempeña un papel fundamental en la manifestación del shock profundo y en las múltiples lesiones orgánicas (Tracny, 1988).

Otros factores patogénicos de las enterobacterias incluyen el antigeno K1. que está presente en un elevado porcentaje de cepas de E. coli que causan meningitis neonatal; la cápsula de K. pneumoniae. que. al igual que la de los neumococos, inhibe la fagocitosis; el antigeno Vi de Salmonella typhi, que puede interferir con los procesos que causan la muerte intracelular de este organismo: y diversos tipos de antígenos superficiales como las umbrías, que participan en la adherencia de los microorganismos a las superficies mucosas. Los factores determinados por plásmidos parecen desempeñar un papel importante en las propiedades invasivas de Salmonella. Shigella y las cepas enteroinvasivas de £ coli. Además, las enlerotoxmas termolábiles (TL) y termoestables (TE) de E. coli están codificadas por plásmidos. Las toxinas TL estimulan a la enzima adenilato ciclasa en las células de la mucosa del intestino delgado, que, a su vez. activa el cAMP, lo que provoca una salida de líquidos y electrólitos desde las células a la luz intestinal, produciendo diarrea acuosa. Por el contrario, las toxinas TE parecen activar la guanilato ciclasa. Diagnóstico de laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos a partir de muestras contaminadas se facilita en gran medida con el empleo de medios selectivos y diferenciales (Tabla 50-9). El agar EMB (con eosina y azul de metileno) y el agar MacConkey pueden ser utilizados de forma indistinta como medios mínimamente selectivos y diferenciales para la selección y diferenciación inicial de los bacilos gramnegativos termentadores y no termentadores de la lactosa. Los medios XLD y HE son medios diferenciales con un carácter selectivo más acusado, y son especialmente útiles para recuperar especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras con un elevado grado de contaminación bacteriana, como son las heces. El agar bismuto-sulfito (BS) es un medio fuertemente selectivo de gran utilidad para la detección de salmonelas durante los brotes endémicos o epidémicos de las infecciones causadas por estas bacterias. Las especies del género Salmonella producen H;S y se reconocen fácilmente por que las colonias que forman en los medios XLD, HE y BS presentan el centro de color negro. Los medios de enriquecimiento como el caldo selenito F o el caldo GN (para gramnegativos) son recomendables cuando se pretende detectar las especies de los géneros Salmonella o Shigella que están en bajo número en muestras de heces. El agar CIN (cefsulodina-irgasán-novobiocina) incubado a temperatura ambiente es selectivo y diferencial para la recuperación de Y enterocohtica. Las colonias de esta bacteria en agar CIN tienen una apariencia que se denomina "en ojo de toro", con el centro rojo y los bordes transparentes. El agar MacConkey con sorbitol como azúcar fermentable permite diferenciar la cepa 0157:H7 de E coli asociada a síndrome hemolítico urémico, porque a diferencia de oirás cepas de E. coli. ésta es incapaz de fermentar el sorbitol. Algunas enterobactenas pueden ser identificadas presuntivamente mediante la determinación de unas pocas pruebas bioquímicas y características de las colonias que forman. Por ejemplo, las especies de Proteus exhiben una movilidad en enjambre cuando crecen en agar sangre, las de Klebsiella forman colonias mucoides voluminosas, las de Serralia pueden sintetizar un pigmento rojo, las de Salmonella pueden producir H,,S y E. coli es indol positiva. La identifica-

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA

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Tabla 50-10 Caraceristicas diferenciales d e las e s p e c i e s d e enterobacterias aisladas m á s f r e c u e n t e m e n t e e n e l laboratorio d e microbiología clínica (Continuación)

ción deliniliva requiere pruebas bioquímicas adicionales. Se han descrito innumerables esquemas de identificación basados en la realización de pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de los miembros de la familia Enterobacteriaceae. En la Tabla 50-10 se indican las caracleristicas diferenciales de las enterobacterias mas comúnmente aisladas en los laboratorios de microbiología clínica. Hay disponibles diferentes sistemas comerciales para la identificación de la inmensa mayoría de enterobacterias que ofrecen una gran sencillez de uso y precisión. En algunos casos, la identificación puede llevarse a cabo en unas pocas horas y con una elevada fiabilidad mediante estos métodos. Los sistemas semiautomatizados pueden combinar la realización de las pruebas de identificación con las de sensibilidad a los antimicrobianos en un único dispositivo. En general, todos estos sistemas tienen un grado de precisión muy elevado y permiten obtener resultados comparables. La clasificación de las enterobacterias ha experimentado una profunda revisión en los últimos años como resultado de los estudios realizados con técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. Debido a que la agrupación fenotipica basada en pruebas bioquímicas no está siempre de acuerdo con el parentesco genético, se ha eliminado la categoría de tribu (p. ej., Klebsielleae, Proteae) para agrupar a las especies dentro de la familia.

lutivamente antes de que los antibióticos comenzaran a utilizarse terapéuticamente. Un ejemplo de esto es la resistencia a la penicilina observada en especies de los géneros Citrobacter. Klebsiella. Enterobacter y Serratia. Algunas de ellas son intrínsecamente resistentes también a las cefalosponnas de primera generación. La resistencia adquirida es el resultado de la exposición a los agentes antimicrobianos. Ejemplos de la misma son las cefalosporinasas de tipo I producidas por Citrobacter treundh y Enterobacter cloacae. que confieren resistencia a ceftacidima, y las |5-lactamasas de amplio espectro sintetizadas por K. pneumoniae o £ col!, que son responsables de la resistencia a las cefalosporinas de tercera generación. Debido a que el patrón de resistencia de las enterobacterias es impredecíble, las pruebas de sensibilidad deben realizarse, como regla general, si se considera administrar una terapia antimicrobiana. En caso contrario, como pueden ser las infecciones intestinales sin complicaciones causadas por salmonelas, en las que un tratamiento con antibióticos contribuye realmente a prolongar el estado de portador en el individuo afectado, no es necesario llevar a cabo las pruebas de sensibilidad.

Vibrio Características. Las especies del género Vibrio son bacilos gramnegativos cortos, rectos o curvados, anaerobios facultativos, oxidasa positivos, generalmente móviles por flagelos polares, capaces de fermentar los carbohidratos y de reducir los nitratos a nitritos. Algunas de las especies tienen importancia clínica (Tabla 50-11).

Históncamente, el género Salmonella se ha divido en la siguientes especies: S. typhi. S. paratyphi A y B, S. choleraesuis. S. typhimurium y S. enleritidis. Debido a que todas estas especies están muy relacionadas genéticamente, actualmente sólo se reconocen dos especies, S. entérica y S. bongori. cada una de las cuales incluye múltiples serotipos. Casi todos los serotipos conocidos están incluidos en la especie S. entérica (Brenner, 2000). El serotipado se basa en la reactividad inmunológica de los antígenos somáticos "O" termoestables, que son fundamentalmente de naturaleza lipopolisacaridica. y los antígenos flagelares "H", que son termolábiles y de composición proteica. El serotipo typhi de Salmonella también sintetiza un antígeno capsular denominado Vi. que es de naturaleza polisacarídica y termolábil. En la práctica, la mayor parte de laboratorios clínicos identifican los aislamientos como "especie de Salmonella" basándose en las pruebas bioquímicas, utilizando seguidamente los sueros específicos de grupo para asignar el microorganismo aislado a un serogrupo específico. La identificación a nivel de serotipo sólo se lleva a cabo en los laboratorios de referencia. Los aislamientos que se componan como Shigella desde el punto de vista bioquímico también se clasifican atendiendo a la reactividad inmunológica de sus antigenos "O" al igual que las cepas de E coli identificadas como causas potenciales de diarrea, síndrome hemolitico urémico o púrpura trombocitopenica. Hay disponibles sistemas comerciales que permiten la identificación de £ co//0157:H7 y la detección de algunos tipos de toxinas en los cultivos o en muestras de heces; sin embargo, la realización de estas pruebas es llevada a cabo, generalmente, por los laboratorios de referencia.

Las cepas 01 de Vibrio cholerae productoras de toxina colérica son responsables de las epidemias de cólera, enfermedad que se caracteriza por una masiva pérdida de líquidos a nivel del intestino y que provoca deshidratación en el paciente. La toxina colérica ejerce su acción uniéndose a la enzima adenilato ciclasa de las células del epitelio de la mucosa del intestino delgado causando su activación, lo que trae como consecuencia una hipersecreción de agua y electrólitos (Kaper, 1995). Las cepas no-01 de V. cholerae causan una gastroenteritis autolimitada y no provocan epidemias de la enfermedad. Prácticamente ninguna de las cepas no-01 de V. cholerae produce toxina colérica, aunque sí que sintetizan dos tipos de hemolismas y una enterotoxina termoestable.

Sensibilidad a los antimicrobianos. La sensibilidad de las enterobacterias a diversos agentes antimicrobianos es muy variable debido tanto a factores intrínsecos como a mecanismos de resistencia adquiridos. La resistencia intrínseca es el resultado de rasgos genéticos que han aparecido evo-

Las especies V mimicus y V. parahaemolyticus causan gastroenteritis primariamente. La patogenicidad en el caso de V. parahaemolyticus parece estar relacionada más con el carácter invasivo de esta especie que con la producción de enterotoxinas. Más del 95% de cepas de V. parahaemolyticus ais-

Manifestaciones clínicas y patogenia. Entre las especies del género. Vibrio vulniticus causa la patología más grave. Las infecciones de las heridas y la septicemia debidas a esta bacteria son. a menudo, mortales. La enfermedad está asociada con el consumo de ostras crudas o con heridas producidas al manipular ostras. En los casos graves casi siempre existe una afección hepática subyacente. Una función hepática disminuida provoca un aumento en la concentración de hierro utilizable por el microorganismo, lo que facilita su crecimiento,

CAPÍTULO 50

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA

ladas de pacientes con gastroenteritis producen una hemohsina exocelular que es letal para el ratón cuando se le inyecta en dosis elevadas, lo que se conoce con el nombre de fenómeno de Kanagawa. Esta bacteria halófila está ampliamente distribuida en las aguas marinas, contaminando a pescados y mariscos. Los brotes de diarrea aguda tras la ingestión de pescado crudo han sido particularmente frecuentes en Japón, pero también se han producido en EE.UU. y otros países. Diagnóstico de laboratorio. Aunque antiguamente la preocupación sólo afectaba a los viajeros de EE.UU. que iban a áreas endémicas, recientemente se han detectado casos de enfermedad causada por V. cholerae en este pais asociados a la ingestión de mariscos contaminados procedentes de la costa del golfo de México. Además, se han descrito casos de gastroenteritis por V. parahaemolyticus y otras especies halófilas del género Vibrio presentes en mariscos contaminados en muchas regiones del país, especialmente en zonas costeras. Por consiguiente, es importante que los laboratorios clínicos tengan la capacidad para realizar coprocultivos para el aislamiento de especies de Vibrio cuando esté indicado, en función del historial (viajes realizados, alimentos consumidos) de la persona sobre la que existe la sospecha de que esté sufriendo infecciones de este tipo. Con la excepción de V. cholerae y V mimicus, el crecimiento de los vibrios requiere que los medios de cultivo contengan NaCI. La mayor parte de medios de cultivo sólidos y líquidos utilizados habitualmente para el cultivo de bacterias contienen sodio suficiente, por lo que no es necesario utilizar medios especíales en esos casos. Los medios selectivos que contienen sacarosa, como el agar con tiosulfato, citralo y sales biliares (agar TCBS). son de gran utilidad para el cultivo de Vibrio spp. a partir de muestras de heces. Algunas especies (V. cholerae y V. alginolyticus) son capaces de fermentar la sacarosa y forman colonias de color amarillo en ese medio. Puede utilizarse un medio de enriquecimiento como el agua de peptona alcalina antes de realizar la inoculación en medio sólido selectivo, con objeto de aumentar las posibilidades de recuperación de las especies de Vibrio a partir de muestras de heces. Los miembros del género pueden diferenciarse entre ellos y de otros bacilos intestinales gramnegativos según las características bioquímicas que se muestran en la Tabla 50-11. En el caso de los vibrios halófilos puede ser necesario utilizar medios que contengan entre un 1% y un 3% de NaCI para llevar a cabo las pruebas pertinentes. Si se inoculan placas con agar TSI (agar triple azúcar-hierro) y agar LIA (agar lisina-hierro) con finalidad analítica, las reacciones observadas deben ser pendiente ácida/fondo ácido sin gas (A/A) o con formación de H S, y pendiente alcalina/fondo alcalino (K/K), respectivamente. No todos los sistemas comerciales existentes para la identificación de bacterias gramnegativas son seguros para llevar a cabo la identificación de las especies del género Vibrio, y sólo deben utilizarse cuando se ha comprobado previamente su Habilidad ?

Sensibilidad a los antimicrobianos. Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos pueden realizarse mediante el método de difusión en disco, utilizando agar Mueller-Hinton. El National Committee tor Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ha establecido los patrones de referencia para interpretar los resultados de las pruebas de sensibilidad de V. cholerae frente a la ampicilina. la tetraciclina, el trimetoprim-sulfametoxazol. el cloranlenicol y las sullonamidas (NCCLS. 2000a). No existen patrones de referencia para las otras especies del género.

Aeromonas Características. Las especies de este género son bacterias gramnegativas de morfología bacilar, oxidasa y catalasa positivas, y anaerobias facultativas. Generalmente son móviles por medio de flagelos polares, aunque algunas especies son inmóviles. Producen ácidos a partir de los carbohidratos, tanto por via oxidativa como fermentativa, y reducen los nitratos a nitritos. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Aeromonas se encuentran presentes en hábitats acuáticos principalmente. Se han aislado a partir del agua potable, agua de ríos, suelo y varios tipos de alimentos, y sólo raramente de ambientes marinos. Estos microorganismos se han asociado con infecciones intestinales y extraintestinales. Aunque no existe una evidencia definitiva que demuestre el papel de las Aeromonas en las infecciones gastrointestinales, la presencia de especies de Aeromonas en muestras de heces se asocia más con un proceso diarreico que con un estado de portador asintomático. La diarrea se asocia con la capacidad que tienen algunas cepas

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para producir una enterotoxina. También se ha descnto una hemolisina y un factor citopático. Las especies de Aeromonas también causan infecciones de heridas traumáticas, diarrea o septicemia en pacientes inmunocomprometidos (Janda, 1991.1994). Diagnóstico de laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos. termentadores y oxidasa positivos, sugiere fuertemente la posibilidad de que se trate de una especie de Aeromonas. Estos microorganismos crecen fácilmente en los medios de cultivo convencionales, lormando colonias que recuerdan a las que producen las especies del género Pseudomonas. con un color verdoso semejante al del vidrio triturado y un olor afrulado. La mayor parte de especies son [i-hemoliticas cuando crecen en agar sangre. El aislamiento de aeromonas a partir de muestras de heces se facilita si se utiliza agar sangre con ampicilina o medio CIN (agar cefsulodina-irgasán-novobiocina). Sensibilidad a los antimicrobíanos. Las Aeromonas son sensibles a las quinolonas. las cefalosporinas de tercera generación, los aminoglucósidos, el cloranfenicol y las tetraciclinas, aunque producen una |Wactamasa que es responsable de la resistencia a las penicilinas y las cefalosponnas de primera generación. Se ha comprobado que las Aeromonas albergan plásmidos R tanto de enterobacterias como de Pseudomonas spp. Los sistemas comerciales rápidos para las pruebas de sensibilidad pueden no ser liables para este grupo de bacterias, por lo que se recomienda el método de difusión en disco.

Plesiomonas Características. Plesiomonas shigelloses, la única especie comprendida dentro del género Plesiomonas. es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, oxidasa y catalasa positivo, que fermenta la glucosa. Las últimas evidencias obtenidas mediante técnicas de genética molecular indican que el género Plesiomonas está estrechamente relacionado con el género Proteus de la familia Enterobacteriaceae. Manifestaciones clínicas y patogenia. P shigelloses se encuentra en ambientes acuáticos, con una distribución geográfica limitada por la temperatura mínima de crecimiento de la bacteria, que es 8 C. El microorganismo puede aislarse a partir de aguas dulces y de estuario en países tropicales, y provoca gastroenteritis, a menudo tras la ingestión de mansco crudo. Las heces diarreicas contienen, frecuentemente, leucocitos polimorionucleares y hematíes, aunque los individuos infectados también pueden padecer una enfermedad similar al cólera. La gastroententis puede aparecer en casos esporádicos o en forma de epidemias. Las formas extraintestinales de la infección por P shigelloides incluyen meningitis, septicemia, celulitis, artritis y endoftalmitis. Se sabe relativamente poco sobre los factores de virulencia asociados a esta especie bacteriana. P shigelloides parece tener carácter invasivo, y algunas investigaciones sugieren la existencia de una actividad enterotoxigémca (Brenden, 1988). Diagnóstico de laboratorio. P. shigelloides puede aislarse en diversos medios de cultivo no selectivos y selectivos para enterobacterias, incluyendo el agar HE. La producción de ácidos a partir de la lactosa tiene carácter variable, aunque por lo general esta bacteria aparece como no termentadora de la lactosa cuando crece en medios selectivos para bactenas entéricas. Entre otras caracteristicas bioquímicas se pueden citar las siguientes; es indcJ positiva, reduce los nitratos a nitritos, produce catalasa, da positiva la prueba del rojo de metilo y fermenta la glucosa, la maltosa y la trehalosa (Brenden, 1988). Sensibilidad a los antimicrobianos. P. shigelloides es sensible a una gran variedad de antibióticos, incluidos aminoglucósidos, trimetoprim-sulfametoxazol. cloranfenicol. tetraciclinas y quinolonas. La sensibilidad a las penicilinas es variable debido a la producción de una |i-lactamasa similar a la de Aeromonas spp

Campylobacter Características. Los miembros del género Campylobacter son bacterias gramnegativas de pequeño tamaño (0.5 pm -8 pm de largo por 0.2 iim-0,5 pm de ancho), curvadas (en forma de coma o de letra S). móviles y no formadoras de esporas, con un crecimiento óptimo en una atmósfera que contenga entre un 5% y un 10% de oxigeno solamente, razón por la que estas bactenas se consideran microaerófilas. Campylobacter je/uni es la causa más común de enteritis bacteriana en los EE.UU. Otras especies del género asociadas con esta patología son C. coli. C. tari y C upsaliensis. C. letus subespecie fetus causa tromboflebitis séptica, artritis, peritonitis, abscesos y pericarditis (Penner, 1988), especialmente en personas con enfermedades crónicas subyacentes.

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Manifestaciones clínicas y patogenia. C. jejuni se encuentra distribuido por todo el mundo, formando parte de la microbiota del tubo digestivo de animales salvajes y domésticos (ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos y aves de corral, como pavos y pollos). Es la causa más común de enteritis bacteriana en EE.UU.. con una incidencia estimada de 1.000 casos por cada 100.000 individuos. La incidencia de la infección es similar en el Remo Unido y en otros países desarrollados, mientras que en los países subdesarrollados es incluso más elevada. Las infecciones tienen lugar, generalmente, durante el verano y el otoño y normalmente son consecuencia de la ingestión de alimentos mal cocinados, en especial carne de pollo y otras aves de corral. También se han asociado algunos brotes de enteritis por C. jejuni al consumo de leche y a fallos en los sistemas municipales de potabilización de aguas. La infección puede ser desde asintomática hasta muy grave. Las heces diarreicas pueden indistintamente contener o no sangre y leucocitos. Los síntomas pueden durar hasta una semana y generalmente son autolimitados. También pueden producirse infecciones extramtestmales como bacteriemia. artritis reactiva, infecciones de las vías urinarias y meningitis. C. ¡ejuni también está reconocido como la causa antecedente del síndrome de Guillain-Barré. La capacidad patogénica de esta bacteria no está totalmente esclarecida: parece que primero coloniza la mucosa intestinal y luego es capaz de atravesar la superficie epitelial para alcanzar los tejidos subyacentes. El habitat principal de C. telus subesp. lelus es el intestino de ovejas y ganado vacuno, aunque también puede encontrarse en el tracto genital de estos animales, en sus placentas, en el contenido gástrico de los fetos abortados y, con menor frecuencia, en otros animales y en aves. Los mecanismos de transmisión al hombre no están plenamente caracterizados. El contacto directo con animales infectados es una posible causa de contagio, aunque menos de un tercio de individuos infectados tienen un historial de riesgo a la exposición por razones profesionales o ambientales. Los alimentos y las aguas contaminadas pueden ser un vehículo para la infección en humanos, aunque también ésta puede producirse a partir de una fuente endógena. Diagnóstico de laboratorio. Una única muestra de heces es apropiada, generalmente, para detectar patógenos intestinales, incluyendo las especies de Campylobacter. El examen de la muestra en busca de leucocitos fecales no está recomendado porque sólo aparecen en menos de un 25% de los casos. Está disponible un enzimoinmunoensayo (EIA) para la detección de antígenos de C. jejuni y C. coli directamente en las muestras de heces. Pueden utilizarse diferente medios para el aislamiento selectivo de las especies de Campylobacter. como agar carbón vegetal-cefoperazona-desoxicolato, medio selectivo con carbón vegetal, medio semisólido sin sangre (para movilidad), medio de Skirrow y agar Campylobacter con un 5% de sangre de oveja y cinco antimicrobianos (cefalotina, tnmetoprim. vancomicina. polimixina B y anfotericma B). La mayor parte de especies necesitan una atmósfera de incubación microaerófila (5% de 0 , 10% de CO, y 85% de N,). que puede conseguirse mediante sistemas generadores de gases disponibles comercialmente, La cantidad de oxígeno existente en una jarra con vela es demasiado baja para permitir el crecimiento de Campylobacter spp.. por lo que no debe utilizarse. La incubación de los medios a 42' C incrementa la selectividad para C. jejuni. 2

Si se sospecha la presencia de Campylobacter spp. en un hemocultivo basándose en el historial clínico o en la apariencia del microorganismo observado bajo tinción de Gram. el caldo debe ser subcultivado en un agar sangre no selectivo, que se incubará a 37 C en una atmósfera microaerofilica. En general, las colonias de Campylobacter spp. son de color gris, planas, irregulares y extensas, que pueden convertirse en redondas, convexas y relucientes a medida que la humedad del medio va disminuyendo. La observación de la morfología típica bajo tinción de Gram y una prueba positiva de la oxidasa a partir de una colonia crecida en un medio selectivo a 42'C son evidencias suficientes para identificar a un aislamiento como una especie de Campylobacter. C. jejuni es capaz de hidrolizar el hipurato y es sensible al ácido nalidíxico y resistente a la cefalotina. C. coli no hidrolíza el hipurato. Las cepas de C. fetus subesp. ietus son resistentes al ácido nalidíxico, son incapaces de hidrolizar el hipurato y no crecen generalmente a 42°C. Sensibilidad a los antimicrobianos. C jejuni tiene una sensibilidad variable a los agentes antimicrobianos. La mayor parte de especies no son sensibles a las penicilinas y las cefalosporinas. En el caso de infección intestinal, la eritromicina es el antibiótico de elección, con las quinolonas como opción alternativa, aunque se han detectado resistencias frente a ambos

agentes. No existen hasta el momento métodos estandarizados para llevar a cabo las pruebas de sensibilidad en este grupo de microorganismos.

Helicobacter Características. Las especies del género Helicobacter son bacilos gramnegativos curvados o en espiral, no esporulados. que miden entre 0,3 um-1.0 iim de ancho y 1.5 Lim-10 iim de largo. Son móviles por medio de múltiples flagelos localizados en ambos polos de la bacteria o de un único flagelo monopolar, microaerofílicas y tienen metabolismo respiratorio. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies de Helicobaterse encuentran en el Irado gastrointestinal de los mamíferos y las aves. La transmisión entre hospedadores es por vía oral u oro-fecal. Helicobacterpylori está considerado como una de las especies "gástricas" del género. Esta bacteria vive dentro de la capa mucosa del estómago adyacente al epitelio o inmediatamente por debajo de la misma. También se encuentra transitoriamente en el duodeno, en la saliva y en las heces. La infección por H. pylon puede provocar los síntomas de una gastritis aguda. La mayor parte de pacientes infectados desarrollan una gastritis crónica activa que puede conducir a una dispepsia no ulcerosa o a una úlcera duodenal. Esta especie se ha asociado con el 90% de los casos de úlcera duodenal y con la práctica totalidad de los de úlcera gástrica. La infección por H. pylori también se ha relacionado con el carcinoma y el lintoma gástricos (Murray, 1993: Parsonnet, 1991,1994). La prevalencia de la gastritis asociada a la infección por H. pylon aumenta con la edad, lo que sugiere que el microorganismo se adquiere a medida que la gente envejece, Las especies "intestinales" del género, tales como Helicobacter (antiguamente Campylobacter) cmaedi y H. lenelliae. han sido implicadas en casos de gastroenteritis. Estos microorganismos invaden raramente el torrente circulatorio, pudiendo ser aislados entonces mediante hemocultivo. Diagnóstico de laboratorio. Los métodos no basados en el cultivo bacteriano se han utilizado clásicamente para el diagnóstico de las infecciones causadas por H. pylori. Uno de estos métodos se basa en la detección de urea en el aliento. Esta técnica no invasiva detecta la actividad uteásica de H. pylori midiendo el CO etiquetado con C o C que se desprende en el aire expelido por el paciente al que se le ha administrado previamente urea marcada radiactivamente. Los métodos serológicos también se utilizan ampliamente en los pacientes sintomáticos para detectar anticuerpos frente a H. pylon. En algunos casos pueden obtenerse por biopsia muestras de tejido afectado que se examinan histológicamente mediante tinción con hematoxilina y eosina o por la técnica de Gíemsa. para detectar la presencia de bacterias con la morfología típica de H. pylon. Debido a que el microorganismo hidrolíza la urea muy rápidamente, una alícuota de la biopsia de tejido gástrico debe incubarse directamente en caldo urea o en placas con agar urea, para detectar la hidrólisis de la urea entre 1 y 24 horas después. Desde hace poco tiempo, se encuentra disponible en el mercado un enzimoinmunoensayo para la detección de antígenos de H. pylon en heces, que augura ser una alternativa muy prometedora para el diagnóslico no invasivo de las infecciones causadas por esta bacteria. M

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?

Para el cultivo, las muestras de tejidos deben mantenerse a 4 C y ser procesadas antes de que transcurran dos horas tras su recolección. Como medios de transporte pueden utilizarse diferentes alternativas, como el caldo Brucella con un 20% de glicerol, el medio Albemí con cisteína y un 20% de glicerol. solución salina isotómca con un 4% de glucosa y el medio de transporte de Stuart. Las muestras procesadas deben inocularse en alguno de los medios apropiados, entre los que se encuentran el caldo infusión de cerebro y corazón, agar Brucella. agar Columbia y medio de Skirrow enriquecido con sangre o suero de caballo, o con sangre de oveja. Se recomienda que los medios contengan vancomicina, anfolencina y cefsulodina como agentes selectivos, Una vez inoculados, los medios deben incubarse en una atmósfera microaerofilica (5%-10% de CO.„ 80%-90% de N y 5%-10% de 0 ). con humedad elevada, a 35 C. durante 5-7 días. La presencia de H (5%-8%) en la atmósfera de incubación favorece el crecimiento de H. pylon. 2

?

Por lo general, en los medios antenormente mencionados. H. pylori óa lugar a colonias pequeñas, de color gris y translúcidas, formadas por bacilos espirales gramnegatívos. cuando se observan en extensiones teñidas por el método de Gram, y que dan positivas las pruebas de la oxídasa, la catalasa y la ureasa. Generalmente no se lleva a cabo el aislamiento de las especies intestinales de Helicobacter a partir de heces. Las diferentes especies del género pueden

CAPÍTULO 50

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA

crecer y delectarse en los sistemas automatizados para hemocultivo que se emplean en muchos laboratorios, aunque en este caso puede ser necesano prolongar el período de incubación más allá de los cinco días estándar. Sensibilidad a los antimicrobianos. Para el tratamiento de las infecciones causadas por H. pylori se utilizan regímenes de administración combinada de antibióticos, que incluyen, usualmente. dos antibióticos (metronidazol. clantromicina, tetraciclina o amoxicilina) y un medicamento antiácido. Se ha descrito la existencia de cepas que son resistentes al metronidazol y a la claritromicina. Para realizar las pruebas de sensibilidad, el NCCLS recomienda el método de dilución en agar, empleando agar Mueller-Hinton enriquecido con un 5% de sangre de oveja (NCCLS, 2000b).

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que producen las bacterias de este grupo. Las reacciones se detectan usualmente al cabo de 48 horas, aunque en algunos casos puede ser necesario prolongar la incubación hasta siete días. Sensibilidad a los antimicrobianos. Como regla general, las pruebas de sensibilidad deben realizarse con todos los aislamientos de P. aeruginosa con significado clínico. Esto es especialmente importante en el caso de cepas hospitalarias, que pueden ser resistentes frente a uno o incluso todos los agentes antimicrobianos que se utilizan para tratar las infecciones Entre éstos se incluyen los aminoglucósidos, las carboxi- y ureidopenicilinas, la celtacidima o cefepima y las quinolonas.

Burkholderia y Stenotrophomonas Pseudomonas Características. El género Pseudomonas ha experimentado una profunda revisión y en la actualidad muchas de las especies que habían sido inicialmenle clasificadas dentro de este género han sido reclasificadas dentro de los géneros Burkholderia. Slenolrophomonas, Comamonas, Shewanella. Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas. Acidovorax y Brevundimonas. Entre las especies que permanecen dentro del género Pseudomonas. P. aerugmosa es la que tiene mayor importancia como patógeno del hombre. Las pseudomonas son bacilos gramnegativos. aerobios estrictos, catalasa y oxidasa positivos. Su metabolismo es estrictamente respiratorio (oxidativo), nunca fermentativo, utilizando el oxígeno como el aceplor final de electrones. Algunas especies son móviles por medio de flagelos polares. Manifestaciones clínicas y patogenia. Las especies del género Pseudomonas se encuentran distribuidas en ambientes húmedos. Algunos de los habitat más inusuales en donde se pueden encontrar estas bacterias incluyen los productos cosméticos, el agua de las piscinas y jacuzzis. y la parte interior de la suela de las zapatillas. En este último caso, esta es la fuente a partir de la que pueden infectarse con P. aeruginosa pequeñas heridas punzantes en la planta de los pies. La especie del género responsable de la mayor morbilidad y mortalidad hoy en día es P. aeruginosa. Aunque otras especies del género se aislan a menudo a partir de especímenes clínicos, sólo están implicadas ocasionalmente en infecciones en el hombre. P. aeruginosa es ubicua en el ambiente hospitalario, encontrándose presente en casi cualquier lugar en el que haya humedad, incluyendo equipos médicos, soluciones desinfectantes y jabones. Se encuentra muy raramente lormando parte de la microbiota normal en las personas sanas, pero en los individuos hospitalizados la lasa de colonización se incrementa de forma proporcional a la duración del período de hospitalización. P. aeruginosa puede producir infecciones graves en pacientes con quemaduras, que tienen heridas traumáticas o quirúrgicas, que han sufrido manipulaciones en sus vías urinarias, que tienen enfermedades en los sistemas hematopoyético. reticuloendotelial y linfático, y en todos aquellos que tienen problemas en sus defensas inmunológicas de tipo humoral o celular. Las infecciones pulmonares causadas por estos microorganismos aparecen primariamente en pacientes con fibrosis quistica La tasa de mortalidad más elevada se da en individuos con leucopenia grave (7(B. T)'

Filo Ciliophora (ciliados) Balanlidium coli (I)* Filo apicomplexa (apicomplejos) Clase Sporozoea Subclase Piroplasmea Babesia spp. (B)° Subclase coccidios Plasmodium falciparum (B) P malariae (B) P ova/e (B) P wvax (B) Cryptosporidium parvum (I)" Cyclospora cayetanensis ( I ) Isospora belli (I)* Toxoplasma gondii (T)' Filo Microspora (microsporidios) Encephalilozoon spp. (E, H, T)* £ intestinalis (I. T)' Enterocytozoon bieneusi (I)' -

Filo Platelmintos (gusano plano) Clase ceslodos (lenias) Diphyllobothrium spp. (I)' Dipylidium caninum (I)* Echinococcus granulosus (H)" £ multilocularis (H)' Hymenolepis nana (I)' H. diminuta (I)' Taen/a saginata (1)" 7 solium (I. T)" Clase Tremátodos (lombrices) Clonorchis sinensis (H) Fasciola hepática (H)* Fasciolopsis buski(i) Heterophyes heterophyes (I) Metagonimus yokagawai(I) Nanophyetus salmincola (1)" Opistorchis viverinni (H) Paragonimus spp (L)* Schistosoma haematobium (B) S japonicum (B) S. mekongi (B) S. manson/(B) Filo Nematodos (gusanos redondos) Clase Adenophoros (aplasmidios) Trichinella spiralis (T. 1)" Trichuris trichiura (I) Capillaria philippinensis (I) Clase Secernentia (plasmidios) Enterobius vermicularis (I) Ascaris lumbhcoides (I)' Ancylostoma duodenale (I) Necator amencanus (I)* Strongyloses stercoral (I) Trichostrongylus spp. (I)' Amsaki spp. (1)" Wucfiereria bancrotli (T, B) Brugia malayi (T. B) Loa toa (T, B) Onchocerca volvulus (T) Mansonella perstans (TB) M. ozzardi (T. B) M streptocerca (T) Dracunculus medinensis (T) Angiostrongylus cantonensis (T) A costaricencis (T) -

-

* Parásitos patógenos naturales de Estados Unidos B sangre. C liquido cefalorraquídeo: E 0|0: H: hígado: I: intestino L pulmón T: tejidos; V: vagina Adaptada de Murray PR Barron EJ Pfaller M. y cois. Manual of Clinical Microbiology, 6a ed Washington DC ASM Press. 1995

diagnóstico diferencial a menos que el paciente aporte información voluntariamente o se le interrogue específicamente sobre la historia de viajes u otras exposiciones. La malaria es una de las patologías parasitarias que cursa con un cuadro febril agudo, que puede tener consecuencias letales a menos que se la considere en el diagnóstico diferencial y se recoja una historia de viajes a una zona endémica. Se han hecho varias estimaciones de la prevalencía y mortalidad de las infecciones parasitarias en todo el mundo (Tabla 55-2). Se desconoce la incidencia actual de las infecciones por parásitos en los EE.UU. porque la mayoría no se declaran a las oíicmas de salud pública. Giardia lamblia.

otros protozoos intestinales y los gusanos redondos intestinales son los más frecuentemente declarados (7,2%. 10% y 3.5%, respectivamente) por los laboratorios, pero probablemente son más comunes otros parásitos, entre los que se incluyen Cryptosporidium. Cyclospora y los microsporidios, aunque están infradiagnosticados (Kappus, 1994). Este capítulo hace una revisión del abordaje general de los laboratorios para la detección y el reconocimiento de los protozoos y helmintos en las muestras humanas. Se necesita una descripción de las distintas especies de parásitos para tener una información clínica y biológica esencial para el diagnóstico y tratamiento. Para una mayor descripción de los parásitos.

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SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA N

Tabla 55-2 Prevalencia mundial e s t i m a d a para las infecciones parasitarias Población estimada N. anual afectada de muertes Enfermedad Protozoos Amebiasis Tripanosomiasis africana Tripanosomiasis americana Giardiasis Leishmaniasis Malaria Helmintos Ascariasis Ceslodos ClonorquiasisOpistorquiasis Dracunculosis Fasciolopsiasis Filarías linfáticas Uncinanas Oncocercosis Paragonimiasis Esquistosomiasis millón Estrongiloidiasis Tricoeslrongiliasis Tncunasis

Aprox. 10% de la población 100.000 nuevos casos al año 24 millones 200 millones 1.2 millones 400-490 millones 1.3 billones 65 millones 13.5 millones < 100.000 10 millones 128 millones 1,3 billones 17.7 millones 2.1 millones 150 millones

40.000-110.000 5.000 60.000

2.2-2.5 millones 1 550

cuencia de muestras necesarias para el diagnóstico. También son útiles en muchas ocasiones los métodos de diagnóstico inmunológico y molecular, y a veces pueden ser los únicos métodos de diagnóstico disponibles. Se puede encontrar una descripción completa de los procedimientos de laboratorio general para la delección e identificación de los parásitos en distintas fuentes a las que nos remitimos (Ash. 1987; Balows, 1 9 8 8 : Beaver. 1984; Garcia. 1997.1999: Isenberg. 1992; Murray. 1999: Price. 1994). La familíarización con la calibración y el uso de un micrómetro ocular es necesaria para llevar a cabo cualquier examen parasitológico en cualquier laboratorio. La medición del tamaño de los trolozoítos de los protozoos y los quistes, así como de los huevos de los helmintos y las larvas, es algo muy necesario para una rápida identificación. Diferenciar entre amebas patógenas y no patógenas (concretamente entre Entamoeba histolytica y E. hartmanni) sólo puede realizarse con seguridad a través de la cuidadosa medición del tamaño. Igualmente, los huevos de Diphyllobothrium spp., Paragonimus westermani y Fasciola>Fasciolopsis pueden distinguirse según su tamaño (Smith, 1979).

Examen de sangre

500 000-1

35 millones 5,5 millones 900 millones

Adaplada de Marken EK. John DT Krotoski WA Marken and Voge's Medical Pa rasilology 8 ed Filadelha. WEt Saunders Company. 1999

Los parásitos que se pueden detectar en muestras de sangre son los agentes de la malaria (Plasmodium spp.). babesiosis (Babesia spp.), tripanosomiasis (Trypanosoma spp.) y leishmaniasis (Leishmania donovam) y filanasis (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi. Loa loa y Mansonella spp.). Las técnicas más importantes que debe realizar el laboratorio para el diagnóstico de los parásitos sanguíneos son la preparación, la tinción y el examen de las extensiones gruesa y fina de sangre. Otras técnicas menos frecuentes son aquellas de concentración reservadas para la detección de microfilarias (National Committee tor Clinical Laboratory Standards [NCCLSj, 2000).

Frotis sanguíneos gruesos y finos nos remitimos a un gran número de textos disponibles (Beaver. 1984; Cook. 1996: Garcia. 1997. 1999; Goldsmith. 1989: Kettle, 1995; Lañe. 1993; Markell. 1999: Strickland, 2000; Warren. 1990: entre otros) Una importante fuente de información la tenemos también en los atlas de parasitología para todo laboratorio que trabaja con parásitos, y que debe estar disponible para consulta (Ash, 1987. 1997; Brooke, 1984; Isenberg, 1992: Murray, 1999; Peters, 1989: Spencer, 1982; Sun, 1988). En otros textos se documentan aspectos específicamente patológicos de la inlección parasitaria (Binford, 1976; Connor, 1997; Gutiérrez, 2000; Orihel, 1995; Marcial Rojas, 1971; Sun, 1982; Von Lichtenberg, 1991; Woods, 1993). Las infecciones parasitarias en los mmunodeprimidos también han sido objeto de revisión (Walzer. 1989)

MÉTODOS DE LABORATORIO Se han descrito numerosos métodos para la detección e identificación de parásitos en las muestras clínicas, algunas de las cuales son útiles para detectar distintas especies, mientras que otras detectan una única especie en particular. Es preferible para el laboratorio ofrecer un número limitado, pero competente, de procedimientos a llevar a cabo, en vez de proporcionar una gran variedad de pruebas poco empleadas que puedan resultar problemáticas. Los análisis de sangre y heces comprenden la mayoría de los requerimientos clínicos para un estudio parasitológico. Otras muestras son de uso menos frecuente, como las urogenitales, el esputo, los aspirados y las biopsias. Como cada vez hay nueva información disponible de algunos de los llamados parásitos emergentes, los laboratorios pueden necesitar desarrollar y usar métodos adicionales altamente específicos o encontrar laboratorios de referencia competentes donde llevar a cabo las pruebas. Las muestras recogidas para la valoración del laboratorio dependen de la especie y del estudio del parásito sospechado. El conocimiento del ciclo de vida del parásito da información de la determinación del tipo, número y fre-

Es necesario el examen de frotis sanguíneos teñidos para la identificación de la mayoría de los parásitos sanguíneos. Los frotis finos se preparan igual que los usados en el diagnóstico diferencial hematológico: la sangre se extiende sobre un portaobjetos en una fina capa evitando la superposición de los elementos celulares. Es importante la integridad de las membranas celulares para determinar la naturaleza mtracelular o exlracelular de la inlección. En el frotis grueso, la sangre se concentra en un área pequeña en la que muchas células yacen en el fondo. Durante la tinción, los eritrocitos pierden la hemoglobina, de modo que sólo son visibles los núcleos leucootarios. las plaquetas y los parásitos (si estuviesen). Se prefiere el uso del frotis grueso para el diagnóstico, ya que posee entre dieciséis y treinta veces más sangre por campo que el frotis fino, incrementándose asi la posibilidad de detectar parásitos reduciendo el tiempo necesario de examen. La cantidad de sangre estudiada en un frolis grueso en cinco minutos, usando un objetivo de aceite de inversión (100 x), requeriría al menos treinta minutos si se examinase la misma cantidad en un frotis fino. Mientras que la probabilidad de detección de una infección aumenta con el frotis grueso, la identificación de la especie se realiza mediante examen del frotis fino, ya que así la morfología es más definida, especialmente para la malaria Para el examen ordinario, se deberían preparar ambos tipos de frotis. Preparación de las extensiones, La sangre para examen puede obtenerse por punción en el dedo, en el lóbulo de la oreja o por punción venosa. La sangre de la punción del dedo debe dejarse salir libremente para evitar su dilución con los líquidos titulares y no debe ser contaminada con alcohol desinfectante, sino que primero se debe dejar que ésta se seque. Si se obtiene por punción venosa, se usará la primera gota de sangre (sin anticoagulante) para preparar el frotis a la cabecera del paciente. El uso de anticoagulantes está contraindicado en la sospecha de malaria porque pueden distorsionar la morfología de los parásitos e interferir en su tinción. En la práctica, no obstante, la sangre suele remitirse al laboratorio con anticoagulante, ya que puede ser el único modo de asegurar que se puedan preparar las extensiones. El anticoagulante más utilizado, en tales

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

casos, es el ácido etilendiaminoletraacético (EDTA). pero debe ser llevado al laboratorio en menos de una hora para evitar el deterioro de la morfología de los organismos. Los anticoagulantes no interfieren en la tinción de las microfilarias. Tanto el frotis fino como el grueso se deben preparar en un porta limpio y sin grasa. Los frotis gruesos se preparan poniendo unas cuantas gotas de sangre en una zona de 1,5 cm de diámetro y dejándolos secar a temperatura ambiente, casi siempre por la noche. Un frotis grueso debe ser lo suficientemente fino para que se pueda leer un periódico a su través; si fuese demasiado grueso, el frotis puede escurrirse por el portaobjetos. El exceso de calor podría fijar los eritrocitos y evitar su deshemoglobinización. Tinciones. La sangre empieza a perder su afinidad por las tinciones en unos tres dias y los Irolis gruesos más antiguos no pierden bien la hemoglobina. Los mejores resultados de la tinción se logran con el uso de la tinción de Giemsa. ya que la cromatina de las células y la del parásito se tiñe con viveza, mientras que la hemoglobina de los eritrocitos queda de color rojo pálido. Es la única tinción que permite ver el punteado entrocitario que se produce en la infección por algunos parásitos de la malaria. La tinción de Wright puede usarse para frotis finos, pero tiñe los parásitos peor que el Giemsa y tiñe los eritrocitos, dejando un fondo poco nítido. Debido a que la tinción de Wright lleva alcohol como fijador, los frotis gruesos se deben lisar con agua antes de ser teñidos. El proceso de tinción con Giemsa requiere mayor atención a la hora de preparar los activos y de realizar el protocolo de tinción, mientras que en el caso de la tinción de Wright suele estar todo automatizado. Generalmente, el colorante de Giemsa fresco se debe hacer cada día, usando una solución diluyeme con agua tamponada con fosfato. Para lograr una adecuada tinción, incluyendo la aparición del punteado de Shüflner, el agua tamponada se debe mantener con un pH entre 6,8 y 7.2. Se debe revisar cada lote de Giemsa para determinar el tiempo de tinción óptimo y su dilución, ya que hay algunas variaciones de lote a lote (NCCLS. 2000). Examen de las extensiones. Tanto los frotis gruesos como los linos se examinan en su totalidad bajo un objetivo de bajo aumento (10x) para detectar microfilarias, que no suelen estar en gran número. Particularmente se deben examinar los bordes del frotis fino, ya que las microfilarias se desplazan allí frecuentemente durante la preparación del frotis. El examen con aumento de 50x en aceite de inversión puede usarse para la búsqueda de protozoos en frotis sanguíneos, aunque es aún necesario el examen en objetivo de aceite de inversión 100x para detectar los parásitos más pequeños, como Plasmodium spp.. Babesia spp.. y Leishmania spp. Nuevamente, el examen de los bordes es importante, puesto que los eritrocitos son desplazados a una capa de células, permitiendo la evaluación de su morfología y la existencia de protozoos mtracelulares. Un experimentado microscopisla antes de dar un resultado negativo debe examinar como poco cien campos con aceite de inversión en frotis gruesos (dedicando cerca de cinco minutos) y doscientos campos en un frotis fino (dedicando al menos quince minutos) usando un objetivo de cíen aumentos (Ash, 1987).

Técnicas de concentración Se han descrito una variedad de técnicas especiales para la concenlración de parásitos sanguíneos, especialmente para leishmanias. tripanosomas y microfilarias. Los detalles se pueden encontrar en otros textos (Ash, 1987; Beaver. 1984; Garcia, 1997.1999: Isenberg. 1992; NCCLS, 2000). La preparación de extensiones tamponadas, que puede realizarse con los recursos existentes en la mayoria de los laboratorios, es útil para detección de Leishmania donovani, tripanosomas y microfilarias. Tras la centrifugación de una muestra de sangre con anticoagulante, la capa de células que queda entre el plasma y los eritrocitos es recogida y usada para preparar frotis sanguíneos para teñir o para hacer una preparación en fresco para detectar organismos móviles (Ash. 1987; Strickland. 2000). Para la detección de microfilarias, es útil la concentración de Knott o la filtración de membrana, especialmente cuando la densidad de microfilarias en sangre periférica es baja. En la técnica de Knott, la sangre anticoa-

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gulada se lisa con formalma al 2% y se centrifuga para concentrar las microfilarias en el sedimento, que puede ser posteriormente examinado como una preparación en fresco, o bien se tiñe con Giemsa o hemaloxilina. En el proceso de filtración de membrana la sangre es lisada y pasada a través de un filtro de membrana de 5 pm, que posteriormente es teñida con hematoxilina para detectar alguna microfilaria (Ash, 1987; NCCLS, 2000). El uso de naranja de acridina-fluorocromo en un formato de microhematócrito (OBC. método de detección de parásitos sanguíneos. Becton Dickinson, Franklin Lakes. NJ) permite la delección de parásitos sanguíneos y parece ser más sensible que los tradicionales frotis grueso y fino. Los laboratorios que detectan malaria infrecuentemente pueden tener dificultades para la interpretación de los resultados con este método, pero sin embargo se les anima a conservar la experiencia en la realización de las técnicas con los tradicionales frotis sanguíneos (NCCLS. 2000).

Examen de muestras fecales La identificación de parásitos intestinales se realiza a través del examen directo de la deposición usando heces acuosas, técnicas de concentración, tinciones permanentes y, menos frecuentemente, cultivos. Se han hecho populares los nuevos métodos de inmunoensayo mediante anticuerpos específicos para detectar antígenos de Giardia lamblia. Cryptosporidium parvum y Entamoeba histolytica. Los estadios de helmintos más frecuentemente vistos son los huevos y larvas, aunque ocasionalmente pueden verse gusanos enteros o porciones. La infección por protozoos intestinales se diagnostica por la detección de trofozoítos. quistes u ooquistes. Los métodos habituales para la identificación de huevos y parásitos (examen O/P) deberían incluir procedimientos que permitiesen detectar tanto protozoos como helmintos, dejando el uso de técnicas especiales sólo para solicitudes especificas. Como existen pocos laboratorios dedicados al examen parasitológico, deben estar capacitados para realizar un examen directo de heces frescas acuosas, técnicas de concentración y técnicas de tinción. Muchas infecciones por protozoos pueden no detectarse a menos que se realicen exámenes con tinción permanentes (García, 1979,1997; NCCLS. 1997; Price, 1994: Smith, 1996).

Recogida, manejo y conservación de muestras Una correcta detección e identificación de los parásitos de las muestras fecales requiere una adecuada recogida y manejo de las mismas. Las muestras antiguas, mal conservadas o contaminadas son de escaso valor. Las muestras no se pueden recoger en la semana que sigue a la ingestión de sustancias que dejen residuos cristalinos, como componentes antidiarreicos no absorbibles, antiácidos, bismuto, bario o agentes antimaláricos. Los laxantes oleosos, como el aceite mineral, también pueden interferir en el examen. El uso de antibióticos o los medios de contraste pueden disminuir el número de organismos en el tracto digestivo, especialmente protozoos, durante varias semanas (Ash. 1987). Las muestras se deben remitir al laboratorio mientras están frescas o con los conservantes apropiados. Todas las muestras frescas se deben examinar en la primera hora tras ser remitidas, y las muestras líquidas deben examinarse en menos de treinta minutos o ser puestas en conservantes para mantener el máximo rendimiento. Estas estrategias aseguran que los frágiles protozoos y trofozoítos no sean destruidos inadvertidamente. La muestra que no se procese inmediatamente se debe dejar en una habitación a temperatura ambiente o refrigerada y nunca colocada en una incubadora, ya que peligraría la integridad de los parásitos. Las muestras deben ser pasadas directamente a un cartón seco y limpio o que el paciente defeque sobre un papel encerado y se transfiera una parte a un recipiente. Las muestras liquidas pueden también ser recogidas en una cuña limpia. Los contenedores deben tener una tapa hermética y se deben colocaren una bolsa de plástico antes de llevar al laboratorio. La mezcla inadvertida de orina o de agua del inodoro con la muestra puede destruir los protozoos y trofozoitos, por lo que se debe evitar. También la contaminación con

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 55-3 Fijadores de muestras fecales y técnicas de examen Técnica de examen Fijadores Ninguno (heces Irescas) Formatina al 10% Fluido de Schaudinn Alcohol polivinilo (PVA)' PVA modificado' Mertiolato-yodo-formalina (MIF) Acetato sódico-lormalina (SAF)

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" Aunque las técnicas de concentración con PVA se ha descrito, no son totalmente usadas debido al problema de reconocimiento de algunos organismos. ' El sulfato de cobre o el sulfato de cinc sustituyen al cloruro de mercurio. Las extensiones preservadas con MIF se deben teñir con policromo IV. :

agua o tierra puede introducir accidentalmente organismos de vida libre que se pueden confundir con los parásitos. Hay equipos que contienen viales de conservación apropiados para el examen de extensiones teñidas que están disponibles en el mercado a bajo precio. Se debe poner inmediatamente una parte de la muestra fresca en estos viales y mezclarlos completamente. Estos equipos son especialmente útiles para aquellos pacientes a los que es imposible extraer una muestra fresca en el plazo requerido o para los que han de recoger varias muestras en días consecutivos. Con la técnica de los dos viales, una parte se fija en tres porciones de formalina tamponadas al 5%-10% y otra parte en otras tres porciones de alcohol polivinilo fijador (PVA). Otros sistemas de conservación disponibles son: mertiolato-yodo-formalina (MIF) y acetato sódico-formalina (SAF) (Tabla 55-3). El SAF tiene la ventaja de que puede usarse para tinciones permanentes, para el estudio en fresco y para procedimientos de concentración y además no contiene mercurio, que sí está presente en los fijadores de Schaudinn y PVA. Además de ser venenoso, el mercurio puede presentar problemas de eliminación en muchos estados. Sin embargo, la calidad de las tinciones permanentes con el SAF no es tan buena como con los fijadores de Schaudinn y del PVA. El PVA con base de sulfato de cinc y otros nuevos productos comerciales van ganando popularidad y su uso está indicado cuando los componentes con mercurio no se puedan utilizar (García. 1993, 1997: NCCLS, 1997). El examen de tres muestras recogidas en días alternos es el mínimo necesario para realizar una adecuada evaluación E/P (NCCLS, 1997: Smith. 1996). Este procedimiento asegura un intervalo óptimo de recogida de aquellos parásitos que poseen una eliminación cíclica, especialmente Giardia lamblia y Strongyloides stercoralis. El uso de purgantes puede dar una sensibilidad adicional para detección de parásitos como E. histolytica. El laboratorio debe ser avisado antes del comienzo de la purga para tener personal disponible para el proceso. Las muestras han de recogerse en contenedores diferentes y ser remitidas al laboratorio en pocos minutos. Se recomiendan purgantes como el sulfato sódico o el fosfato sódico tamponado.

Examen

macroscópico

Se debe examinar de un modo general la consistencia de las heces (formadas, blandas, acuosas, descompuestas) y si hay presencia de moco, sangre, larvas o gusanos adultos y proglótides. Los protozoos y trofozoítos se encuentran fácilmente en muestras acuosas o descompuestas, mientras que los quistes predominan en las muestras blandas o formadas. Los helmintos o sus huevos se pueden encontrar en cualquier tipo de heces. La mayoría de los parásitos se distribuyen de modo uniforme en

la muestra, aunque algunos huevos (especialmente esquistosomas) pueden pasar al torrente fecal en el colon descendente y el recto y distribuirse irregularmente, como puede ocurrirle a los huevos de Taenia spp. Los trofozoílos de los protozoos pueden ser más numerosos en la parte final de la deposición y deberían ser buscados específicamente en la mucosidad (Smith, 1996).

Examen

microscópico

Las muestras se deben examinar microscópicamente por examen directo de material fresco o conservado, por examen de los concentrados o con tinción permanente. Cada procedimiento tiene sus ventajas e inconvenientes. La humidificación de las heces frescas con suero salino permite la detección y observación de trofozoítos móviles de protozoos y larvas de helmintos, El estudio de heces conservadas puede permitir la detección de parásitos que no se concentren bien. Los procesos de concentración son de mayor rentabilidad para la detección de quistes de protozoos y huevos de helmintos, así como de larvas, pero no es satisfactorio para la detección de trofozoítos de protozoos. Las tinciones son útiles para la delección y el examen morfológico de los trofozoítos de los protozoos y los quistes. Las circunstancias para llevar a cabo cada procedimiento dependen del tipo de muestra (formada, blanda, descompuesta, acuosa). Generalmente, las muestras frescas blandas, descompuestas o acuosas deben tener los tres procedimientos de manejo (Smith, 1996). Las muestras acuosas se deben concentrar por centrifugación simple mejor que por flotación o concentración con formalina-etil acético. El estudio directo se puede omitir si la muestra llega con conservantes (NCCLS, 1997). Como mínimo, las muestras tomadas se deben estudiar por un proceso de concentración, aunque se ha demostrado un gran rendimiento cuando se emplea una tinción (García, 1979,1997). Estudio directo en fresco. El estudio directo es uno de los más fáciles de realizar entre los estudios parasitológicos, aunque la correcta interpretación requiere un examen cuidadoso y gran experiencia en el uso del microscopio. Es más útil cuando las muestras frescas se examinan para trofozoítos móviles o larvas de helmintos (especialmente residuos líquidos o aspirados duodenales). Una pequeña cantidad de muestras se mezcla con una gota de suero salino al 0,85% y se cubre con un cubreobjetos. La preparación ha de ser lo suficientemente densa para permitir leer un periódico a su través. El examen de la totalidad del portaobjetos se ha de hacer sistemáticamente con el objetivo de bajo aumento (10x), con el diafragma del microscopio cerrado para aumentar el contraste. Los objetos sospechosos y aquéllos retráctiles, como los quistes de los protozoos, se deben examinar con el objetivo de gran aumento (40x). La detección del movimiento de amebas de movimiento lento requiere un examen durante al menos 15 segundos. En ausencia de imágenes sospechosas, por lo menos se ha de examinar un tercio de la preparación con el objetivo de 40x. El uso del objetivo de aceite de inversión no se suele utilizar a menos que el cubreobjetos se haya sellado con esmalte de uñas o vaspar (una mezcla al 50:50 de jalea de petróleo y parafina). Se debe hacer una segunda preparación igual salvo que se añada una gota de yodo Lugol al 1:5, o una preparación equivalente, en vez del salino, El uso de yodo Lugol o yodo Gram produce la agrupación del material, por lo que se desaconsejan. El yodo es útil para incrementar la visibilidad de las estructuras nucleares en los quistes de protozoos y para la detección de inclusiones de glucógeno. Entre sus limitaciones se incluye una pérdida de la motilidad de los trofozoítos y de la refractilidad de los quistes, así como la dificultad para reconocer los cuerpos cromatoides. Técnicas de concentración. Las técnicas de concentración, que se pueden realizar con material fresco conservado (Tabla 55-3), son más sensibles que el estudio directo para detectar quistes de protozoos y huevos de helmintos y sus larvas, debido a que disminuye el material de desecho en las preparaciones y, en la mayoría de las ocasiones, se concentran los organismos. Aunque se han descrito gran variedad de métodos y modificaciones, algunos son útiles sólo para parásitos específicos (Ash,

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

1987: Barnes, 1984; García, 1997, 1999; Melvin. 1982: NCCLS, 1997) Para el uso sistemático, se debe seleccionar un método que permita la detección de quistes de protozoos y huevos de helmintos. Los métodos de concentración se basan en los principios de sedimentación y flotación. En la sedimentación, los parásitos más pesados emigran al fondo debido a la gravedad o por centrifugación. En la flotación, los quistes y huevos más ligeros suben a la superficie de una solución de alta densidad. Los dos procesos de concentración más usados en los EE.UU. son las técnicas de flotación centrífuga con sulfato de cinc (técnica de Faust) y la sedimentación con éter-formalina (técnica de Ritchie o modificaciones). En la práctica, el etil acético ha sustituido al éter en el último método debido al peligro de su uso y a unos resultados superpombles (Truant. 1981). La concentración con formalina-etil acético es una técnica de sedimentación básica que es eficiente en la recuperación de la mayoría de los quistes de protozoos, larvas y huevos de helmintos, incluyendo los huevos con opérculo, y tiene una moderada efectividad para los huevos de esquistosomas. Con esta técnica se consigue menos distorsión de los quistes que con la flotación con sulfato de cinc. Sin embargo, los huevos de Hymenolepis nana se pueden perder y la concentración de G. lamblia y de los quistes de lodamoeba bütschlii puede ser defectuosa. Para una correcta concentración de ooquistes de coccidios y esporas de microsporidios se debe prestar atención a la velocidad y tiempo recomendado de centrifugación (Isenberg, 1992; NCCLS. 1997). A pesar de estos problemas, la técnica es comúnmente empleada por su simplicidad y su disponibilidad en la mayoría de los laboratorios. Con la técnica de flotación de sulfato de cinc, la muestra fresca se procesa usando sulfato de cinc con una densidad específica de 1,18, y la muestra lormalinizada se procesa con una solución de una densidad de 1.20. Los elementos parasitarios se recuperan de la capa superficial de la solución Iras la centrifugación. Esto produce una preparación más limpia que la de formalina-etil acético, pero es inútil para la detección de larvas de nematodos, huevos inlértiles de Ascaris y huevos de la mayoría de los tremátodos y de las tenias. También puede haber problemas con las muestras que contienen gran cantidad de grasas. El uso de material formalinizado en vez de fresco ayuda a limpiar los muestras y previene la apertura de los que opérculos y la distorsión de los parásitos (Bartlett, 1978). Tinciones permanentes. El uso de preparaciones teñidas permite guardar permanentemente las muestras y su revisión por distintos médicos cuando aparezcan dificultades de identificación. De todos los métodos descritos para el estudio de las muestras fecales, únicamente la tinción permanente es la diseñada para el uso del objetivo de aceite de inversión (100x). La tinción es más útil para la detección de trofozoítos y quistes de protozoos, que pueden reconocerse cuando la preparación en fresco y los concentrados sean negativos. Aunque no suele ser úlil para la detección de huevos o larvas de helmintos, las tinciones son más sensibles para detectar inlección por protozoos y se recomienda su uso para todas las muestras remitidas para estudio de O/P (NCCLS, 1997). Se han descrito una gran variedad de técnicas de tinción y sus modificaciones con todas sus ventajas y desventajas. La tinción de tncromo de Wheatley y la tinción de hierro-hematoxilina son métodos que permiten detectar amebas y flagelados. Desafortunadamente, la detección de la mayoría de las infecciones humanas por coccidios y microsporidios requieren tinciones especiales. Pueden aparecer muchos problemas técnicos a la hora de realizar la tinción. La mayoría dependen del tiempo transcurrido tras la toma de la muestra, de la extensión y de la fijación, asi como de la calidad de los reactivos. Se deben realizar controles positivos de extensiones conocidas con cada batería de extensión. Esto es especialmente cierto para la realización de tinciones más especificas para coccidios y microsporidios. Otros tintes menos comúnmente usados, como la tinción policroma IV, usados con muestras preservadas con MIF y la tinción de negro clorazol E para muestras en fresco no se revisan aquí y los detalles se pueden encontrar en otros textos (García, 1997). Tinción de tricomo de Wheatley. En los EE.UU. la modificación de Wheatley del método de tricromo sigue teniendo gran aceptación por su sim-

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plicidad, fiabilidad y su bajo coste. Los detalles de su realización se pueden encontrar en muchos textos (Isenberg, 1992; Melvin, 1982: NCCLS, 1997; Price, 1994). Con tricromo se pueden teñir muestras que se han lijado con el fijador de Schaudinn o PVA o muestras conservadas con SAF o MIF, pero los resultados son menos satisfactorios. Tinción de hierro-hematoxilina. Esta técnica es mas difícil de llevar a cabo que el tricromo. pero tiene mejores resultados debido a que incrementa la definición del núcleo y las características del citoplasma (Price, 1994). Una tinción modificada del hierro-hematoxilina que puede ser útil es la que incorpora carbol-fucsina, permitiendo la tinción de organismos ácido resistentes, como Cryptosporidium. Cyclospora e Isospora (NCCLS. 1997; Palmer. 1991). Las muestras fijadas con SAF. Schaudinn y PVA pueden teñirse con hierro-hematoxilina (tinción preferida para el SAF). Tinciones ácido-resistentes modificadas. Los ooquistes de Cryptosporidium. Cyclospora e Isospora son difíciles de reconocer en extensiones teñidas con tricromo o hierro-hematoxilina. pero se pueden detectar con la técnica de tinción acido-resistente. como la modificada Kinyoun. la modificada de ácido-resistente dimetil-sulfóxido (DMSO) o la auramina-0 (Bronsdon, 1984; Current, 1991: Ma, 1983: NCCLS, 1997). Las tinciones ácido-resistentes son sensibles y eficientes para la detección de estos protozoos, pero pierden especificidad. Se debe prestar especial atención a los criterios morfológicos cuando se usan estas tinciones y es obligatorio el uso de controles positivos Para aquellos laboratorios en los que Cryptosporidium se aisla, rara vez se recomienda el uso de reactivos de alta especificidad y sensibilidad. Las muestras biliares, los esputos, las heces en fresco o fijadas con formalina o SAF se deben teñir con tinciones ácido-resistentes. Tinciones para microsporidios. Los microsporidios (específicamente Enterocytozoon bieneusi y Encephalitozoon intestmalis. junto con un gran número de otras especies) se han implicado como agentes comunes de procesos diarreicos, especialmente en inmunosuprimidos, aunque su detección ha sido problemática. Aunque la biopsia y la microscopía electrónica han sido una clave de sus diagnósticos, se han descrito procedimientos de tinción para ser llevados a cabo en el laboratorio. Una tinción del tricromo modificada con una concentración aumentada (diez veces) y 2F¡ cromotropo con un incremento en el tiempo de tinción ha ganado aceptación como estudio para la identificación de esporas de microsporidios (Weber, 1994). Las técnicas de tinción fluorescente mediante el uso de agentes blanqueantes ópticos como el Uvitek-2B y el calcoflúor blanco también son útiles para el screening rápido y sensible de heces y otras muestras (DeGirolami. 1995: Didier. 1995: Luna. 1995; van Gool. 1993). El pequeño tamaño (1,5 pm-3 pm) de estos organismos hace su detección difícil, y estos estudios no deberían realizarse sin una adecuada comparación con el control.

Técnicas adicionales para el examen de parásitos entéricos Técnica de papel de celofán para oxiuros. La hembra del oxiuro, Enterobius vermicularis. emigra desde el colon a la piel penanal, donde deposita sus típicos huevos fecundados. Los huevos, y a veces los gusanos adultos, se pueden detectar por el examen de un trozo de adhesivo de celofán o con los equipos comerciales de recolección de pegado en la piel perianal. Los huevos o los adultos no suelen encontrarse en las heces, por lo que se considera una muestra inapropiada para la detección de este parásito. Las muestras se deben tomar por la noche, cuando los gusanos son activos, o a primera hora de la mañana, antes de la ducha o de la deposición. Se deben examinar vanas muestras de diferentes días antes de descartar infección. Estudio de los huevos. La estimación de la carga de gusanos es a veces necesaria para evaluar la eficacia terapéutica o la tasa de reinfección por nematodos intestinales (Ascaris. Trichuris y uncinarias) y. ocasionalmente, esquistosomas. Los procedimientos incluyen el método de extensión

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

directa de Beaver. recuento de huevos con la dilución de Stoll, frolis grueso de Kato y diversas modificaciones (Ash. 1984; Beaver. 1984: García, 1997). Hay grandes variaciones en los resultados con estos estudios, y la significación clínica del nivel de recuento de huevos varia según la especie infectante, la edad de la persona y el estado nutricional (Beaver, 1984). Los métodos de incubación de huevos se usan para detectar la presencia de esquistosomiasis en infecciones leves y para determinar su viabilidad. Los huevos fecundados de esquistosomas contienen un miracidio que se incuba en varias horas tras ser colocados en agua sin cloro. En la práctica, la orina o las heces se mezclan con diez partes de agua y se colocan en un matraz de Erlenmeyer. La parte superior del vaso se tapa con papel de plata y se coloca bajo una lámpara de mesa. Los miracidia incubados son muy fototrópicos y se acumulan cerca de la luz. Los huevos, si los hay. pueden ser examinados por su viabilidad, mediante el estudio de los movimientos ciliares dentro de las células llama (excretoras). Cultivo de nematodos y técnicas de detección. Se usan muchas técnicas de cultivo (coprocullivos) para la detección e identificación de los distintos nematodos infectantes, entre los que se cuentan el cultivo con filtro de papel Harada-Mori, el cultivo en filtro de papel inclinado y el cultivo en carbón vegetal (Ash, 1984; Beaver 1984: Garcia, 1997). La diferenciación entre lombrices y tricostrongiles según la morfología de los huevos es difícil, mientras que la larva en fase infectiva es mas fácilmente identificable. Tales técnicas de cultivo pueden también ser útiles para la detección de larvas de Strongyloides. que pueden estar en escaso número, y para diferenciarlas de las lombrices uncinarias. Con todos los métodos de cultivo, las heces son incubadas en un ambiente húmedo que permite lograr la incubación de los huevos. En las técnicas de arada-Mori y del filtro de papel inclinado, las larvas emigran desde las heces a la fase acuosa, donde se pueden detectar con más facilidad. En el cultivo del carbón vegetal las larvas migran primero a una gasa húmeda que se coloca en agua, permitiendo su colonización. La técnica de Baermann es una técnica sensible y fiable para la delección de Strongyloides y otras larvas de nematodos a partir de muestras fecales. En esta técnica, las heces se colocan en varias capas de gasas en la parte superior de una pantalla de alambre que se suspende en un embudo. El extremo del embudo está cerrado con una abrazadera y se añade agua hasta el nivel de la gasa. Las larvas emigran activamente a través de

Tabla 55-4

O b j e t o s e n c o n t r a d o s e n las m u e s t r a s fecales q u e p u e d e simular parásitos entéricos

Tipo de artefacto

Semejanza

Neutrófilos Macrófagos Células del epitelio columnar Células del epitelio escamoso Levaduras

Quisles de Entamoeba histolytica Trofozoilos de Entamoeba histolytica Trofozoilos de amebas

Conidias do hongos Esporas de champiñón Células de plantas Hebras de plantas Polen Diátomos Granulos do fécula, gotas de grasa, burbujas de aire, moco Huevos de ácaros ingeridos Huevos ingeridos de nematodos de las plantas Larvas ingeridas de nematodos de las plantas

Trofozoílos de amebas Quistes de protozoos (especialmente Endolimax nana) Huevos de helmintos Huevos de helmintos Quistes de protozoos, huevos de helmintos Larvas nematodos Huevos de helmintos (Ascaris o huevos de tenia) Huevos de helmintos Quistes de protozoos

Huevos de helmintos Huevos de helmintos Larvas de nematodos

Adaptada de Isenberg HE (ed): Clinical Microbiology Procedures Handbcok. vols t y 2. Washington. DC. American Society for Microbkxógy, 1992

las gasas y se depositan en la base del embudo, donde se pueden recoger para su examen. La recuperación de larvas puede ser superior a la técnica de cultivo, ya que examina una gran cantidad de heces. En las infecciones latentes por Strongyloides. en las que hay pocas larvas, pueden requerirse varios exámenes a lo largo de una semana para demostrar la infección (Ash. 1987).

Objetos semejantes a parásitos entéricos Hay una gran variedad de objetos que pueden parecerse a diferentes parásitos y que se pueden ver en las heces y en otras muestras enviadas para examen. Es necesaria una cuidadosa diferenciación de estos objetos para evitar un innecesario o inadecuado tratamiento. Los leucocitos, los macrófagos y las células epiteliales, escamosas y columnares se pueden asemejar a las amebas; la levadura y los granulos de fécula pueden parecerse a quistes de protozoos; las conidias fúngicas y pólenes pueden confundirse con huevos helmintos: las fibras o la piel de las plantas pueden simular larvas de nematodos, y los trozos de vegetales parecerse a gusanos adultos o proglótides. (Tabla 55-4). Los ejemplos de artefactos y seudoparásitos se pueden revisar en otros textos (Ash, 1997; Garcia. 1997; Isenberg, 1992; NCCLS, 1997).

Examen de muestras urogenitales y otras muestras (esputos, aspirados y biopsias) Los productos vaginales y uretrales, secreciones prostáticas u orina se pueden remitir a laboratorio para la detección de Trichomonas vaginalis. El método más rápido y efectivo es la preparación de varias extensiones con una gota de muestra (se debe centrifugar la orina) diluida con una gota de suero salino y cubriendo con un cubreobjetos. Se examina con un objetivo de bajo aumento (10x) en condiciones de poca luz para ver los trofozoítos móviles, que poseen un movimiento espasmódico. Los exámenes con gran aumento pueden revelar el movimiento de los flagelos y las características ondulantes de las membranas. El uso de cultivo, anticuerpos fluorescentes, o técnicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) aumenta la sensibilidad si es necesario (Briselden, 1994). Se precisan cultivos de los organismos para demostrar las resistencias a los fármacos imidazólicos (Meri, 2000). En el esputo se pueden hallar un gran número de protozoos y helmintos, y la técnica a usar depende del organismo sospechado. Generalmente la técnica requerida para detectar un parásito en su sitio habitual se aplica al esputo. Cuando se sospechan amebas, se deben hacer tinciones permanentes. Son apropiadas las tinciones ácido-resistentes o anticuerpos específicos para Cryptosporidium. mientras que las tinciones tricromo o lluorocromo se deben emplear para detectar esporas de microsporidios. Las técnicas de identificación para Pneumocystis carinii se describen en otro apartado. Para el examen de aspirados se necesita el empleo de las tinciones adecuadas para el germen implicado. Además de los métodos utilizados para espulo, la tinción de Giemsa es habitualmente apropiada para el examen de protozoos, especialmente los hemoflagelados. Los biopsias se deben remitir para estudio histológico tras haberse hecho extensiones y tras ser preparadas para la tinción con Giemsa u otros tintes permanentes. El cultivo para leishmanias y tripanosomas también puede hacerse en tejidos y puede ser importante para demostrar estas infecciones. Las biopsias cutáneas mandadas para Onchocerca o Mansonella deben separarse en salino y ser examinadas a los 30 y 60 minutos para microfilarias. La biopsia muscular para las larvas de Trichmella spiralis se debe examinar mediante la colocación de las muestras frescas en dos portas de cristal o para estudio histológico habitual. Las biopsias de recto o vejiga se pueden examinar para buscar huevos de esquistosomas.

Técnicas de cultivo parasitario Se han descrito métodos de cultivo para una gran variedad de protozoos, pero pocos laboratorios químicos se toman el esfuerzo debido a su

CAPÍTULO 55

Tabla 55-5

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

P r u e b a s de anticuerpos, antigenos y A D N para el diagnóstico de e n f e r m e d a d e s parasitarias*

Enfermedad parasitaria Protozoos Amebiasis Babesiasis Enfermedad de Chagas Criptosporidosis Giardiasis Leishmaniasis Malaria Toxoplasmosis Trichomoniasis Helmintos Triquinisosis Toxocariasis Estrongiloidiasis Filariasis Cisticercosis Equinococosis Esquistosomiasis Paragonimiasis

Métodos serológicos

DD, EIA, IHA IFA

Método de detección de antigenos o A D N EIA

CF, EIA, IFA, IHA EIA. DFA. IFA EIA. DFA, IFA CF IFA IFA EIA. IFA, IHA

IC DFA. IP EIA, DFA. prueba de ADN

EIA. BF, IHA EIA EIA IHA EIA, IHA EIA, IHA. IB IHA. IEP. DD (arcS), IB EIA. IB EIA. IB

" Equipos disponibles en comercios o en laboratorios de referencia o de salud publica. BF lloculacion do benlonila. CF fijación de complemento. DA aglutinación directa; DD difusión doble: DFA: anticuerpos de fluorescencia directa; EIA: enziomoinmunoensayo; IB mmunoblotl, IC inmunocaplura: IHA hemaglutinacion indirecta; IFA: anticuerpos de fluorescencia indirecta, IP inmunoperoxidasa: IEP: inmunoeleclroloresis Adaptada de Wilson M, y Schantz P. Pieniazek, N Diagnosis ol parasitic infections: Inmunologic and molecular methods En Murray PR. Barron EJ. Pfaller y cois (eds ) Manual of Clinical Microbiology, 6 ' ed Washington, DC. ASM Press. MA. 1995. p 1.159.

escaso empleo y a la pobre familiaridad con dichos métodos. Cuando se hace una petición de cultivo suele ser para Trichomonas vaginalis. Leishmania spp., Trypanosoma cruzy, Enlamoeba histolytica. Acanlhamoeba spp o Naeglena lowlen. Además, ocasionalmente se pide a los laboratorios cultivos para Toxoplasma gondii. Una revisión de los métodos se puede encontrar en otros textos (Ash. 1987; Fritsche, 1989a: Garcia. 1997: Isenberg. 1992; Murray. 1999: NCCLS. 1997).

1203

mosis o la toxocariasis no se pueden diagnosticar fácilmente por criterios morfológicos, y los estudios invasivos no se recomiendan en primera medida. Las diarias, los esquistosomas y Strongyloses pueden permanecer subclinicas debido a infecciones leves o al estadio de la latencia clínica. En esas circunstancias, la evaluación serologica puede resultar útil, especialmente en individuos que han viajado a zonas endémicas sin residir en ellas. Ya que los test serológicos se piden rara vez, las muestras se remiten a laboratorios de referencia (centros para el control y prevención de enfermedades [CDC]). Algunos de los tesl más comúnmente usados pueden estar disponibles en centros locales, entre los que se incluyen toxoplasmosis, amebiasis y triquinosis. Los criterios de interpretación vienen establecidos por los fabricantes, y los reactivos pueden variar en los diterentes centros. Las peticiones individuales de estos test deben cuestionarse acerca de las características de realización, incluyendo sensibilidad y especificidad, y deben estar sobre aviso de que pueden producirse reacciones cruzadas. Además, las serologías de las enfermedades parasitarias no diferencian entre infección activa e infección pasada, punto impodante cuando se estudia a alguien que ha residido en áreas endémicas. Hay métodos de detección antígena disponibles para muchas enfermedades parasitarias que incluyen amebiasis, criptosporidiosis, giardiasis, malaria, y tricomoniasis (Tabla 55-5) y pueden ser útiles en aquellos casos en que los test tradicionales son negativos y persiste una alta sospecha clínica Estos estudios tienen la ventaja de detectar la infección actual y pueden ser realizados por personas sin demasiada experiencia (Wilson, 1995).

Métodos de diagnóstico molecular El uso de métodos diagnósticos mediante la amplificación de ADN y ácidos nucleicos se ha descrito para la mayoría de las enfermedades parasitarias más frecuentes y tiene una gran sensibilidad y especificidad (Persing, 1993; Weiss, 1995; Wilson, 1995). Sin embargo, la mayoria de estas técnicas han permanecido para un uso de investigación y no están disponibles para uso habitual (Bendall. 1993). Como dato, el equipo y otros materiales necesarios, incluido el personal entrenado en biología molecular, han permanecido fuera del alcance de la mayoría de los laboratorios de diagnóstico debido a limitaciones fiscales. Aunque hay gran variedad de equipos disponibles para el diagnóstico de bacterias y virus, sólo un equipo ha recibido la aprobación para un parásito como es Trychomonas vaginalis (Briselden. 1994). Los métodos moleculares pueden tener una gran importancia en la identificación de los vectores de los parásitos y contribuir a la prevención mediante programas de control contra dichos vectores (Weiss. 1995).

Métodos de inmunodiagnóstico Control de calidad, de mejora y seguridad Los métodos de inmunodiagnóstico para la detección de anticuerpos o antigenos en las enfermedades parasitarias son muchos, pero tienen gran variabilidad de sensibilidad y especificidad, así como de disponibilidad. El tema está más allá del propósito de este capítulo, pero se puede encontrar una revisión asequible (Wilson, 1995). Los test disponibles para uso sanitario, hospitalario o comercial se resumen en la Tabla 55-5. Históricamente, los procedimientos serológicos para enfermedades parasitarias eran desestimados por su baja sensibilidad y especificidad, debido principalmente a la compleja naturaleza antigénica de los parásitos y la posibilidad de reacciones cruzadas entre las especies descritas. La introducción de nuevos test, combinados con el uso de componentes altamente antigénicos. está dando mejores resultados con grandes valores predictivos. La mayoría de los nuevos test utilizan el enzimoinmunoensayo (EIA) o el inmunoblot (Western blot), aunque aún son populares la inmunofluorescencia indirecta (IFA), la hemaglutinación indirecta (IHA). la fijación de complemento (CF) y la lloculacion de bentonita (BF). El uso de test serológicos en el diagnóstico de enfermedades parasitarias es un suplemento a los métodos habituales de diagnóstico que intentan detectar el parásito de un modo directo en las heces, la sangre, los tejidos o los Huidos corporales. Ciertas infecciones como la toxoplas-

El programa de segundad para la sección de parasitología del laboratorio es semejante al de otras secciones del laboratorio, cubriendo todos los aspectos esenciales del trabajo, incluidos, entre otros, un manual del proceso completo que debe ser revisado anualmente, guias de mantenimiento de todas las muestras y de recogida de datos, así como de los resultados, programa completo de control de calidad con la apropiada supervisión técnica y revisión, y la participación en programas de competencia. Los laboratorios también necesitan centrarse en la satisfacción del cliente, mediante la participación en el equipo de trabajo con cuestionarios de opinión, en la identificación de problemas y en la generación de soluciones para la mejora de calidad. Para el rendimiento de la sección de parasitología, se deben monitorizar periódicamente muestras desconocidas, tanto internas como extemas, y se debe actualizar la competencia, especialmente en aquellos laboratorios con escaso volumen de muestras. Debe existir un material de referencia disponible para el uso del laboratorio que incluya muestras positivas, atlas impresos y atlas de preparaciones. Se deben considerar potencialmente infecciosas las muestras sin preservar. Toda la sangre y fluidos corporales se deben manejar de acuerdo

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SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

con las normas universales de precaución realizadas por la administración de salud y seguridad laboral (Federal Register, 1991). Además de los virus de transmisión sanguínea, los parásitos de la malaria y los hemoflagelados también pueden ser infecciosos. Una gran cantidad de parásitos pueden seguir siendo infectivos en muestras de heces frescas, como los quistes de protozoos entéricos, los huevos de Taenia sotium. Enterobius vermicularís H. nana, y las larvas de Strongyloides stercoralis. Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides y las uncinadas pueden persistir infectivas en muestras antiguas, y los huevos de Ascaris pueden sobrevivir en formalina al 5%. Las muestras fecales también pueden contener patógenos como Salmoneiia, Shigella o virus, Es esencial una observación cuidadosa del manejo de las muestras. También es necesaria una especial atención al lavado de las manos. En uso de etil acético en vez de éter en las técnicas de concentración es recomendable para evitar la posibilidad de explosión (Truant, 1981).

PROTOZOOS SANGUÍNEOS Y TISULARES Malaria La malaria (del italiano malaria, que significa mal aire) es una infección aguda y a veces crónica del torrente sanguíneo que se caracteriza por fiebre, anemia y esplenomegalia, y es provocada por parásitos apicomplejos del género Piasmodium. Los hallazgos clínicos defimloríos de un ataque de malaria consisten en escalofríos, fiebre (mayor de 40 C), diaforesis generalizada, seguidos por el cese de la fiebre. Las crisis se producen cada 610 horas y se desatan por la ruptura sincrónica de eritrocitos, de los que se libera una nueva forma infecciosa conocida como merozoito. La enfermedad se produce generalmente entre los 45" norte y 40° sur de latitud (WHO, 1987) y se transmite únicamente por mosquitos Anopheles hembra. Las cuatro especies de Piasmodium que producen la malaria humana son P. vivax. P. lalciparum. P. malariae y P. ovale. La infección por P. falciparum se da principalmente en zonas tropicales de todo el mundo, mientras que las infecciones por P. vivax se producen tanto en zonas tropicales como templadas. P. malariae también se da en todo el mundo, pero mucho menos extendido que P. lalciparum o P. vivax. P. ovale es el menos frecuente de la malaria, siendo la mayoría de los casos en el oeste de África, India y Sudamérica. 1

Dado que la infección de la malaria es potencialmente tratable, se debe considerar en el diagnóstico diferencial de la fiebre de origen desconocido y en historia de viajes a zonas endémicas. En una era de creciente empleo de los viajes por todo el mundo, el riesgo de contraer malaria no es insignificante, y la rápida extensión de las resistencias a los fármacos se debe considerar a la hora de valorar una profilaxis o un tratamiento. La evaluación del laboratorio ante la sospecha de la malaria sigue basándose en el examen de los frotis grueso y fino de la sangre, para objetivar los parásitos intraeritrocitarios. Aunque su aproximación diagnóstica es sencilla, la realización de estas técnicas puede ser problemática. La identificación de este organismo requiere un entrenamiento continuo para mantener la experiencia, por lo que los laboratorios que no suelen ver muchos casos pueden optar por mandar las muestras a laboratorios de referencia. Otros métodos más avanzados de laboratorio, incluidas la tinción naranjaacridína (véase Métodos de laboratorio) o la detección del ADN específico (Lanar, 1989; Persing. 1993; Weiss, 1995), dan una mayor sensibilidad y especificidad pero no suelen estar disponibles en laboratorios pequeños. El reciente desarrollo de los ensayos inmunológicos para la detección de lactato deshidrogenasa específica de Piasmodium parece dar una alta sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de la malaria. Uno de estos test, realizado con una tira de reactivo, es especialmente prometedor en aquellas situaciones donde la facilidad de la realización de los estudios es crítica y hay escasez de medios (Piper, 1999; Palmer. 1998). Ciclo vital. Los parásitos de la malaria tienen una fase sexual (esporogonia) en el mosquito Anopheles. que produce esporozoítos infecciosos, y un estado asexual (esquízogonia) en los humanos que deriva en esqui-

zontes y merozoítos (Fig. 55-1). En el torrente sanguíneo algunos merozoítos se diferencian en gametocitos (gametogonias), que. cuando son digeridos por un mosquito hembra de Anopheles, maduran a microgametos masculinos y macrogametos femeninos. La lusión de un microgameto y un macrogameto da lugar a un oocineto móvil que emigra a través de la pared de estómago y forma un ooquiste. Dentro del ooquiste se forman numerosos esporozoítos móviles. La ruptura del ooquiste maduro en la cavidad corporal libera esporozoítos que emigran a través de los tejidos de las glándulas salivares, desde donde pasan a huéspedes vertebrados cuando el mosquito se alimenta. El tiempo requerido para el desarrollo en el mosquito es de 8-21 días. Los esporozoítos en los vertebrados alcanzan las células hepáticas en pocos minutos e inician una fase de proliferación conocida como esquízogonia exoeritrocitaria. La liberación de merozoítos tras la ruptura de los esquizontes hepáticos o la ruptura de esquizogonias eritrocitarías produce la infección del torrente circulatorio, causando la clínica de la malaria. P. vivax y P. oválese diferencian de P. lalciparum y de P. malariae en que las recaídas por especies antiguas pueden producirse semanas o meses después tras el primer brote. Esto es consecuencia de la renovación de las esquizogonias exoeritrocilarias, y a veces eritrocitarías. a partir de esporozoítos hepáticos latentes que se conocen como hipnozoitos (Krotoski, 1982). Las recurrencias debidas a P. lalciparum o P. malariae, llamadas recrudescencias, se deben a un incremento en el número de formas sanguíneas hasta niveles clínicamente detectable, no a formas hepáticas persistentes. Los hepatocitos se infectan sólo por esporozoítos a través del mosquito, de este modo la infección por P. vivax o P. ovale adquiridas por transfusión no recidivan. Los merozoítos liberados de los hepatocitos afectados infectan a los eritrocitos. La consiguiente amplificación del parásito en el torrente sanguíneo durante un tiempo y su aparición sincrónica desata las crisis de malaria. Los parásitos de P. vivax y P. ovale infectan a los eritrocitos jóvenes, mientras que P. malariae infecta a los viejos y P. falciparum a los eritrocitos de cualquier edad. Los estadios morfológicos observados en los eritrocitos incluyen trofozoitos (formas en crecimiento), esquizontes (formas en división) y gametocitos (formas sexuales) (Láminas 55-1 a 55-4). Los trofozoítos más jóvenes tienen un contorno globuloso o con una vacuola central, una masa de cromatina roja y un citoplasma azul. En frotis teñidos, los trofozoítos se asemejan a anillos de sello y se describen como anillos o con forma anular. Los trofozoítos en crecimiento tras la fase de anillo mantienen una única masa de cromatina, pero tienen un citoplasma abundante que puede ser compacto o ameboide (irregular). Los trofozoítos maduros aún poseen una única masa de cromatina y un grandísimo citoplasma que rellena parcialmente el eritrocito. El pigmento hemozoína (hematina), un derivado de la hemoglobina, es característico de todos los eritrocitos que contienen formas maduras de la malaria, pero no se detecta en las formas anulares. Los esquizontes inmaduros tienen dos o más masas de cromatina y un citoplasma sin dividir, mientras que los maduros poseen tanto el citoplasma como la cromatina divididos, de tal modo que los merozoítos son evidentes. Los esquizontes maduros rompen el eritrocito, liberando merozoítos e iniciando un nuevo ciclo de infección. El ciclo eritrocitario se realiza en 48 horas aproximadamente (periodicidad terciana) para P. falciparum. P. ovale y P. vivax, y en 72 horas (periodicidad cuartana) para P. malariae. En algunos momentos de la infección una subpoblación de merozoítos se transforma en gametocitos. Los de P. vivax, P. malariae y P. ovale son redondeados, mientras que los de P. falciparum son alargados (forma de salchichas). Característicamente, los macrogametocitos (femeninos) poseen una masa compacta de cromatina, mientras que los microgametocitos (masculinos) la tienen más dispersa. Los gametocitos en desarrollo son más compactos que los trofozoítos en crecimiento. Epidemiología. La transmisión endémica de la malaria requiere un reservorio, un mosquito vector y un huésped susceptible. El control de la malaria se dirige a la eliminación del mosquito, al tratamiento de los casos activos y a la profilaxis de personas susceptibles. Sin embargo, la aparición de resistencias a los insecticidas por parte de los mosquitos y de la resistencia al tratamiento y profilaxis por parte de P. falciparum. y recientemente por P. vivax (Murphy, 1993), y la falta de recursos hacen difícil el control en muchas zonas.

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

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Figura 55-1. Ciclo de vida del parásito de la malaria (Cortesía del CDC. Parasitology Training Branch. Atlanta. GA.)

Los negros con anemia falcilorme son menos susceptibles a la malaria por P. falciparvm. y las personas que carecen del grupo sanguíneo Duffy están protegidas contra la infección por P. vivax (Miller. 1976). El déficit de glucosae-fosfato deshidrogenasa (G6PD) se ha asociado a una protección contra la malaria, pero la evidencia está menos demostrada que con las otras anomalías hereditarias. La malaria secundaria a transfusión puede producirse cuando el donante padece una malaria subclínica. y puede resultar mortal para el receptor. Del mismo modo, puede darse una malaria congénita en niños nacidos de madres de zonas endémicas. Los niños la adquieren durante el nacimiento a causa de la rotura de los vasos placenlarios en una transfusión malerno-fetal. Ni en

la malaria congénita ni en la secundaria a transfusión se esperaba que existieran recaídas, ya que no se forman esquizogonias exoeritrocitarias El número de casos de malaria en EE.UU. aumentó de 151 en 1970 a 1.838 en 1980, pero descendió a 1.411 en 1993 (CDC. 1988,1993). Las especies causantes de la infección en 1987 fueron P. vivax (44%), P. falctparum (43%), P. malariae (4%). P. ovale (3%) y un 6% indeterminado. El intervalo entre la llegada a EE.UU. y el desarrollo de la enfermedad fue menos de un mes para el 25% de los casos de P vivax y del 80% de los casos por P. lalciparum. Sólo un 3% de los pacientes desarrollaban la enfermedad tras un año. Los ciudadanos de EE.UU. adquirieron la infección en África (63%), Asia (18%). hemisferio occidental (14%) и Oceanía (4%).

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Enfermedad clínica. La mayoría de los pacientes con infección por P. lalciparum desarrolló los síntomas en menos de un mes tras la exposición, mientras que esto podía ser mayor de seis meses con otras especies de Plasmodium. Los síntomas comunes de malaria incluyen escalofríos y fiebre, que suele asociarse a esplenomegalia. En los estadios precoces, los episodios febriles son irregulares, pero luego se van haciendo más sincrónicos, tomando la periodicidad terciana (P. vivax. P. falciparum y P. ovale) o cuartana (P. malaria). Los pacientes pueden tener anemia y otras manifestaciones como diarrea, dolor abdominal, cefalea y mialgias. La malaria por P. falciparum puede producir mucha parasitemia (50%). llegando a producir hemolisis grave, hemoglobinuria y gran anemia. Los eritrocitos infectados por trofozoítos en crecimiento y esquizontes de P. falciparum tienden a ser secuestrados en capilares, pudiendo llegar a ocluirlos, causando clínica asociada y anoxia tisular. La afectación cerebral se conoce como malaria cerebral, produciendo desorientación, delirio, coma y. frecuentemente, la muerte. En las infecciones graves por P. falciparum las transfusiones pueden salvar la vida (Nielson. 1979; Organización Mundial de la Salud [OMS], 1987). La evolución de la malaria sin tratamiento depende de la especie causal. La mayoria de los casos fatales se deben a P. falciparum. En los restantes casos, las crisis febriles pueden ir siendo progresivamente menos graves y desaparecer gradualmente. Los pacientes con infección por P. vivax o P. ovale pueden sufrir recaída tras meses o incluso tras años. Los pacientes con infección por P falciparum y P. malariae pueden tener períodos asintomáticos y sufrir recaída debido a la presencia de parasitemia de bajo grado. Las recaídas y reagudizaciones se pueden asociar con cambios en la inmunidad del huésped o con cambios antígénicos en los parásitos. Las extensiones periféricas pueden mostrar leucocitos con pigmento malárico. Un aumento del número de reticulocitos se debe al rápido recambio eritrocitario. Se puede detectar la presencia de grandes plaquetas alargadas en la sangre periférica debido a un rápido recambio, secundario a un secuestro esplénico, La infección por malaria puede interferir con otros test serológicos, produciendo falsos positivos, especialmente con los de la sífilis. El tratamiento y profilaxis de la malaria puede ser difícil debido a aparición de resistencias a la cloroquina por P lalciparum. así como otros antipalúdicos, y a la menos extendida resistencia a la cloroquina por P. vivax. También, personas que han adquirido P. vivax o P. ovale, o que han pasado mucho tiempo en zonas muy endémicas para estos parásitos, requieren tratamiento con primaquína para erradicar los hipnozoítos y prevenir así las recaídas. El uso de primaquína puede ser peligroso en los déficit de G6PD y se debe realizar un screening previo antes de empezar el tratamiento. Diagnóstico. Se debe incluir a la malaria en el diagnóstico diferencial de fiebre en pacientes que han viajado o residen en zonas endémicas, drogadictos o gente que ha recibido transfusiones. El diagnóstico suele hacerse por la detección de parásitos en frotis de sangre finos y gruesos. Las muestras de sangre se deben tomar preferiblemente justo antes del pico febril o tras el pico febril. A veces es necesaria la toma de muestras separadas varias horas para detectar la infección e incluso la especie, ya que el número y fase de los parásitos varían según el ciclo. Un cuidadoso examen de los frotis gruesos revelaría la presencia de parásitos en casi todos los pacientes con clínica de malaria. La identificación de parásitos de la malaria en los frotis finos requiere un abordaje sistemático. Hay tres factores principales a tener en cuenta: la aparición de eritrocitos infectados, la aparición de parásitos y los estadios hallados. En la Tabla 55-6 se resumen las características diagnósticas de las especies que se ilustran en las Láminas 55-1 a 55-4. Los eritrocitos infectados por P vivax o P ovale suelen estar aumentados de tamaño en comparación con los que les rodean, mientras que los parásitos P. malariae y P. falciparum suelen encontrarse en eritrocitos de un tamaño normal. Más del 20% de los eritrocitos con P. ovale pueden ser ovales o con fimbrias (proyecciones irregulares en los márgenes de la célula), mientras que menos del 6% de los eritrocitos infectados por P vivax son ovales. Pueden verse numerosos granulos rosas uniformes dentro del eritrocito (granulos

de Schüffner) en las células infectados con P vivax y P. ovale, aunque pueden no ser evidentes en las células infectadas con formas tempranas o en extensiones que no se han teñido al pH apropiado (véase previamente en Métodos de laboratorio). La presencia de granulos de Schüffner es útil, ya que no se ven en P malariae y P falciparum. Mientras los trofozoítos crecen en las células infectadas, la cantidad de hemoglobina en el eritrocito disminuye y se acumula pigmento de hemozoína. La cantidad y aspecto del pigmento varían según la especie. Las formas anulares de todos los parásitos pueden ser similares si solo se encuentran formas anulares, impidiendo diferenciar las especies. Los anillos jóvenes de P. falciparum son más pequeños que los de las otras especies (un sexto del diámetro de la célula roja, en comparación con un tercio del diámetro de la célula roja de las otras especies). Los anillos de P. falciparum que han crecido son similares en tamaño a los de oirás especies. Los trofozoítos que yacen en la superficie del eritrocito o que protruyen se denominan formas apliqué o accolé. y se ven más frecuentemente en infecciones por P. falciparum. La presencia de células doblemente infectadas y doble punteado de cromatina en los trofozoítos en anillo es más frecuente en P falciparum. pero puede producirse en las demás especies. Los trofozoítos en crecimiento de P vivax tienen una forma irregular y se denominan ameboideas. Los de P. malariae y P. ovale permanecen compactos. Los trofozoítos y esquizontes maduros de P. falciparum suelen ser secuestrados en el lecho capilar por adherencia a las células endoteliales. por lo que no se ven en sangre periférica excepto en infecciones graves. Cuando se detectan esquizontes en la sangre periférica, la determinación del número de merozoítos puede ser útil para dilerenciar las especies. Los gametocitos de P. falciparum son fácilmente identificables por su forma característica en salchicha. Los gametocitos de P. vivax, P. malariae y P. ovale son similares y difíciles diferenciar, aunque las características de la célula roja infectada pueden ayudar. La variedad de los estadios en la sangre penférica puede ser útil. En la detección de infecciones por P. falciparum predominan las formas en anillo, y el hallazgo de numerosas formas en anillo sin otras formas maduras es una evidencia de infección por P falciparum. En las infecciones por P. vivax. P. malariae y P ovale se encuentran diferentes estadios de parásitos con algún predominio, dependiendo de la fase del ciclo. Para la detección de la malaria se prefieren frotis gruesos, ya que se examina mayor cantidad de sangre (véase previamente en Métodos laboratorio). Las formas en anillo suelen tener la apariencia de signos de puntuación más que de anillos completos, y debe buscarse la presencia de cromatina roja y citoplasma azul para identificarlos como parásitos. Los granulos de Schüffner pueden ser útiles para la identificación y se deben reconocer alrededor de los trofozoítos en crecimiento como un halo rosa. El carácter ameboide de los trofozoítos de P vivax no es tan evidente en los frotis gruesos, pero es útil el número de merozoítos en los esquizontes maduros. Los macro y microgametocitos pueden no ser diferenciabas. La forma distintiva en salchicha de los gametocitos de P falciparum es aún evidente, sin embargo puede ser más estirado que en los frotis finos. Los gametocitos de otras especies se pueden detectar y diferenciar fácilmente de los núcleos celulares por la presencia de pigmento de hemozoina de refracción. Pueden producrise infección mixta (en aproximadamente el 5% de las veces), pero se debe ser prudente a la hora de hacer el diagnóstico, a menos que exista evidencia de dos poblaciones claramente separadas de parásitos. La mezcla más común es la infección por P falciparum y P. vivax. El hallazgo de gametocitos de P falciparum en una persona claramente infectada con P. vivax es diagnóstico. Hay múltiples artefactos que pueden simular parásitos en el frotis. Los más frecuentes en los frotis finos son las plaquetas superpuestas a los glóbulos rojos. Estas plaquetas se pueden identificar fácilmente porque no tienen una auténtica forman anillo y no muestran diferencia de la cromatina y de citoplasma y, además, no contienen pigmento. Se pueden confundir grupos de bacterias o plaquetas con esquizontes. A veces, masas de plaquetas pueden asemejarse a gametocitos de P. lalciparum, pero no muestran el colorante diferencial o el pigmento. También se pueden confundir con parásitos los grumos de colorante, las bacterias contaminantes o las esporas.

Tabla 55-6 Comparación de las especies de Plasmodium que afectan a los humanos Apariencia del eritrocito Especies Plasmodium vivax

Plasmodium malariae

Plasmodium ovale

Plasmodium falciparum

Tamaño

Aumentado. La talla máxima alcanzada por los trofozoítos y esquizontes puede ser 1-2 veces el diámetro normal Normal

Granulos del eritrocito En todos los estadios excepto en las formas precoces de anillo (Rara vez se ven los puntos de Ziemann)

Aumentado. Tamaño máximo + V*-V veces el diámetro En todos los estadios excepto del eritrocito. en las formas de anillo Aproximadamente el 20% o más tempranas de los eritrocitos infectados son ovalados y/o fimbriados el borde tiene proyecciones irregulares Normal. Los eritrocitos infectados son normales (Ocasionalmente se ven puntos de Maurer)

Apariencia del parásito Citoplasma

Pigmento

Número de merozoitos

Estadios hallados en sangre periférica

Irregular, ameboide en los trofozoítos. Tiene apariencia "extendida"

Marrón dorado, poco llamativo

12-24, la media es 16

Todos los estadios La mayoría de los estadios pueden verse en el mismo frotís

Redondo, trofozoítos compactos con citoplasma denso. Trofozoítos con forma de banda ocasionalmente

Marrón oscuro, basto, llamativo

6-12, promedio Todos los estadios. La gran de 8: a veces variedad de los estadios se ven esquizontes no suele verse. Relativamente pocos anillos en "roseta o gametocitos presentes

n > c

Redondo, trofozoítos compactos Marrón oscuro. A veces levemente ameboide. llamativo Los trofozoítos en crecimiento tienen grandes masas de cromatina

Los anillos jóvenes son pequeños, delicados y frecuentemente con doble punteado de cromatina Los gametocitos están alargados

6-14, promedio de 8

Negro. 6-32. Basto y llamativo promedio 20-24 en los gametocitos

r-

o en C7!

>

Todos los estadios 9 O

Anillos y/o gametocitos. Otros estadios se desarrollan en los vasos sanguíneos u órganos internos, pero no en la sangre periférica, excepto en infecciones graves

>

De Smith JW Melvm DM. Onhel TC. y cols.: Diagnostic Parasitology-Blood and Tissue Parasites Chicago. American Society of Clinical Pathologists. 1976. con autorizaciOn

K5 O

-4

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Los test serologicos para malaria son específicamente útiles para estudios epidemiológicos y para la detección de donantes de sangre infectados. No obstante, estos test no están capacitados para diferenciar entre infección actual o pasada. Hay test sensibles y específicos disponibles en el CDC de IFA que utilizan antígenos para las cuatro especies humanas (Wilson. 1995).

Babesiosis Como el parásito de la malaria, los agenles de la babesiosis o piroplasmosis son protozoos apicomplejos extendidos por todo el mundo que infectan eritrocitos, produciendo enfermedades febriles de gravedad variable. A diferencia de la malaria, se transmite por garrapatas y hay una gran variedad de animales que actúan como reservorio. La infección en EE.UU. se produce principalmente en estados del noreste y del medio oeste, donde el parásito de los roedores Babesia microli es el responsable de la infección (Herwaldt. 1995). /. capulahs es la garrapata vector. Estudios recientes han implicado a otra especie de Babesia, aun sin nombre (por el momento conocida como WA1), como causante de la enfermedad en el oeste de EE.UU. Se cree que este parásito, asociado con la enfermedad en Washington y California, se transmite por la garrapata de patas negras. Ixodes paciticus (Persing, 1995: Quick. 1993). En Europa, es el parásito canino Babesia divergens. transmitida por Ixodes ricinus. el que infecta a los humanos. El espectro clínico varía desde enfermedad latente y subclínica a hemolisis fulminante. Se han descrito fatalidades, especialmente en espleneclomizados o inmunosuprimidos. Las personas mmunocompetentes pueden tener sintomas similares a la malaria, como fiebre, escalofríos, malestar general y anemia, aunque sin la característica periodicidad. La investigación de un brote por Babesia microli en la isla de Nantucket, en Nueva Inglaterra, mostró que algunos pacientes sinlomálicos portaron el parásito durante meses,

y otros mostraron evidencia serológica de infección sm historia de enfermedad clínica (Ruebush, 1980). Otra evidencia es que la infección crónica subclínica puede ser infrecuente (Persing, 1995). El parásito se multiplica en los eritrocitos como esquizogonias, pero no produce gametocitos. Aunque los trofozoitos de muchas especies tienen forma de pera, en algún momento de su desarrollo los de S. microli suelen parecerse a delicadas formas anulares que pueden confundirse con las de la malaria, especialmente P. falciparum (Lámina 55-5A) (Healy, 1980). Los trofozoitos de Babesia se pueden diferenciar de los de la malaria por la presencia de múltiples anillos en una célula que pueden formar una tetrada (cruz de Malta) y por la ausencia de trofozoitos grandes en crecimiento y de los gametocitos. También, las células de los infectados por Babesia carecen de pigmento de hemozoina, que está presente en las células infectadas por Plasmodium. La historia de residencia o viaje en zonas endémicas, o picadura reciente por garrapatas, puede sugerir infección por Babesia. Hay disponibles test serológicos (IFA) para Babesia microtiy WA1 en el CDC con referencia a los departamentos de salud estatal. Los test serológicos de malaria son negativos en la babesiosis. aunque pacientes con malaria pueden tener actividad cruzada con las serologías de Babesia (Wilson. 1995).

Hemoflagelados Los hemoflagelados de humanos y animales son miembros del orden de los Kinetoplastida y se caracterizan por la presencia de un gran mitocondrión conocido como cinetoplasto, que contiene suficiente ADN para ser visto por microscopio de luz cuando se tiñen con Giemsa. Los dos géneros importantes en la patología humana son Trypanosoma y Leishmania. Ambos se transmiten por artrópodos y tienen huéspedes animales como reservónos.

Figura 55-2. Morfología de los hemoflagelados.

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

Los cínetoplástídos tienen diferente morfología dependiendo de su presencia en huéspedes vertebrados, incluidos los humanos, o en sus vectores (Fig. 55-2). El estadio amastigote es esférico, de 2 urn a 5 pm de diámetro, y posee un núcleo y cinetoplasto. Por definición le falta un flagelo externo, aunque a nivel ultraestructural es aparente un axonema (parte inlracelular del flagelo) Los amastigotes se pueden encontrar en huéspedes humanos o animales infectados con T. cruzío Leishmania spp.. donde se multiplican únicamente dentro de las células. El promastigote es un organismo alargado y delgado con un núcleo central, un cinetoplasto anterior y un axonema. y un flagelo libre que va desde el extremo anterior. Esta fase se da en el insecto vector de Leishmania y es la que se detecta en los cultivos. El epimastigote es similar al promastigote. pero el cinetoplasto está más cerca del núcleo y posee una pequeña membrana ondulada que acaba en un flagelo libre. Todas las especies de Trypanosoma que infectan a humanos toman la forma de epimastigote en el vector o en el cultivo. En el tripomasligote, el cinetoplasto está en el extremo posterior y el flagelo forma una membrana ondulada que se extiende a lo largo de la célula, acabando como un flagelo libre en el extremo anterior. La forma de tripomastigote se da preferentemente en el torrente sanguíneo en el huésped de mamíferos infectados con Trypanosoma spp. Las fases infecciosas encontradas en los vectores formados a partir de epimascigotos se conocen como tnpomastigotes metacíclicos

Trypanosoma Las infecciones por Trypanosoma incluyen las causadas por T. brucei (tripanosomiasis africana o del Viejo Mundo) y T. cruzi (tripanosomiasis americana o del nuevo mundo o enfermedad de Chagas). Ambas son de gran importancia en zonas endémicas, pero rara vez pueden verse en EE.UU. Una tercera especie. T. rangeti, se ha descrito en humanos en América, pero no produce de enfermedad clínica. El tripomastigote del torrente sanguíneo del grupo T. brucei (Lámina 55-5B) es mayor de 30 um de longitud, con unas curvas graciosas y un pequeño cinetoplasto. Los del T. cruzi son más pequeños (20 um), tomando formas de S y C en los frotis teñidos, y poseen un cinetoplasto más largo. En África ecuatorial, los parásitos del grupo T. brucei infectan tanto a humanos como a animales y se transmiten por la picadura de la mosca tsetse, del género Glossina. La proliferación de los organismos en el punto de punción produce un chancro transitorio. En el este de África, la tripanosomiasis es causada por I brucei rhodesiense, que tiene un gran número de huéspedes animales como reservónos. La enfermedad se caracteriza por un cuadro febril agudo rápidamente progresivo y adenopatias. La muerte del paciente se da tras la afectación del sistema nervioso central. La infección en África occidental es debida a T. brucei gambiense, que es el causante de la clásica enfermedad del sueño africana. La enfermedad posee un curso crónico que empieza con fiebre intermitente, sudoración nocturna y malestar. Pueden ser llamativas las adenopatias, especialmente las cervicales (signo de Winterbottom). Con el tiempo, acaba afectando al sistema nervioso central: somnolencia, confusion, fatiga y estupor progresivo, coma e incluso muerte. Los humanos son el principal reservono ante esta enfermedad (OMS. 1986). El diagnóstico se debe sospechar con la historia geográfica y los hallazgos clínicos. Se observa un aumento en la IgM total en sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR). Existe pleocitosis con 50-500 células mononucleadas/microlitro en el liquido cefalorraquídeo. El diagnóstico se confirma por la demostración de los parásitos en frotis sanguíneos, tanto gruesos como finos, extensiones, aspiraciones de adenopatias o de la médula ósea, o en el centrifugado de líquido cefalorraquídeo teñido con Giemsa (Cattand, 1988; Van Meirvenne, 1985). Los cultivos o la inoculación en animales también pueden ser útiles si estuviesen disponibles. La tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas está causada por T. cruzi. En su forma selvática, se da en EE.UU., Centroamérica y. sobre todo, en Sudamérica. La infección humana es común en zonas de México, Centroamérica y Sudamérica, donde se transmite por chinches de la familia de los Reduviidae. Los géneros y especies implicadas en la transmisión varian de un país a otro y según los diferentes nichos ecológicos. Algunas de las chinches son responsables de mantener el ciclos selvático en los reservónos animales, mientras que otras están acostumbradas a la

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vida doméstica, donde infectan a casas de pobre construcción, especialmente en zonas rurales. A la hora de alimentarse, las chinches defecan. Las heces contienen tripomastigotes infectivos que tras el rascado entran en el cuerpo por el punto de la picadura a través de la mucosa intacta de la boca o la conjuntiva. La forma infectiva entra activamente cerca de las células tisulares, donde se transforman en amastigotes en división. Cuando las células infectadas se llenan de amastigotes, se transforman en tripomastigotes, seguido de la rotura celular. Los tnpomastigotes se liberan en la sangre periférica alcanzando los tejidos distantes, donde comienza el ciclo reproductivo de novo. La enfermedad de Chagas puede causar infección aguda o crónica. La aguda es más frecuente en niños menores de cinco años y se caracteriza por malestar, escalofríos, fiebre, hepatoesplenomegalia y miocarditis. El edema palpebral (signo de Romana) puede presentarse si la inoculación se produce en la cara. El edema tisular en otras partes, tras la picadura de las chinches infectadas, se llama chagoma. En personas ancianas, el curso agudo es leve o frecuentemente asintomático. En ambos casos, el paciente estará afectado de por vida Las manifestaciones crónicas de la infección, incluido el megaesófago, el megacolon y las alteraciones de la conducción miocárdica. son debidas a la destrucción de las células efectoras del sistema parasimpático por autoanticuerpos. La infección se puede transmitir por transfusiones, y las infecciones latentes pueden exacerbarse por ¡nmunosupresión. El diagnóstico en el estadio agudo se hace demostrando el parásito en frotis gruesos o finos de sangre, extensiones o en aspirados de los chagomas o de las adenopatias. Estas muestras también se pueden cultivar con el uso del medio Novy-MacNeal-Nicolle (Ash, 1987; Garcia, 1997; Vísvesvara, 1992c). En las áreas endémicas se puede usar el xenodiagnóstico (examen de contenido gástrico de chinches a las que se les ha permitido picar a un paciente). En los estudios en los estadios crónicos, el diagnostico serológico es el método de elección. El EIA. IFA y el test de CF están disponibles, aunque no permiten diferenciar entre enfermedad aguda o crónica y pueden tener reacción cruzada con pacientes con leishmaniasis.

Leishmania La leishmaniasis es una enfermedad del sistema reticuloendotelial producida por protozoos cinetoplástidos del género Leishmania. Todas las especies que infectan a humanos tienen reservónos anímales y se transmiten por moscas que pertenecen a género Phlebolomus en el Viejo Mundo y Lulzomyia en el Nuevo Mundo. Los parásitos toman la forma de amastigotes en los mamíferos y la forma de promastigotes en los insectos vectores. Las especies de Leishmania no se pueden diferenciar por examen de otros amastigotes o promastigotes. La leishmaniasis puede lomar diferentes formas clínicas: la forma cutánea, mucocutánea y visceral son las más conocidas. La forma y gravedad varían según la especie infectante, el estado inmune del huésped y la exposición previa (Peters. 1987: Strickland, 1999). Leishmaniasis cutánea. La leishmaniasis cutánea del Viejo Mundo (llaga oriental) se produce en el sur de Europa, norte y este de África, Oriente Medio. Irán, Afganistán y el sur de Rusia. Las infecciones están producidas por L tropica. L. major y L. aethiopica. aunque L. donovam y L. infantum también pueden producir lesiones cutáneas. L. tropica causa la úlcera urbana o seca, que es más duradera que la rural o la úlcera húmeda de L. major. Estas úlceras suelen producirse en una zona expuesta del cuerpo y se cura espontáneamente. La infección deja inmunidad duradera. L. tropica puede llegar a ser viscerotrópica. tal como se demostró recientemente en personal militar que participó en la operación Tormenta del Desierto (Magill, 1993). L. aethiopica produce una infección cutánea más agresiva, que en algunos casos puede producir lesiones mucosas a distancia o leishmaniasis cutánea difusa, cuyo extremo se caracteriza por múltiples módulos cutáneos que se asemejan a la lepra lepramatosa. La leishmaniasis cutánea del Nuevo Mundo es causada por muchas especies, incluidos L. mexicana. L. braziliensis. L. amazonensis. L vene-

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SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

zuelensis. L. garnhami, L. pifanoi. L. peruviana. L. panamensis y L. guyanensis. Las lesiones causadas por L. mexicana pueden afectar al lóbulo de las orejas (úlcera del chiclero), siendo autolimitada, y se desconoce su afectación a distancia de las mucosas. Sin embargo, L. mexicana y L. amazonensis pueden causar lesiones cutáneas difusas similares a las de L aethiopica. Existe un foco de leishmaniasis cutánea en el sur de Texas, donde las infecciones están causadas por una o más especies (Gustafson, 1985). L. peruviana, hallada en las pendientes occidentales de los Andes peruanos, causa una infección llamada uta. una lesión cutánea benigna que se da preferentemente en niños. L. peruviana se adquiere en las casas, donde los principales reservorios son los perros domésticos. Esta situación epidemiológica contrasta con otras leishmaniasis cutáneas que suelen adquirirse en los bosques y tienen animales salvajes como reservónos. Leishmaniasis mucocutánea. La Leishmaniasis mucoculánea (espundia) es provocada por L. braziliensis y rara vez por otras especies causantes de lesiones cutáneas más agresivas, y a veces se disemina a membranas mucosas, especialmente la nasal, la oral y la faríngea. En estas zonas puede producir lesiones desfigurantes por erosión de las partes blandas y de los cartílagos. L. braziliensis se distribuye en México, América central y Sudaménca.

res. incluidos células levaduriformes de Histoplasma capsulatum y los trofozoitos de Toxoplasma gondii. Leishmama spp. tiene un cmetoplasto y no posee pared celular. En contraste, Histoplasma pierde el cinetoplasto. y la pared celular se tiñe con ácido periódico de Shifl (PAS) y con plata metenamina. De acuerdo con un estudio (Weigle, 1987), la sensibilidad de las secciones histológicas teñidas con hematoxilina-eosina es del 14%. las impresiones del 19%. de los cultivos del 58%. y de todos los métodos combinados del 67%.

Toxoplasma

gondii

Toxoplasma gondii es un parásito protozoo del filo Apícomplexa con una distribución mundial en el ser humano y en los animales tanto domésticos como salvajes, especialmente carnívoros. La infección en inmunocompetentes suele ser asintomática o leve, pero en los mmunocomprometidos puede traer serias complicaciones. La infección in útero puede producir una infección congénita grave con secuelas o causar la muerte letal (Remington, 1990).

Leishmaniasis visceral. La leishmaniasis visceral del Viejo Mundo se produce esporádicamente a lo largo de toda la geografía y es causada bien por L. úonovanio por L. infantum. L. donovanies predominante en África. Asia y la India y L. infantum predomina en las regiones mediterráneas y en el Oriente Medio, aunque existen superposiciones. La leishmaniasis visceral del Nuevo Mundo está producida por L. chagasiyse produce esporádicamente en América central y Sudamérica. Algunas especies que producen enfermedad cutánea también pueden ser responsables, en ocasiones, de enfermedad visceral, como se demostró recientemente en algunos grupos que participaron en la operación Tormenta del Desierto (Magill. 1993). En algunas áreas los humanos pueden servir de reservorios. aunque suelen ser diversos animales, incluidos perros y gatos, los que toman este papel.

El estadio sexual del ciclo vital de este parásito coccidio se completa en el epitelio intestinal de los gatos y otros felinos, que le sirven exclusivamente como huéspedes definitivos. Durante este ciclo, pueden formar esquizogonias asexuales y gametocitos sexuales, dirigidos al desarrollo de los ooquistes inmaduros que pasan a las heces. Los ooquistes maduran a una fase infectiva (que contiene dos esporoquistes y cuatro esporozoítos cada uno) en el plazo de 2 a 21 días. La ingestión de estos ooquistes puede conducir a la infección de una gran variedad de vertebrados susceptibles en los que los trofozoitos en crecimiento (taquizoitos) pueden infectar activamente cualquier célula nucleada. La proliferación de los taquizoitos produce la muerte celular. Una vez que se desarrolla la inmunidad, los organismos forman quistes tisulares que pueden contener cientos o miles de bradizoítos de crecimiento lento. La presencia de quistes tisulares es característica de las infecciones crónicas. Todos los estadios del ciclo vital se producen en los felinos, pero sólo los estadios de trofozoitos y quistes se producen en humanos y otros huéspedes intermediarios.

La infección suele ser benigna y a veces subclínica, aunque algunos individuos, especialmente chicos |óvenes e individuos mal nutridos, tienen marcada afectación visceral, especialmente hígado, bazo, médula ósea y ganglios linfáticos. En algunos casos la muerte se produce tras meses o años, a menos que se les trate adecuadamente. La infección se llama Kala-azar en la India, por el oscurecimiento que toma la piel La leishmaniasis visceral es también una infección oportunista en individuos inmunosuprimidos (VIH), como mala respuesta a tratamiento (Medrano, 1992).

Los humanos adquieren la infección por Toxoplasma gondii por la ingesta de carne mal cocinada, especialmente cordero o cerdo, que contiene quistes tisulares, o por la ingesta de ooquistes inactivos de material contaminado por heces de gato. Los brotes pueden producirse por la inhalación de polvo contaminado en el interior de establos (Teutch, 1979) y por beber agua contaminada o leche sin pasteurizar (Benenson. 1982: Sacks. 1982). También puede producirse por la transmisión por transfusión o por trasplantes

Diagnóstico de leishmaniasis. El diagnóstico se realiza habitualmente por la visualización de los amastigotes en las extensiones o en las biopsias, o por el crecimiento de los promastigotes en cultivos. En la leishmaniasis tegumentaria, el borde de la lesión (que es más activo) debe ser biopsiado y se debe emplear en fresco para hacer muestras. También se debe preparar una extension haciendo una incisión de 2 mm a 3 mm en el borde de la ulcera y cogiendo pequeña cantidad de tejido de la superficie tras cortar la superficie con la hoja del bisturí. Tanto la extensión como la muestra de la biopsia se deben tratar con Giemsa. Las muestras que se deben tomar cuando se sospecha leishmaniasis visceral incluyen preparaciones teñidas, aspirados de adenopatías o de médula ósea y biopsias de bazo o hígado.

La mayoría de las infecciones agudas son asintomáticas o similares a otras enfermedades en las que destacan la fiebre y las adenopatías. La infección congénita puede producirse cuando la madre tiene infección aguda durante la gestación. El riesgo de inlección en neonatos no se relaciona con la presencia o ausencia de síntomas en la madre, sino que la gravedad de la infección depende del estadio de la gestación. Si se contrae en la primera mitad del embarazo, puede aparecer muerte intrauterina, microcefalia o hidrocefalia con calcificaciones intracraneales. Si se da la infección en la segunda mitad del embarazo, suelen ser asintomáticos al nacimiento, aunque puede aparecer fiebre, hepatoesplenomegaha e ictericia. La coriorretmitis, el retraso psicomotor y las convulsiones pueden aparecer meses o años después.

El cultivo es deseable, ya que es más sensible y permite determinar las especies y subespecies. práctica que puede ayudar al tratamiento clínico del paciente. Las biopsias y aspirados recogidos asépticamente se cultivan en el medio de Novy-MacNeal-Nicolle o en el medio de Drosophila de Schneider suplementado con suero fetal de carnero (Visvesvara, 1992c). Los cultivos suelen empezar a mostrar promastigotes de 2 a 5 días, pero se debe esperar al menos cuatro semanas.

En inmunosuprimidos, especialmente aquellos con sida, las infecciones por Toxoplasma gondiiduelen presentarse con afectación de líquido cefalorraquídeo (Luft. 1988). Otras posibles manifestaciones clínicas y patológicas son neumonitis. miocarditis, retinitis, pancreatitis y orquitis (Luft, 1989; Schnapp, 1992). La toxoplasmosis puede ser difícil de diagnosticar clínicamente y a veces se descubre en las autopsias (Gutiérrez, 2000). Estas infecciones suelen ser resultado de la reactivación de infecciones latentes, adquiridas meses o años antes, pero ocasionalmente pueden ser infección primaria.

Los amastigotes hallados en las biopsias, extensiones y secciones tisúlares se reconocen por su tamaño (de 2 pm a 4 pm), por su citoplasma, por el núcleo y un cmetoplasto (Lámina 55-5C). En las secciones tisulares pueden parecer mas pequeños debido a su reducción de tamaño durante la fijación. Los amastigotes deben diferenciarse de otros organismos mtracelula-

El diagnóstico de toxoplasmosis se puede establecer por el examen de tejidos, sangre o fluidos corporales. El hallazgo de taquizoitos o quistes tisulares es definitivo, pero puede existir dificultad para demostrarlo en las tin-

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

clones con hematoxilina-eosina; las tinciones fluorescente o con inmunoperoxidasa suelen ser útiles. El Giemsa es bueno para la tinción de extensiones de fluidos corporales y tejidos. Los organismos se pueden demostrar inoculando material adecuado en cultivo de tejido o en un ratón. La recuperación en cultivos virales también se ha descrito, pero requiere una incubación prolongada (Shepp, 1985). El aislamiento de los organismos a partir de la sangre o fluidos corporales es evidencia de infección aguda, mientras que su obtención en tejidos puede significar infección crónica. En las extensiones, los taquizoítos son ovalados o en forma de media luna, midiendo aproximadamente 3x7 um; los quistes miden más de 30 urn de diámetro y suelen ser esféricos, excepto en las fibras musculares, donde están alargados (Láminas 55-50. E y F). El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es de alta sensibilidad y especificidad para su detección en la encefalitis por Toxoplasma, enfermedad diseminada e infección intrauterina (Cazenave. 1991; Grover, 1990. Parmley. 1992; Weiss. 1995). Estos procedimientos no están completamente disponibles, sin embargo requieren un control de calidad cuidadoso para evitar resultados falsos positivos. La serologia permanece en primera linea para el diagnóstico por Toxoplasma (Wilson. 1995). El test de Sabin-Feldman y el test de IFA son los estándares con los que se comparan los otros métodos, aunque el primero es llevado a cabo sólo en algunos centros. Muchos de los test EIA están disponibles a la venta y generalmente dan un resultado similar al del IFA Los anticuerpos aparecen en una o dos semanas y los titulos pico entre la sexta y octava semanas. Los test para los anticuerpos IgM específicos son especialmente útiles para diagnóstico de infección aguda e infección congenita, pero el conocimiento de las limitaciones (especialmente de los falsos positivos) es de gran importancia. La persistencia de anticuerpos IgM en ocasiones durante un año o más, es también problemático y se debe interpretar en conjunto con los resultados de la IgG. Debido a que muchas personas han tenido infecciones asintomáticas, los titulos bajos de IgG tienen poco significado. Los títulos en pacientes con infección crónica ocular también pueden ser bajos. Los inmunosuprimidos, como los pacientes con sida que tienen infecciones activas por Toxoplasma, casi siempre tienen anticuerpos IgG existentes, aunque los títulos pueden ser bajos y la actividad de IgM rara vez es detectada. La interpretación de los titulos de IgG e IgM varía según el método usado y quien lo haya llevado a cabo. El laboratorio que lo hace debe dar los criterios necesarios para su interpretación.

Amebas oportunistas de vida libre Las amebas de géneros Naegleria. Acanthamoeba y Balamuthia habitan en la tierra, el agua y otros substratos ambientales, donde se alimenta de otros organismos microscópicos, especialmenle bacterias y levaduras. Los tres géneros se han asociado con infecciones oportunistas del sistema nervioso central, y la infección por Acanthamoeba causa queratitis (Kilvmgton. 1994: Marciano-Cabral. 1988; Martínez. 1985: Ubelaker. 1991; Visvesvara. 1999). La memngoencefalitis causada por el ameboflagelado Naegleria lowleri suele afectar típicamente a niños y jóvenes adultos que han estado nadando o buceando en lagos o piscinas de aguas dulces calientes. Los ameboflagelados entran en el cerebro a través de la lámina cribiforme y del bulbo olfatorio, alcanzando los lóbulos frontales, donde produce una meningoencefalitis aguda hemorrágica que suele ser latal en el plazo de una semana Iras el comienzo de los síntomas. Tiene un malísimo pronóstico a pesar del tratamiento vigoroso. El diagnóstico suele establecerse por autopsias al encontrar trofozoítos (los quistes no se suelen ver) en los cortes histológicos (Lámina 55-6/1). El diagnóstico en vida se hace ocasionalmente al ver trofozoítos típicos en el líquido cefalorraquídeo, bien sea en examen directo o en preparaciones teñidas o en cultivo. Los trofozoítos miden de 10 pm a 35 pm, y tienen cariosomas largos, redondeados y centrales: si se ponen en agua destilada templada, se convierten en formas flageladas en una o dos horas. Los quistes son esféricos y miden de 7pm a 15 pm de diámetro. El cultivo se suele hacer en placas de agar no nutriente (1,5% agar, 0,5% cloruro sódico. pH 6.6-7,0) sem-

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brado con un tapiz de E. col! viva o muerta con calor (Visvesvara. 1999). Las amebas digieren las bacterias, dejando huellas en el tapiz de bacterias, que pueden ser vistas con bajo aumento utilizando poca luz (Lámina 55-60). La meningoencefalitis amebiana granulomatosa (GAE) puede ser causada por varias especies de Acanthamoeba. incluidas A. castellao!. A. culbertsoni. A. polyphaga y A. astrnyxis entre otras Suele ser una infección oportunista subaguda o crónica de pacientes con enfermedades crónicas debilitantes e inmunosuprimidos. causando la muerte en semanas o meses tras el inicio de los síntomas. Se cree que la infección se extiende por vía hematógena a partir de un foco primario de la piel, la faringe o de tracto respiratorio. Pueden producirse infecciones sistémicas en personas con sida y presentarse como lesiones cutáneas o ulcerativas, abscesos subcutáneos o nodulos eritematosos (Lámina 55-6C) (Tan, 1993). No es necesaria la exposición al agua, ya que los quistes de Acanthamoeba son llevados fácilmente por el aire y pueden hallarse en la nariz y la garganta (Lawande, 1979; Wang. 1967). La reacción tisular consiste en granulomas con trofozoítos en los tejidos viables y quistes en las áreas de necrosis. El diagnóstico se suele hacer en autopsias, pero se pueden ver organismos en las biopsias cerebrales mediante técnicas de cultivo descritas para Naegleria. Los trofozoítos de Acanthamoeba son algo más grandes que los de Naegleria, midiendo entre 15 pm y 45 pm, y poseen unas proyecciones filamentosas similares a agujas, conocidas como acanlopodios. Los quistes miden de 10 pm a 25 pm y tienen doble pared: una externa rugosa (ectoquistes) y otra interna poligonal estrellada o redondeada (endoquistes) (Lámina 55-60). La identificación de las especies es problemática y refleja la incertidumbre a la hora de reconocer las dieciocho o mas especies descritas. El uso de técnicas de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa puede resultar útil para diferenciar especies y están disponibles por el CDC (Visvesvara, 1999). La GAE puede ser causada por amebas leptomyxldes, especialmente Balamuthia mandrillaris (Visvesvara. 1993). Morfológicamente. Balamuthia no se puede diferenciar de Acanthamoeba por la histología habitual, aunque se pueden detectar diferencias a nivel ultraeslructural. Estos organismos son antigénicamente diferentes y se pueden identificar mediante el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales en ensayos con inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa (Visvesvara, 1999). Balamuthia no crece en las placas de agar usadas para Naegleria y Acanthamoeba, pero se puede hallar en cultivos de tejido usando lineas celulares de mamíferos. La queratitis por Acanthamoeba es una dolorosa infección de la córnea cada vez más frecuente y que es más habitual que se produzca en personas que usan lentes de contacto blandas o que sufren un traumatismo en la córnea (Anuran. 1987: Kilvington, 1994). La desinfección incompleta o infrecuente y el uso de suero salino casero son factores de riesgo conocidos para sufrir la infección (Stehr-Green, 1990). La enfermedad se caracteriza por el desarrollo de un infiltrado en anillo en el estroma corneal que progresa a ulceración y riesgo de perforación con pérdida del ojo. La infección se puede confundir con una queratitis fúngica. bacteriana o herpética que característicamente es refractaria a los antimicrobianos más habituales. Se ha empleado la queratoplastia en el tratamiento de esta enfermedad, aunque se han descrito avances recientes en la terapia médica (Varga, 1993). El diagnóstico se establece por la demostración de trofozoítos amebianos o quistes en los raspados o biopsias corneales (Lámina 55-6E). Se pueden usar un gran número de tinciones, incluidos el Giemsa, el PAS y el tricromo. El uso de fluorocromo-calcoflúor blanco es especialmente útil en la detección de quistes de amebas (Lamina 55-6F) (Marines. 1987). Los cultivos (descritos previamente) aumentan la sensibilidad.

PROTOZOOS INTESTINALES Y UROGENITALES Los grupos de protozoos que habitan el tracto intestinal en humanos incluyen las amebas, flagelados, ciliados, coccidios y microsporidios, sin ser todos ellos patógenos. En una revisión de muestras fecales enviadas a los laboratorios del departamento estatal de salud, Giardia lamblia estaba presente en

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un 7,2%, £ histolytica en un 0,9%, Dientamoeba tragilis en un 0.5% y Cryptosporidium spp. en un 0.2% de las muestras. Los protozoos no patógenos se encuentran en aproximadamente el 10,7% de las muestras (Kappus, 1994). La mayoría de las infecciones intestinales son adquiridas por vía fecal-oral, tanto directamente, desde manipuladores de alimentos, como indirectamente, a través del agua contaminada. Para la mayoría de los laboratorios, la identificación de los protozoos intestinales es uno de los aspectos más difíciles de la parasitología. Los protozoos son pequeños y las especies patógenas se deben diferenciar de las no patógenas y de las células inflamatorias, de las células de endoteliales, de las levaduras, de los pólenes y de otros objetos. Hay un número de características que ayudan para la identificación de los protozoos intestinales. El tamaño es útil (Fig. 55-3) y un adecuado micrómelro ocular debe estar disponible. La diferenciación de amebas de los flagelados en muestras húmedas o material fresco es relativamente fácil por los seudópodos típicos de las amebas, mientras que los flagelados se mueven más rápidamente, de un modo que se asemeia a una hoja cayendo. El número y el tamaño de los núcleos y el patrón de la cromatina. visto en preparaciones con tinción permanente, son también útiles. Las características del citoplasma incluyen fibrillas y otras estructuras típicas de los flagelados, material ingerido en los trofozoitos amebianos y la masa de glucógeno y cuerpos de cromatina en quistes de amebas. Los flagelados suelen estar agrandados y con forma de huso, con uno o varios núcleos en un extremo. Cuando se examina por cualquier método, las características nucleares y citoplasmáticas se deben determinar a partir de un número de organismos para completar la identificación. Cuando se informa de la presencia de dos o más especies en una muestra, el observador debe ser capaz de definir las diferentes poblaciones para evitar confundir algún organismo con apariencia atípica. Los trofozoitos predominan en las heces líquidas, pero degeneran en menos de una hora a menos que se pongan conservantes. Los quistes predominan en las heces formadas y son más resistentes a la degeneración. Ambas formas se pueden ver en el examen directo a partir de heces frescas. La formalina no conserva bien los trofozoitos, y se pueden perder a menos que se preparen extensiones con tinciones permanentes. Para la

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Figura 55-3. Rangos de los tamaños de los protozoos intestinales. (Los trofozoitos de B. cotí pueden medir hasta 200 pm.)

identificación definitiva se debe hacer un examen de muestras con tinción permanente.

Amebas

y

Blastocystis hominis

Los tres géneros de amebas que pueden habitar el tracto intestinal humano son: Entamoeba. Endolimax y lodamoeba. Los quistes se digieren y se exquistan en el intestino delgado. El resultado es la proliferación de trofozoitos por fisión binana en la luz del colon. Tanto los quistes como los trofozoitos pueden salir con las heces, pero sólo los quistes maduros son infectivos. Entamoeba histolytica es la única especie de ameba capaz de invadir tejidos y producir enfermedad. El género Entamoeba, caracterizado por la presencia de cromatina de la membrana nuclear, incluye E. histolytica, el agente de la amebiasis; E. dispar, una especie no patógena idéntica a E. histolytica; E. hartmanni y £ coli. que se encuentran habitualmente como especies comensales: y £ polecki que se encuentra a veces en personas que tienen contacto con cerdos (Fig. 55-4) (Gay, 1985: Levin, 1970). £ gingivaiis. que no tiene un estadio quistico conocido, puede habitar en la boca de individuos con pobre higiene bucal (Dao, 1983). £ polecki y £ gmgivalis se ven rara vez y no se describen más adelante. Endohmax nana e /. bütschlii son especies no patógenas. Dientamoeba fragilis se reconoce actualmente como flagelada, aunque pierde su flagelo externo y se explica en el texto dentro de los flagelados, pero puede ser encontrada con las amebas en las tablas y figuras debido a sus similitudes morfológicas. Entamoeba histolytica. Esta ameba puede producir diversas enfermedades, siendo las más comunes la disentería amebiana, la colitis amebiana y a abscesos hepáticos (Beaver, 1984; Ravdin, 1988: Strickland, 1999). Los mecanismos de defensa del huésped, el contacto previo con el parásito, la alimentación y la cepa de Entamoeba histolytica son los responsables de la gravedad de la infección. Los análisis de los patrones de isoenzimas han mostrado que sólo ciertas cepas son invasivas y que la mayoría de las infecciones no se detectan (Bruckner. 1992; Murray 1999). Las diferencias genéticas y bioquímicas entre las cepas invasivas y no invasivas se han identifica-

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MEDICA

do, y se ha propuesto que se denomine a la cepa no patógena Entamoeba dispar (Diamond, 1993). La disenteria amebiana, que es rara en EE.UU.. es una enfermedad aguda que se caracteriza por diarrea sanguinolenta con calambres abdominales. Se produce una invasión de la mucosa intestinal, causando ulceración que puede conducir a perforación y peritonitis. La forma más común de la enfermedad vista en este país es la colitis amebiana, que puede simular una colitis ulcerosa y otra forma de enfermedad inflamatoria intestinal. Los síntomas suelen ser menos graves que en la disentería amebiana, pero pueden incluir diarrea no sanguinolenta, estreñimiento, dolor abdominal y pérdida de peso. Se pueden formar pequeñas ulceraciones de la mucosa y extenderse dentro de la submucosa formando úlceras. Se puede afectar todo el colon o una parte, más frecuentemente el ciego, el recto-sigma o el colon ascendente. Los abscesos hepáticos por amebas son la forma extraintestinal más frecuente de amebiasis, dándose aproximadamente en el 5% de los pacientes que presentan amebiasis intestinal. Se caracteriza por fiebre y dolor en el hipocondrio derecho. Estos abscesos hepáticos se suelen diagnosticar por escáner, ecografía y test serológicos. Las amebas están presentes en las heces en menos de la mitad de los pacientes en el momento de la detección del absceso hepático. La hepatitis amebiana. caracterizada por un aumento doloroso del hígado en personas con amebiasis intestinal, también puede producirse. Su patogénesis es aún poco conocida. Rara vez pueden aparecer abscesos amebianos en otros órganos como pulmón, cerebro o piel, bien por diseminación hematógena desde el intestino o bien por continuidad desde abscesos hepáticos. Se pueden formar masas de tejido granulomatoso (amebomas) como respuesta a la presencia de amebas, pudiendo causar en el intestino una lesión en servilletero que podría simular un carcinoma. Epidemiología. La mayoría de las infecciones por E. histolytica se adquieren por ingesta de agua o alimentos contaminados, aunque un brote se produjo por una irrigación colónica contaminada (Istre, 1982). Se pueden ver seudoepidemias a causa de la confusión en el laboratorio de las

* inrrt-cuentc. prohuhli'im'ntt- di-

1213

células inflamatorias, otras amebas o restos fecales como si fuesen E. histolytica (CDC. 1985; Krogstad, 1978). Aunque £ histolytica es un parásito endémico de Estados Unidos, muchas personas lo adquieren durante viales o viviendo en países extranjeros. Diagnóstico. El examen de una serie de muestras fecales puede ser suficiente para el diagnóstico de amebiasis intestinal en la mayoría de los casos. Si se han administrado antibióticos o medios de contraste, la infección puede ser enmascarada durante una temporada. El material aspirado de un absceso hepático puede mostrar trofozoítos al microscopio. La última porción del aspirado es la que más trofozoítos suele contener y puede usarse para el examen microscópico directo o para tinción permanenle. Si hubiese tejido disponible, la sección puede mostrar organismos que se tiñen mucho con PAS (Lámina 55-7C) Los cultivos (Diamond, 1988; Visvesvara. 1992a) no tienen un empleo muy extendido para diagnóstico, pero son útiles para la investigación y esenciales para determinar la patogenicidad basándose en las ¡soenzimas Los test de detección de antigenos por EIA son específicos, sensibles y capaces de diferenciar a Entamoeba histolytica de Entamoeba dispar y están disponibles en el mercado (Wilson, 1995; Murray, 1999; Rosenblatt, 1995). En uso de las técnicas de PCR y de ADN también es útil para diferenciar Entamoeba histolytica de Entamoeba dispar (Bendall, 1993; Samuelson, 1989; Weiss, 1995), pero no están comercializadas. Los test serológicos (Tabla 55-5) son los más útiles para el diagnóstico de infección extraintestinal, ya que aproximadamente el 95% de los pacientes con abscesos hepáticos son seropositives. Esto disminuye al 70% para la infección intestinal y al 10% para los portadores asintomátícos. Los titulos detectables pueden durar meses o años tras el tratamiento correcto (Wilson, 1995). Los trofozoítos de Entamoeba histolytica miden de 10 pm a 60 pm de diámetro; la forma comensal suele medir de 15 pm a 20 pm y las formas invasivas unas 20 pm (Tabla 55-7; Figs. 55-3 a 55-5; Lámina 55-7), En el examen directo, los trofozoítos muestran una movilidad progresiva gracias a la rápida formación de un pseudópodo hialino que tiene una clara dife-

u n g e n aniíiKil.

Figura 55-4. Amebas halladas en las muestras fecales humanas. {Dientamoeba Iragilis es un flagelado.)

to

Tabla 55-7 Morfología de los trofozoítos de las amebas intestinales

Especies

Tamaño (diámetro o longitud)

Núcleo

Citoplasma

Motilidad Número

:

Cromatina periférica

Cromatina cariosómica

Apariencia

Inclusiones

Entamoeba histolytica/ E. dispar

10-60 um; talla habitual, Progresiva, con 15-20 (im en la forma pseudópodos hialinos comensal', en torno a como dedos 20 pm para las formas invasivas'

1 No visible sin teñir

Granulos finos Habitualmente distribución y tamaño regular

Entamoeba hartmanni Entamoeba coli

5-12 pm; habitualmente Habitualmente no progresiva. de 8-10 (im pero a veces puede ser progresiva 15-50 um; Como una babosa, no progresiva, lo habitual 20-25 um pseudópodos abruptos

Similar a la Entamoeba Pequeño, discreto. histolytica Irecuentemente excéntrico Granulos bastos de tamaño Grande, discreto, y distribución irregular habitualmente excéntrico

Finamente granular

Endoiimax nana

6-12 pm; lo habitual 8-10 (tm

Ninguno

Grande irregular

Granular, vacuolado

lodamoeba bütschiii

8-20 pm; habitualmente 12-15 pm

1 No visible sin teñir 1 Frecuentemente visibles en preparación sin teñir 1 A veces visible en preparaciones sin teñir 1 No suele ser visibie sin teñir

Ninguno

Grande, habitualmente central. Bastamente granular, Rodeado por granulos refráctiles vacuolado y acromáticos. Estos granulos no suelen verse en las preparaciones teñidas

Bacterias, levaduras u otro material

Ninguno

Grandes acúmulos de 4-8 granulos Finamente granular, vacuolado

Bacterias

Dientamoeba fragilis*

5-15 pm. habitualmente 9-12 pm

Como una babosa habitualmente no progresivo, pseudópodos abruptos Como una babosa, habitualmente no progresiva

Los pseudópodos son angulares, aserrados o lobulados y alineados, casi transparentes

2 (En el 20% sólo hay un núcleo.) Son invisibles en preparaciones sin teñir

Pequeño, discreto Habitualmente central pero a veces excéntrico

'Habitualmente hallado en casos as¡niomáticos o crónicos, puede contener bacterias. 'Usuaimente hallado en casos agudos; con frecuencia contienen glóbulos rojos. 'Visible en material sin (¡jar Los núcleos se pueden ver a veces en material lijado '•Flagelado (véase texto) Adaptada de Brooke MM Melvm DM: Morphology of Diagnostic Stages Of Intestinal Parasites of Man. USDHEW PHS. Publicación n.- 1.966. 1969

Finamente granular

A veces eritrocitos en las formas invasivas— Las no invasivas contienen bacterias Bacterias

Basto, frecuentemente Bacterias, vacuolado levaduras y otros materiales Bacterias

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MEDICA

1215

I nuiiiwbjvu.il

bniumijcbu Insilili Ltv'j

Figura 55-5. Núcleos de amebas. Este dibujo muestra algunas de las distintas apariencias de los núcleos de las amebas en las preparaciones teñidas. (Dientamoeba Iragilises un flagelado: véase texto.)

renciación entre el endoplasma y el ectoplasma: el núcleo no es visible. En la enfermedad invasiva algunos trofozoítos contienen eritrocitos sin digerir (Lámina 55-7C), una característica de la infección por E. histolytica. En las preparaciones teñidas, la cromatina nuclear periférica suele distribuirse a lo largo de la membrana nuclear como finos granulos. El cariosoma es pequeño y a veces centralmente emplazado, con finas fibrillas que no suelen ser visibles y que lo sujetan a la membrana nuclear. Pueden existir variaciones en la estructura nuclear, pudiendo estar algunos cariosomas localizados excéntricamente y la cromatina periférica distribuida irregularmente. La única característica que es patognomónica de E. histolytica es la fagocitosis de eritrocitos, que rarísima vez se produce en otras especies, El citoplasma es finamente granular y en los organismos invasivos no hay inclusiones, o bien únicamente inclusiones de eritrocitos. En los organismos no invasivos pueden verse bacterias ingeridas. En los organismos en degeneración, el citoplasma puede ser vacuolado y el núcleo puede tener cromatina anormalmente agrupada. Los quistes de E. histolytica son esféricos y miden de 10 pm a 20 pm (habitualmente de 12 pm a 15 Jim) de diámetro (Tabla 55-8; véanse Figs. 55-3 a 55-5: Lámina 55-7). La fase de prequiste tiene un núcleo único y carece de pared refráctil. Cuando madura, desarrolla otros núcleos, siendo cada uno aproximadamente 1/6 del diámetro del quiste. Los núcleos son similares a los de los trofozoítos, pero su tamaño menor les hace menos Utiles como característica dílerenciadora. El citoplasma puede contener vacuolas de glucógeno y cuerpos cromaloides de extremos romos o agudos. El numero y el tamaño de los núcleos, así como el aspecto de los cuerpos cromatoides, son criterios importantes para la identificación de los quistes. En los laboratorios que no usan alguno de los métodos inmunológicos o moleculares para diferenciar E. histolytica de E. dispar y que cuentan únicamente con análisis morfológicos, se deben usar formatos de informes que tengan en consideración las tecnologías de diferenciación. Asi, un informe de E. histolytica/E. dispar sería lo más apropiado en última instancia. Amebas no patógenas. El microbiólogo debe estar capacitado para diferenciar las amebas no patógenas o comensales de la £ histolytica/ E. dispar y de D. Iragilis (un flagelado), que son potencialmente patógenos. Las características de identificación, que se ven mejor en cortes teñidos permanentemente, se resumen en las Tablas 55-7 y 55-8 y en las Figuras 55-3 a 55-5. La identificación de trofozoítos se basa en el tamaño y las características del núcleo y del citoplasma: la identificación de quistes se basa en el tamaño, numero y características del núcleo y en la presencia de los cuerpos de cromatina. así como en sus características, sin olvidar las masas de glucógeno. £ hartmanni tiene características morfológicas similares a las de £ histolytica, excepto en que los trofozoítos tienen un diámetro máximo de 12 pm,

y los quistes de 10 pm. teniendo los quistes a veces un núcleo único. Históricamente. E. hartmanni tue llamada la raza pequeña de £ histolytica. Su diferenciación requiere cuidadosas mediciones con un micrómetro ocular bien calibrado. Entamoeba coli. una habitante habitual del lumen, puede ser difícil de diferenciar de E. histolytica. El citoplasma se tiñe algo más oscuro que el de E. histolytica y es más vacuolado. conteniendo numerosas bacterias ingeridas, levaduras y otros materiales. Aunque las características nucleares difieren de las de Entamoeba histolytica (Fig. 55-5). puede existir una superposición significativa, especialmente en muestras que no se han conservado debidamente. Los quistes maduros de £ coli contienen ocho núcleos, aunque pueden llegar a tener 16 o más. Los quistes inmaduros, que son poco comunes, tienen cuatro núcleos (un cuarto del diámetro del quiste) mayores que los de E. histolytica (un sexto de diámetro del quiste) y pueden contener glucógeno. La distribución de la cromatina periférica y los cariosomas no tiene gran importancia en la identificación de los quistes de Entamoeba. Los cuerpos cromatoides, cuando se presentan, son irregulares, con extremo desflecado, mientras que los extremos romos se ven en £ histolytica. Entamoeba nana es la ameba más pequeña que inlecta a los humanos. Los trofozoítos con frecuencia tienen un núcleo atípico que contiene una masa de cromatina triangular, una banda de cromatina que atraviesa el núcleo o dos masas discretas de cromatina en los lados opuestos de la membrana nuclear (Fig. 55-5). Un halo claro o espacio cariolinfoide rodea el cariosoma y se extiende a la membrana nuclear. La forma nuclear atipica puede ser útil en la diferenciación de £ nana de /. bütschlii que es de una apariencia similar pero más larga. Los quistes de Endolimax suelen contener cuatro núcleos, aunque se pueden ver con menos núcleos. El glucógeno, cuando está presente, se dispone difusamente por el citoplasma en vez de en masas. Los quistes se diferencian fácilmente de las otras amebas, pero se pueden confundir con Blastocystis hominis. El núcleo del Blastocystis hominis pierde el halo que se veía en los quistes de £ nana. El núcleo de los trofozoítos de /. bütschlii y sus quistes tienen un cariosoma grande y central frecuentemente rodeado por granulos acromáticos que pueden no ser diferentes, pero aparecen sólo como un halo o espacio cariolinfoide. En algunos núcleos, el halo es claro sin granulos acromáticos, haciendo al organismo indistinguible de £ nana. Los quistes de /. bülschliicontienen un núcleo único en el que el cariosoma suele ser excéntrico, con unos granulos acromáticos en media luna (véanse Figs. 55-3 a 55-5). Los quistes se caracterizan por una vacuola prominente de glucógeno que se tiñe de marrón rojizo en las muestras frescas teñidas con yodo, de ahí el nombre del organismo. El glucógeno se disuelve con los fijadores acuosos y puede no ser visible en el material almacenado.

Tabla 55-8 Morfología de los quistes de a m e b a s intestinales Especies

Núcleo

Tamaño

Contorno

Entamoeba histolytica/ E. dispar

10-20 urn; habitualmente 12-15 pm

Entamoeba hartmanni

5-10 urn riabitualmente 6-8 pm

Entamoeba colt

10-35 urn; Habitualmente esférico. 8 en los quistes maduros habitualmente 15-25 urn Ocasionalmente ovaiado. Ocasionalmente quistes muy triangular u otro contorno nucleados con 16 o más Los quistes inmaduros tienen 2 o más

Endolimax nana

5-10 pm; habitualmente 6-8 urn

lodamoeba biitschlii

5-20 pm; Ovalado, elíptico, triangular 1 en los quistes maduros habitualmente 10-12 urn u otro contorno

Citoplasma

Número

Cromatina periférica

Cromaiina cariosómica

Cuerpos cromatoldes

Habitualmente esférico

4 en los quistes maduros. 1 ó 2 en los quistes inmaduros

Cromatina periférica. Granulos uniformes. finos y homogéneos

Pequeña, discreta y habitualmente central

Presente. Barras alargadas con extremos desflecados

Habitualmente esférico

4 en ios quistes maduros Similar a Entamoeba 1 ó 2 en los quistes inmaduros histolytica

Similar a Entamoeba histolytica

Presente. Barras alargadas con extremos desflecados

Esférico, ovalado o elíptico

4 en los quistes maduros. A veces se ven quistes inmaduros con menos de 4 núcleos

Glucógeno Habitualmente difuso. Frecuentes masas concentradas en los quistes jóvenes Se tiñen de marrón rojizo con el yodo Similar a Enthamoeba histolylica

Cromatina periférica. Grande, discreto. Presente. Habitualmente Habitualmente difuso, Bastos granulos habitualmente excéntrico. con extremos castigados pero a veces masas irregulares en tamaño y pero a veces central bien definidas en los distribución, pero quistes inmaduros. frecuentemente son más Se liñe de marrón uniformes que los que se rojizo con el yodo encuentran en los trofozoitos Ninguno Grande, habitualmente Ocasionalmente, granulos Habitualmente dituso. central pequeños o masas ovaladas Frecuentes masas pero no están presentes en concentradas en los los cuerpos vistos en quistes |óvenes. Entamoeba Se tiñe de marrón rojizo con el yodo Ninguno Grande, habitualmente Granulos a veces presentes. Masas compactas excéntrico. Granulos pero los cuerpos vistos en bien definidas. 'elráctiles. acromáticos Enlamoeba no están Se tiñen de marrón en uno de los lados del presentes oscuro con el yodo cariosoma

Adaptada de Brooke MM Melvm DM: Morphology of Diagnostic Stages of Intestinal Parasites of Man. USDHEW PHS. PuDlicacion n " 1 966 1969.

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

1217

Figura 55-6. A. Ciliados, coccidios y Blaslocyslis spp. hallados en muestras tecales humanas. B, Flagelados hallados en muestras tecales humanas. (Adaptada de Brooke MM. Melvin DM: Morphology ol Diagnostic Stages of Intestinal Parasites of Man (Publicación n. [CDC] 848116.) Washington, DL, Departamento de Salud y Recursos Humanos de los Estados Unidos, 1984. ?

Blastocystis hominis. Blastocystis hominis es un protozoo similar a la ameba que habita en el intestino y se encuentra frecuentemente en muestras fecales de individuos asintomáticos. Algunos estudios han relacionado la enfermedad intestinal sintomática con infección grave, aunque esto es controvertido (Markell, 1986; Miller 1988: Sheehan, 1986; Stenzel, 1996: Zierdt, 1991). Los quistes pueden tomar una de las siguientes tres formas: vacuolada, que es la más común, ameboide o granular. La vacuolada también se conoce como forma vacuolada central, que suele ser esférica y de tamaño variable (de 5 pm a 20 pm), con un área central clara y de dos a cuatro núcleos periféricos (Fig, 55-6A; Lámina 55-8G). Las formas ameboides de contornos atípicos pueden predominan en infecciones graves. La presencia de Blastocystis se debe informar, especialmente cuando son numerosos (cinco o más por campo de 400x) (Sheehan. 1986; Stenzel. 1996).

Flagelados Dientamoeba fragilis. Dientamoeba tragilis es un patógeno ameboide que infecta el colon y se asocia a diarrea, especialmente en niños jóvenes

(Preiss. 1991: Spencer, 1979; Tumer, 1985: Yang, 1977). Aunque es parecido a las amebas. Dientamoeba se ha reclasificado como un flagelado basándose en los detalles ultraestructurales y la similitud antigénica. No se le conoce un estadio de quiste. Debido a la similitud de Dientamoeba a las amebas en el microscopio de luz óptica, estas especies se han incluido tradicionalmente en las tablas y figuras de las amebas (véanse Tabla 55-7; Figs. 55-3 a 55-5: Lámina 55-7H). Los síntomas incluyen diarrea y distensión abdominal Recientes investigaciones sugieren que la dientamebiasis es una causa de diarrea más frecuente de lo que se pensaba; el 4,3% de los pacientes en un estudio podaban este organismo (Spencer, 1979: Murray, 1999). Aproximadamente el 25% de las personas infectadas presentaban síntomas. En contraste con la amebiasis, esta infección no suele asociarse con otros protozoos fecales, pero muestra una asociación entre diez y veinte veces mayor de lo esperado con enterobiasis (infección por oxiuros, analizado más adelante). Esta asociación sugiere que la infección por D. tragilis puede estar difundida por la ingesta de huevos de lombrices infectadas con D. tragilis (Burrows. 1956). La infección por D. tragilis pasará desapercibida a menos que se examinen preparaciones con tinción permanente. Pueden necesi-

1218

SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

tarse muchas muestras, ya que la eliminación varia día a día. Cuando se preparan extensiones, la última parte de las muestras fecales debe ser la examinada, ya que es donde mayor número de parásitos se pueden encontrar. De 2/3 a 4/5 de los organismos contienen dos núcleos que constan de un grupo de cuatro a ocho granulos cariosómicos que pueden formar un cariosoma grande e irregular (Fig. 55-5), Se puede confundir con trofozoítos de Enlamoeba nana o de /. bütschlii. El citoplasma es finamente granular y suele contener bacterias ingeridas. Los trofozoítos son delicados y pueden pasarse por alto fácilmente, de modo que la preparación teñida se debe examinar cuidadosamente. Se ha descrito un método de inmunofluorescencia que puede ayudar a su detección pero que no está comercializado (Chan, 1993). Giardia lamblia. G. lamblia es un protozoo patógeno intestinal que produce endemias y epidemias por todo el mundo, y en EE.UU. es especialmente problemática para los viajeros, campistas y homosexuales (Wolfe, 1992), Frecuentemente produce enfermedad en personas que beben agua contaminada, y se ha descrito un gran número de epidemias a partir del agua en lugares como Aspen, Colorado. Leningrado. Rusia, Roma y Nueva York (Craun, 1986). Los protozoos patógenos no mueren por las concentraciones habituales de cloro de las aguas municipales, y así, salvo que se filtre, puede actuar de fuente de infección, como ya sucedió en las epidemias de Roma y Nueva York. Los trofozoítos de G. lamblia se multiplican en el intestino delgado y atacan la mucosa mediante una ventosa ventral cóncava. Puede ser asíntomática o producir patología que va desde diarrea leve con vagas molestias abdominales hasta un síndrome de malabsorción con diarrea y esteatorrea, parecido a esprúe. La patogenia no está totalmente comprendida, aunque puede darse una interrupción de la integridad del borde en cepillo de la mucosa, produciendo déficit de disacaridasas debido al efecto directo o indirecto del parásito (Wolfe, 1992). La giardiasis se debe considerar en todo paciente con diarrea de más de diez días de duración. El diagnóstico se hace demostrando los trofozoítos o quistes de Giardia en las muestras fecales. Los trofozoítos suelen estar en las heces díarreicas, mientras que los quistes están en las heces formadas. La eliminación de los organismos varía de día en día, por lo que puede ser necesario el examen de diferentes muestras en diferentes días. El examen directo suele ser especialmente útil para el hallazgo de los trofozoítos con su motilidad en "caída de hoja". Los quistes se pueden ver tanto en examen directo como en concentraciones, y tanto quistes como trofozoítos se pueden ver en tinciones permanentes. En algunos casos no se pueden hallar en muestras fecales y son necesarios pequeños aspirados intestinales o muestras del test de la cuerda. El laboratorio debe ser avisado de antemano para que el personal esté disponible para la realización de un examen directo nada más recibir la muestra. Muchos métodos de detección de antígenos por inmunofluorescencia o por EIA están comercializados (Wilson, 1995; Wolfe, 1992; García, 1997). Parecen tener buena sensibilidad y especificidad y pueden detectar algunas infecciones no detectadas por el examen de las heces. También pueden ser especialmente útiles en investigación epidemiológica, pero no reemplazan la necesidad de los tradicionales estudios morfológicos para detectar otros parásitos. Los trofozoítos de Giardia mirados desde el exterior tienen una torma de pera con extremo posterior en forma de huso y poseen dos núcleos que les da el aspecto de una cara sonriendo con ojos prominentes (Tabla 55-9: véanse Fig. 55-68 y Lámina 55-8C a E). Cuando se ven desde un lado, el extremo anterior es más grueso y ahusado posteriormente: la mitad anterior consta de una ventosa en la cara ventral. Los cuatro flagelos laterales, los dos ventrales y los dos caudales no suelen ser evidentes en las muestras frescas o en las preparaciones teñidas. Los quistes son ovales y suelen ser tener cuatro núcleos. Bajo el núcleo, los cuerpos medios oscuros con fibrillas se cruzan longitudinalmente, dando unas características internas distintivas. El citoplasma suele estar apartado de la pared de los quistes. Chilomatix mesnili. C. mesnili (Tabla 55-9; Fig. 55-68; Lámina 55-8F) es un flagelado habitual del lumen no patógeno, que se debe distinguir de los tro-

fozoítos de las amebas y de Giardia en las preparaciones. La localización del único núcleo en uno de los extremos y la forma de huso del otro extremo es útil. Si se examinan varios organismos, serian visibles el citoplasma y el surco espiral en algunos de ellos. Los tres flagelos externos no suelen ser visibles en preparaciones teñidas o fijadas con formalina. Los quistes con forma de limón contienen varias fibras citosomales curvas con un aspecto parecido a un imperdible. Pentatrichomonas hominis. P. hominis. conocida antiguamente como Trichomonas hominis (Tabla 55-9; Fig. 55-68) es un raro flagelado intestinal no patógeno que se puede confundir con Entamoeba hartmanni o los pequeños trofozoítos de Entamoeba histolytica. No se tíñen especialmente bien y frecuentemente se distorsionan en las preparaciones. Hay que examinar muchos de ellos en las preparaciones teñidas para lograr ver el núcleo único similar al de Entamoeba. la membrana ondulada y los flagelos. Un objeto prominente similar a una vara, el axostilo, atraviesa el organismo y protruye en el extremo posterior. No se han descrito estadios quisticos. Trichomonas vaginalis. Trichomonas vaginalis es una causa frecuente de vaginitis, caracterizada por inflamación, prurito, flujo vaginal y. a veces, disuria. Se suele transmitir por relación sexual, frecuentemente por varones que tienen una infección asíntomática. A veces los hombres pueden padecer una prostatitis o una uretritis. Trichomonas vaginalis se suele diagnosticar en el mismo despacho del médico mediante un examen directo del flujo vaginal o del prostético, o bien del sedimento de orina. Morfológicamente, Trichomonas vaginalis se asemeja al P. hominis. pero es más grande (cerca de 23 pm) y la membrana ondulante se extiende sólo hasta la mitad del cuerpo. Debido a la diferencia en el habitat, no suele ser necesario diferenciar estas Trichomonas morfológicamente. El examen directo puede ser insensible y el uso de cultivo o las técnicas de inmunoensayo se recomiendan cuando el diagnóstico no es fácil (García, 1997; Visvesvara, 1992b; Wilson, 1995). Los cultivos tienen una sensibilidad de aproximadamente el 90% (Beal, 1992; Krieger, 1988; Schmid. 1989), así como las técnicas inmunofluorescentes y el EIA que usan anticuerpos monoclonales (Kreiger, 1988; Lisi, 1988; Wilson, 1995). La tinción de Papanicolaou puede revelar T. vaginalis en ocasiones, pero tiene baja sensibilidad y especificidad. Otros flagelados. Enteromonas hominis y Retortamonas intestinalis son flagelados intestinales pequeños, no patógenos, que se ven rara vez y que cuando están presentes pueden darse en gran número. Las características morfológicas se revisan en la Tabla 55-9 (véase también la Fig. 55-68). Trichomonas tenax son unas tricomonas que veces se aislan en la cavidad oral, pero no causan enfermedad.

Ciliados Balantidium coli. B. coli (Fig. 55-6A; Lámina 55-8H) puede causar un síndrome similar a la disentería con úlceras en el colon similares a las de las amebas, pero no produce abscesos hepáticos u otras lesiones sistémicas. La inlección humana, rara en EE.UU., se puede adquirir de los cerdos, que son los habitualmente infectados. 8. coli es el protozoo más grande que infecta a los humanos. Los trofozoítos van desde 40 pm hasta cerca de 200 pm en su mayor tamaño (la mayoría son de 50 pm a 100 pm) y están cubiertos uniformemente con cilios que son ligeramente más largos en el extremo anterior, adyacente al citostoma. Hay un gran núcleo que se ve tácilmente en las preparaciones, y un micronúcleo más pequeño que rara vez es visible. En el citoplasma hay numerosas vacuolas alimenticias y vacuolas contráctiles. Los quistes son redondos, midiendo de 50 pm a 70 pm de longitud. En los quistes más jóvenes se pueden ver cilios y las características nucleares son similares a las de los trofozoítos. Las muestras fecales contaminadas con agua estancada pueden contener ciliados de vida libre que pueden diferenciarse de 8. coli por el patrón ciliar.

Tabla 55-9 Morfología de los flagelados intestinales Especies

Forma

Motilidad

Forma de pera

Rápida, en sacudidas

Tamaño

Trofozoítos Pentatrichomonas lodo hominis'

8-20 LUTI;

Forma de pera

Rotatoria, rígida

Forma de pera

Caída de hoia

Oval

En sacudidas

No visible en preparaciones sin teñir 1 No visible en preparaciones sin teñir 2 No visible en preparaciones sin teñir 1 No visible en preparaciones sin teñir 1 No visible en preparaciones sin teñir

habitualmente 10-15 um Giarda lamblia

10-20 (im; habilualmente 12-15 u.m

Enteromonas hominis

4-10 um; Relorlamonas intestinalis

N° de flagelos' 3-5 anterior.

habilualmente 11-12 um 6-24 urn

Chilomastix mesnih

U.- de núcleos

Forma de pera u oval En sacudidas habilualmente 8-9 um

1 posterior 3 anterior, 1 en el citostoma 4 lateral 2 ventral. 3 caudal. 3 anterior. 1 posterior 1 anterior, 1 posterior

4-9 um, Especies Quistes Chilomastix mesnih Giardia lamblia

habitualmente 6-7 (jrn 6-10 jim; habilualmente 8-9 um Tamaño 8-13 ym;

?

Forma

N. de núcleos

Forma de limón con unos botones hialinos anteriores o "pezón' Oval o elíptico

1 No visible en preparaciones sin teñir Habitualmente 4 No diferenciabies en preparaciones sin teñir Habitualmente localizados en un extremo 1 -4 habitualmente 2 en el extremo opuesto del quiste, no visible en preparaciones sin teñir

habilualmente il-i2u.m Enteromonas Retortamonas

hominis intestinalis

4-10 um; habitualmente 6-8 ym 4-9 um. habitualmente 4-7 um

Alargado u oval Forma de pera o similar a un limón

'No es practico para la identificación de especies en el examen ordinario 'Pentatrichomonas hormnis no tiene forma guistica. Adaplada de Brooke MM Melvm MD Morpnology of Diagnostic Stages of Intestir

Otras características Membrana ondulada que se extiende a lo largo de el cuerpo Citostoma prominente que se extiende un tercio o la mitad Surco espiral a lo largo de la superficie ventral Ventosa que ocupa la mitad o tres cuartos de la superficie ventral Un lado del cuerpo es plano. Flagelo posterior que se extiende libremente hacia el posterior o el lateral Citostoma prominente que se extiende aproximadamente hasta la mitad del cuerpo Otras características Citostoma con fibrillas de soporte. Habitualmente visible en preparaciones teñidas Fibrillas o flagelos longitudinales en el quiste Citoplasma frecuentemente apartado a una porción de la pared del celular Se asemeía al quiste de E. nana. Los flagelos o fibrillas no suelen verse

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No visible en preparaciones sin teñir

Se parece al quiste de Chilomastix. Sombra exterior al citoplasma con fibrillas de soporte que se extienden sobre el núcleo

is of Mai USDHEWPHS Publicación n.1.966 1969

No —-

~o

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SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Coccidios Los coccidios comprenden un gran grupo de parásitos apícomplejos que tienen una lase sexual en el intestino de los vertebrados e invertebrados. Algunas especies pueden también desarrollarse asexualmente en zonas extraintestinales en los tejidos del huésped. Los géneros infectantes del intestino humano, como Isospora. Sarcocystis. Cryptosporidium y Cyclospora suelen producir una diarrea autolimitada en personas inmunocompetentes. Se puede desarrollar una diarrea grave en inmunosuprimidos tras la infección de Isospora. Cryptosporidium y Cyclospora. Isospora belli. Isospora belli sufre un desarrollo sexual y asexual en el citoplasma de las células epiteliales del intestino delegado (Lámina 55-9/4). El desarrollo sexual produce ooquistes. que pasan a las heces y maduran a fase infectiva en el medio ambiente. La infección humana causa diarrea y malabsorción. que suele ser autolimitada. En pacientes con sida u otra inmunosupresión, la enfermedad puede durar meses o años y podría causar la muerte (DeHovitz, 1986; Mannheimer. 1994). El diagnóstico se hace hallando ooquistes no esporulados de 12 x 30 pm en las heces, habitualmente en examen directo o en preparaciones concentradas (Lámina 55-9S). Si la muestra sin fijar se deja a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas, se produce la esporulación. Los ooquistes infectivos contienen dos esporoquístes, cada uno de los cuales tiene cuatro esporozoitos (Fig. 55-6/4) Los ooquistes. como los de Cryptosporidium, se tiñen con tinción ácido resistente. Sarcocystis spp. Las especies de Sarcocystis son coccidios de doble huésped en los que la lase sexual se da en el intestino de carnívoros y la asexual o extraintestinal se da en los músculos y tejidos de huéspedes intermediarios. Los humanos pueden servir como huéspedes intermedios o como huéspedes definitivos, dependiendo de la especie de Sarcocystis. La infección intestinal con S. hominis y S. suihominis se adquiere por ingesta de carne poco hecha (vaca o cerdo) respectivamente, que contiene los quistes tisulares (sarcoquisles), La infección suele ser asmtomática, pero algunos pacientes desarrollan diarrea pasajera, dolor abdominal o anorexia. La infección intestinal es autolimitada, ya que la multiplicación asexual se produce en el huésped intermediario y no se repite en el huésped definitivo. La producción de ooquistes se limita por el número de organismos ingeridos como sarcoquistes. El diagnóstico se hace al detectar los esporoquistes esporulados de 25 x 33 pm en las heces (Fig. 55-6A). Cada esporoquiste maduro contiene cuatro esporozoitos. La pared de los ooquistes es fina y no suele verse o se rompe liberando dos esporoquistes. Estas formas, que se ven mejor en examen directo o en tinciones ácido resistentes, parecen más grandes que los ooquistes de Cryptosporidium, y la tinción de tricromo es de poco valor en la detección de estos parásitos. Los hombres también puede servir de huésped intermediario en muchas especies innominadas de Sarcocystis (conocidos colectivamente como S. lindemannt), en cuyo caso los quistes se encuentran en los músculos esqueléticos y cardíacos (Beaver. 1979: Strickland, 1999). Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum utiliza un único huésped en su ciclo vital, pero puede infectar a humanos y a una gran variedad de animales, incluidos los de ganado vacuno y ovino. Los parásitos se desarrollan en el borde en cepillo de las células endotelíales del intestino y a veces se extienden a otras zonas como la vesícula biliar, el páncreas o el tracto respiratorio (véanse Fig. 55-6A y Lámina 55-9Cy 0). Cryptosporidium es una causa frecuente de diarrea aguda autolimitada en personas sanas, especialmente en niños. La epidemiología es similar a la de Giardia. Uno de los mayores brotes conocidos transmitido por agua se produjo en Milwaukee y Wisconsin en el año 1993. En este brote, más de 400.000 personas cayeron enfermas por beber agua contaminada con vertidos de granjas tras unas fuertes lluvias (McKenzíe, 1994). Como los quistes de Giardia y los ooquistes de Cryptosporidium son resistentes a la cloracíón habitual del agua potable, y a menos que el agua comunitaria se filtre, pueden darse epidemias. En pacientes con sida, Cryptosporidium puede producir diarrea secretora crónica que puede durar meses o años y puede acarrear la muerte. El período de

incuóación es aproximadamente de ocho días, y en personas previamente sanas puede durar de 9 a 23 días. Los pacientes pueden tener malestar, liebre, anorexia, calambres abdominales y diarrea (Current, 1991; Mannheimer, 1994). El diagnóstico se suele hacer examinando las heces. Existen varios métodos de concentración que son buenos, incluidas la sedimentación con formalina-etil acético y la flotación en azúcar de Sheather (García, 1983). La disponibilidad del método de formalina-etil acético hace a esta técnica muy atractiva, aunque se deben incrementar al máximo el tiempo y la velocidad de centrifugación para maximizar el rendimiento (NCCLS, 1997; Isenberg. 1992), Se prepara una extensión con el sedimento y se tiñe con tinte ácido resistente o reactivos inmunolluorescentes. Se han evaluado muchos métodos de tinción ácido resistente, incluida la auramina-O, pero el que tiene un uso más extendido es el método de Kinyoun modificado. Los ooquistes esféricos miden de 4 pm a 6 pm de diámetro y cuando se tiñen de este modo se tornan a un fucsia profundo, aunque hay algunas irregularidades en la intensidad de la tinción y puede variar el porcentaje de los quistes que se tiñen. Se debe usar un control positivo en cada preparación. Son especialmente buenos los reactivos de inmunofluorescencia y de EIA, con alta sensibilidad y especificidad (Arrowood. 1989; Murray. 1999; Rosenblatt, 1993; Rusnack, 1989), para los laboratorios donde es poco habitual el hallazgo de Cryptosporidium y donde hay dificultad para la interpretación de las tinciones ácido resistentes. La necesidad de examinar heces para Cryptosporidium depende de la población a cubrir, de los objetivos, de los intereses y de la habilidad del personal del laboratorio. Algunos laboratorios realizan exámenes para Cryptosporidium sólo si se pide específicamente y otros examinan todas las muestras de los inmunosuprimidos. Cyclospora cayetanensis. Cyclospora cayetanensis es un parásito coccidio de reciente descripción responsable de enfermedad diarreica en inmunocompetentes e inmunosuprimidos (Ortega, 1994: Murray. 1999). Se ha deteclado en pacientes de diferentes países, incluido Estados Unidos, y fue inicialmente descrito como un alga verde-azulada, similar a un cuerpo parecido a una cianobacteria, o como un coccidio (Ortega. 1993). La infección produce un cuadro seudogripal, con náuseas, vómitos, pérdida de peso y diarrea acuosa explosiva que dura de una a tres semanas. Los ooquistes no esporulados son esferas no retráctiles de 8 pm a 10 pm que contienen un acumulo de glóbulos refráctiles englobados dentro de una membrana cuando son vistos al microscopio de luz óptica. Se requieren de una a dos semanas para su esporulación, después los ooquistes maduros contienen dos esporoquistes, cada uno con dos esporozoitos. En las tinciones de tricromo los ooquistes aparecen como objetos claros, redondos y algo arrugados. Los ooquistes autofluorecen desde un verde brillante a un azul intenso bajo la epifluorescencia ultravioleta y las técnicas de tinción con colorante ácido resistente modificado o auramina-O. Se deben diferenciar de los ooquistes de Cryptosporidium, que se tiñen de igual forma pero son más pequeños (de 4 pm a 6 pm) (Lámina 55-9E).

Microsporidios Los microsporidios son unos parásitos protozoos lormadores de esporas, intracelulares estrictos, del filo Microspore que infectan a variedad de animales, incluidos los humanos (Franzen. 1999: Shadduck. 1989). Hay importantes patógenos en los huéspedes inmunosuprimidos, especialmente en aquellos con sida, siendo responsable en ellos de un gran porcentaje de diarreas inexplicables por otra causa (más del 30% en algunos estudios) (Curry, 1993). Enterocytozoon bieneusiy Encephalitozoon intestinalis, las dos especies más frecuentemente implicadas en la infección intestinal humana, pueden producir diarrea y pérdida de peso en los pacientes con sida, similares a las causadas por Cryptosporidium. E. intestinalis también puede producir enfermedad diseminada (Cali, 1993; Willson, 1995). Los organismos se multiplican mtracelularmente (merogonia) y forman esporas resistentes (esporogonia) que rompen ocasionalmente la célula

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

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Figura 55-7. Tamaños relalivos de los huevos de helmintos. (Del CDC. Rama de Entrenamiento Parasitológico, Atlanta. GA.)

huésped e infectan las células adyacentes o se eliminan al exterior. La esporas contienen un túbulo enrollado que se refuerza por el apropiado estimulo ambiental y penetra la membrana de las células receptoras. El esporoplasma del parásito se inyecta a través del túbulo al citoplasma de la célula huésped, donde se multiplica. Los reservónos no se han identificado. A veces ha habido pacientes que han sido infectados por otros géneros de microsporidios, incluidos Encephalitozoon (hepatitis, infección ocular, enfermedad del sistema nervioso central). Nosema (infección diseminada) y Pleistophora (miosiüs) (Curry. 1993: Shadduck. 1989). entre otras (Franzen. 1999).

hasta cerca de 10 m de longitud, y para los huevos de 25 pm a 150 pm (Fig. 55-7). Es importante una comprensión de los ciclos vitales de los helmintos y de su distribución geográfica para el conocimiento de las fases parasitarias que pueden encontrarse ante una sospecha, qué órganos o tejidos pueden afectarse y cuándo se puede esperar que aparezcan los diferentes estadios tras la exposición. Aunque el diagnóstico suele depender del hallazgo e identificación de un estadio del desarrollo (huevo, larva o adulto), algunas infecciones se puede diagnosticar principalmente por la clínica o los datos serológicos, o ambos.

Hasta hace poco, el diagnóstico requería el examen de los tejidos al microscopio de luz óptica (Lámina 55-9Fy G) y al microscopio electrónico. El desarrollo de una tinción de tricromo modificada para el examen de muestras fecales para esporas ha resultado un importante avance en el diagnóstico (Weber. 1992). Con este método, las pequeñas esporas elípticas (de 1,5 pm a 3 pm) se tiñen de rojo sobre un fondo débilmente verde, y algunas poseen una característica banda cruzada (Lámina 55-9H). También se han descrito modificaciones de este método. Las tinciones fluorocromas, así como la Uvitex 2B y la calcotlúor blanco, parecen ser más sensibles en la detección de esporas y pueden ser útiles en el screening inicial de la muestra (DeGirolami, 1995: Luna, 1995: van Gool, 1993). El pequeño tamaño de las esporas hacen de su detección todo un reto.

Ciertas especies tienen ciclos de desarrollo donde los estadios infecciosos se pueden transmitir directamente de persona a persona (Enterobius y H. nana). En otros (Trichuris. Ascaris y Trichostrogylus) se requiere un periodo extra de maduración en el extenor del huésped antes de que el huevo o la larva sean infecciosos. La ingesta de los estadios infecciosos puede ser accidental por el parásito vector iDipylidium. Hymenolepis). plantas (Fasciolopsis. Fasciola) o tejidos animales (Trichinella, Taenia. Diphyllobolhrium. Clonorchis. Opisthorchis. Paragonimus. Heterophyes. Melagonimus y Nanophyelus). En algunos casos las larvas pueden penetrar directamente la piel (uncinarias. Strongyloides y esquistosomas).

HELMINTOS INTESTINALES Los helmintos intestinales aquí tratados incluyen nematodos (gusanos redondos), cestodos (tenias) y tremátodos (lombrices), que residen como adultos en el tracto de gastrointestinal o en otras localizaciones (hígado, pulmón o sangre) y que producen huevos que salen dei cuerpo humano por vía intestinal. Los tamaños para los helmintos adultos van desde 1 mm

La detección e identificación de los huevos y larvas en heces, orina o esputo requieren una sistemática aproximación y el entrenamiento adecuado del personal. El tamaño de los huevos y de las larvas es una característica especialmente importante, y con frecuencia se requiere el uso de un micrómetro ocular calibrado. Se debe prestar atención a las características externas de los huevos, incluida la forma, el grosor de la pared, la presencia o ausencia de cubierta mamelonada. opérculos, hombros operculares. botón, tapón polar o espinas. También se debe observar el desarrollo de los huevos (embrionados o sin embrionar) la presencia o ausencia de ganchos, que caracterizan a los cestodos. El examinador también necesita conocer la gran variedad de artefactos que se detectan en las heces y que pueden simular huevos o larvas (Tabla 55-4).

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Nematodos Enterobius vermicularis. La infección por Enterobius u oxiuros es la infección helmíntica más frecuente en niños de todos los estratos sociales en EE.UU. Aunque es principalmente típica de los niños, la rápida maduración de los huevos permite que sea fácilmente transmitida de niño a niño y a adultos tanto en familias como en instituciones. Los gusanos machos o hembras viven principalmente en el ciego y en las áreas adyacentes. Las hembras miden más de 13 mm y tienen un extremo posterior puntiagudo que da pie a su nombre, oxiuro. Ambos sexos tienen prominentes alas laterales que se ven en una sección axial y un bulbo esofágico prominente (Lámina 55-1OA a C). Aunque los machos rara vez son vistos, las hembras se pueden encontrar en la superficie de las heces o en la piel perianal, especialmente por la noche, donde deposita sus huevos; éstos son incoloros y ovoidales con un lado aplanado y miden entre 20 pm y 40 pm de ancho y de 50 pm a 60 pm de largo (Lámina 55-106). Se hacen infectivos en horas y Iras ser ingeridos completan el desarrollo hasta adultos grávidos en un mes (período de latencia). Aunque la infección puede ser asintomática. los niños frecuentemente tienen prurito anal, irritabilidad e insomnio. La infección por Enterobius debe ser descartada en todo estudio de enuresis. Los gusanos adultos pueden migrar a zonas inusuales, como la vagina, la trompa de Falopio o la cavidad peritoneal. Su muerte en estas localizaciones puede producir una reacción inflamatoria granulomatosa (Symmers. 1950). La detección de los huevos y. a veces, de los gusanos adultos en la piel perianal se hace mediante la técnica de papel de celofán durante el sueño o a primera hora de la mañana (Ash, 1987; García, 1997). En el examen habitual de las heces sólo se detecta del 5% al 10% de los casos. Se requiere un examen de muestras tomadas en diferentes días para poder detectar los huevos (Sadun, 1956).

un grueso caparazón con estrías radiales y tapones mucosos que son poco llamativos. Ascaris lumbricoides. Este es el nematodo más largo que afecta al tubo digestivo humano y probablemente el gusano intestinal redondo más frecuente, puesto que infecta a aproximadamente 1,3 billones de personas en todo el mundo (Markell, 1999). Afecta principalmente a regiones con pobre higiene y, como el Trichuris, es más común en niños, siendo, a su vez, los más predispuestos a las infecciones graves. Ascaris adulto vive principalmente en el duodeno y en el yeyuno proximal. Las hembras miden más de 35 cm de largo por 6 mm de diámetro. El macho es algo más pequeño y tiene un extremo curvado ventralmente, a diferencia de la hembra (Lámina 55-10F). Tanto los inmaduros como los adultos se pueden identificar por la presencia de tres labios prominentes en su porción anterior. Las hembras producen unos 2.000 huevos al día, que están sin embrionar y requieren de 4 a 6 semanas en un ambiente óptimo para que sean infectivas. Posteriormente, al ingerirlos alcanzan el intestino y las larvas penetran en la mucosa llegando al torrente circulatorio. De ahí son transportados a los pulmones, donde maduran rápidamente en el lecho capilar alveolar y luego pasan al alvéolo. Los mecanismos de aclaramiento mucociliar los arrastran hasta la epiglotis y nuevamente son ingeridos y se hacen adultos en el intestino. Desde que son huevos hasta que alcanzan el estadio adulto pasan aproximadamente dos meses. La clínica de la ascariasis va desde la infección asintomática a la enfermedad grave. El paso de las larvas por los pulmones puede causar una neumonitis por Ascaris o un síndrome de Lóffler, caracterizado por infiltrados pulmonares difusos bilaterales y bronquitis con eosinofília asociada. Este síndrome es infrecuente y habitualmente se produce en individuos previamente expuestos a los antígenos de los Ascaris.

La presencia de escaso número de gusanos en el intestino no suele advertirse, mientras que la infección grave produce diferentes grados de diarrea y dolor abdominal. También puede producirse una obstrucción Trichuris thchiura. La infección por Trichuris es típica de las zonas trointestinal con una masa de gusanos, especialmente en niños. Incluso con picales y subtropicales. Los gusanos adultos se hallan en el intestino y espepoco número de gusanos, hay que estar alerta, ya que tienen facilidad para cialmente en el ciego, pero las infecciones graves se pueden ver en el colon invadir sitios ectópicos, como la vía biliar y el hígado, el apéndice y el y en el recto. Los machos y hembras miden más de 50 mm de longitud y perestómago. La fiebre y el tratamiento pueden favorecer su migración. En las manecen en la mucosa por el extremo anterior, que es fino, mientras que el zonas endémicas con frecuencia se usan antihelmínticos antes del uso de otro extremo, más grueso, cuelga libremente en la luz. La hembra es alargaanestesia en la cirugía. da, mientras que la cola de los machos es enrollada (Lámina 55-10D). TriEl diagnóstico se realiza al visualizar los huevos en las heces o por la churis tiene un ciclo vital en el que los huevos salen con las heces sin detección de un gusano adulto en el vómito o en las heces. Un recuento embrionar y tarda varias semanas, en las adecuadas condiciones de la tiemenor de 20 huevos por extensión (2 mg de heces) indica infección leve, y rra, en madurar a un estadio infectivo. Cuando se digieren huevos embriosi es mayor de 100 huevos, por extensión, indica infección grave. nados, se liberan larvas y maduran en el colon, donde se fijan y viven más Los huevos fértiles de Ascaris pueden ser redondos o ligeramente ovales, de diez años. con una cubierta irregular externa, mamelonada, amarilla-marrón y con un Las infecciones leves suelen ser asintomáticas, pero cuando hay muchos caparazón grueso. Los huevos que pierden su cubierta se llaman decorticaparásitos (más de 300 gusanos) pueden aparecer diarrea o síntomas de dos y pueden asemejarse a los de las uncinarias. Se eliminan sin embrionar disentería junto con deshidratacíón y anemia (Beaver, 1984; Strickland, 1999). y miden aproximadamente de 55 pm a 75 pm de largo por 35 pm a 50 pm de Una posible complicación en niños con infecciones graves es el prolapso recancho (Lámina 55-10G y H). Las hembras pueden producir huevos sin fertilital (Cooper, 1988). zar, que son más largos y más alargados (más de 90 pm de longitud) y tienen El diagnóstico se hace al hallar los huevos en las muestras fecales o una cubierta más fina y con mamelones irregulares. Estos huevos están llecon técnicas de conservación. Los huevos son como barriles, con unos nos de gotas de grasa irregulares. tapones refráctiles en ambos extremos, y suelen medir de 50 pm a 55 pm Trichostrongylus spp. La enfermedad humana causada por Trichosde largo por 22 pm a 24 pm de ancho (Lámina 55-10E). A veces, los trongylus spp. representa una infección zoonótica, ya que infecta principalhumanos se pueden infectar por el gusano del perro, T. vulpis, que posee mente a herbívoros como la oveja, la vaca o las cabras. Hay distintas espeunos huevos más grandes y anchos que los de Trichuris trichiura. A veces cies que pueden infectar a humanos como, T. colubriformis. T. orientalis. T. pueden ser necesarias técnicas de cuantificación de los huevos para valoaxei y T. brevis, que se encuentran en muchas partes del mundo. Los gusarar la intensidad de la infección, la eficacia del tratamiento y la tasa de nos adultos habitan en el intestino y producen huevos que maduran en el reinfección. exterior. Las larvas salen y se colocan entre la tierra y la vegetación, donde pueden ser ingeridos por sus huéspedes definitivos. A diferencia de las unciCapillaria philippinensis. Este parásito, que normalmente se narias. no invaden la piel directamente ni poseen una fase migratoria por los encuentra en pájaros que se alimentan de peces, afecta a humanos que pulmones. Las infecciones suelen ser leves y asintomáticas, pero las graves comen pescado crudo y que contiene larvas. Aunque se describió en pueden dar diarrea y dolor abdominal, habitualmente con eosinofília. Los huepersonas de Filipinas, y luego en Tailandia, a veces se ven casos en vos son semejantes a los de las uncinarias pero más largos y estrechos, de otras partes de Asia. Oriente Medio y Sudamérica (Cross, 1992). Puede 78 pm a 98 pm por 40 pm a 50 pm y ligeramente ahusados en un extremo. producir diarrea crónica y los infectados pueden eliminar huevos, larvas y gusanos adultos en las heces. Los huevos son similares a los de TriUncinarias. Las uncinarias, que están entre los helmintos que con más churis, aunque miden de 36 pm a 45 pm de largo y 21 pm de ancho, con frecuencia afectan a los humanos, se dan en regiones tropicales y subtropi-

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secundaria. Por cada adulto de A. duodenale se pueden perder entre 0.15 I y 0.25 mi de sangre al día. comparado con los 0,03 mi de cada N. americanus. El crecimiento del niño puede verse afectado con la infección crónica. La pérdida de sangre y el número de uncinarias se correlacionan con el numero de huevos por gramo de heces, lo que puede a ayudar a determinar cuándo empezar el tratamiento en pacientes en áreas endémicas (Layrisse, 1964a, 1964b). El diagnóstico se realiza por el hallazgo de huevos de cubierta fina en las heces. Éstos son parcialmente embrionados cuando se eliminan y miden de 58 um a 76 pm de longitud por 36 pm a 40 pm de ancho (Lámina 55-11/4). Los huevos embrionados o de larvas rabdiformes libres pueden encontrarse en muestras sin conservar que no se examinan en su momento. Las uncinarias rabdiformes pueden distinguirse de las de Strongyloides slercolans. ya que las primeras tienen una cámara bucal más grande y un primordio genital que no llama la atención (Fig. 55-8). La maduración de las larvas tiene como consecuencia la aparición de filarías infectivas, que tienen un extremo puntiagudo y un esófago que mide aproximadamente un cuarto de su longitud. Los huevos de uncinarias se deben diferenciar de los de Trichostrongylus spp. (que son más largos y más picudos) y de los de los nematodos de las plantas, especialmente Heterodera spp. (que son más largos, con el extremo romo, que pueden ser asimétricos) (Lámina 55-116). Aunque los adultos se pueden diferenciar según las partes de la boca y la bolsa copulatoria de los machos, los huevos de las uncinarias humanas son indistinguibles. En el examen directo, un recuento de menos de cinco huevos por portaobjetos denota infección leve, que raramente puede producir anemia, mientras que más de 25 indica infección grave y que fácilmente puede asociarse a síntomas. Figura 55-8. Larvas de uncinarias y de Strongyloides slercolans A. Larva rabdiloiStrongyloides stercolaris. La infección por Strongyloides se da en de de S. slercolans en heces humanas. Obsérvese el corto tamaño de la cavidad muchas zonas de los trópicos y subtrópicos, pero la infección también se bucal y el gran primordio genital (GP). 6, Larva rabditoide de uncinarias vista en las produce en zonas templadas y que históricamente fueron áreas endémicas heces dejadas 24 horas a temperatura ambiente. La cavidad bucal es más larga y del sureste de los Estados Unidos. Las hembras adultas miden de 2 mm a el primordio es más corto 3 mm y viven unidas a la mucosa del duodeno, donde se reproducen por padenogénesis (Lámina 55-11C), Los machos no se dan en los vertebrados. Los huevos se abren en el intestino, liberando la lase inicial o larvas rabditoides que salen en las heces (los huevos casi nunca se hallan). En este ciclo directo las larvas rabditoides se transforman en diarias infectivas de tercer estadio en el suelo. Estas larvas infectivas penetran con facilidad la piel de los individuos y migran a los pulmones por vía circulatoria, y de ahí al árbol bronquial, siendo nuevamente deglutidas. Es entonces cuando se completa el desarrollo a estadio adulto. Bajo unas condiciones de suelo adecuadas con gran humedad, se puede dar un ciclo indirecto transitorio cales y en algunas zonas templadas. Necaloramericanus se halla en EE.UU. en el que las nuevas larvas evolucionan a una generación de vida libre y en otras partes del mundo, superponiéndose su distribución con la de consistente en machos y hembras reproductivas. Los huevos asi formados Ancylostoma duodenale. que no se da en EE.UU. desarrollan larvas filariformes que infectan de nuevo a los humanos. Una Las hembras adultas miden más de 12 mm y los machos un poco metercera variante del ciclo de vida de Strongyloides consiste en autoinfecnos. Los machos se diferencian por la bolsa copulatoria con forma de abación. en la que la maduración del estadio filariforme se completa en el tracnico en su extremo posterior. En el extremo anterior tienen una cápsula to intestinal, con la consiguiente reinvasión de la mucosa intestinal o de la bucal que contiene dientes o láminas cortantes. Ambos sexos se fijan a la piel perianal. mucosa intestinal, donde pueden vivir más de dieciocho años (Beaver, 1988). Los huevos se eliminan por las heces y se desarrollan rápidamente según las condiciones. Las larvas rabdiformes se liberan y se hacen infectivas en su estadio de filarías en unos siete dias. Cuando contactan con el huésped apropiado, las larvas penetran la piel y posteriormente acceden a la circulación llegando a los pulmones, desde donde suben por el árbol bronquial hasta ser nuevamente deglutidas. Cuando maduran en el intestino, comienzan a poner huevos. Aunque poseen ciclos de vida similares, Ancylostoma puede madurar directamente en el intestino si se ingiere la larva infectiva. Las uncinarias pueden causar patología cutánea en el sitio de entrada de la larva. Esto se caracteriza por inflamación, eritema y ampollas con gran picor. Su paso por el pulmón puede causar síndrome de Lóffler, como se describió para Ascaris. Dependiendo de la carga de gusanos, la infección intestinal puede dar gastroenteritis con dolor abdominal, diarrea y nauseas. Sin embargo, las uncinarias son más conocidas por su capacidad para causar pérdida crónica de sangre con anemia ferropénica

La clínica es variable y depende de la cepa adquirida (Genta, 1989). La migración de las larvas de tilarias puede causar irritación, eritema y prurito en el punto de entrada, mientras que una emigración tardía por los pulmones puede producir síndrome de Lóffler (Purtilo. 1974). La clínica intestinal se asocia a la intensidad de la infección, pudiéndose producir síntomas de ulcera péptica, dolor abdominal y diarrea. Se han descrito una infección crónica con un síndrome de malabsorcion. La capacidad del parásito para autoinfectar puede perpetuar la infección durante décadas, como se observó en tropas aliadas que estuvieron prisioneras en la guerra del sudeste de Asia durante la Segunda Guerra Mundial (Gilí, 1979). Por otra parte, en pacientes sanos, la autoinfección puede causar larva currens (lesiones urticariformes lineales). En pacientes inmunosuprimidos, alcohólicos o desnutridos la autoinfección puede acabar en una hiperinfección con riesgo vital por una reproducción rápida del parásito (Genta. 1992; Maaen, 1987). A veces, una forma de presentación de la hiperinfección es una neumonitis grave, seguida de diarrea, enteritis y septicemia. En los pacientes de las áreas endémicas se

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

debe descartar Strongyloides antes de terapias inmunosupresoras (Stickland. 1999). El diagnóstico se hace por el hallazgo e identificación de las típicas larvas rabdiformes en las heces, aunque el examen O/P no siempre logra revelarlas (Lámina 55-110) (Genta. 1989; Pelletier, 1988). Las larvas rabdiformes de Strongyloides se deben diferenciar de las de las uncinarias. y se caracterizan por una cavidad bucal corta y un primordio genital prominente (Fig. 55-8). Las larvas filariformes de Strongyloides tienen una cola con una muesca y un esófago que mide aproximadamente la mitad de su cuerpo. Ambos estadios larvales pueden verse con lacilidad en muestras frescas con bajo aumento. Si se detectan larvas filariformes infectivas en una muestra reciente, es diagnóstico de superinfección (Eveland. 1975). El examen del aspirado duodenal o de las muestras del test de la cuerda puede ser útil en las sospechas con un examen de ordinario negativo. El método de concentración del embudo de Baermann o una de las técnicas de coprocultivos (véase previamente en Métodos de laboratorio) pueden demostrar también la infección (Ash, 1987; García, 1999; Genta, 1989). Las larvas pueden hallarse en el espulo o en otras muestras pulmonares, especialmente en los síndromes de hiperinfección. Los test serológicos son útiles cuando se sospecha la infección, pero no se logra demostrar por otros métodos. El EIA y otros test poseen buena sensibilidad y especificidad aunque pueden existir reacciones cruzadas con las filarías y otras infecciones por nematodos. Estos test no suelen distinguir entre infección pasada y actual, pero son útiles para ver la respuesta al tratamiento (Wilson, 1995). Anisakiasis. Véase más adelante en Helmintos tisulares.

Cestodos Los cestodos o gusanos planos son platelmintos similares a cintas que viven en el tracto intestinal de los vertebrados como adultos, y en los tejidos o cavidades corporales de diferentes huéspedes intermediarios, como larvas. Se unen a la mucosa intestinal por un escólex. o un órgano de sujeción, en el extremo anterior, que puede tener ventosa, surcos (botrios) o un róstelo con garfios según las especies. El cuerpo del gusano, o estróbilo, se compone de una región cervical de crecimiento activo y una serie de proglótides que se desarrollan secuencialmente a lo largo de los estadios inmaduro, maduro y, finalmente, grávido en el extremo posterior. Cada proglótide posee tanto gónadas femeninas como masculinas, y está capacitada para producir huevos fértiles. Los huevos de la mayoría de los cestodos son infecciosos (excepto los de Diphyllobothrium) y pueden diferenciarse fácilmente de los de otros helmintos por la existencia de un embrión con seis ganchos. Según las especies, los huevos se eliminan con las heces o se liberan como proglótides. No es infrecuente para algunas especies con gran longitud de estróbilos que éstas se eliminen intactas o que las proglótides migren activamente por el ano. Las especies largas de Taenia y Diphyllobothrium pueden llegar a medir más de 762 cm y vivir unos 20 años.

Las larvas de cestodos se hacen infectivas tanto en los cuerpos de los huéspedes vertebrados como de los invertebrados, según las especies, y completan su ciclo vital cuando son digeridos por un huésped definitivo. Las larvas de muchas especies pueden infectar a humanos, produciendo cisticercosis. hidatidosis. esparganosis y cenurosis. Estos cuadros se explican más adelante bajo el epígrafe de Helmintos tisulares Taenia saginata. Los humanos son los únicos huéspedes definitivos de Taenia saginata, el gusano plano de la vaca. Aunque su distribución es mundial, son especialmente comunes en Oriente Medio, África. Europa. Asia y América latina. En EE.UU. es esporádico. Los cisticercos larvales (Cysticercus bovis) se desarrollan en los tejidos del ganado que pasta en tierras contaminadas con desechos humanos. Cuando los humanos comen carne de vaca cruda o poco hecha, los cisticercos se transforman en un adulto fértil dentro del intestino en un plazo de dos a tres meses. Los síntomas son infrecuentes, pero pueden incluir malestar abdominal y diarrea. A diferencia de 7! solium. los huevos de I saginata no son infectivos para los hombres y su ingesta no provoca cisticercosis. El diagnóstico se realiza al encontrar los huevos en las heces con técnicas directas o de concentración, o en los pliegues perianales mediante la técnica de papel celofán. Los huevos son esféricos y miden de 31 pm a 43 pm de diámetro (Lámina 55-12A). La cubierta es gruesa y radialmente estriada, con embriones con seis garfios. Los gusanos de la especie Taenia son indistinguibles y deben informarse únicamente como huevos de Taenia. La identificación de las especies se debe hacer recuperando las proglótides o, a veces, los escólex. Las proglótides tienen una característica protuberancia lateral conocida como poro genital. La inyección de tinta china por dicho poro usando una aguja fina puede lograr definir el útero. El útero grávido de 7aen/'a saginata tiene de 15 a 20 corchetes laterales, mientras que el de T. solium tiene de 7 a 13 (Fig. 55-9: Lámina 55-126). Las proglótides también pueden ser aclaradas por la noche en glicerol o teñidas con carmín o hematoxilina mediante las técnicas descritas (Ash. 1987). Si se aisla, el escólex de T. saginata se puede identificar por la presencia de cuatro ventosas y la ausencia de garfios en la corona o róstelo. Taenia solium. Taenia solium. el gusano plano del cerdo, es más frecuente en Europa, especialmente en Europa del este, América latina, China, Pakistán y la India. Ocasionalmente puede verse en los Estados Unidos, principalmente en inmigrantes. La infección con el gusano adulto se adquiere por la ingesta de cerdo poco hecho o crudo que contiene cisticercos (C. cellulosae). Cuando hay síntomas, éstos son idénticos a los de la infección por T. saginata. Un dato importante es que la ingesta de huevos de T. solium, bien a partir de un gusano adulto o bien por comida contaminada, puede acabar en cisticercosis (Schantz, 1992). Se pueden encontrar más detalles en Helmintos tisulares. Los procedimientos para el diagnóstico de infección intestinal por T. solium son los mismos que los usados para T. saginata, aunque son aparentes ciertas diferencias morfológicas. En el escólex de T. solium existen

Figura 55-9. Proglótides grávidas de distintos gusanos planos humanos. 1, Taenia saginata. 2, Taenia solium. 3. Dipylidium caninum. 4, Diphyllobothrium latum. 5. Hymenolepis spp.

CAPITULO 55

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

cuatro ventosas y, a diferencia de T. saginata. el róstelo tiene dos filas de garfios. Las proglótides grávidas tienen de 7 a 13 corchetes uterinos laterales (Fig. 55-9). Hymenolepis nana. H. nana, conocida como el gusano plano enano, tiene una distribución mundial y es la especie de cestodos más frecuentemente hallada en EE.UU. Es un parásito común en ratones y el más pequeño que infecta a los humanos, midiendo hasta 4 cm de largo. El escólex tiene un róstelo armado, y las proglótides tienen dos polos genitales localizados en el mismo lado del estróbilo (Fig. 55-9; Lámina 55-12F). El ciclo vital puede ser tanto directo, a través de la ingesta de los huevos, como indirecto, a través de la ingesta de huéspedes intermediarios (habitualmente por el escarabajo del grano), que contienen larvas cisticercoides. En primera instancia, los huevos se pueden pasar directamente de persona a persona, habitualmente entre niños, o ser ingeridos en la alimentación, especialmente productos de grano contaminados con excrementos de roedores. Los huevos se anclan en el intestino y el embrión penetra la mucosa, en donde pasa la larva cisticercoide. Posteriormente emergen y se vuelven a anclar en la pared intestinal, donde completan su desarrollo a adultos en dos a tres semanas. La ingesta de escarabajos con lanzas es mucho menos (recuente. La autoinfección interna puede producirse en algunos individuos en los que los huevos se anclan rápidamente tras ser puestos por el adulto e invaden rápidamente la pared intestinal sin abandonar el cuerpo. Tal mecanismo es el responsable de los casos esporádicos de infecciones masivas. La infección sintomática, caracterizada por dolor abdominal, diarrea, anorexia e irritabilidad, se da en pacientes con gran número de gusanos. El diagnóstico se hace por el aislamiento en las heces de los huevos ovales de pared fina e incoloros, que miden de 30 um a 47 pm de diámetro (Lámina 55-12D). Contienen un embrión con seis garfios (oncosfera) centralmente localizados separados de la pared por un espacio claro. El embrión posee dos engrasamientos polares de los que surgen finos filamentos que se extienden en el espacio claro hasta alcanzar la pared. A veces se pueden detectar estróbilos intactos si se examinan las heces detenidamente. Hymenolepis diminuta. El gusano plano de la vaca. H. diminuta, tiene una distribución cosmopolita y. a veces, infecta a los humanos. La infección, sin embargo, es infrecuente, ya que necesita un huésped artrópodo intermediario en el que las larvas cisticercoideas se desarrollen. La infección humana suele producirse por ingesta accidental de escarabajos infectados, que contaminan los productos de grano o cereales. Los gusanos adultos se desarrollan en el intestino, donde pueden crecer hasta 60 cm. Al igual que los de H. nana, las proglótides tienen poros genitales en un único lado, pero se diferencian de estas especies en que el escólex carece de róstelo armado. Las infecciones suelen ser asintomáticas debido al pequeño número de gusanos que suelen infectar a una persona, aunque se han descrito síntomas intestinales. El diagnóstico se obtiene por el hallazgo en las heces de huevos de pared gruesa, ligeramente ovoides, de color amarillo-marrón, que miden de 70 pm a 85 pm por 60 pm a 80 pm (Lámina 55-12E). Los huevos son los que más fácilmente se confunden con los de H. nana pero se diferencian porque no poseen filamentos polares. Diphyllobothrium spp. Los humanos se pueden infectar por una de las variadas especies de gusanos planos del pescado llamado Diphyllobothrium. que suelen infectar a mamíferos que se alimentan de peces y. posiblemente, a pájaros (Connor, 1997; Curtís, 1991). Estos parásitos se dan en las zonas templadas, especialmente en el norte de Europa, Escandinavia, la antigua URSS y Japón, La infección también se produce en Canadá y en los estados centrales del norte de la costa pacifica y en Alaska. Aunque Diphyllobothrium latum es la especie conocida que con más frecuencia infecta a humanos, su diferenciación no se puede basar en la morfología de los huevos. El parásito habita en el intestino, donde puede llegar a medir 10 m y persistir durante años. Los huevos se eliminan por las heces sin embrionar y deben alcanzar un arroyo o un lago para desarrollarse. En las siguientes semanas surge una forma de larva ciliada, el coracidio de los seis garfios, y

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es ingerido por un tipo de zooplancton. El coracidio se desarrollará en una larva procercoide. que es infectiva para el segundo huésped intermediario, un pez. En éste, el procercoide migra a los tejidos y se transforma en larva de pleurocercoide. Los pleurocercoides pueden escalar la cadena alimenticia y afectar a peces más grandes. Los humanos lo adquieren a través de la ingesta de pescado poco hecho o crudo que ha pasado al menos parte de su vida en agua dulce. Los gusanos adultos maduran y se inician en la producción de huevos en un mes. La infección puede ser asintomática. con la eliminación de trozos de estróbilos como manifestación inicial. En otros, puede presentarse un grado variable de molestias abdominales y diarrea. Raras veces puede producirse una obstrucción intestinal. En las áreas endémicas del norte de Europa, un pequeño porcentaje de pacientes desarrolla un déficit de vitamina B,, con anemia megaloblástica. El diagnóstico se hace al hallar los típicos huevos marrones, ovalados y operculados en las heces mediante las técnicas habituales. Éstos miden de 58 pm a 76 pm por 40 pm a 51 pm y, además del opérculo, poseen una proyección abotonada pequeña y redondeada en el extremo (Lámina 55-12F). La presencia del opérculo es la única entre los cestodos que infecta a humanos y se debe tener cuidado para no confundir los huevos con los de los tremátodos, especialmente con el Paragommus o Nanophyetus. La identificación del género es posible cuando una porción de estróbilo o un gusano intacto es eliminado. El escólex es alargado y posee un par de surcos longitudinales conocidos como botrios, que suplen a las habituales ventosas. Las proglótides grávidas son más anchas que largas y tienen sus poros genitales colocados en mitad de la cara ventral, adyacentes al útero con forma de roseta que se halla en el centro (Fig. 55-9; Lámina 55-12G). Dipylidium caninum. D. caninum es un gusano liso frecuente de perros y gatos en la mayor parte del mundo y no es raro que afecte a humanos, especialmente a niños. En su habitual ciclo de vida, los huevos se ingieren por las larvas de pulga, que infestan las áreas frecuentadas por perros o gatos. Las larvas cisticercoideas persisten hasta que la pulga pasa al estado adulto. La ingestión accidental de pulgas adultas que contienen el cisticercoide produce la infección. Los niños tienen el mayor riesgo de infección, ya que están en gran contacto con animales. Los gusanos maduran en el intestino y crecen hasta 70 cm de largo. La infección tiene pocos síntomas, generalmente causados por las proglótides que se mueven activamente. La detección se basa en el hallazgo de los huevos típicos, paquetes de huevos o proglótides en las heces. Los huevos son esféricos y contienen un embrión con seis garfios. Miden de 24 pm a 40 pm de diámetro y aparecen aislados o formando paquetes (Lámina 55-12H). El escólex es alargado, con cuatro ventosas y un róstelo retráctil y pequeño. Las proglótides tienen forma de barril y dos poros genitales, uno en cada lado, lo que le da el nombre común de gusano plano de doble poro (Fig. 55-9).

Tremátodos Los tremátodos, o lombrices, son helmintos dorso-ventralmente aplanados (platelmintos) que incluyen tanto formas hermafroditas (lombrices intestinales, hepáticas y pulmonares) como otras con diferenciación de sexos (lombrices sanguíneas o esquislosomas). Todas las especies de los humanos se caracterizan por una ventosa oral, por la que se abre al tracto digestivo, y otra ventosa para su fijación. Los adultos miden desde 1 mm (Metagonimus) a 70 mm (Fasciola gigantica). Los huevos llegan al exterior eliminados por las heces, el esputo o la orina, según las especies. Los hermafroditas producen huevos operculados que no están embrionados (Clonorchis y Opisthorchis son excepciones). Los huevos de esquistosomas no son operculados y cada uno contiene una larva madura cuando se elimina. La larva trematodo. o miracidia. es ciliada y capaz de penetrar los tejidos de un molusco. Cada especie de trematodo usa algún tipo de caracol como primer huésped intermediario. Un proceso de multiplicación asexual compleja dentro de caracoles produce un gran número de larvas que nadan libremente y se llaman cercarías.

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SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MEDICA

Las cercarías de esquistosomas son capaces de penetrar la piel humana directamente, produciendo esquistosomiasis. Las lombrices hermafroditas enquistan en la vegetación acuática o invaden los tejidos de un segundo huésped, como un pez o un cangrejo, según las especies. La ingesta de estas larvas enquistadas, llamadas metacercarias, produce infección humana. La infección se produce en muchas zonas tropicales y subtropicales. Su presencia depende de la ausencia de tratamiento de las aguas residuales, de la disponibilidad de los huéspedes intermediarios apropiados y, en el caso de las especies hermafroditas. de las costumbres dietéticas asociadas a la ingesta de metacercarias. Alguna de estas enfermedades, especialmente la esquistosomiasis, se están extendiendo debido al incremento del uso de irrigaciones en las áreas endémicas. La clínica varía según el número de gusanos parasitarios, los órganos afectados y la respuesta del huésped. Muchas infecciones son asintomáticas. El diagnóstico se hace identificando los huevos típicos en heces, esputo, orina y, a veces, tejidos. Los métodos directos y los de concentración con lormalma-etil acético son más útiles para el aislamiento de estos huevos, mientras que los métodos de flotación con sulfato de cinc son menos satisfactorios. Fasciolopsis buski. Es el trematodo intestinal más largo que infecta a humanos, variando de 20 mm a 75 mm de largo y de 8 mm a 20 mm de ancho. Se da en China, sudeste de Asia y la India, hallándose con frecuencia en cerdos como reservorio natural. Se adquiere por la ingesta de metacercarias de las plantas acuáticas, como el castaño de aguas. Los gusanos se unen a la pared del duodeno y del yeyuno, donde maduran a adultos en tres meses. Los síntomas incluyen diarrea, dolor epigástrico y náuseas, si hubiese suficientes gusanos como para producir ulceración de la mucosa. Puede existir eosinolilia incluso en los asintomáticos. El diagnóstico se hace al ver los huevos largos (de 130 pm a 140 um por 80 pm a 85 pm), marrones, ovales y de pared delgada (Lámina 55-13/4). El opérculo puede pasar desapercibido y los huevos ser eliminados sin embrionar. La diferencia con los huevos de Fasciola no suele ser posible, aunque las infecciones pueden diferenciarse basándose en la historia geográfica y en la clínica. Los huevos de tremátodos equinostomas. cuando afectan a humanos, son similares pero más pequeños (Beaver. 1984). Heterophyes y Metagonimus. Estos dos géneros incluyen un número de especies de minúsculos gusanos intestinales (de 1 mm a 3 mm de longitud) que infecta a humanos. Heterophyes heterophyes y Metagonimus yokogawai son parásitos comunes en Asia, pero, (unto con otras especies, se encuentran también en otras partes del mundo. La infección se adquiere por la ingesta de metacercarias en pescado de agua dulce poco hecho. Aunque son de poca importancia médica, pueden producir diarrea y dolor abdominal. La infección es autolimitada, ya que los gusanos tienen una vida de tan sólo unos pocos meses. El diagnóstico se realiza por el hallazgo de huevos embrionados y operculados que miden de 20 pm a 30 pm de largo por 15 pm a 27 pm de ancho (Lámina 55-138). La diferenciación de estos huevos de los de Clonorchis y Opisthorchis es difícil, aunque el opérculo es más profundo en Opisthorchis. No obstante, tal distinción puede ser importante por razones médicas. Nanophyetus salmincola. Nanophyetus salmincola es un pequeño gusano intestinal (de 0,8 mm a 1.1 mm) descrito en el este de Siberia y en el noroeste de la costa pacífica de EE.UU. (Eastburn, 1987: Fristche. 1989b). Estos gusanos se adquieren por la ingesta de salmón crudo o poco cocinado o bien ahumado, o por truchas con metacercarias infecciosas. Los sintomas están en función del número de gusanos y puede incluir dolor abdominal, diarrea y, a veces, eosinofilia. Los huevos, de 60 pm a 80 pm por 34 um a 50 pm son ovoidales. operculados y de un color marrón amarillento (Eastburn, 1987). Hay un engrosamiento en el extremo de la pared que lo diferencia de botón visto en los huevos de Diphyllobothrium. Fasciola hepática. Las vacas, las ovejas y las cabras de muchas partes del mundo están infectadas con la lombriz hepática Fasciola hepática y, menos Irecuentemente, con especies de Fasciola giganiica. Los parásitos adultos habitan en el árbol biliar y de|an huevos que se eliminan por las

heces. Las cercarías eliminadas a partir de los caracoles huéspedes se enquistan en la vegetación acuática, donde las metacercarias quedan a merced de los huéspedes herbívoros. Los humanos lo adquieren al comer berros. Una vez ingeridas, las larvas pasan la pared intestinal y migran por el peritoneo hasta el higado. Atraviesan la cápsula hepática y el parénquima, llegando a alojarse en el interior de los conductos biliares, donde la puesta de huevos comienza en aproximadamente dos meses. La migración a través de higado provoca una reacción inflamatoria dolorosa en el parénquima y. posteriormente, en los conductos biliares, pudiendo acabar en fibrosis. Las manifestaciones clínicas incluyen cólico, ictericia obstructiva, dolor abdominal, colelitiasis y eosinolilia. El diagnóstico se realiza al hallar los huevos en las heces. Los huevos operculados. sin embrionar. son de un color marrón amarillento, de 130 pm a 150 um por 63 pm a 90 pm, pudiendo ser difíciles de distinguir de los de Fasciolopsis (Lámina 55-13A). Falsas infecciones, como la producida por la ingesta de higado de vaca u oveja infectados, se diagnostican mediante una buena anamnesis y realizando un seguimiento del examen de las heces para buscar la eliminación de los huevos. Clonorchis sinensis y opisthorchis viverrini. Clonorchis sinensis. la lombriz hepática oriental, y una especie cercana. Opisthorchis viverrini. habitan el sistema biliar de los humanos y de otros piscívoros, incluidos gatos y perros. C. sinensis se da principalmente en China, Taiwan, Corea, Japón y Vietnam, mientras que Opisthorchis viverrini se halla en el sureste de Asia, especialmente en el norte de Tailandia. También se conoce la infección humana por O. lelineus en Europa y por Amphimerus pseudolelineus en Ecuador (la misma que O. guayaquilensis). Todos estos parásitos se adquieren al ingerir las metacercarias en pescado crudo o poco cocinado. Las lanzas emigran a la via biliar, donde viven más de 20 años y crecen hasta 25 mm (Lámina 55-13C). Producen huevos que se eliminan en la bilis y posteriormente en las heces. Con frecuencia las infecciones son asintomáticas, aunque gran número de lombrices e infecciones de repetición pueden producir inflamación biliar y posterior hiperplasia fibrosa y cirrosis hepática. Se ha descrito el desarrollo de un colangiocarcinoma en las infecciones mantenidas. El diagnóstico se realiza al aislar los huevos operculados en las heces. Estos huevos son pequeños, marrones y embrionados (Lámina 55-13D) Los huevos de Clonorchis no pueden ser diferenciados fácilmente de los de Opisthorchis. Ambos miden de 25 pm a 35 um por 12 pm a 20 pm y tienen un opérculo prominente y un pequeño botón en el extremo. Éstos son difíciles de diferenciar de los del grupo de Heterophyes'Metagommus. aunque estos últimos carecen de opérculo y del botón del extremo. Cuando no se logra una identificación, en el laboratorio deberá reflejarse (p. ej.. catalogándolos como huevos de Clonorchis/Opisthorchis/Heterophyes/ Metagonimus). Paragonimus spp. Muchas especies de Paragonimus pueden parasitär los pulmones de gatos, perros y otros carnívoros, incluidos los hombres. P westermani es problemática en muchas áreas de Asia, mientras que en América del Sur y América Central se han implicado diferentes especies, incluidas P. mexicanus. P. caliensis y P. ecuadoriensis. P. kellicotti se ha implicado en ocasiones en casos en Norteamérica, y se han descrito otras especies en África (Mariano, 1986; Pachucki, 1984; Strickland, 1999). Los gusanos adultos miden hasta 12 mm por 6 mm y Irecuentemente se hallan por parejas en el parénquima pulmonar, donde residen en una cápsula librótica causada por el huésped (Lámina 55-13E). La cápsula comunica con los bronquios, pudiendo eliminar los huevos en el espulo o en las heces. Aunque es un caracol el que sirve de primer huésped intermediario, los cangrejos de agua dulce sirven como segundos intermediarios para las metacercarias. La ingesta de crustáceos crudos o marinados puede causar la infección. Las larvas se liberan en el estómago y migran a través de la pared intestinal al peritoneo, alcanzando, a veces, los pulmones a través del diafragma. La maduración tarda aproximadamente de cinco a seis semanas y los gusanos pueden vivir durante años. Los síntomas, cuando existen, se pueden deber a la migración de las larvas a través de los tejidos o ser causados por los adultos asentados en el pulmón. No es infrecuente que los gusanos se desarrollen en zonas ectó-

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

picas como el peritoneo, tejido subcutáneo o el cerebro. La afectación de los pulmones suele asociarse con fiebre, escalofríos y eosinofília. Una vez estabilizado, los síntomas incluyen tos crónica con abundante expectoración y episodios de hemoptisis. La radiografía puede mostrar infiltrados nodulares, calificaciones o infiltrados parcheados. Los huevos que permanecen en los pulmones o en sitios ectópicos pueden producir reacción granulomatosa extensa. El diagnóstico se hace al encontrar los típicos huevos en las heces, en el esputo o en los tejidos. Los huevos de las diferentes especies de Paragonimus no se pueden distinguir fácilmente y se deben deducir según el área de origen. Los huevos, operculados y sin embrionar, miden de 80 pm a 120 pm por 45 pm a 70 pm y poseen una capa externa moderadamente gruesa de color marrón amarillenta (Lámina 55-13F). El opérculo es aplanado y suele sobresalir del resto de la pared por unos prominentes hombros. El extremo operculado está algo endosado pero carece de botón. Los huevos de Paragonimus se pueden diferenciar de los de Diphyllobothrium y Fasciola/Fasciolopsis por el tamaño. Schistosoma spp. La esquistosomiasís, o bilharziasis, está entre las más importantes enfermedades parasitarias del mundo, afectando entre 200 y 300 millones de individuos. Los machos adultos y hembras habitan en las venas mesentéricas o de la vejiga. Las especies más importantes para los humanos son S. imansoni, S. japonicum, S. mekongi. S. intercalatum y S. haematobium. Las otras especies infectantes de humanos son menos frecuentes. Los esquistosomas adultos y hembras son más finos y miden cerca de 26 mm por 0,5 mm. Los machos, que son algo más cortos, se abrazan a la hembra con unos márgenes laterales del cuerpo (el canal ginecóforo) para fecundarla. Cuando se examinan in situ, los esquistosomas son encontrados frecuentemente copulando. En este sitio de asiento producen poca o ninguna respuesta inflamatoria. Los huevos se depositan en las vénulas, donde pueden causar una gran respuesta inflamatoria que resulta en una expulsión de los huevos a la luz intestinal o a la luz de la vejiga. La patogenia está en función del sitio, el número de huevos y la respuesta de los huésped a los antígenos de los huevos. Los huevos están totalmente embrionados cuando se eliminan y listos para eclosionar cuando se depositan en agua dulce. El miracidio penetra en un caracol apropiado, donde sufre una transformación y una extensa división asexual. Tras cuatro semanas, un gran número de cercarías de cola bífida emergen del molusco. Éstas nadan durante horas y penetran fácilmente en la piel del huésped susceptible, incluidos los humanos. Tras la penetración, las cercarías, llamadas ahora esquistosomulas, pasan a la circulación atravesando los pulmones antes de llegar a los vasos mesentéricos-porta. La clínica se produce en primer lugar por la penetración de la cercaría (dermatitis cercarial). por el inicio de la puesta de huevos (esquistosomiasis aguda o fiebre de Katayama) y como una complicación tardía de la proliferación tisular y reparación (esquistosomiasis crónica). Tras la penetración de la cercaría, puede aparecer un exantema papular con prurito en cuestión de horas. Este es un fenómeno de sensibilización producido por una exposición previa a los antígenos de cercaría. La forma más grave de dermatitis se da en individuos que tienen una exposición repetida a esquistosomas de cercarías. La dermatitis por cercarías o picor del nadador se produce en todo el mundo y es una entidad bien conocida en EE.UU. (Hoeffler, 1974). El comienzo de la puesta de huevos por adultos entre las cinco y siete semanas puede producir una esquistosomiasis aguda o fiebre de Katayama, un síndrome similar a la enfermedad del suero que se da en las infecciones primarias graves, especialmente en las del S. japonicum. La respuesta al antígeno es a través de la producción de inmunocomplejos (Boros, 1989). La infección crónica produce puesta continua de huevos, pudiendo permanecer algunos en el cuerpo. Alrededor de esos huevos se producen granulomas en el intestino y en la vejiga y se van sustituyendo por colágeno pudiendo causar fibrosis y cicatrización. Los huevos atrapados en el hígado pueden causar fibrosis con obstrucción del flujo portal. A veces, los huevos se depositan en lugares ectópicos, como la médula espinal, los pulmones o el cerebro.

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El diagnóstico se hace viendo los huevos en las heces u orina por examen directo o métodos de concentración con formalina-etil acético. La concentración con sulfato de cinc no es satisfactoria para detección de los huevos pesados de esquistosomas. Los huevos también pueden detectarse en las biopsías de recto, vejiga y, a veces, del hígado (Lámina 55-14). El uso de métodos de eclosión de huevos puede emplearse a veces para determinar su viabilidad o, menos frecuentemente, para detectar la enfermedad leve. La mezcla de heces con agua destilada se coloca en un frasco cubierto por papel de aluminio para protegerlo de la luz, exponiendo a una luz brillante sólo el cuello o un lateral. Los miracidios, si estuviesen presentes, nadarían hacia la luz y se podrían detectar con una lupa. Los test serológicos pueden ser útiles para el screening en personas que han viajado a zonas endémicas y que. aun teniendo orina o heces negativas, tienen el riesgo de infección, o para monitorízar la respuesta al tratamiento. Aunque no está totalmente disponible, hay laboratorios de referencia y el CDC puede realizarlo. Generalmente, los test serológicos varían según el antígeno empleado y la metodología usada. El CDC usa el test del screening de Falcon. una técnica inmunoabsorbente con enzima fijadora (FAST-ELISA). Aquellos que son positivos en el screening se evaluarán posteriormente por inmunoblot para aumentar la especiticidad (Wilson, 1995). Schistosoma mansoni. S. mansoni se da en África, especialmente en áreas tropicales y en el delta del Nilo, Sudáfrica y Madagascar, Brasil, Venezuela, Surinam y algunas islas del Caribe, incluido Puerto Rico. Los adultos de S. mansoni viven principalmente en la vena porta y en la mesentérica inferior. La puesta de huevos en el intestino produce dolor abdominal y disentería, con abundante aparición de sangre y moco en las heces. En este momento se pueden detectar huevos en las heces. La infección crónica puede acabar produciendo fibrosis hepática e hipertensión portal, según el número de gusanos. Los huevos son más difíciles de encontrar en esta fase. Los huevos, que miden de 116 pm a 180 pm por 45 pm a 58 pm, son ovalados, con una espina lateral larga que sale del huevo cerca del extremo (Lámina 55-14A y S). Si la espina no se viese, el huevo podría estar rotado en el cubreobjetos. En el caso de que la larva sea viable, puede ser evidente el movimiento del miracidio dentro de los huevos en las muestras sin fijar. Se pueden necesitar técnicas de concentración para detectar huevos, ya que los individuos con exposición limitada o con infección crónica pueden eliminar pocos. Schistosoma japonicum. Schistosoma japonicum. que se da en China, sureste de Asia y Filipinas, produce una patología que es similar a la de S. mansoni. pero frecuentemente más grave porque se producen más huevos (aproximadamente diez veces más). Esta enfermedad ha sido erradicada en Japón, aunque aún existen reservónos animales. Los gusanos adultos viven en el territorio de la vena mesentérica superior y los huevos alcanzan fácilmente el hígado, causando fibrosis e hipertensión portal, siendo la complicación más frecuente de la infección crónica. El menor tamaño de los huevos predispone a su diseminación, especialmente al cerebro y la médula espinal. Los huevos suelen ser ovalados, de entre 75 pm y 90 pm por 60 pm a 68 pm, con una espina lateral que pasa desapercibida, por lo que es difícil de demostrar (Lámina 55-14C y D). Schistosoma mekongi. Esta especie se da en reservónos humanos y en animales de países a lo largo del río fvlekong, especialmente Camboya y Laos (Bruce, 1980). Es similar al S. japonicum, pero se diferencia por varias características biológicas y por los huevos más pequeños (de 60 pm a 70 pm por 52 pm a 62 pm), que de otro modo serían indistinguibles de los de S. japonicum. Schistosoma haematobium. La esquistosomiasis urinaria se da en muchas partes de África. Oriente Medio y Madagascar. Los parásitos emigran por vía hemorroidal al plexo venoso de la vejiga, la próstata, el útero y la vagina. Uno de los síntomas más comunes y tempranos es la hematuria, especialmente al final de la micción. La enfermedad crónica puede causar dolor pélvico y cólico vesical con tenesmo vesical. El acumulo de huevos en los tejidos puede producir hipertrofia del urotelio, metaplasia escamosa y fibrosis, que puede progresar a obstrucción y, finalmente, fracaso renal. La

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esquístosomíasís urinaria se ha asociado también a carcinoma escamoso de vejiga (Badawi. 1992). Los huevos se aislan de la orina mediante el examen del sedimento. Éstos son alargados, de 112 pm a 180 iim por 40 pm a 70 pm con una característica espina terminal (Lámina 55-14£). A veces se detectan en las heces o en la biopsia del recto. Schistosoma intercalatum. Esta especie se da en muchas partes de Álrica central y en África occidental y produce esquistosomiasis intestinal. Los huevos tienen una espina terminal similar a la del S. haematobium, pero se dan principalmente en las heces y son más largos (de 140 pm a 240 pm por 50 pm a 85 pm).

HELMINTOS TISULARES Nematodos Filarías Los nematodos filariales son parásitos comunes de los vertebrados transmitidos por artrópodos. Los adultos son largos y finos, midiendo cerca de 100 mm. y es sabido que afectan distintos tejidos, como el subcutáneo, linfáticos, vasos sanguíneos, espacio pleural y peritoneal, corazón y cerebro. Todos producen larvas denominadas microfilarias, que pueden detectarse en la sangre o en la piel, según las especies. Las microfilarias de algunas especies circulan por la sangre con una periodicidad bien definida (tanto diurna como nocturna), mientras que otras no. Las microfilarias siguen su desarrollo sólo en el apropiado artrópodo vector, usualmente un mosquito o una mosca, donde maduran a la fase infectiva. Cada larva es entonces depositada en los tejidos de un huésped definitivo cuando el vector se alimenta de sangre.

do evolucionar a linfedema y fibrosis obstructiva (Lámina 55-15A). La afectación grave de los miembros inferiores y de los genitales produce elefantiasis. En la mayoría de las áreas, las microfilarias circulan por la sangre periférica con una periodicidad nocturna que corresponde con las actividades alimenticias de los vectores habituales (mosquitos Culex. Aedes y Anopheles). La infección del pacífico Sur suele ser sin periodicidad. Los microfilarias están envainadas, aunque esto puede no ser evidente con la tinción de Giemsa. La cola es punteada y no hay núcleos en la punta. El espacio cefálico no es tan largo como ancho y los núcleos de la columna nuclear son diferenciales (Fig. 55-10; Lámina 55-15S). Pueden ser necesarias técnicas de concentración para su aislamiento, ya que las microfilarias suelen estar en pequeño número. Brugia malayi. Esta especie produce una enfermedad similar a la de W. bancrofti. aunque suele ser más moderada y con mayor frecuencia afecta a los linfáticos de los miembros superiores. Se da principalmente en la India, sudeste de Asia, Corea, Filipinas y Japón. La infección humana por especies zoonóticas se encuentran periódicamente en EE.UU. La microfilaria circula por la sangre de un modo periódico. Sus vainas se tiñen bien con Giemsa. La punta tiene un ensanchamiento con dos núcleos solitarios al final de la columna nucleada (llamados núcleos subterminal y terminal). El espacio cefálico puede ser más largo que ancho (Fig. 55-10; Lámina 55-15C). B. timones otra especie que se da en el este del archipiélago indonesio, especialmente en las islas de Timor y Flores. Sus microfilarias son muy similares a las de la B. malayi, aunque algo más largas.

El diagnóstico se hace por el hallazgo de microfilarias en la sangre o en la piel, ya que los estadios adultos son habitualmente secuestrados en los tejidos. El uso del Irotis sanguíneo grueso teñido con Giemsa o hematoxilina es la técnica habitual, aunque suelen requerirse otros procedimientos más sensibles, como un filtro de membrana, la concentración de Knott o análisis por saponificación (García, 1997). Las microfilarias pueden verse moviéndose en el examen directo de la sangre o de los fluidos tisulares. La identificación de las especies es importante debido a su diferente patogenicidad. La característica principal usada para la identificación de microfilarias incluye la presencia o ausencia de vaina, así como sus características de tinción, la morfología de la cola y la distribución de los núcleos celulares en su interior, y el tamaño del espacio cefálico, asi como la apariencia de su columna nuclear. Ya que las microfilarias de Wuchereha y Brugia suelen poseer una periodicidad nocturna, la sangre de los pacientes en los que se sospecha debe recogerse entre las 10 de la tarde y las 2 de la madrugada. Loa loa posee un periodo diurno, por lo que la sangre debe recogerse en torno al mediodía. M. ozzardiy M. Persians carecen de periodicidad. Las microfilarias de M. streptocerca y Onchocerca volvulus están presentes en la piel y se detectan por examen de biopsias. Los test serológicos para el diagnóstico de filarías linfáticas pueden ser útiles en pacientes seleccionados, especialmente en los no nativos de áreas endémicas. Tales métodos son limitados en su capacidad para diferenciar entre exposición pasada o actual y además pueden existir reacciones cruzadas con otras especies de nematodos. Los test de detección de antigenos también pueden ser útiles para la filariasis linfática, pero no suelen estar disponibles (Wilson, 1995). Wuchereria bancrofti. Esta especie, responsable de la filariasis bancroftiana, es la filaría que más frecuentemente infecta a los humanos. Las zonas endémicas son África central. África del Norte, la India, sureste de Asia y ciertas islas del Pacifico Sur, así como partes de Centroamérica y Sudamérica y las Indias occidentales. Los gusanos adultos residen en el sistema linfático, donde producen adenopatias y linfangitis crónica, pudien-

Figura 55-10. Exiremos anterior y posterior de las microfilarias más frecuentemente encontradas en humanos. í, Wuchereria bancrofti. 2. Brugia malayi. 3. Onchocerca volvulus. 4. Loa loa. 5. Mansonetla perstans. 6. Mansonella ozzardi.

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

Loa loa. Conocido como el gusano del ojo. Loa loa vive en el tejido subcutáneo. Los nematodos están migrando continuamente produciendo una reacción inflamatoria local transitoria (de 2 a 3 dias) conocida como Calabar. La aparición ocasional en la conjuntiva permite su extirpación. La loasis se da principalmente en África occidental y central, donde las moscas ciervo del género Chrysops sirven como vector. El parásito provoca una gran eosinofilia y se le ha visto a veces en EE.UU. en gente que viajó a África. La microfilaria, que circula por la sangre con una periodicidad diurna, está envainada, pero esta vaina no es visible con Giemsa. Los núcleos de la cola llegan hasta la punta redondeada. La columna nuclear es distintiva y el espacio cefálico es más corlo (Fig. 55-10: Lámina 55-150). Onchocerca volvulus. La infección por Onchocerca es una de las primeras causas de ceguera en las zonas endémicas, como África central. América central (México y Guatemala) y el norte de Sudaménca. Los vectores son las moscas negras del género SimuHum. Los gusanos adultos viven en nodulos subcutáneos fibrosos y en el tejido más profundo, pudiendo crecer hasta 40 mm de diámetro (Lámina 55-15f). Los nodulos suelen darse en la mitad superior del cuerpo de las personas infectadas en Centroamérica y en la mitad inferior del cuerpo en las personas afectadas de África. Los gusanos adultos producen microfilarias que emigran por la piel. Las complicaciones son secundarias a dicha migración, causando múltiples formas de dermatitis. Los movimientos de las microfilarias por la superficie del ojo pueden causar queratitis, opacidad corneal y daños en las cámaras del iris causando asi ceguera por infecciones repetidas. El diagnóstico se hace al hallar las típicas microtilarias en los raspados cutáneos o biopsias cutáneas, preferiblemente de la región escapular o de la cresta iliaca. Como alternativa se puede examinar el exudado de la piel cicatricial o el aspirado de los nodulos (Beaver. 1984). Las microfilarias en las preparaciones teñidas pierden tanto la vaina como los núcleos de la cola (Fig. 55-10). Mansonella spp. Hay muchas especies de Mansonella que infecta a los humanos, pero se las considera como mínimamente patógenas. Sin embargo, las microfilarias se deben diferenciar de las auténticas filarias patógenas. M. ozzardi se halla en el centro de América y Sudamérica y en algunas zonas del Caribe. Los parásitos adultos residen en los tejidos subcutáneos. M. perstans se da en áreas de África tropical y. a veces, en Sudamérica. Se cree que los adultos residen principalmente en las cavidades corporales y mesenténcas. Los microfilarias carecen de vaina y circulan por la sangre sin evidencia de periodicidad. La microfilaria de M. ozzardi tiene una cola fina, afilada, sin núcleos, mientras que la cola de M. Persians es ancha y abrupta, con núcleos que llegan hasta la punta (Fig. 55-10; Lámina 55-15F). M. streptocerca, que se halla en África tropical, se puede confundir con O. volvulus, ya que tanto los adultos como las microfilarias se localizan en la piel y en los tejidos subcutáneos. También pueden causar dermatitis. Las microfilarias que se encuentran en las muestras cutáneas carecen de vaina y poseen un pliegue en la cola con núcleos hasta la punta. Todas las especies de Mansonella se transmiten por mosquitos del género Cuhcotdes. Filarias zoonóticas. Ciertos nematodos filanales de los géneros Dirolilaria y Brugia, que habitualmente parasitan a mamíferos salvajes y domésticos, pueden afectar a humanos. Dirofilaria immitis está muy extendida y la infección humana está bien documentada. La larva transmitida por mosquito migra hasta el lado derecho del corazón. Cuando el gusano muere, se transporta hasta una arteriola pulmonar, causando un nodulo granulomatoso que puede verse como una lesión con forma de moneda en la radiografía de tórax. El diagnóstico suele hacerse por histología de dicho nodulo. Otras especies de Dirofilaria como D. tenuis. D. repens y D. ursi suelen producir nodulos subcutáneos. Estos nodulos se han descrito en múltiples sitios del cuerpo, como la cara, la conjuntiva y la mama y se suelen quitar con cirugía. El examen histológico muestra una gran reacción inflamatoria mixta rodeando a un gusano muerto. Los criterios para identificar las filarías zoonóticas en la histología se pueden encontrar en otros textos (Connor, 1997; Ohnel, 1995: Gutiérrez, 2000).

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Otros Dracunculus medinensis. Los gusanos adultos viven en el tejido subcutáneo y se hacen clínicamente evidentes cuando la hembra migra a la superficie cutánea y produce ampollas, habitualmente en los miembros inferiores. Cuando las extremidades se meten en el agua, las ampollas se rompen y liberan múltiples larvas móviles. El zooplanclon ingiere las larvas, que después maduran a estadios infectivos y se transmiten nuevamente a humanos al tragar accidentalmente el zooplancton del agua. Es endémico de áreas de África, Oriente Medio y Asia y puede causar cicatrices cutáneas desfigurantes con riesgo de sobreinfección bacteriana grave posterior. Se han hecho grandes esfuerzos de control en los últimos años para erradicar este parásito (CDC, 1992). El diagnóstico se hace al ver a la hembra en la superficie cutánea y las larvas en el Huido de las ampollas. El gusano puede ser cuidadosamente extraído en varios días, pero procurando no dañarlo. La muerte de un gusano in situ produce gran reacción inflamatoria y posterior sobreinfección bacteriana. Angiostrongylus cantonensis y Angiostrongylus costaricencis. La menmgoencefalitis eosinofílica humana producida por A. cantonensis se produce tanto en epidemias como esporádicamente en áreas del sur del Pacífico, sudeste de Asia y Taiwan. Los parásitos maduros se suelen encontrar en las arterias pulmonares de las ratas. Las larvas migran hasta la traquea, donde se eliminan con las heces. Se transforman en infectivas dentro de babosas o caracoles terrestres y. cuando son comidas por un huésped roedor, emigran por el cerebro antes de madurar en las arterias pulmonares. Los humanos lo adquieren al comer caracoles o cangrejos o camarones crudos, que pueden actuar de huéspedes transportadores, así como vegetales contaminados con moluscos infectados. En los humanos, las larvas de A. cantonensis migran al sistema nervioso central, causando una meningitis con gran eosinofilia en el líquido cefalorraquídeo (Alicata. 1991). El diagnóstico se hace tanto por la clínica como por la anamnesis, aunque la larva se ha aislado ocasionalmente en el liquido cefalorraquídeo (Kubersky, 1979). A. costaricencis se da en América central y Sudamérica (LonaCortez. 1980). El parásito, responsable de la forma intestinal de la angiostrongiliasis. suele residir en las arterias mesentéricas del íleon y del ciego de los roedores. La infección humana se da en esas mismas localizaciones, causando inflamación granulomalosa y abdomen agudo. El diagnóstico se hace por el examen histológico de la pieza quirúrgica y el hallazgo de huevos en los tejidos (Strickland. 1999). Trichinella spiralis. La infección por Trichinella humana se da en todo el mundo, aunque su incidencia en EE.UU. está actualmente descendiendo, con menos de cien casos al año. Los humanos adquieren la infección por la ingesta de carne de cerdo cruda o, a veces, con la carne de oso, que posee larvas infectivas. Los gusanos ingeridos maduran en el intestino y producen nuevas larvas en dos a tres semanas. Durante esta fase aparecen síntomas gastrointestinales que duran varios dias. Posteriormente las larvas pasan a los linfáticos y vénulas, alcanzando así la circulación sistémica. Invade principalmente los músculos esqueléticos, donde sufre el desarrollo y se encapsula. Durante la fase de migración y encapsulación puede aparecer fiebre, dolor muscular, dificultad respiratoria, edema periorbital y eosinofilia. dependiendo de la cantidad inoculada. Tras enquistarse, los síntomas son mínimos. Asi, pueden persistir viables durante años, aunque a veces se calcifican. El diagnóstico se hace con la anamnesis y la clínica, y se confirma mediante la biopsia del músculo esquelético, especialmente del gastrocnemio o del deltoides (Lámina 55-11E y 11F). Los test indirectos incluyen la medición de la creatina fosfocinasa, que suele estar elevada, y la detección de anticuerpos por floculación con bentonita o con EIA. De éstos, el más específico es la creatina fosfocinasa y el EIA es el más sensible (Wilson, 1995). Larva migratoria. La larva migratoria se produce por la migración de larvas de ciertas uncinarias, ascáridos y especies de Strongyloides a través de los tejidos. El síndrome varia según la especie causante, el número de gusanos y los tejidos afectados.

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

La larva migratoria cutánea (CLM), o picor del suelo, se produce por la migración cutánea de uncinarias de perros o gatos del género Ancylostoma, que penetra la piel pero no puede tener el habitual patrón de maduración. Aparecen en la piel tractos serpiginosos, eritematosos y pruriginosos en zonas expuestas al contacto con el suelo. Especial problemática surge en los climas húmedos y cálidos, donde los huevos y larvas de estas uncinarias viven más tiempo. Algunas especies de Strongyloides que parasitan animales salvajes pueden causar una dermatitis similar. La larva visceral migrans (VLM) suele estar causada por el áscaris canino Toxocara canis y, en menor grado, por Toxocara cali, del gato doméstico. Los niños suelen infectarse por la ingesta accidental o intencional de tierra contaminada con heces de perros o gatos. Tras la eclosión de la larva, ésta es incapaz de completar su ciclo vital y comienza una migración prolongada a través de diferentes órganos y tejidos. Los niños pueden debutar con retraso del crecimiento y aparición de fiebre, hepatomegalia, neumonilis, eosinofilia e hipergammaglobulinemia. Una reacción inflamatoria en la retina puede simular un retinoblastoma, un tumor maligno con el que se debe hacer el diagnóstico diferencial. El diagnóstico de VLM se suele realizar mediante los hallazgos clínicos, ya que el parásito raramente se consigue aislar. Los test serológicos pueden ser útiles para confirmar la sospecha y actualmente se recomienda el EIA, que usa los antígenos de la fase larval (Wilson, 1995). Un síndrome similar al VLM puede ser causado por especies de Gnathostoma. que inlectan el estómago de mamíferos. La infección humana es más frecuente en el sudeste de Asia, pero también se han descrito casos en México y Ecuador. Este parásito utiliza un cefalópodo como primer huésped intermediario y peces y anfibios como huéspedes secundarios. También pueden servir como huéspedes diferentes clases de reptiles, pájaros y mamíferos. Las larvas pueden migrar a través del tejido subcutáneo, produciendo inflamación transitoria y, ocasionalmente, invasión del sistema nervioso central. La existencia de lesiones migratorias y una historia de ingesta de pescado crudo pueden ayudar para el diagnóstico clínico. Capillaria hepática. Aunque suele parasilar roedores, a veces causa enfermedad en humanos, especialmente en niños, en los que puede simular una VLM, hepatitis, absceso amebiano hepático u otras enfermedades patológicas. En el huésped roedor, los huevos se digieren y producen una larva migratoria que llega al higado, donde madura y pone huevos en el parénquima. Cuando el hígado es ingerido por un depredador, los huevos se eliminan en las heces y contaminan el suelo. Los niños están en riesgo para adquirirlos si ingieren la suciedad. En las áreas endémicas el diagnóstico se hace por el examen de biopsia hepática o por autopsias. Los huevos son fácilmente reconocibles en la biopsia al tener paredes estriadas gruesas. Anisakis. Pseudoterranova y Eustrongyloides spp. La ingesta de pescado crudo, aunque se considere una exquisitez en algunas partes del mundo, tiene como resultado un incremento en el número de casos de inlecciones por nematodos del pescado. Anisakiasis y Pseudoterranova son parásitos comunes gastrointestinales de mamíferos marinos, y las fases infectivas se encuentran en diferentes peces de agua salada, salmón y calamares como huéspedes intermediarios. Los pequeños crustáceos similares al camarón sirven como primer huésped. Cuando se digieren, esta larva penetra la pared gástrica o del intestino, produciendo dolor abdominal agudo. La infección por Anisakis se puede diagnosticar por presunción basándose en una anamnesis y hallazgos clínicos, y se puede confirmar mediante el aislamiento de un gusano en la endoscopia o por la presencia de un granuloma eosinólilo que contenga un nematodo en una de las piezas quirúrgicas. Las especies de Anisakis tienden a ser más productoras de enfermedad invasiva, mientras que Pseudoterranova spp. tienden a ser tosidas o vomitadas intactas (Lámina 55-11 £7 y 11H) (Sakanari. 1989). La larva de Anisakis es difícil de identificar (Binford, 1976). Se han descrito escaso número de infecciones por Eustrongyloides spp. en personas que ha comido sushi casero. Estos parásitos suelen infectar pájaros que se alimentan de pescado, pero en humanos la larva rojo brillante invade la cavidad abdominal, precisando tratamiento quirúrgico (Wittner. 1989).

Cestodos Son muchas las especies de cestodos que afectan a humanos en sus estadios de larva y pueden causar seria enfermedad. Las más habituales son fácilmente distinguibles de las otras y tienen patrones de transmisión únicos Cuando se ven en secciones tisulares, las larvas y adultos contienen cuerpos laminados basofilos conocidos como corpúsculos calcáreos, importantes para su identificación. Cisticercosis. La infección humana con la (ase larval del gusano plano del cerdo, Taenia solium. se da en todo el mundo tras la ingesta accidental de huevos de un adulto. Es especialmente prevalente en México y el resto de América latina, Europa, la India y Asia. La mayoría de los casos en EE.UU. se originan en zonas endémicas, aunque en los últimos años el número de casos de origen local ha aumentado (Richards, 1985). Los huevos se pueden ingerir accidentalmente con comida contaminada o con agua; posteriormente eclosionan en el tracto gastrointestinal penetrando los embriones en la mucosa intestinal, que diseminan posteriormente por el torrente sanguíneo a sitios a distancia, especialmente el músculo esquelético y también al corazón, cerebro u ojos, donde la clínica inflamatoria puede ser muy evidente. Una complicación frecuente en áreas endémicas son las crisis y frecuentemente es el síntoma de presentación (Lámina 55-16/1). El diagnóstico suele hacerse con los hallazgos clínicos en las zonas endémicas, pero puede ser más difícil en áreas no endémicas. El uso de la tomografía computanzada (TC) es muy útil, pero no suele estar disponible en la mayoría de las áreas endémicas. La radiografía es útil para ver la existencia de quistes calcificados, pero no para el diagnóstico de infección reciente. El aislamiento de cisticercos intactos mediante cirugía confirma el diagnóstico. El cisticerco, o gusano vesiculado, es un saco lleno de líquido translúcido, oval que contiene un único escólex que mide 5 mm o más de diámetro (Lámina 55-16S). Entre los test serológicos, el inmunoensayo con glucoproteinas disponible por el CDC tiene alta sensibilidad y especificidad, superando al EIA (Díaz. 1992). Desafortunadamente, estos test no diferencian entre infección activa e inactiva, por lo que no son útiles para monitorizar la respuesta al tratamiento. La existencia de cisticercosis en personas de un área no endémica y sin clara historia de viaje obliga a la investigación de la exposición de los manipuladores de alimentos relacionados con el paciente, o de la posibilidad de infección con una especie diferente de Taenia (Schanz, 1992). Hidatidosis. La infección humana con estadios larvales de gusanos planos del género Echinococcus puede tomar una de estas tres formas: hidatidosis unilocular causada por E. granulosus. hidatidosis multilocular o alveolai causada por E. multilocularis e hidatidosis poliquística causada por E. vogeli (Thompsom. 1995). Los huéspedes definitivos de estos minúsculos gusanos son los perros. Lo que pierden de tamaño, lo ganan en número de individuos, con varios cientos o miles de gusanos que ponen gran número de huevos en un solo huésped. Los huevos se eliminan por las heces y se digieren por huéspedes intermediarios, como la oveja, la vaca, el cerdo, los roedores y otros herbívoros. Los humanos, especialmente los niños, se infectan tras la ingesta accidental de huevos. Los huevos se rompen en el intestino y el embrión penetra la pared intestinal y pasa a la sangre. Aunque la mayoría de las hidátides se desarrollan en el higado, algunas se diseminan a otros sitios. El desarrollo de los quistes es lento y puede durar años para lograr un tamaño de 10 cm o 15 cm de diámetro. En el huésped secundario, los quistes contienen numerosos protoescólex, que proliferan a partir de la membrana germinal. E. granulosus es el más importante causante de patología humana, especialmente en áreas de cuidadores de ovejas o vacas, incluidos los EE.UU. donde los perros son los huéspedes definitivos. La hidatidosis unilocular se desarrolla como un quiste único en el higado y, posteriormente, en el pulmón u otro sitio. Los quistes están llenos de un liquido claro que contiene capsulas germinales y numerosos protoescólex pudiendo llegar a ser miles (Lámina 55-16C y D). La clínica es la derivada del lento crecimiento de la masa, aunque la infección en el sistema nervioso central se hace aparente antes que en otras zonas. El diagnóstico se basa en la presentación clínica y la his-

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

toría junto con el uso de radiografía o TC y la ecografía. Los test serológicos son muy útiles para confirmar el diagnóstico y constan de un test de screening como EIA o el IHA seguido, si fuese positivo, de un test de confirmación como el inmunoblott o el gel de difusión (Wilson. 1995). La sensibilidad va desde el 60% al 90% según cada caso. Los falsos positivos se pueden dar en la cisticercosis, aunque la presentación clínica debería evitar la confusión. La aspiración de contenido de los quistes es potencialmente peligrosa, ya que el vertido de su contenido puede producir diseminación o riesgo de shock anafiláctico, pero si se realiza, revelaría una mezcla de protoescólex, cápsula germinal, garfios y corpúsculos calcáreos. E. multiloculans causa hidatidosis multilocular o alveolar en las regiones del norte de Europa y Rusia, y en Alaska. Canadá y el norte de EE.UU. Los huéspedes miermediarios incluyen una variedad de pequeños roedores; los zorros, los lobos y los perros son los huéspedes definitivos. La infección humana se da en el hígado, donde las hidátides se desarrollan como un quiste invasivo que se introduce en el tejido con un patrón alveolar. Aunque la membrana germinal prolifere en el hígado, los protoescólex carecen de desarrollo, La imagen puede asemejarse a la de un hepatocarcinoma. Los test serológicos que usan los antígenos de E. granulosus son útiles para el diagnóstico. El uso diferencial de antigenos de ambos parásitos parece tener un gran potencial para la diferenciación entre estas dos enfermedades (Wilson, 1995). £ vogeli produce un quiste hidatidico poliquíslico que es invasivo, pero se diferencia de £ multilocularis en que £ vogeli produce tanto membrana germinal como protoescólex. La enfermedad está limitada a Latinoamérica, donde los roedores completan el ciclo vital (D'Alessandro. 1979). La hidatidosis poliquíslica en Sudamérica puede también ser causada por E. oligarlhus, un parásito de felinos y roedores. Esta especie es morfológicamente similar a £ vogeli y en el pasado se confundieron casos (D'Alessandro. 1995). Esparganosis. La esparganosis está causada por la larva del género Spiromelra. emparentada con Diphyllobothrium spp. Habitualmente parásita perros y gatos y están en Asia (Spirometra mansoni) y Norteamérica ¡Spirometra mansonoides). Los ciclos vitales son similares a los de Diphyllobothrium. los cefalópodos sirven como primer huésped intermediario para la larva procercoide y el pescado como segundo huéspedes para la larva pleurocercoide. Los humanos se infectan con estos estadios larvales a través de la ingesta de cefalópodos en el agua o con el pescado crudo o poco cocinado. El uso de ranas o serpientes como cataplasmas también puede transferir larvas. La esparganosis se suele presentar como un edema local o migratorio a nivel subcutáneo junto con eritema y dolor; a veces se da una infección cerebral. La exploración quirúrgica puede revelar un delicado gusano, delgado y de color marfil y de escasos centímetros de largo. Los cortes axiales demuestran un grueso tegumento con profundos pliegues y un parénquima con marcadas fibras musculares. No se han visto cavidades corporales en los nematodos y los corpúsculos calcáreos son numerosos (Lámina 55-16F) (Orihel, 1995; Gutiérrez, 2000). Coenurosis. La tenia intestinal de perros y gatos (principalmente T. muíticeps y T. serialis) produce una larva en los huéspedes intermediarios conocida como coenuro. Este estadio consta de un largo saco transparente (de unos 10 cm) que contiene muchos escólex que surgen de una membrana germinal que se invagina en quistes llenos de líquido (Lámina 55-16E). Las ovejas son los huéspedes intermediarios de T. multiceps. y los roedores, liebres y conejos lo son para T. serialis. aunque los humanos juegan este papel por la ingesta accidental de huevos producidos por gatos y perros domésticos. Como un cisticerco. el coenuro puede desarrollarse en cualquier órgano causando una enfermedad similar. El diagnóstico se suele hacer por el examen de quistes extirpados o en secciones tisulares. La presencia de múltiples escólex invaginados en una sola vesícula lo diferencian del resto de los cestodos larvales.

Tremátodos Todos los tremátodos que habitan en el hígado, el pulmón y la sangre y que maduran en humanos producen huevos que generalmente salen del cuerpo

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por las heces, la orina o el esputo. Dada su localización extraintestinal, estas lombrices y sus huevos se pueden encontrar en los tejidos, como hallazgo o asociados a clínica. Los adultos de F. hepática. C sinensis y O. vivernm se pueden hallar en el hígado y en las vías biliares y. a veces, en sitios ectópicos. La presencia de los típicos huevos, tanto libres en los tejidos como dentro del útero de los helmintos, frecuentemente facilita la identificación definitiva. El adulto de Paragonimus spp. es el que reside principalmente en el pulmón, pero puede hallarse en sitios ectópicos como el cerebro y el tejido subcutáneo, produciendo abscesos frecuentemente asociados con una gran producción de huevos. Los esquistosomas adultos viven en los vasos sanguíneos, principalmente en el territorio de la vena mesentérica interior (S. mansoni). vena mesentérica superior (S. japonicum y S. mekongi) y en el plexo vesical (S. haematobium). Aunque los adultos no suelen encontrarse en las biopsias tisulares. los huevos pueden encontrarse en gran número de tejidos del intestino, del hígado y de la vejiga (Lámina 55-14 B, Dy F). Los huevos pueden diseminarse por la sangre a otros locos, incluidos el cerebro, la médula espinal, los pulmones, el corazón, los ríñones y el bazo. Los huevos de S. japonicum tienen tendencia especial a diseminarse debido a su pequeño tamaño y al gran número de huevos producido. La identificación de los huevos depende del reconocimiento de su tamaño típico y de su morfología en los tejidos adecuados.

ARTRÓPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICA

Los artrópodos comprenden un gran y diverso grupo de organismos, algunos de los cuales tienen una gran importancia clínica o económica. Esto es debido a que son una importante causa de morbimortalidad en los humanos y para sus animales domésticos, con serias pérdidas económicas para la agricultura. Aunque quizá los artrópodos son más conocidos entre los clínicos por su capacidad para transmitir agentes infecciosos, como son virus, bacterias (Rickettsia, espiroquetas y otros), protozoos y algunos helmintos, éstos también pueden causar patología directamente por invasión tisular. envenenamiento, formación de vesículas, pérdida de sangre y reacciones alérgicas. El miedo exagerado a artrópodos (entomofobia) y los delirios de infestación (delirio de parasitosis) son neurosis no infrecuentes que pueden afectar a algunos individuos. Las especies que directa o indirectamente causan enfermedad humana son representativas de todas las clases de artrópodos (Tabla 55-10). En esta sección, se presenta una aproximación que se puede usar en el laboratorio clínico cuando se evalúan muestras con artrópodos, seguida por una breve descripción de cada grupo de artrópodo con relevancia médica. Existe una variedad de textos generales y especializados disponibles para una completa cobertura del campo de la entomología (Beaver. 1984; García. 1997: Goddard. 1996: Harwood. 1979; Kettle. 1993; Lane, 1993; Centro Nacional de Declaración de Enfermedades, 1969; Strickland, 1999).

Características biológicas Los artrópodos se caracterizan por una simetría bilateral y un cuerpo segmentado, varios pares de apéndices articulados y un caparazón rígido que se va modificando durante el crecimiento. El desarrollo va desde huevos hasta adultos a través de una metamorfosis gradual (huevo, ninfa y adulto) o completa (huevo, larva, pupa y adulto). Las chinches, los revúviros, los piojos y las cucarachas son ejemplos de insectos que sufren una metamorfosis gradual. La mosca, el mosquito, las pulgas, las hormigas, las abejas y las avispas, asi como los escarabajos, sufren una metamorfosis completa. Las formas larvales similares a los gusanos se hacen pupa y luego adultos. Los arácnidos sufren cambios de desarrollo muy similares al proceso gradual de metamorfosis. Las larvas de estos artrópodos, que con frecuencia, sufren una metamorfosis completa, suelen ser los más difíciles para identificar y se deben enviar a un especialista.

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SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 55-10 Clasificación de los artrópodos de importancia médica Clase Insecia (insectos) Orden Anopleura (piojos) Orden Siphonaplera (pulga) Orden Diclyoplera (cucarachas) Orden Hemiptera (chinches, revúviros) Orden Hymenoplera (hormigas, avispas, abejas) Orden Coleóptera (escarabajo) Orden Lepidoptera (orugas, mariposas, polillas) Orden Díptera (moscas, ácaros. mosquitos) Clase Aracnida (arácnidos) Subclase Scorpiones (escorpiones) Subclase Araneao (arañas) Subclase Acari (garrapatas, ácaros, ninguas) Clase Diplopoda (milpiés) Clase Chilopoda (ciempiés) Clase Crustácea (crustáceos) Orden Copepoda ( c e f a l ó p o d o s ) Orden Decapoda (cangrejos) Clase Pentastomida (gusanos de la lengua)

Mecanismos de lesión Invasión tisular directa. La invasión de la superficie de tisular (conocida como inlestación) se produce con gran variedad de artrópodos, de los que los ácaros, la pulga y algunas larvas de dípteros son los más comunes. La invasión de tejidos profundos y las cavidades (referidos como infección) se da principalmente con los gusanos y. rara vez. con las larvas de pentastómidos. La invasión por larvas de dípteros, llamada miasis. puede darse en tejidos vivos o desvitahzados según las especies. Envenenamiento. Muchos artrópodos pueden inyectar saliva o veneno con sus mordiscos o picaduras. Para la mayoría de las personas produce sólo una reacción local tisular. pero puede producir serias reacciones, como anafilaxia debido a una previa sensibilización a la toxina en cuestión. Las picaduras de heminópteros (hormigas, abejas y avispas) y las de escorpiones son las más agresivas (Reisman, 1994). Las mordeduras de ciertos artrópodos, especialmente los ciempiés, los mosquitos, las moscas, las chinches, los revúviros, las chinches asesinas, los piojos, las pulgas, las garrapatas y los ácaros, también pueden ser tóxicas, causando reacciones locales o sistémicas. Casi todas las arañas son venenosas, pero sólo un pequeño grupo (arañas viudas, arañas violín y algunas tarántulas) pueden causar peligro para la salud humana. Causas de envenenamiento menos (recuentes pero también descritas son motivadas por la exposición a los pelos urticantes de ciertas orugas o larvas de escarabajos.

biana, giardiasis y gusanos. Los mecanismos que intervienen en la transmisión biológica varían desde la simple amplificación en el artrópodo vector hasta cambios más complejos del ciclo vital del parásito. Tanto garrapatas como ácaros intervienen en la transmisión de ciertas bacterias (Rickellsia. Ehrlichia. espiroquetas y otras), protozoos (Babesial y virus. Entre los insectos, los piojos transmiten bacterias {Rickettsia, Bartonella y Borrelia): los revúviros transmiten Trypanosoma: las pulgas transmiten agentes de peste, tifus y gusanos planos caninos; y los dípteros transmiten arbovirus. malaria. Trypanosoma, Leishmania. filarías y bacterias. Reacciones de hipersensibilidad. La mayoría de las reacciones graves de las picaduras suelen ser producidas por hipersensibilidad alérgica. Las picaduras de heminópteros son las responsables de la mayoría de las muertes por artrópodo y suelen ser por hipersensibilidad tras una exposición repetida al veneno (Reisman. 1994). La alergia también puede exacerbarse tras la exposición a la saliva, excrementos o partes del cuerpo de los ácaros. garrapatas, piojos, chinches, orugas, polillas y mariposas. Se puede producir asma y fiebre elevada como respuesta a estos alérgenos en el ambiente (Frazier, 1980). Manifestaciones psicológicas. La entomofobia se define como un irrazonable o excesivo miedo a la vista o al contacto con artrópodos Aunque esto puede causar alteraciones en las actividades habituales de una persona, rara vez es incapacitante. El delirio de parasitosis es un trastorno emocional más serio por el que una persona está convencida de que estaba infectada con parásitos o artrópodos a pesar de la evidencia objetiva de lo contrario. Si esto progresase, podría resultar en una pérdida de empleo, divorcio, abuso de pesticidas y mudanzas repetidas. Las visitas a los servicios de salud suelen ser numerosas, aunque insatislactoñas. El problema puede empezar tanto en el hogar como en el trabajo y se puede transferir del uno al otro. El delirio puede ser tan convincente que puede ser creído por otros miembros de la familia o amigos o tomarse como propio. El paciente puede remitir muchas muestras, como piel, pelo, mocos o pelusa al laboratorio. Es obligación del laboratorio examinar dicho material para descartar una auténtica infestación. El misterio de la irritación y el picor puede deberse a picaduras de ácaros, piojos, pulgas o chinches no reconocidas o bien a insectos y ácaros traídos por un roedor o pájaros en el área habitada por el paciente. Antes de descartar tales causas, se deben buscar y excluir su presencia (Lynch. 1993).

Aproximación de laboratorio a la identificación de artrópodos

Vesiculación. Algunos de los milpiés más largos son capaces de rociar o lanzar una sustancia química vesicante (productoras de ampollas) desde unas glándulas localizadas en cada segmento del cuerpo. Esto es especialmente irritante si alcanza la conjuntiva. Los escarabajos vejiga son llamados así por su capacidad de descargar fluidos vesicantes (cantaridina. el ingrediente aclivo de la mosca afrodisíaca española) cuando se les manipula.

Las muestras de artrópodos son frecuentemente dirigidas al laboratorio clínico tanto por médicos como por pacientes con la esperanza de que sean identificados, pero pocos trabajadores de los laboratorios reciben algo más que un entrenamiento superficial en entomología. Sin embargo, los especialistas pueden tener acceso a textos y claves que permiten una identificación de los grupos encontrados con más frecuencia, especialmente los ectoparásilos (pulgas, ácaros. piojos y garrapatas). De mayor importancia es la capacidad del personal del laboratorio para reconocer las raras situaciones en las que se debe buscar la opinión de un experto. Esto es de especial relevancia en las ocasiones en las que se están lomando importantes decisiones terapéuticas y de pronóstico. Los laboratorios de salud pública local o estatal suelen tener expertos disponibles o conocen a personas entrenadas en entomología médica en institutos educacionales, o museos u oirás agencias, incluido el CDC.

Pérdida de sangre. Los artrópodos responsables de causar pérdidas de sangre a los hombres o animales domésticos incluyen chinches, revúviros. pioios. pulgas, moscas, mosquitos, garrapatas y ácaros. Aunque no suele suponer un nesgo para la vida, tiene el riesgo de transmisión de agentes infecciosos.

Las muestras recibidas en el laboratorio suelen ser organismos intactos, raspados cutáneos, tejidos, esputos, orina o heces. También se pueden remitir objetos personales como plantillas, agua, ropa, ropa de cama y alfombras, entre otras. No es raro que se remitan artrópodos hallados en el inodoro tras la micción o la deposición. En la mayoría de los casos, la presencia de estos organismos es coincidencia y no implica infección.

Transmisión de agentes infecciosos. Muchos artrópodos juegan un papel muy importante en la transmisión mecánica o biológica de agentes infecciosos. La mosca doméstica puede ser responsable de la transmisión del agente de disenteria bacilar, cólera, tifus, diarrea viral, disentería ame-

La correcta muerte y conservación de los artrópodos es importante para preservar sus características, que luego serán necesarias para su identificación. Los artrópodos pequeños, sin alas, especialmente los ectoparásitos (piojos, pulga, garrapatas y ácaros). larvas (gusanos, orugas, larvas), arañas

CAPÍTUIO 55

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PARASITOLOGÍA MEDICA

y escorpiones se deben colocar directamente en alcohol etílico al 70%-80%. Las grandes formas larvales se matan mejor en agua caliente (sin hervir), para que sus cuerpos se extiendan sin contraerse antes de meterlos en alcohol. Los tejidos afectados u otros escombros se deben manipular con delicadeza o lavar antes de conservarlos. Las formas más pequeñas (acaras, pequeñas garrapatas, pulgas, moscas de arena) se deben preparar como muestras permanentes. Los insectos alados, especialmente los mosquitos adultos y moscas, se deben matar exponiéndolos a humos de etil acético o cloroformo y preservarlos en seco para mantener la información taxonómica recogida en las escalas corporales y de las alas. Tales artrópodos suelen pinchar y secar, seguido por un almacenamiento en cajas herméticas protegidas con naftalina o diclorobenceno. Más detalles de la recolección, preservación y preparación de las muestras artrópodos se pueden encontrar en otros textos (Beaver. 1984; García. 1993; Lañe, 1993; Steyskal, 1987).

Insectos Los insectos comprenden más del 90% de todas especies de artrópodos descritos, aunque sólo algunas especies son responsables de patología humana. Los miembros de esta clase se diferencian de los demás artrópodos por poseer el cuerpo dividido en tres partes (cabeza, tórax y abdomen), un par de antenas, tres pares de patas y uno, dos o ningún par de alas. Es la única clase de artrópodos en los que se ha desarrollado el vuelo. Piojos. Los piojos están aplanados dorso-ventralmente, sin alas, con unas características pinzas en el final de cada pata que les permite fijarse a los pelos o a la ropa (Lámina 55-17/1 y S). Todas las especies se alimentan de sangre intermitentemente y pueden causar una dermatitis poco explicada. Los huevos, conocidos como liendres, se depositan en los pelos o en la ropa, según la especie. Aunque se les nombra según su principal localización, no siempre están confinados a esa localización. El piojo de la cabeza, Pediculus capitis. y el de cuerpo, Pediculus humanus. son indistinguibles por personal no especialista. Son más largos que anchos y miden hasta 3 mm. La dilerencias biológicas son aparentes. P. humanus es el único que transmite el agente del tifus, la fiebre de las trincheras y la fiebre recurrente (Kim. 1986). La infestación por ambos tipos se da en gente acinada y con poca higiene. Los niños en edad escolar tienen mayor riesgo para adquirir el piojo de la cabeza, al compartir gorros, ropa y peines (Orkin, 1985). Las liendres de piojo de la cabeza se colocan principalmente en el eje del pelo, y las del corporal se colocan en la ropa. Los productos de cuidado del pelo, las micosis del pelo, así como otros objetos, pueden simular liendres y su diferenciación es importante. Las liendres miden 1 mm y, cuando aún no han eclosionado, poseen un opérculo intacto (Lámina 55-17C). La transmisión se da principalmente al compartir ropa infestada, así como ropas de cama, ya que el piojo corporal tiende a poner los huevos en racimos especialmente a lo largo de las costuras o dobleces de la ropa. El piojo del pubis. Phlhirus pubis, es diferente de los otros. Es más redondeado (mide hasta 2 mm de diámetro), y el abdomen es más parecido al de un cangrejo. Su primer par de patas es mayor y más largo que las demás patas (Lámina 55-17S). Estos piojos y sus liendres se hallan principalmente en el vello púbico. pero pueden extenderse al tórax, las axilas y a la cara. La transmisión suele producirse durante el acto sexual. Pulgas. Las pulgas son pequeños ectoparásitos (de 1 mm a 2 mm). sin alas y lateralmente aplanados que se alimentan de sangre (Lámina 5517D). Sus largas y musculosas patas están adaptadas para saltar de grandes distancias. Todas las pulgas que alectan a humanos son parásitos de otros mamíferos o aves de corral. La infestación se produce por la exposición a animales domésticos y mascotas. Las especies más nocivas son la pulga del perro (Ctenocephalides canis). la del gato (C. Felis), y la humana (Pulex irrilans). Algunas personas crean alta sensibilización a las mordeduras de las pulgas, mientras que a otras casi no les afecta. Las pulgas de gatos y perros también son huéspedes intermediarios de gusanos pla-

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nos de D. caninum y, menos frecuentemente, de H. diminuta y H. nana. Ya que las larvas de estas especies frecuentemente se dan en los lechos de los animales, alfombras y muebles, su erradicación puede requerir la fumigación y su limpieza. La pulga de la rata oriental. Xenopsyila cheopis. es una especie muy importante, ya que transmite el bacilo de la peste y el agente del tifus murino. Aunque parásita en muchas especies de ratas, estas pulgas atacan con facilidad a humanos. La pulga ningua o de las arenas (Junga penelrans) se halla en América central y Sudamérica y regiones de África tropical. La pulga hembra se une a la piel especialmente entre los dedos del pie y bajo las uñas, donde crecen hasta el tamaño de un pequeño guisante. Tras la puesta de huevos, la pulga muere, produciendo una respuesta inflamatoria con el riesgo de una sobreinfección bacteriana. La tungiasis se diagnostica al identificar la porción oscura del abdomen de la pulga saliendo de la piel en una lesión alargada (Beaver, 1984; Goddard, 1996: Lañe, 1993). Cucarachas. Las cucarachas se han adaptado rápidamente a la vida de los humanos compartiendo nuestra comida, cobijo y nuestro calor. Aunque son unos compañeros algo pesados, éstos son potencialmente transportadores de patógenos lecales debido a su capacidad de moverse rápidamente desde los desagües a las cocinas o despensas. Además de transmitir bacterias, pueden extender poliovirus. virus de la hepatitis, protozoos intestinales, incluida Entamoeba histolytica. y muchas especies de nematodos entéricos. También se pueden dar alergias y asma en algunos individuos tras la exposición a excrementos, caparazones o partes del cuerpo de las cucarachas (Goddard, 1996). Chinches y revúviros. Las chinches (familia Cimidiae) y los revúviros (familia Reduviidae) son insectos chupadores de sangre con probóscides largas y estrechas que las doblan bajo el cuerpo cuando no las usan. Las chinches (Cimex lectulanus y Cimex hemipterus) son marrones rojizas, aplanadas dorso-ventralmente, sin alas, de unos 5 mm de longitud (Lámina 55-17£). Tienen una distribución cosmopolita y atacan a la mayoría de los mamíferos, alimentándose principalmente por las noches. Durante las horas del día se esconden ba|o los colchones, el papel de las paredes las tablas del suelo. Aunque no se les conocen como transmisores de enfermedades, sus mordiscos pueden ser dolorosos, con ampollas, según la sensibilidad del individuo a su saliva. Los revúviros (Tnatoma. Rhodnius. Panstrongyius) tienen una cabeza con forma de cono con un cuello estrecho y un abdomen que se ensancha en su mitad. Estos son negros o marrones y algunos tienen marcas naranjas o negras en el abdomen. Suelen medir de 1 cm a 3 cm y, a diferencia de las chinches, tienen unas alas bien formadas para volar. Al igual que las chinches, se alimentan en vertebrados y causan similares reacciones cutáneas. En México y América central y Sudamérica transmiten el agente de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzí. en las heces, que posteriormente se introducen en la piel mediante el rascado (Goddard, 1996; Lañe, 1993). Abejas, avispas y hormigas. Los heminópteros son insectos sociales que hábilmente defienden sus nidos cuando se les molesta. En las hembras no reproductoras, el órgano ponedor de huevos se modifica como un aguijón capaz de inyectar veneno para capturar presas o para defenderse. El veneno de la abejas, avispas y avispones causa sólo una inflamación dolorosa temporal en la mayoría de las personas, pero pueden causar a veces reacciones sistémicas, como anafilaxia en personas sensibilizadas (Reisman. 1994). Cerca de cien personas mueren cada año en EE.UU. por este motivo. La abeja de la miel africana se encuentra ahora en Norteamérica tras su introducción en Brasil en 1956. Estas abejas, que son fácilmente más provocadas por otras abejas, muestran un masivo comportamiento a la hora de picar. Muchas especies de hormigas son problemáticas para los humanos por su capacidad de morder, y algunos grupos, como las hormigas segadoras y las hormigas del fuego, son capaces de producir picaduras dolorosas. Escarabajo. Aunque quiza son con frecuencia conocidos como provocadores de plagas en los campos de agricultura, algunos tienen unas mordeduras dolorosas y otros, especialmente los escarabajos vejiga, pueden exudar un líquido vesicante (cantaridina) que produce dermatitis o ampollas.

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Las larvas de ciertos escarabajos poseen pelos urticantes que producen dermatitis o, si se ingieren, irritación del tracto gastrointestinal. Las larvas y los adultos de los escarabajos del grano pueden actuar como huéspedes intermediarios para los gusanos planos H. diminuta y H. nana de los roedores y humanos. Polillas y mariposas. Algunas larvas (orugas) de lepidópteros poseen pelos urticantes o espinas que inyectan veneno al manipularlas. Aunque la mayoría de los efectos de estas toxinas pueden quedar en la piel, se han descrito efectos sistemáticos, incluidos shock y parálisis (Goddard, 1996). Los adultos de la polilla gitana y de montecillo de hierba poseen pelos urticantes que pueden causar dermatitis, conjuntivitis o irritación de la vía aérea, especialmente en trabajadores forestales (Shama. 1982). Moscas y mosquitos. Los dípteros se caracterizan por poseer un par de alas membranosas. Entre todos los artrópodos, son los responsables de la mayor parte de las enfermedades humanas producidas al alimentarse de sangre, transmisión de agentes infecciosos y la invasión directa de tejidos por sus larvas (miasis). Las picaduras suelen causar irritación local debido a la sensibilidad a la saliva y, en algunos individuos, reacciones sistémicas. Además de su acción de sangre, los repetidos ataques pueden producir daños físicos y psicológicos. Ciertas especies chupadoras de sangre son también responsables de la transmisión de patógenos: malaria, filariasis y arbovirus por mosquitos; las oncocercosis por la mosca negra; loiasis por la mosca ciervo; leishmaniasis y bartonellosis por la mosca de la arena; tripanosomiasis africana por la mosca tse-tsé. Otros agentes virales, bacterianos o parasitarios se transmiten con facilidad de modo mecánico por las moscas no picadoras, como la mosca doméstica o la mosca de la carne que pueden contaminar fácilmente el alimento. La miasis puede producirse de un modo accidental, facultativo u obligatorio. La mosca doméstica no tiene la necesidad de desarrollarse en los tejidos de mamíferos, aunque puede hallarse a veces en tejidos muertos. Este tipo de miasis accidental no es infrecuente, pero no suele tener relevancia clínica. La miasis facultativa es causada más frecuentemente por la mosca de la carne, que suele alimentarse de tejidos muertos pero puede ir a los tejidos viables adyacentes. La miasis obligatoria se produce por especies que se desarrollan sólo en tejidos vivos. Estas especies tienen un origen zoonótico. La mosca humana. Dermatobia hominis. se desarrolla en lesiones subcutáneas como forúnculos, con el extremo posterior apareciendo por la superficie cutánea (Lámina 55-17F). Estas especies se encuentran más frecuentemente en personas que ha estado algún tiempo en América Central o Sudamérica, o con menos frecuencia en África. Es raro que los huevos sean transportados al huésped por otros insectos, habitualmente mosquitos. La mosca Cordyiobia anthropophaga. hallada en África subsahariana, también causa una miasis foruncular. Sus huevos se suelen poner en el suelo o en las ropas tendidas y la larva penetra rápidamente al contacto con la piel. La miasis obligatoria grave es la causada por Chrysomya bezziana y por Cochlimyia hominivorax. Estas especies ponen sus huevos en el ganado vacuno, habitualmente en las heridas o cerca de la nariz. Las larvas se mueven y se alimentan activamente a través de los tejidos vivos. Las infecciones humanas pueden ser especialmente destructivas y afectar al 0|0, a la nariz o a la boca. Otras especies también pueden ser causantes de miasis obligatorias en los humanos (Lane. 1993).

grejo, y una cola segmentada con un aguijón globuloso en el extremo (Lámina 55-18A). Tienen una naturaleza depredadora, paralizando a sus víctimas con su veneno del aguijón, aunque también puede usarlo para fines defensivos. La toxicidad humana varía según las especies. Pueden no producir más daño que la picadura de una abeja, pero algunos son mortales, causando cerca de mil muertes al año. Las especies venenosas se dan en el hemisferio oeste, Europa, África y Oriente Medio (Beaver, 1984; Goddard, 1996). Arañas. Las arañas carecen de cola con aguijón, pero a cambio poseen quelíceros parecidos a colmillos en su zona bucal, a través de los cuales pueden inyectar veneno. Aunque la mayoría son venenosas, tan sólo unas pocas tienen quelíceros capaces de penetrar la piel humana. La mayoría de las picaduras producen sólo irritación y dolor temporal. Las arañas viudas (género Lactrodectus) son uno de los grupos responsables de síntomas sistémicos gracias a la acción de una potente neurotoxina capaz de producir somnolencia, dolor muscular, parálisis, convulsiones y, a veces, la muerte. La tasa de mortalidad publicada varía del 1% al 6%. Se han descrito cinco especies en EE.UU., siendo la viuda negra (Lactrodectus mactans) la más extendida. Las hembras de la viuda negra poseen un color negro brillante con una característica marca rojo-naranja en la parte inferior del abdomen y tienen una envergadura de 3 cm o 4 cm. Viven en localidades protegidas, como cobertizos, bosques y sótanos (Strickland, 1999). Las arañas violin (género Loxosceles) son causantes del aracnidismo necrótico. En EE.UU., el recluso marrón (Loxosceles reclusa) es el que más frecuentemente afecta, aunque hay otras especies. Esta especie mide de 1 cm a 2 cm, con un color entre canela y marrón oscuro, con una marca oscura en forma de violin orientada hacia la parte delantera en el dorso del cefalotórax. Cuando se halla en los hogares está recluida en su guarida, prefiriendo zonas tranquilas como armarios, sótanos o porches. Su picadura es indolora y con frecuencia no se descubre hasta horas después, cuando se forma eritema, edema y dolor. El veneno es dermonecrotizante y hemolítico, causando necrosis cutánea durante varios días. La lesión puede tener dificultad para cicatrizar y puede sobreinfectarse. Son raras las reacciones sostenidas, como la hemolisis y el fallo renal agudo. Otros géneros también se han implicado en aracnidismo necrotizante (Fisher, 1994). Garrapatas. A diferencia de las arañas y escorpiones, las garrapatas tienen un cefalotórax fusionado con el abdomen y un característico hipostoma para alimentarse. Se desarrolla en cuatro fases: huevo, larva, ninfa y adulto. Tras anclarse, necesita alimentarse de sangre para su desarrollo. Los humanos la adquieren en las áreas de arbustos o de hierba en las cercanías de los huéspedes animales. Son ectoparásitos que necesitan alimentarse de sangre y son importantes vectores de patógenos virales, bacterianos y protozoos, tanto para hombres como para animales domésticos. Su alimentación también causa daño local y pérdida de sangre, especialmente al ganado y a la fauna, o la parálisis de la garrapata que es un síndrome causado por una neurotoxina secretada por las glándulas salivares que causa parálisis flácida ascendente y toxemia. La clínica puede asemejarse al síndrome de Guillain-Barré, a la poliomielitis o al botulismo. La resolución de los síntomas se da en tan sólo unas horas o días tras quitar la garrapata.

Los arácnidos de importancia médica son los escorpiones, las arañas, las garrapatas y los ácaros. Los escorpiones y las arañas poseen dos segmentos corporales, el cefalotórax y el abdomen, mientras que las garrapatas y los ácaros sólo tienen uno. Poseen cuatro pares de patas, tanto de ninfas como de adultos. La larva de garrapata y de ácaros tiene tres pares de patas. Todos carecen de antenas, mandíbulas y alas. Los escorpiones y las arañas son más conocidos por su capacidad de inyectar veneno, mientras que las garrapatas y los ácaros son conocidos por actuar como vectores de patógenos virales, bacterianos y protozoos.

Las especies que afectan a humanos son los miembros de la familia Ixodidae (garrapatas duras) y Argasidae (garrapatas blandas). Las duras tienen el aparato bucal dirigido hacia delante y un caparazón escleroso en el dorso llamado scutum. Este caparazón cubre la totalidad del dorso del macho, pero sólo la porción anterior de la hembra, permitiendo que se hinche cuando engorda (Lámina 55-186 y C). Las garrapatas Argasidae tienen un cuerpo blando que carece de caparazón y el aparato bucal está dirigido ventralmente, siendo invisible cuando se la observa desde arriba (Lámina 55-180). Las garrapatas sin engordar miden de 2 mm a 5 mm pero crecen varias veces tras engordar. Las garrapatas duras engordadas pueden asemejarse a las blandas, por lo que se debe tener cuidado a la hora de su identificación (Sonenshine, 1991,1993).

Escorpiones. A diferencia de otros arácnidos, los escorpiones sólo tienen un par de pinzas delanteras, que les da un aspecto similar a un can-

La mayoría de garrapatas observadas libres o unidas a la piel son duras. Las blandas suelen alimentarse brevemente por la noche. Las especies de

Arácnidos

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MEDICA

garrapatas duras importantes en América del Norte son Dermacentor variabais (garrapata canina americana). D. andersoni (garrapata de la madera de las Montañas Rocosas). Amblyomma americanum. Rhipicephalus sanguineus (garrapata canina marrón). Ixodes escapularis (garrapata de palas negras) e /. pacificus (garrapata de patas negras del oeste). A Dermacentor y Amblyomma se les llama también garrapatas adornadas por las marcas blancas en sus caparazones. Las otras carecen de adorno. Las garrapatas Dermacentor transmiten la liebre manchada de las Montañas Rocosas y posiblemente la tularemia y liebre Q. Ixodes son vectores de la enfermedad de Lyme. babesiosis y ehrlichiosis, y en otras partes del mundo transmiten ciertos arbovirus. Amblyomma es capaz de transmitir la fiebre manchada de las Montañas Rocosas y también una tularemia y la enfermedad de Lyme. Todos estos géneros pueden causar la parálisis de la garrapata. Rhipicephalus se ha implicado en la transmisión de la fiebre manchada de las Montañas Rocosas y en ehrlichiosis del norte de América, y la fiebre botonosa en el área mediterránea. Las garrapatas blandas del género Ornithodoros se dan en muchas zonas del mundo, incluido EE.UU. y son importantes vectores de fiebres recurrentes por espiroquetas (Borrelia recurrentis y las formas relatadas) (Spach. 1993; Murray, 1999). Ácaros. Los ácaros son arácnidos microscópicos (menores de 1 mm) ampliamente distribuidos en el ambiente. Las especies con importancia médica pueden afectar a los hombres, actuar de vectores o causar alergias al polvo. Los hombres son con frecuencia infestados tanto por Demodex tolliculorum como por Demodex brevis. ácaros de los forúnculos, y Sarcoptes scabei. el acaro de la sarna. Los ácaros del folículo son minúsculos (0,1 mm a 0,4 mm) y alargados, con patas achaparradas con las que se pueden asir de los folículos del pelo y de las glándulas sebáceas (Lámina 55-18F). Suelen ser hallazgos incidentales en las preparaciones histológicas cutáneas. Aunque su presencia se ha asociado a varias condiciones cutáneas, son frecuentemente hallados en individuos sanos, lo que hace su trascendencia incierta (Burns, 1992).

1235

Clases de menor importancia médica Milpiés. Los milpiés son artrópodos similares a los gusanos con numerosos segmentos, cada uno de los cuales posee dos pares de patas que pueden encontrarse en y bajo la vegetación. Aunque carecen de aparato bucal mordedor, algunas especies producen secreciones vesicantes desde las glándulas colocadas en los segmentos. Cuando se les agrede, las largas especies tropicales pueden lanzar un liquido a una distancia de varios centímetros. La exposición de la piel o mucosas a estos líquidos causa quemazón y ampollas. Ciempiés. Estos animales son más planos que los milpiés y tienen sólo un par de patas por segmento; poseen largas antenas. Tienen un movimiento rápido y pueden causar picor con un par de pinzas frontales que están modificadas a partir del primer par de patas. Aunque no suelen causar serios daños, las especies más grandes (26 cm a 45 cm) del sur de EE.UU. y de las regiones tropicales son capaces de penetrar la piel al locarla, produciendo un picor urente y doloroso con inflamación local. Aunque podrían existir reacciones sístémicas en personas sensibilizadas, esto es raro (Goddard. 1996). Crustáceos. Los crustáceos de importancia médica son principalmente los que sirven de huéspedes a larvas de diferentes helmintos. Muchos géneros de cangrejos son huéspedes intermedianos de diferentes especies de lombrices {Paragommus spp.) en todo el mundo. Los cefalópodos son zooplancton microscópicos que a veces sirven como huésped intermediario para los nematodos D. medinensis y Gnathostoma spinigerum y para los cestodos Diphyllobothrium y Spirometra.

Sarcoptes scabieies el acaro de mayor importancia médica dada su capacidad para crear túneles serpigmosos por la capa superior de la epidermis. Se transmite por contacto personal y se puede encontrar principalmente en los espacios interdigitales, la cara flexora de las muñecas y los antebrazos y, menos frecuentemente, en otras zonas como las mamas, las nalgas y los genitales externos. La inflamación y el prurito intenso son secundarios a la creación de los túneles y la producción de excrementos y huevos. La clínica varía según la sensibilización a los parásitos y a sus productos. Las lesiones se sobreinlectan con frecuencia. La aparición de una dermatitis generalizada debida a la existencia de miles de ácaros en ancianos o inmunosuprimidos se conoce con el nombre de sarna noruega. El diagnóstico se hace colocando los raspados cutáneos de áreas afectadas en hidroxido potásico al 20% o en aceite mineral para su aclaramiento y su examen al microscopio. La detección de huevos, larvas de seis patas o ninfas de ocho patas o adultos es diagnóstico, pero a veces puede resultar difícil (Fig. 55-11: Lámina 55-18E). El diagnóstico de sarna en una institución o en una escuela puede causar seudoepidemias, en las que muchos desarrollan picores sin evidencia de enfermedad. Se debe tener cuidado para diagnosticarlos adecuadamente, para diferenciar los casos reales de las parasitosis psicógenas o ilusorias (Lynch. 1993; Orkin. 1985). Un número de ácaros animales pueden afectar a humanos para alimentarse de sangre, tanto como larvas como por adultos, cuando no tienen otros mamíferos o pájaros disponibles. Las larvas de las ninguas (familia Trombiculidae) son un problema en muchas partes del mundo, ya que sus salivas pueden causar grandes reacciones inflamatorias con gran prurito. Estas larvas de seis patas, frecuentemente de color rojo, se unen a la piel en zonas donde la ropa aprieta, como es en los tobillos, caderas y muñecas o axilas. En áreas de Asia y Australia los ácaros Trombiculidae son vectores del agente del tifus de la maleza (Lañe. 1993). Ciertos ácaros no mordedores juegan un papel en la rinitis alérgica, asma y ciertas lesiones cutáneas. Las secreciones, excrementos y partes del cuerpo de Dermatophagoides larinae y de D. pteronyssinus son potentes alérgenos que se dan en el ambiente doméstico (Frazier, 1980). Los test ordinarios realizados por un alergólogo pueden identificarles.

Figura 55-11. Sarcoptes scabiei. Diagrama de un surco subcutáneo. (Ad = hembra adulta; E = huevos; £e = huevos embrionados; Ex = excrementos; Es = cascara de nuevo: So • orificio de entrada.) (Atter Railliet fn Brumpt.)

1236 Tabla 55-11

SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Infecciones parasitarias en huéspedes comprometidos

Infección Protozoos intestinales Criptosporidiosis

Anomalías predisponentes Sida (especialmente CD4 + < 200/u.l). trasplantes y quimioterapia

Isosporiasis

Sida, trasplantes y quimioterapia

Ciclospondiasis

Sida, probablemente otra inmunosupresión

Microsporidiosis

Sida, probablemente otra inmunosupresión grave

Giardiasis

Inmunodef¡ciencia común variable, agammaglobulimemia ligada al cromosoma X

Protozoos sanguíneos y tisulares Encefalitis granulomatosa amebiana

Sida y otros estados de inmunosupresión

Comentarios

Diarrea grave (mayor 17 litros/dia). Puede tener afectación extraintestinal incluidos páncreas, tracto biliar y pulmones Terapia limitada, no curativa Diarrea grave, afectación extraintestinal (adenopatías). existe tratamiento disponible Diarrea grave similar a la criptospondioso e isosporiasis. Respuesta al Trimetroprima sulfametoxazol Varios síndromes: 1. Enfermedad mullisistémica 2 Enteritis con diarrea grave (más frecuente) 3 Infección ocular 4. Síndrome hepatobiliar con granulomas, necrosis hepática, colangilis 5. Enfermedad del músculo esquelético El examen de sedimentos de orina con una corréela tinción permite el diagnóstico de síndrome extraintestinal y algunos casos de enfermedad intestinal Diarrea crónica, malabsorción. Sida no es una condición predisponente

Referencias

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Thielman y Guerraní (1998)

Habilualmente causada por el género de la Martinez y Visvesvara (1997) Acanthamoeba o Balamuthia. Causa infección subaguda o crónica del sistema nervioso central, pero puede ser aguda en los huéspedes inmunodeprimidos con diseminación Habitualmente especies o reactivación de McCabe y Chirurgi (1993) quistes de infecciones previas. Con frecuencia enfermedad diseminada con afectación multiorgánica o lesiones del sistema nervioso central multifocal. Puede causar neumonitis similar a la del Pneumocystis carinii. Puede dar coriorretinitis. Puede producirse tras trasplantes de médula ósea. El trasplante cardíaco de donante seropositivo y receptor seronegativo puede dar una toxoplasmosis fatal Limitada influencia de la leishmaniasis cutánea Herwaldt (1999) Susceptibilidad a leishmaniasis visceral, pero no aumenta la gravedad. Mayor lacilidad de recaída tras el tratamiento

Toxoplasmosis

Sida con CD4+ habitualmente < 100/(jl y otros estados de inmunosupresión, trasplantes cardiacos, donante seroposilivo y receptor seronegativo

Leishmaniasis

Sida, otra inmunosupresión

Tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas)

Sida, linfoma linfoblástico, trasplantes cardíacos, otras inmunosupresiones

En sida, frecuentemente se afecta el sistema nervioso central, el miocardio y la piel

Markell y cois. 1999). Mileno (1998)

Babesiosis

Esplenectomia

Habilualmente hay infección subclinica en los inmunocompetentes. Los esplenectomizados suelen desarrollar enfermedad clínica que puede ser latal Por automfección endógena; puede darse hipennfección o inlección diseminada y presentarse como neumonía o enfermedad iniestinal grave. Puede aparecer sepsis por gramnegalivo o meningitis con gramnegalivo por la translocación bacteriana causadas por la larva invasora. Se debe descartar esta inlección antes del tratamiento inmunosupresor en las áreas altamente endémicas

Markell y cois. 1999). Mileno (1998)

Helmintos Estrongiloidiasis

Artrópodos Sarna

Inmunosuprimidos por trasplantes o quimioterapia, corticoïdes o linloma, El sida noes el mayor factor predisponente

Neoplasias, inmunodeprimidos por trasplantes, quimioterapia, sida

Deriva a una sarna noruega con afectación general de la piel. A veces tiene gran prurito. Los pacientes tienen muchos ácaros y son muy contagiosos. Pobre respuesta al tratamiento

Markell y cois. (1999). Mileno (1998)

Markell y cois 1999). Mileno (1998)

CAPÍTULO 55

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PARASITOLOGÍA MÉDICA

Pentastómidos. Los pentastómidos. o gusanos de la lengua, son artrópodos que pierden las características morfológicas típicas. Los adultos son como gusanos que viven en las fosas nasales de ciertos reptiles, pájaros y mamíferos. Las larvas se parecen a ácaros y residen en roedores, herbívoros y peces de agua dulce. Se han descrito inlecciones hepáticas y pulmonares en el hombre tanto en Asia como en África. Se han hallado adultos en la nasofaringe de personas en Oriente Medio y África, donde causan una rinopatía obstructiva conocida como halzún (Beaver. 1984: Strickland, 1999).

INFECCIONES PARASITARIAS Y HUÉSPEDES INMUNOSUPRIMIDOS Los huéspedes inmunosuprimidos padecen anomalías en su sistema inmune humoral o celular secundario a enfermedad, tratamiento o causa congenita. La malnutrición grave también puede comprometer a las defensas. En la mayoría de los casos suelen deberse a alteraciones celulares (células T) secundarias a sida, neoplasias, quimioterapia, trasplantes, corticoides o a la combinación de varias de ellas. Para la giardiasis, el factor predisponente es el defecto inmune humoral, y para la babesiosis es la esplenectomia. Con la pandemia del VIH y el sida especialmente grave, en países subdesarrollados con alta incidencia de parásitos como la malaria, esquistosomiasis, ascariasis. amebiasis y filariasis, es una suerte que estas infecciones no causen especial gravedad en pacientes con sida. Algunas enfermedades parasitarias, como las causadas por Cryptosporidium. Toxoplasma y Slrongyloides. son más graves en inmunosuprimidos, pero hay diferencias. Por ejemplo, mientras que la infección por Cryptosporidium y por Toxoplasma son particularmente problemáticas en personas con sida, la infección por Slrongyloides no lo es, pero es un problema en los receptores de trasplantes y en los que reciben quimioterapia, La Tabla 55-11 recoge las infecciones parasitarias más graves y/o más frecuentes en los inmunosuprimidos. Las manifestaciones clínicas pueden ser distintas de las de la población normal, como se cita en dicha sección.

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SECCIÓN VI

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CAPirULO 55

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1240

SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

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CAPÍTULO

56

Patología molecular de enfermedades infecciosas Martin G. Cormican, M.D., Ph.D. Michael A. Pfaller, M.D

APLICACIONES DE MÉTODOS MOLECULARES EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Detección de patógenos sin amplificación de diana

ESTANDARIZACIÓN, CONTROL DE CALIDAD Y VALORACIÓN DE LA COMPETENCIA DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

1250

Pruebas de ADN para identificación de cultivos

BIBLIOGRAFÍA

1251

1241

Amplificación del ADN para diagnóstico Epidemiología molecular

En la pasada década, las técnicas de biología molecular han contribuido enormemente para que podamos entender la patogenia y epidemiología de las enfermedades infecciosas. Como las técnicas se han vuelto más accesibles y refinadas, las que se ocupan del diagnóstico y tratamiento de la infección humana han buscado dirigir el desafío de adaptar estos métodos para resolver los problemas clínicos habituales, esto es, para el diagnóstico de la enfermedad, para orientar el tratamiento y para el control infeccioso y epidemiológico hospitalario La patología molecular representa, cada vez más, una parte del servicio diagnóstico que una diversión esotérica para entusiastas. Como las técnicas moleculares se han vuelto sistemáticas, las preguntas del coste y potencial para contribuir al cuidado del paciente necesitan ser dirigidas en cada caso. En cuanto al valor del método, está en función del grado en que facilita el trato con los problemas clínicos, no de la elegancia de la técnica. Por tanto, el diagnóstico molecular es el más apropiado para agentes infecciosos que son difíciles de detectar, o para identificar o determinar la sensibilidad antimicrobiana en un tiempo rápido, comparado con métodos convencionales. Los principios de la biología molecular relacionados con el diagnóstico de laboratorio se comentan con detalle en los Capítulos 58, 59. 63. 66 y 68.

el coste puede estar justificado por una mejoría de las medidas de control para la infección para proteger a los pacientes y cuidar la salud de los trabajadores. La epidemiología molecular puede hacer una verdadera contribución a la detección y control de la extensión de la infección, con capacidad para reducir los porcentajes de infección nosocomial y la petición de antibióticos caros utilizados para tratar organismos resistentes En este punto, sin embargo, la mayoría de la justificación del gasto en diagnóstico molecular y epidemiología es especulativo: sin embargo, los costes del equipamiento, reactivos y expertos son sustanciales, y el director del laboratorio debe también considerar las cuestiones económicas (Kant, 1995). El nivel de inversión justificada debe determinarse en una institución dada, y en algunos casos usar el servicio de laboratorio de referencia puede presentarse como la opción más eficaz.

El diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas tiene una gran base de ácidos nucleicos y necesita el aislamiento de ácidos nucleicos de los microorganismos y material clínico, y el uso de enzimas endonucleasas de restricción, electroforesis en gel y técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. Cada vez más se están utilizando técnicas más modernas para amplificación de ácidos nucleicos para material clínico. El análisis de la secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) se ha ido automatizando. Aunque por el momento no es de uso general en el laboratorio, el análisis secuencial proporciona el último resultado de los organismos caracterizados, y cuando se acompaña con técnicas de amplificación, nos ha dado las directrices con las que hemos podido identificar a los microorganismos que no han podido cultivarse y que antes eran desconocidos en enfermedades infecciosas (Amann, 1994; Wilson, 1994). La tecnología del trozo del gen también parece ofrecer un potencial considerable en el futuro para la caracterización de microorganismos en el laboratorio clínico.

El uso de métodos moleculares para la identificación y detección directa de los microorganismos en la microbiología clínica se está desarrollando gradualmente y ya hay varios productos disponibles comercialmente (Tablas 56-1 a 56-3). Los usos prácticos incluyen el uso de pruebas de ácidos nucleicos para una detección directa de organismos en el material clínico o para la identificación de organismos previamente aislados. Además, las técnicas basadas en la amplificación pueden utilizarse para la detección e identificación y para definir características selectas (p. ej., genes resistentes a los antibióticos) de organismos. Finalmente, los métodos moleculares proporcionan un gran significado de caracterización de organismos, asi como a nivel de subespecies. en investigaciones epidemiológicas.

Una consideración importante en la aplicación general de las técnicas moleculares es el coste. En el área de diagnóstico de enfermedades infecciosas, la mejoría del paciente y la reducción del coste de los antibióticos pueden hacer pesar más que el aumento de los costes del laboratorio. En la actualidad no se han demostrado esos ahorros en muchas aplicaciones diagnósticas de métodos moleculares. En el caso de enfermedades transmisibles.

APLICACIONES DE MÉTODOS MOLECULARES EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Detección de patógenos sin amplificación de diana La detección de microorganismos patogénicos por la prueba del ADN, directamente a partir de muestras, ha sido ampliamente investigado usando una variedad de formatos de hibridación y generadores de señales. El desarrollo de productos comerciales se ha focalizado en el diagnóstico directo de enfermedades transmitidas por vía sexual y patógenos respiratorios utilizando pruebas de hibridación fase solución y pruebas etiquetadas con éster acridina (Tabla 56-1).

SECCIÓN VI

1242 Tabla 56-1

MICROBIOLOGÍA MÉDICA

P r u e b a s d e A D N para la detección de p a t ó g e n o s *

Organismo

Formato de h i b r i d a c i ó n

Virus del papiloma humano

Fase solución

Virus del herpes simple Citomegalovirus Virus de la hepalitis B

Fase solución Fase solución Fase sólida Placa microtiter Fase solución Fase solución Fase sólida Placa microtiter Fase sólida Placa microtiter

Chlamydia Neisseria

•

trachomatis gonnorrhoea

VIH Virus de la hepatitis C

Sistema informador

Estado

Hibridación ADN/ARN y quimioluminiscencia Slot blot con digoxigenina Hibridación Hibridación Cadena ramificada de ADN

Comercial' Comunicado Comercial' Comercial Comercial''

Ester acridina Ester acridina Cadena ramificada de ADN

Comercial*' Comercial" Comercial''

Cadena ramificada de ADN

Comercial'

1

1

'La tabla contiene ejemplos de métodos disponibles y no pretende ser exhaustiva. Las páginas web de los principales labricantes son una fuente útil paia una mloimacion actualizada Oigene. Silver Spring. MD Murex/Abbol. Abbott Park, IL. ''Chiron. Emeryville, CA "Gen-Probe, Irte., San Diego. CA. :

Un diagnóstico directo por una prueba de hibridación es rápido y está libre de los problemas de contaminación asociados con la amplificación de dianas y es menos susceptible a la inhibición que otros muchos procedimientos de amplificación. Una limitación de la prueba de hibridación estándar es el requerimiento para detectar 10' o más copias. Para algunas aplicaciones, se debe valorar un método rápido, conveniente, y que no se base en el cultivo con este nivel de sensibilidad, y las estrategias de señales de amplificación pueden detectar números tan bajos como 500 genes/ul (Shan, 1994; Murphy, 1999). Incluso los formatos de amplificación de señales más sofisticados no parecen mejorar la sensibilidad analítica de los métodos basados en la amplificación de dianas, que pueden detectar menos de 50 copias de genes/ml (Erali. 1999). La gran sensibilidad de los ensayos de amplificación parece ser la venlaja en ensayos de calidad; sin embargo, la tecnología de pruebas sensibles se está utilizando para muchos ensayos. En enfermedades infecciosas, la prueba de hibridación basada en la membrana (Southern blot, ranura/punto blot) parece improbable que sea una herramienta significativa en el diagnóstico del laboratorio en un futuro. El formato basado en la membrana es quizás el más aplicable para el análisis de un gran número de muestras asi como para buscar aplicaciones. La clasificación del virus del papiloma humano (HPV) y la detección segura del HPV

Tabla 56-2 P r u e b a s c o m e r c i a l e s d e A D N para la identificación de cultivos* Organismo

Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium-intracellulare Mycobacterium gordonae Mycobacterium kansasii Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Blastomyces dermatitidis Cryptococcus neoformans Neisseria gonnorrhoeae Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Haemophilus influenzae Especies de Enterococcus Streptococcus agalactiae

Formato de h i b r i d a c i ó n

Sistema informador

En solución

Ester acridina

En solución En solución

Ésler acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridina

En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución En solución

Ester acridina Ésler acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridma Ester acridina Ester acridina Ester acridma Ester acridina

'Las pruebas recogidas han sido desarrolladas por Gen-Probe Inc . San Die- | go. CA La tabla contiene ejemplos de las pruebas descrilas sin pretender sei exhaustiva. Las páginas web de los principales fabricantes son una fuente útil para una información actualizada. J

en pruebas diagnósticas fue posible al principio por pruebas de ADN. Una variedad de todas las pruebas genómicas y pruebas de oligonucleotides para los tipos más comunes de HPV (p. ej.. tipos 16 y 18 comúnmente asociados con carcinoma uterino cervical y los tipos 6 y 11 asociados con enfermedad benigna) han sido descritas y se han utilizado tanto el titulaje isotópico como el no isotópico (Faulkner-Jones, 1993; Lorinez, 1992; Ángel, 1992). Los formatos Southern blot y ranura/punto blot también se han investigado para el diagnóstico de toxoplasmosis cerebral y malaria falciparum entre otros, pero aún no han sido utilizados en los laboratorios diagnósticos. Los sistemas comerciales han utilizado la hibndación de fase solución con un titulaie no isotópico. Aquellos que no utilizan señal de amplificación serán considerados en primer lugar. Los productos titulados con éster acridina PACE 2 (Gen-Probe) con una detección quimioluminiscente son quizá los más utilizados. Otras técnicas para la aproximación diagnóstica son los sistemas de ensayo de captura de híbridos (HCA) (Digene y Murex). Tanto el Gen- Probe como los ensayos de captura de híbridos usan un titulaje con prueba no radiactiva que permite una larga vida. Además, el formato es relativamente sencillo y puede utilizarse para un número pequeño o grande de muestras. Las pruebas Gen-Probe (titulación con éster acridina) para la detección de la Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae están disponibles comercialmente. Se puede utilizar una muestra clínica para detectar ambos patógenos. El proceso entero se realiza en un único tubo, y la señal quimioluminiscenle se lee en un luminómetro y se interpreta relativamente para un control positivo o negativo. La liabilidad del equipo Gen-Probe para detectar C. trachomatis en muestras clínicas se ha evaluado en luncion del cultivo celular y métodos inmunológicos. Al igual que los métodos inmunológicos, pero a diferencia del cultivo, el método no depende de la viabilidad de los patógenos. En un estudio comparativo reciente, el método Gen-Probe era más sensible que el enzimoinmunoensayo Chlamydiazima (EIA). pero menos sensible que un ensayo comercial de amplificación de dianas (AMP-CT, Gen-Probe) (Wylie. 1998). El ensayo GenProbe para N. gonorrhoeae se ha evaluado en un número de estudios que recientemente han sido revisados con exhaustividad (Koumans. 1998). Los supervisores dicen que el ensayo puede ser más útil en situaciones donde la optimización del cultivo es difícil. Un punto significativo adicional es el requerimiento continuo de cultivo para propósitos médico-legales. Los HCA para detectar el HPV. el virus del herpes simple (VHS) y el citomegalovirus (CMV) ya han sido descritos. Los ensayos HCA se han descrito como más sensibles que los cultivos para detectar tanto el VHS como el CMV. Unas modificaciones recientes del ensayo HPV están dirigidas a mejorar la sensibilidad. El sistema HC es. sin embargo, menos sensible que la amplificación de ácidos nucleicos (Barret-Muir. 1958: Cope. 1997: Cullen. 1997: Poljiak. 1999). Las pruebas de ADN de cadenas ramificadas (Chiron) y Q|3 replicasa (Gene-Trak) (Shan, 1994) representan test de estrategias diagnósticas que incorporan una amplificación de señal. Las pruebas de ADN de cadenas ramificadas se han desarrollado para la detección y cuantificación del virus de la

CAPÍTULO 56

Tabla 56-3

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PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

S i s t e m a s diagnósticos comerciales d e amplificación de ácidos nucleicos*

Organismo

Técnica de a m p l i f i c a c i ó n

Detección de la a m p l i f i c a c i ó n

Virus de la hepatitis C

Transcnplasa inversa y PCR NASBA

Prueba de captura microtltulo' Prueba del oligonucleótido suieto al abalorio magnético

VIH

PCR y transcriptasa inversa

Prueba de captura microtltulo

NASBA

Prueba del oligonucleótido sujeto ai abalorio magnético

PCR

Prueba de captura microtitulo'

NASBA

Prueba del oligonucleótido suieto al abalorio magnético

Cilomegalovirus

Mycobacterium tuberculosis

1

1

1

1

PCR

Prueba de captura microtltulo'

SDA

Prueba de captura microwell'

TMA

Prueba do éster acridina"'

LCR

Captura de anticuerpos del producto etiquetado

PCR

Prueba de captura microtltulo'

LCR

Captura de anticuerpos de producto etiquetado

1

NASBA

Prueba del oligonucleótido suieto al abalorio magnético

TMA

Prueba del éster acridina"

PCR

Prueba de captura microtitulo' Captura de anticuerpos de producto etiquetado |

1

Neisscria gonnorrhoeae

LCR

tivo por hibridación no depende de la capacidad para detectar cantidades pequeñas de ácidos nucleicos. La ventaja de la identificación basada en la prueba sobre métodos no moleculares es mejor para organismos de crecimiento lento, como las micobacteñas u organismos para los que no hay sistemas de identificación disponibles en el mercado. En este punto, la identificación por hibridación es relativamente cara, porque en muchos sitios los aislamientos para identificarlos se hacen de manera individual y hay que hacer un gran número de controles para cada aislamiento clínico. En este capítulo se comentarán algunas de las pruebas descritas o disponibles en el mercado. La identificación de las micobacteñas cultivadas por un método convencional es lenta, tarda mucho tiempo. Las pruebas de titulación con éster acridina para el complejo Mycobacterium tuberculosis complex. Mycobacterium avium-intracellulare. M. gordonae y M. kansasii están comercialmente disponibles (Gen-Probe. San Diego, CA). El uso de estas pruebas permite la identificación del cultivo en un día de trabajo, y la especificidad y sensibilidad son excelentes (99% y 95,5%, respectivamente) (Goto. 1991: Walton, 1991; Richter. 1999). En algunas ocasiones, alguna variedad de M. tuberculosis puede no reaccionar con la prueba del complejo M. tuberculosis, y parece que hay subespecies de M. kansasii que no reaccionan con la prueba M. kansasii(Badak, 1999; Niemann, 1999).

1

Chlamydia trachomatis

1243

1

"La tabla contiene eiemplos de las pruebas descritas, sin pretender ser exhaustiva Las paginas web de los principales fabricantes son una luente útil para una información actualizada 'Roche. Indianapolis. IN 'Organon Teknika. Durham NC ^Becton Dickinson Cockeysville. MD "Gen-Probe, Inc.. San Diego. CA "Abbott. Abbotl Park. IL PCR: Reacción en cadena de la pohmerasa: NASSA amplificación basada en I la hebra de ácido nucleico. SAD amplificación por desplazamiento de hebra: ! TMA amplificación mediada por transcripción; LCR: reacción en cadena de la | ligasa.

hepatitis C (VHC) y el virus de la hepatitis B (VHB) (Urdea. 1991; Heerman, 1999). el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Murphy 1999) y para la detección del gen mecA. asociado con resistencia a la oxacilina en estafilococos (Kolbert, 1998). Este ensayo de hibridación se presenta en un formato similar al del inmunoensayo de enzimas. La prueba para hibridación de dianas se da en una solución, y después se captura el híbrido para el microtítulo por una prueba adicional unido al microtitulo. El límite de detección de ácidos nucleicos diana no es tan bajo como el conseguido con la amplificación de la diana (Lunel, 1999; Yen-üeberman, 1996; Zaaijer, 1994). Los resultados cuantitativos en un rango alto de concentraciones de dianas pueden ser útiles para detectar la carga viral, el pronóstico y monitorizar la respuesta al tratamiento en muchas infecciones virales (Heerman, 1999; Yen-Lieberman.1996; Lunel, 1999).

Pruebas de ADN para identificación de cultivos Las pruebas de ADN tienen unas reglas establecidas para la identificación de cultivos de microorganismos (Tabla 56-2). La identificación del cul-

Los métodos de identificación del cultivo de Histoplasma capsulatum. Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis y Cryptococcus neolormans también están disponibles (Stockman. 1993). Las evaluaciones indican que la especificidad es del 100% y la sensibilidad del 97% o más para todas las especies excepto para B. dermatitidis (87.8%) Al repetir el test, la sensibilidad aumentó al 97.3% para B. dermatitidis y el 100% para otras especies. El sistema Gen-Probe N. gonorrhoeae se ha utilizado para la identificación de cultivos N. gonorrhoeae, además del uso para su aplicación directa en especímenes clínicos (AccuProbe) se compara favorablemente con un sistema comercial de utilización rápida de carbohidratos (Quadferm. bioMérieux) y un sistema de coaglutinación (Phadeback Monoclone GC test) para identificación de N. gonorrhoeae cultivadas. Las pruebas de ADN tituladas con éster acridina son válidas para la identificación de cultivos de Staphylococcus aureus. Streptococcus pneumoniae. Escherichia coli. Haemophilus influenzae, Enterococus spp., Streptococcus agalactiae y Listeria monocytogenes. Estas pruebas se han utilizado para identificar organismos cosechados en los botes de hemocultivo que hayan sido positivos por centrifugación (Davis, 1991). La identificación se realiza en treinta minutos y es sencilla.

Amplificación del ADN para diagnóstico La amplificación de ácidos nucleicos tiene el potencial para superar la principal limitación de la hibridación ampliando selectivamente las dianas específicas que están presentes en concentraciones bajas para niveles detectables. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Sistemas Moleculares Roche) fue la primera técnica de amplificación desarrollada y permanece como el método más conocido y empleado. Nuevas tecnologías de amplificación, la reacción en cadena de la ligasa (LCR. Laboratorios Abbott), la amplificación de hebras de ácidos nucleicos (NASBA, Organon Teknika), la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA. Becton y Dickinson) y la amplificación mediada por transcripción (TMA. Gen-Probe) forman las bases de los sistemas de diagnóstico adicionales que están disponibles en la actualidad. El desarrollo de los productos comercializados se ha centrado principalmente en sistemas para detectar infecciones virales especificas (virus de la hepatitis C. virus de la hepatitis B, CMV, VIH), en los agentes principales de las enfermedades de transmisión sexual (N. gonorrhoeae y C. trachomatis) y en el complejo M. tuberculosis. Los productos comerciales se diseñan con vista a que el usuario los acepte, prevenir la contaminación, estandarización de reactivos y potenciales condiciones de reconversión. No está claro a qué nivel las diferencias son significativas entre los niveles de delección logrados utilizando diferentes estrategias de amplificación. Se ha informado de un número de estudios comparando dos o más métodos de amplificación para patógenos particulares (Brown. 1999; Griffith. 1997; Schepetiuk, 1997: Slary. 1998) y. en general, ninguno de los nuevos métodos ha demostrado un nivel de sensibilidad mayor que la PCR. Los factores para elegir entre los sistemas pueden incluir el porcentaje de productos disponibles, el coste y la conveniencia de

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SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

que pueda hacer en laboratorios individuales. Probablemente es más práctico para un laboratorio elegir un sistema de amplificación sencillo que les pueda proporcionar todos los test que ellos piden. En la Tabla 56-3 se resumen algunos de los patógenos que han recibido mayor atención, y los métodos de amplificación que se han utilizado. El número de sistemas diagnósticos disponibles está constantemente aumentando, y las páginas web de algunos de los principales fabricantes dan información útil y actualizada de los productos disponibles o en desarrollo. En la actualidad, los métodos moleculares tienen una regla establecida para el diagnóstico clínico y la dirección de un número de ¡nlecciones virales, y puede volverse también valioso en el screening de donaciones de sangre (Roth, 1999). En el caso de algunos patógenos bacterianos, la evaluación de la regla de los métodos moleculares relacionados con el cultivo o métodos inmunológicos puede ser difícil de valorar. En la mayoría de los estudios hay un numero de muestras que son positivas para los test de ensayos basados en la amplificación, pero negativas por métodos inmunológicos o de cultivo. La clasificación de los resultados de estos test son falsos positivos por amplificación o falsos negativos por cultivo/detección de antígeno, tienen implicaciones importantes para los propósitos de calcular la sensibilidad y especificidad de los ensayos basados en la amplificación y en juzgar los méritos relacionados con las diferentes actitudes para el diagnóstico de laboratorio. Muchos investigadores han intentado tratar el problema utilizando la técnica de análisis diferentes. El valor y limitaciones de los análisis diferentes crea controversias: los que la proponen la consideran como la actitud disponible más práctica (Schachter. 1998). mientras que los que se oponen creen que el proceso tiende a predisponer resultados a favor de los ensayos basados en la amplificación (Hadgu, 1996; Miller, 1998). Una dificultad adicional en la toma de decisiones concerniente al papel de ciertos ensayos, basados en la amplificación, en el laboratorio clínico debe expresar las reservas en una revisión, considerando la calidad de muchos estudios publicados (Koumans, 1998).

Diagnóstico de infección viral La identilicación del VHC ha sido posible gracias a las técnicas de biología molecular: por tanto, no es sorprendente que la PCR y otros métodos moleculares tengan un papel importante en su diagnóstico. La serologia nos permite detectar una infección previa por VHC, pero no permite diferenciar entre la infección actual y una curación espontánea. Como el VHC es un ARN-virus, la transcripción inversa en cADN es un paso preliminar necesario para la amplilicación por PCR. Ya se han descrito una variedad de reacciones PCR utilizando la transcnptasa inversa y la ADN-polimerasa. El mercado de Roche Diagnostic comercializa un producto (Amplicor RT-PCR) en el que la transcriptasa inversa y la amplilicación se realizan por la misma enzima, la de Tth del Thermus thermophilus. y este proceso ha sido automatizado (COBAS Amplicor System) (Poljak. 1997). La detección del virus por métodos moleculares confirma la infección reciente y tiene establecida una regla en el diagnóstico clínico de la infección por VHC y en una respuesta monitorizada para el tratamiento. Para el diagnóstico de infección por VIH se detectan anticuerpos específicos para el virus con un test serológico, y como la acreditación espontánea del VIH no es anticipada, generalmente se acepta la detección de estos anticuerpos inequívocamente como una evidencia de infección actual. En el caso de recién nacidos, la detección de anticuerpos puede reflejar una transferencia transplacentaria de anticuerpos maternos, y se requiere un período prolongado de seguimiento (mas de 18 meses) para confirmar la infección sólo por métodos serologicos. La detección de virus por métodos moleculares tiene una regla para resolver el estado de esos niños y también para dirigir a esos pacientes de quienes el suero es, en repetidas ocasiones, indeterminado en los test serologicos. El VIH existe en la sangre como ARN-virus y como ADN-proviral incorporado en el genoma de células mononucleares de sangre periférica. La transcriptasa inversa no es necesaria para detectar el ADN-proviral, pero se necesita para la detección o cuantificación de ARN-VIH libre. Se ha publicado que el ensayo Amplicor Monitor es más sensible que el A DNramificado o el NASBA para la detección del VIH (Bootman. 1999). y niveles de detección tan bajos como 20 copias de ARN-VIH/ml de plasma pueden conseguirse mediante el uso de protocolos de extracción específicos para el ARN (Fischer, 1999).

La PCR también ha sido ampliamente estudiada para el diagnóstico de la infección por CMV en pacientes trasplantados, y se ha descrito un sistema comercial para la delección de CMV por PCR (Long. 1998). Los problemas del diagnóstico de enfermedad por CMV difieren del VHC y del VIH en que el virus es ubicuo, y por tanto su detección en sangre por cualquier método no confirma la enfermedad clínica per se. El desafio en el diagnóstico de CMV ha sido distinguir a los pacientes inmunocomprometidos que tienen o van a desarrollar la enfermedad relacionada con el CMV de aquellos en los que la infección por CMV no es clínicamente signilicativa. Por estas razones, el CMV estaba entre los primeros virus en los que la cuantificación del virus por la PCR fue investigada (Gema, 1994). Más recientemente, la detección del ARN-mensajero CMV. que representa la evidencia de una transcripción activa del genoma viral, ha sido utilizada para detectar la enfermedad por CMV y valorar las respuestas al tratamiento con informes micialmente favorables (Aono. 1998). La cuantificación de los virus por métodos moleculares ha sido reconocida ahora como de importancia significativa en relación con VHC, VIH y VHB y, posiblemente, también con aquellos como el virus Epstein-Barr asociado con enfermedad linfoproliferativa En test de PCR cuantitativos, una cantidad conocida de una diana alterada por PCR o unas series de concentraciones conocidas de dianas alteradas se añaden a las reacciones de PCR que contienen dianas de ADN nativo a partir de una muestra de un paciente. Las cantidades relativas generadas a partir del nativo y una diana alterada o un patrón interno reflejan las cantidades relativas generadas en el sustrato de amplificación, y esto permite su cuantificación. El sistema de detección del generado se debe diferenciar de los originados del nativo y de la secuencia alterada del patrón estándar. Esto puede acompañarse por el uso del microtitulo wells que contengan tanto una prueba especifica para el tipo nativo como una prueba especifica de diana modificada. Una aproximación más actual de la PCR cuantitativa es la tecnología Taqman. que explota la actividad de la exonucleasa 3 -5 de la enzima polimerasa (Kimura. 1999). En adición a los primeros, la mezcla de la reacción contiene una prueba interna que se degrada durante el primer paso de extensión de cada ciclo de PCR La degradación de la prueba interna causa un aumento de la señal fluorescente en la mezcla amplificada. La señal fluorescente puede monilonzarse continuamente a través del proceso de amplificación, y la intensidad de la señal en relación con el número de ciclos de amplificación realizados es en función del nivel de templados presentes al principio. Esta aproximación puede proporcionar una cuantificación más exacta sobre un rango más amplio de concentración inicial de dianas que la PCR cuantitativa convencional, en la que la concentración del generado se determina en un punto del tiempo determinado en un número definido de ciclos. La cuantificación del VHC puede ser importante en el pronóstico y monitorización del tratamiento, y una vanedad de sistemas para la cuantificación del VHC están disponibles o han sido descritos. Los más estudiados han sido quizá los métodos RT-PCR (Roche, Monitor) y el ADN-ramilicado (Chiron, Quantiplex) (Hawkins, 1997; Jacob, 1997: Lu, 1998); sin embargo, el NASBA (Organon) y la tecnología PCR cuantitativa nueva (Roche Taqman) se han descrito más recientemente (Lunel. 1999; Martel. 1999). La variedad de sistemas y el desarrollo crean los estatus definitivos acerca de los valores de la dificultad de los diferentes sistemas. Algunos asuntos importantes para tener en consideración son el registro dinámico de los sistemas disponibles (el registro de concentraciones de genomas virales dentro del cual el método es más exacto y reproducible). la variación en la capacidad para detectar y cuantificar los diferentes genotipos virales VHC y las dificultades del desarrollo de un patrón adecuado para la calibración. La cuantificación del virus VIH se utiliza mucho para el pronóstico y evaluación de la respuesta al tratamiento de la elevada actividad antirretroviral (HAART) (Ledergerber. 1999). Los acercamientos técnicos y los problemas asociados con la cuantificación de ARN-VIH son por ío general parecidos a esos que hemos comentado antes para el VHC (Erali. 1999; Triques. 1999). También se ha publicado una aproximación alternativa interesante para la cuantilicación del VIH basada en la medición de la actividad enzimática de la transcriptasa inversa en el plasma (García-Lerma. 1998). La PCR ha sido estudiada y/o utilizada para el diagnóstico de una variedad de otras infecciones virales, incluidas la infección por enterovirus (Pozo, 1998:

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PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Rotbart. 1994). VHS (Tremblay. 1997), virus JC (García de Viedma. 1999) y parvovirus (Jordán. 1998). Los mélodos basados en la amplificación pueden llegar a aumentar su importancia en el diagnóstico y tratamiento de la infección viral, como parece que aumenta el número de infecciones virales inlluidas por agentes antivirales específicos y, particularmente, en situaciones criticas, como en la infección del sistema nervioso central (Read. 1997).

Detección de patógenos bacterianos En estos últimos años se han evaluado un gran número de ensayos de amplificación para la detección del M tuberculosis complex (MTBC) en muestras respiratorias y no respiratorias. En general, la sensibilidad de estos ensayos es excelente (del 95% al 100%) para muestras en las que la extensión para bacilos ácido-resistentes (BAAR) es positiva, pero es más baja para muestras donde la extensión es negativa (con frecuencia del 50% al 80%) (leven, 1997; Piersimoni, 1998; Pfyfler, 1999; Tortoli, 1999), En métodos de PCR que utilizan varios métodos para la preparación de las muestras y dianas para amplificación, se asocian con falta de estandarización, como lo ilustra Noordhoek (1994), que encontró grandes variaciones en la capacidad de los laboratorios para detectar MTCB en muestras ciegas y para informar las muestras negativas correctamente. Para los laboratorios clinicos, los problemas de una estandarización pobre parecen reducirse por el uso de ensayos comerciales con un control central de la calidad de los reactivos y los procedimientos operantes. En general, los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos para la detección de MTBC son más sensibles que las extensiones BAAR, pero menos sensibles que el cultivo. En la actualidad, los ensayos comerciales están aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) sólo para los test de las extensiones BAAR positivas en muestras respiratorias. Aunque un número de estudios han comparado dos o más métodos basados en la amplificación (Brown, 1999; Piersimoni. 1998; Tortoli. 1998). ninguno de los estudios hasta el momento ha sido lo suficientemente exhaustivo como para lograr sacar una conclusión firme. El cultivo conserva su papel central en el diagnóstico de la tuberculosis porque los ensayos de amplificación existentes no detectan todas las muestras positivas para cultivo, y es necesario aislar el organismo para un test de sensibilidad (y su tipificación epidemiológica, si estuviese indicada). Los métodos de amplificación son altamente específicos en distinguir MTBC de otras micobacteñas que MTBC (MOTT) en muestras BAAR de extensiones positivas, esto nos permite iniciar un tratamiento adecuado y un control de la infección. En la actualidad, los test de amplificación no pueden sustituir la extensión BAAR, porque el último se utiliza para determinar el nivel de mfectividad de los pacientes (los pacientes con una extensión positiva son mucho más infecciosos que los de extensión negativa) y para juzgar la respuesta inicial al tratamiento. No hay un contexto similar en el que interpretar los métodos basados en la amplificación. Además, los métodos de amplificación responden una pregunta mucho más específica (¿está el MTBC presente'') que la extensión (¿están presentes BAAR?). En la actualidad, el papel de los ensayos de amplificación se complementa con los de microscopio y cultivo. La amplificación de ácidos nucleicos también se ha aplicado para otros patógenos bacterianos del tracto respiratorio. Legionella pneumophila es un patógeno enrevesado para el que un diagnóstico rápido puede ser de una gran importancia. El sistema Legionella EnviroAmp (Perkin Elmer) puede tener aplicaciones para una detección rápida de Legionella es muestras óroncoalveolares (Weir. 1998). De modo similar. Bordetella perlussis, Chlamydia pneumoniae y Mycoplasma pneumomae presentan dificultades particulares para el diagnostico de laboratono, que tiene que ser dirigido por PCR (Farrell. 1999; Grondahl. 1999: leven, 1997). Pueden ser prometedores para el futuro múltiples ensayos de PCR capaces de detectar y discriminar entre un gran número de patógenos respiratorios potenciales (virales y bacterianos) (Grondahl, 1999). El diagnóstico de las enfermedades de transmisión sexual también ha sido un área importante para el desarrollo de los ensayos de amplificación. N. gonorrhoeae crece rápidamente en una agar convencional apropiado, y el cultivo tiene una alta sensibilidad y especificidad bajo condiciones óptimas (Koumans. 1998). N. gonorrhoeae es difícil de detectar, sin embargo, una adecuada recogida y transporte y condiciones de cultivo son criticas y puede que no sea fácil realizarlas en cualquier lugar. El cultivo de C. trachomalis

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también es exigente, ya que requiere facilidades para el cultivo de tejidos, por tanto, los métodos que no son de cultivo para la detección del anlígeno de Chlamydia han sido muy utilizados durante vanos años. Casi lodos los métodos de amplificación se han descrito o desarrollado para la detección de C. trachomatis (Morre, 1998: Pasternack, 1999: Schepetiuk, 1997, Stary, 1998; Vincelette. 1999), En general, las evaluaciones publicadas indican que los métodos basados en la amplificación son específicos y más sensibles que el cultivo celular o los métodos inmunológicos (Schepetiuk. 1997: Stary. 1998; Vincelette. 1999; Wyiie. 1998). En un estudio multicéntrico reciente del automatizado test COBAS Amplicor CT/NG (Roche), la sensibilidad y especificidad variaban con el tipo de muestra (Vincelette. 1999). Para muestras uretrales de hombres, se publicó una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98,5%: para muestras endocervicales la sensibilidad era del 96.5% y la especificidad del 99,4%. y para la orina, la sensibilidad variaba del 94,4% al 95,1% y la especificidad del 99.8% al 100%. La realización de ensayos de amplificación de las muestras de orina puede facilitar el screening para la infección del C. trachomatis. La remisión de muestras de orina parecen ser más aceptables que los métodos de recogida de muestras más invasivos. Se han publicado comparaciones de diferentes métodos de amplitícación (Pasternack. 1999: Schepetiuk, 1997; Stary, 1998), pero en la actualidad no hay suficientes datos para determinar los méritos de cada uno de los diferentes sistemas. Ambos, tanto la PCR como el LCR. pueden también utilizarse para detectar N. gonorrhoeae: hay que examinar una sola muestra para ambos patógenos, y está disponible un ensayo PCR múltiple para la detección, tanto del patógeno N. gonorrhoeae como de C. trachomatis (Vincelette. 1999). El LCR ha sido publicado como más sensible que el cultivo (Kehl. 1998). y puede tener posibilidades para ser aplicado en muestras de orina en el screening para N. gonorrhoeae en poblaciones de bajo riesgo (Kacena, 1998). Las limitaciones de algunos estudios de ensayos de amplificación para la detección de N. gonorrhoeae se han resumido (Koumans. 1998). y esto, junto con la posibilidad de resultados falsos positivos con el Amplicor PCR con Neisseria subflava, enfaliza la necesidad del refinamiento de estas nuevas tecnologías (Farrel, 1999). Aunque los patógenos específicos que causan infección de los tractos respiratorio y urogenital han recibido mucha atención, los ensayos de PCR tienen también su utilidad. Se han descrito ensayos de PCR que son también capaces de amplificar los genes ribosomales rARN de prácticamente cualquier bacteria y de un gran número de muestras clínicas Una rápida secuencia de los productos amplificados y la comparación de la secuencia de datos con las secuencias en una base de dalos ADN puede permitir la identificación de una amplia variedad de organismos (Goldenberger, 1997: Tang, 1998). Esta aproximación también ha sido útil en buscar publicaciones para la detección e identificación de patógenos que antes eran desconocidos o incultivables (Fredericks, 1996). El desarrollo de la tecnología de trozo de gen puede aumentar el potencial de esta aproximación a la amplificación de un gen diana presente en todos los patógenos potenciales, seguido de una caracterización rápida del producto amplificado por hibridación entre un margen amplio de pruebas específicas de las especies (Belgrader, 1998: Marshall, 1998).

Detección de hongos La infección fúngica invasiva es un problema creciente en muchos países (Pfaller, 1994). Candida spp. están entre las causas que encabezan la infección nosocomial del torrente sanguíneo en EE.UU., y la aspergillosis es una causa significativa de mortalidad en pacientes trasplantados y otros pacientes inmunocomprometidos La infección fungica sislémica es diticil de diagnosticar a tiempo y puede que esto contribuya a una mortalidad elevada. La PCR ha sido estudiada para su posible uso en el diagnóstico de candidemia (Bougnoux. 1999) y aspergillosis invasiva (Latge, 1999), y recientemente se ha descrito un test de PCR con una amplia especificidad para una variedad de patógenos fúngicos (Van Burik, 1998). La aplicación clínica de la PCR para el diagnóstico de aspergillosis pulmonar invasiva es complicada por una alta frecuencia de muestras de lavados broncoalveolares positivos (BAL) de sujetos sanos, debido a la presencia transitoria de conidias en el tracto respiratorio. Es preferible utilizar el suero del plasma, dado que es menos probable la contaminación con conidias. Se ha publicado recientemente que un test de PCR progresivo puede ser más sensible que la delección de galactosa por el

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análisis de immunoabsorción enzimálica (ELISA) para el diagnóstico precoz de la Aspergillosis invasiva (Kawamura, 1999). Como las bacterias, la combinación de un amplio espectro de PCR para amplificar un producto de todos o de la mayor parte de los hongos asociados con infección humana es una estrategia potencialmente importante (Van Burik, 1998). La amplilicación podría seguirse de una hibridación del producto amplificado para una serie de especies. En la actualidad, aunque parece que se van a publicar artículos promeledores. la PCR para el diagnóstico de infección lúngica invasiva no se ha utilizado mucho y no ha sido convincente que pueda compensar las limitaciones del cultivo en un diagnóstico rápido de infección fúngica invasiva en huéspedes inmunocomprometidos.

527-bp de la región 16S rARN con análisis de ordenador pueden servir para identificar bacilos gramnegativos aeróbicos inusuales, y pueden tener también más aplicaciones (Tang. 1998). Se ha hecho énfasis en la necesidad critica de generar y completar bases de datos genéticas para asegurar la asignación apropiada de las especies basada en la secuencia del gen 16S rARN, (Fredericks, 1996; Tang. 1998). El potencial para la identificación de organismos mediante el uso de textos universales para obtener un generado seguido por un uso rápido de una extensa serie de especies, o incluso pruebas especificas de subespecies para definir las especies'subespecies. puede aumentar mucho mediante el desarrollo de la tecnología de los genes (Troesch, 1999).

Detección de resistencia antibiótica Detección de parásitos En los laboratorios clínicos, el diagnóstico de infecciones con muchos parásitos protozoos depende de las heces vistas al microscopio, de una extensión de sangre o de médula osea, o de tejido. La detección del antigeno en las heces en el caso de la Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum es una alternativa. El examen microscópico de las muestras implica dedicarle mucho tiempo, requiere una gran habilidad y tiene una sensibilidad limitada para muestras que tengan pocos microorganismos. Por estas razones, la PCR puede mejorar la detección de parásitos protozoos en los laboratorios clínicos. En un estudio, el ensayo PCR amplificando la subunidad pequeña rARN de Plasmodium fue más sensible que el examen microscópico de un frotis grueso de sangre durante veinte minutos realizado por microscopistas entrenados en diagnosticar la malaria falciparum y para monitorizar la respuesta al tratamiento (Cicerón. 1999). Se han obtenido resultados alentadores también para la delección de Babesia spp. en sangre y parásitos de Leishmania en sangre y médula ósea (Katakura. 1998; Krause, 1996). La detección en el líquido amniótico del ADN de Toxoplasma gondii puede facilitar un diagnóstico rápido para la toxoplasmosis congenita (Gratzl. 1998). y se ha usado en el líquido cefalorraquídeo (LCR) para el diagnóstico de toxoplasmosis cerebral. También se ha descrito su uso para detectar Entamoeba histolytica. Cryptosporidium parvum y Microsporidium (Haque, 1998; Morgan, 1998). Los sistemas de amplificación comerciales para detectar protozoos aún no están disponibles, así como otros patógenos han superado la calidad de la PCR para la detección de 7! gondii (Pelloux, 1998).

Identificación de cultivos La sensibilidad de métodos basados en la amplificación facilita su aplicación para una detección directa de genomas de patógenos específicos en material clínico, pero también son valiosos para la identificación de microbios cultivados. Una reacción de amplificación específica para las especies puede identificar especies sencillas de particular importancia, como MTBC. De modo alternativo, una reacción de amplificación puede destinarse a una diana de un género especifico o una diana 'universal" y restringir la digestión mediante endonucleasa o hibridación con múltiples pruebas, o puede utilizarse una determinación secuencial del generado para identificar y discriminar entre una variedad de especies. Inicialmente se utilizaba la identificación de cultivos por amplificación para micobacterias de crecimiento lento, pero también tiene aplicaciones para otros patógenos inusuales. Es lógico y conveniente para un laboratorio utilizar la amplificación para una detección directa para usar la misma tecnología para la identificación de cultivos donde sea posible. La amplificación de especies especificas se ha utilizado para una identificación rápida de M. tuberculosis. M. avium y M. intracellular cultivados (Ninet, 1999: Tortoli, 1998). La aplicación de esta aproximación a viales BACTEC positivos con un índice de crecimiento bajo puede reducir dos o tres días el tiempo para la confirmación de una diana de todos los miembros del género Mycobacterium, y la generación de patrones específicos para las especies mediante la digestión del generado con endonucleasas de restricción es un método alternativo que puede discriminar entre más de 30 especies de micobacterias (Devallois, 1997). Recientemente se han publicado múltiples pruebas de PCR para una diferenciación entre MTBC. M. avium y otras micobacterias (Cormican, 1995; Kulski, 1995). También se han utilizado múltiples PCR para una confirmación rápida de toxigenicidad en los hallazgos de E. coli citotóxico (Patón, 1988). La amplificación y la determinación secuencial de una región

La resistencia a los agentes microbianos es uno de los principales problemas de salud en esta década. Los métodos moleculares han contribuido sustancialmente para que podamos entender la genética de la resistencia antimicrobiana y la expansión de determinantes de la resistencia. También tienen la posibilidad de contribuir a detectar pronto la resistencia en el marco clínico (Tabla 56-4) (Bergeron. 1998). Los test convencionales estandarizados de sensibilidad antibiótica dependen del crecimiento Inicialmente. se necesita un cultivo puro del patógeno y, un día más como mínimo para el test de susceptibilidad. Con métodos de test de sensibilidad automatizados, como Vitek, los resultados pueden estar disponibles en unas horas para ciertos organismos. Los métodos rápidos que dependen del crecimiento pueden ser menos aplicables para la detección de mecanismos de resistencia, en los que es necesario un período de inducción en presencia de antibióticos antes de que se manifieste la resistencia. En el caso de resistencia meticilina/oxacilina en estafilococos, la resistencia puede expresarse de varias maneras, particularmente en el estafilococo coagulasa negativo (CNS), de modo que la resistencia antibiólica clínicamente relevante puede ser difícil de detectar por los test de sensibilidad estandarizados, incluso después de 48 horas de incubación. Por todas estas dificultades, la detección molecular del gen mecA está siendo cada vez más aceptada como método de referencia entre los métodos fenotípicos que han sido comparados. La PCR y, más recientemente, las pruebas de ADN ramificado han sido ampliamente investigadas para la aplicación para una detección rápida del estafilococo resistente a la meticilina (Kolbert, 1998; Marshall, 1997: Ramotar. 1998; Vannuffel, 1995). En el caso de los patógenos de crecimiento lento, especialmente MTBC. pueden pasar semanas entre el envío de las muestras y el informe final de la sensibilidad microbiana. Este retraso no fue considerado un gran problema durante años porque había disminuido la incidencia de tuberculosis y la resistencia antibiótica era infrecuente. Los test de sensibilidad eran realizados principalmente para confirmar la sensibilidad y para monitorizar la potencial aparición de resistencias. Desde finales de los años 80, los consejos del tiempo de laboratorio en relación al tratamiento de tuberculosis se han vuelto más esenciales por una sene de razones. Éstas incluyen el resurgimiento global de la tuberculosis (incluso en países desarrollados), el surgimiento y la expansión de la resistencia antibiótica para MTBC y la aparición de una población no despreciable con el síndrome de mmunodeficienaa adquirida (sida), en la que la tuberculosis puede progresar rápidamente hasta producir la muerte si no se pone el tratamiento adecuado. La amplificación de PCR de las secuencias de ADN del rpoB (resistente a la rifampicina) y los genes katG. mhA y ahpC (resistente a isoniacida), seguidas por la detección de mutaciones asociadas con resistencia mediante el polimorfismo conformacional de la hebra simple (SSCP). tiene una sensibilidad alta para la detección de resistencia a la rifampicina (>96%) y la isoniacida (87%) (Telenti. 1997). Ha sido recientemente publicado el uso de pruebas de ADN de alia densidad en combinación con PCR para detectar mutaciones en el gen rpoB. Este método tiene la posibilidad de detectar la resistencia a la rifampicina en pocas horas (Troesch, 1999) y podría, en principio, ser aplicado directamente a las muestras sin cultivo previo. Un reconocimiento rápido de las cadenas de MTBC resistentes a los antibióticos es importante para prevenir la expansión de la infección con esas cadenas en pacientes susceptibles y personal sanitario. Los métodos moleculares tienen también aplicaciones para la detección de la resistencia a las medicinas en un gran espectro de organismos. Se ha publicado la detección de resistencia a la vancomicina en enterneceos, neumococos resistentes a la penicilina y en el gen b/a , |5-lactamasa del Hae;u

CAPÍTULO 56

PATOLOGÌA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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Tabla 56-4 Detección d e los p r o b l e m a s d e resistencia a los antibióticos por m é t o d o s moleculares Gen

Agente Meticilina

Prueba de ADN estándar Prueba de ADN ramilicada PCR

Estafilococos

vanA. B. C. D'

Prueba de ADN estándar PCR Prueba estándar PCR y RFLP PCR y secuencia PCR y secuenciamiento

Enterococos

Oxacilina Vancomicma Bela-lactámicos

Ouinolonas

Mutaciones en gyrA. gyrB. parC y parE

Rifampicina

Mutaciones puntuales en rpoB

Isoniacida Etambutol Estreptomicina

Mutaciones puntuales en katG, inhA, ahpC Mutaciones puntuales en embB Mutaciones puntuales en rpsL y rrs Mutación/deleción en el gen TK" Mutaciones puntuales en gen ADN-polimerasa Mutaciones puntuales en el gel RT*

Aciclovir/lármacos relacionados Foscarnet inhibidores transcriptasa inversa Inhibidores proteasa

Organismos

Método de detección

mecA"

Mutaciones puntuales en el gen PROT"

-

PCR y SSCP PCR y secuencia trozo de ADN PCR y PCR y SSCP PCR y secuencia PCR y RFLP PCR y secuenciamiento PCR y secuenciamiento PCR y secuenciamiento PCR y LIPA PCR y secuenciamiento

Haemophilus influenzae Enterobacteriaceae N gonorrhoeae Enterobacteriaceae y cocos grampositivos Mycobacterium tuberculosis'

M tuberculosis^ M tuberculosisM tuberculosis'* Herpes virus" Herpes virus" VIH VIH'

"El mecA codifica la proteina PBP2a' ligada a penicilina alterada, los métodos fenotipicos pueden requerir 48 horas de incubación o mas para detectar las resisten cias y poseen una sensibilidad menor del 100%. La detección de mecA tiene una potencial aplicación clínica para circunstancias especificas 'La resistencia a vancomicina en enterococos puede ser descrita en uno de cada cualro genotipos de resistencia, de los cuales vanA y vanB son los de mayor importancia. La deteción genotipica de la resistencia es útil en la validación de los métodos lenotipicos. La base genética de la resistencia a |i-lactámicos es extremadamente compleja. El bla y el bla son los dos grupos mas comunes de plásmidos codificados que codifican la resistencia a las celalosporinas de tercera generación y a los monopenémicos. •'Mycobacterium tuberculosis es un organismo de crecimiento muy lento Pueden ser necesarias cuatro o más semanas para lograr los resultados del test de susceptibilidad fenotípica La detección de los genes de resistencia en M. tuberculosis tiene potencial aplicación clinica a corlo plazo. "TK: timidina cinasa 'No hay métodos fenolipicos suficientemente prácticos para la delección clinica sistemática de la resistencia a los antivirales. Los métodos genolipicos representan un método práctico habitual para detección de resistencias antivirales 'RT transcriptasa inversa •"PROT proteasa. PCR reacción en cadena de la polimerasa; RFLP: polimorlismo en el Iragmento de restricción. SSCP: polimorfismo en la conlormacion de la hebra simple LIPA: ensayo de la prueba lineal !

nu

mophilus inlluenzaeen el líquido cefalorraquídeo (Bergeron. 1998; Cockerill. 1999; Jones. 1997: O'Neill. 1999; Tenover. 1994). También está cobrando importancia la detección de resistencia en los agentes antivirales desde que la resistencia a los medicamentos se ha reconocido como una barrera significativa para una quimioterapia efectiva de un número de infecciones virales. La detección fenotípica de resistencia a medicamentos en el VIH es compleja, requiere una gran dedicación de tiempo y, por tanto, es poco práctica para propósitos clínicos. Las mutaciones especificas en el gen transcriptasa inversa VIH-1 y el gen polimerasa se asocian con resistencia a los agentes antirretrovirales y pueden detectarse por una gran variedad de métodos moleculares. La detección de mulaciones en el genoma del VIH se relaciona con la detección de resistencia por test lenotípicos (Tedder, 1998). Un ensayo comercial, ensayo de la prueba lineal (LIPA), diseñado para detectar mutaciones en seis codones importantes en el gen transcriptasa inversa, asociadas con resistencia a los fármacos, se ha desarrollado en un intento de facilitar una detección más rápida; sin embargo, su realización puede no ser la adecuada para todas las mutaciones significativas (PuchhammaerStockl, 1999). Como en muchas otras circunstancias, donde se necesita hacer el screening de un gran número de mutaciones posible en el producto amplificado, el conjunto de pruebas de alta densidad (trozos de gen) puede ser útil en el futuro (Gunthard. 1998). Los métodos moleculares no parecen ser los sustitutos para una detección fenotípica de resistencia en la mayoría de las situaciones clínicas en un futuro previsible. Estos métodos pueden aplicarse directamente para muestras clínicas, y pueden, por tanto, ser apropiados para bacterias de crecimiento lento, sobre lodo en situaciones clínicas urgentes, y para la detección de

¡tN

resistencia en virus. Además, son aplicables a organismos no viables y pueden reducir los riesgos biológicos asociados con la manipulación de patógenos viables, como M. tuberculosis. Los métodos moleculares también pueden tener ventajas particulares en relación con los mecanismos de resistencia que se expresan sólo después de un período de incubación largo, desde que los métodos fenotípicos pueden no ser lo sulicientemente fiables a que no estén a tiempo en tales casos. Los métodos moleculares para la detección de resistencia antimicrobiana están limitados en muchos aspectos (Bergeron, 1998). Primero, la ausencia de un gen de resistencia conocido no excluye la posibilidad de resistencia por otro mecanismo. En términos prácticos, la detección molecular se basa en la detección de genes individuales bien caracterizados en especies o generos en los que se espera que se produzca. Los métodos moleculares no detectan los mecanismos de aparición de nuevas resistencias, y no es probable que se apliquen para la detección de la expresión de genes resistentes en especies en las que no se ha observado previamente. Una segunda limitación es que la presencia de un gen para resistencia antimicrobiana no obliga la expresión del fenotipo resistente. Por ejemplo. E. coli tiene un gen cromosómico para una |i-lactamasa similar a AmpC. pero, casi nunca se expresa. En principio esta limitación no es insalvable sí se utilizan preferentemente los ensayos para detectar mARN mejor que para detectar el gen cromosómico. Dadas estas limitaciones, parece probable que por el momento los métodos moleculares para detectar la resistencia antimicrobiana se vayan a quedar como herramientas de laboratorios de referencia, útiles en la monitorización a gran escala de los mecanismos de resistencia, y como estudios de la realización de los métodos fenotípicos.

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SECCIÓN VI

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 56-5 Métodos de epidemiología molecular* Ejemplos

Método

PCR y productos de secuenciamiento

Mycobacterium tuberculosis Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Clostridium difficile Staphylococcus aureus Stenotrophomonas mallophilia Candida albicans Enterobacter cloacae Serratia marcescens Klebsiella pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Candida albicans Enterobacter cloacae Acinetobacter baumanii Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Virus de la hepatitis C Staphylococcus aureus Virus de la hepatitis C Virus de la hepatitis C

PCR y polimorfismo conformacional de la hebra simple

Virus de la hepatitis B

Electroforesis de proteina en gel de poliacrilamida

Clostridium difficile Staphylococcus aureus Neisseria meningitidis Entamoeba histolytica

Polimorfismo de los fragmentos de restricción Enzimas cortantes frecuentes

Enzimas cortantes infrecuentes

Riboescritura

Prueba de hibridación de elementos repetitivos PCR y productos de electroforesis

PCR y productos de prueba de hibridación PCR, digestión de productos y electroforesis

Electroforesis de enzima multilocus

Comentario Gran número de bandas Ahora poco empleado Escasas bandas Electroforesis de pulso de campo Aplicación muy amplia Escasas bandas Automatizado Escasas bandas Perfil basado en secuencias específicas RAPD y otros Pequeña cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequeña cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequeña cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequeña cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Permite una detección de cambios de la secuencia menor en un área especilica Ahora poco empleado Útil para la amplia definición de las relaciones dentro de una especie

•La labia contiene eiemplos de métodos disponibles y aplicaciones y no pretende ser exhaustiva. ——__

Epidemiología molecular La variedad de herramientas disponibles en la aclualidad de epidemiología molecular es considerable (Tabla 56-5), y en particular ha existido una proliferación de métodos basados en la amplificación. Un análisis exhaustivo de los méritos relativos de estos métodos de aproximación diagnóstica está más allá del propósito de este capítulo. Es importante destacar que no hay una técnica universalmente aplicable y que la opción de un uso particular depende de las especies estudiadas, de aquello a lo que la petición hace referencia y de la conveniencia de la técnica. Las técnicas moleculares son útiles para responder preguntas de una clínica presente y para el control de infecciones, y no están limitadas para usos de investigación. Los ejemplos incluyen clarificar el significado de múltiples aislamientos de Staphylococcus epidermidis de un paciente particular y predecir una respuesta para el interferon en la infección por el virus de la hepatitis O La evidencia molecular de identificación del S. epidermidis realizada en diferentes momentos sugiere que el hallazgo es clínicamente significativo, y los genotipos VHC 1a y 1b parece menos probable que respondan al interferon que otros genotipos (MartinotPeignoux. 1998; Vandelli. 1999). Las técnicas moleculares también sirven de ayuda para detectar la emergencia y extensión de las cepas de un organismo con resistencias poco usuales a los fármacos usados, asi como la patogenicidad para determinar la eficacia de los procedimientos de control de la infección, y en la definición de la fuente de epidemias o infección debida a la comida o productos terapéuticos.

Métodos de tipificación molecular ADN-dependientes La bibliografía relativa a la tipificación molecular ADN-dependiente, y en particular a la tipificación por amplificación, se ha convertido en un laberinto de acrónimos y variaciones sutiles. Para poner algún orden en esta área, es útil considerar dos aspectos de cada método: el método técnico (amplificación, restricción de enzimas, prueba o una mezcla de todas eHas) y el princi-

pio (una imagen del cromosoma o foco en secuencias que evolucionan rápidamente). Los métodos de tipificación basados en el ADN. se basan en la divergencia progresiva que se produce en la secuencia de células bacterianas idénticas sobre un gran número de generaciones de división celular. Cuanto más parecida es la secuencia entre dos organismos aislados en pacientes distintos, más probable es que lo se originó fuera de una fuente común en el pasado. El grado de divergencia entre organismos puede advertirse en la secuencia entera de los cromosomas. El grado de resolución más alto para el método requeriría la secuencia de todos los cromosomas, pero esto no es práctico. Por tanto, la mayoría de los métodos desarrollados intentan identificar la variación de la secuencia en puntos distribuidos de manera aleatoria por todo el cromosoma. Esta imagen es la base para el polimorfismo en el fragmento de restricción (RFLP), electroforesis en gel por campo pulsado (PFGE), y la tipificación usando textos arbitrarios. La divergencia de la secuencia no se produce igual en todos los puntos del cromosoma. Algunos elementos específicos del cromosoma se alteran más rápidamente con respecto a otra secuencia de nucleótidos, o con respecto al número de copias del elemento y la distribución de las copias por lodo el cromosoma. Los ejemplos de secuencias de rápido desarrollo, incluidas las secuencias de inserción (IS), transposones (Tn), secuencias tándem repetidas e integrones (In). Un grupo de métodos de tipificación ha empleado estas secuencias altamente variables para estudiar la relación entre los microbios. Algunos métodos utilizan una combinación de la digestión total del cromosoma seguida de una búsqueda de secuencias repetidas. Algunas variables a tener en consideración para elegir un método de tipificación para una aplicación particular son su reproducibilidad (tanto en el propio laboratorio como en otros laboratorios), capacidad disenminativa, rapidez y relación beneficio-coste. Cada vez más, la inspección visual y la evaluación cualitativa de los patrones de unión logrados por muchos de estos métodos de tipificación están siendo complementadas por el uso de análisis cuantitativos monitorizados. y están apareciendo estudios de los métodos de análisis disponibles (Gener-Smidt, 1998; Olive, 1999). La

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PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

capacidad para Transferir rápidamente las imágenes dígitalizadas de patrones de unión a un laboratorio central con la posibilidad de una comparación rápida de cadenas, y la adaptación de consensos a la asignación de los tipos, es lo deseable para aumentar la capacidad de estas técnicas para seguir la pista de la evolución y expansión de cadenas específicas a nivel nacional e internacional. Las dificultades que hay que superar en los métodos de tipificación moleculares son considerables (Van Belkum, 1997). El análisis estándar RFLP con enzimas cortantes frecuentes puede generar un gran número de bandas en el gel de electroforesis. El método ha sido útil en la tipificación de una gran variedad de organismos. Por ejemplo, Bingen (1991) utilizaba RFLP para demostrar que el Enterococcus faecium resistente a la vancomicína aislado de un hospital francés no presentaba la extensión de una cadena sencilla resistente. Por la complejidad de los patrones de unión que hacen difícil el análisis, este método ha sido suplantado. Una solución para la complejidad de los patrones es identificar y analizar sólo un grupo que tenga una secuencia específica en múltiples copias en el genoma. Esto se consigue por una trasferencia de bandas de ADN del gel de electroforesis a una membrana (Southern blot) y la consiguiente aplicación de pruebas de ADN a la membrana. La secuencia multicopia que generalmente usamos es el gen ARN ribosómico. Este proceso, conocido como nbotipificación, ha sido utilizado para estudiar las relaciones entre cadenas de muchas especies, y se han publicado estudios comparativos del valor del ribotipificación en relación con los métodos de tipificación tradicionales para algunas especies. Un sistema totalmente automatizado y un sistema rápido para la realización de la ribotipilicación con una interpretación asistida por ordenador (Ribopnnter. Quahcon. Wilmington. DE) está ahora comercialmente disponible. El Ribopnnter ha sido presentado para ser más discriminatorio que la PCR para Salmonella entérica (Hilton, 1998); sin embargo, comparando el Ríboprinter con la PFGE para la tipificación de E. coli y Pseudomonas aeruginosa. éste era menos discriminatorio que la PFGE (Pfaller. 1996). Se ha sugerido que el Ribopnnter puede ser útil como una herramienta de tipificación de primera linea, pero que las cadenas que aparecen indistinguibles en la ribotipificación pueden ser distinguidas en diferentes grupos en la PFGE. De un modo similar se utilizan las pruebas que hibridan las secuencias multicopias diferentes de 16S rARN. Entre las aplicaciones mejor estudiadas está el uso de una prueba para la secuencia de inserción IS6110 para el tipo MTBC. Este método es relativamente lento y tiene un poder discriminatorio limitado para las cadenas de MTBC con pocas copias de la secuencia IS6110 (Yuen, 1993). Está bien estandarizado y ha sido muy informativo para definir la epidemiología de la tuberculosis (Bradford. 1998; van Embden, 1993). Más recientemente se han descrito un número de diferentes métodos de tipificación para MTBC para suplementar o sustituir el IS6110. La comprobación de las partes digeridas por RLPF con las secuencias ricas en GC polimórficas multicopia (PGRS) puede ser utilizada para suplementar la tipificación IS6110 para cadenas con un número bajo de copias IS6110 (Bradford, 1998). Un número adecuado de bandas para el análisis de la mayoría de los organismos (de 10 a 20 bandas) también puede conseguirse por PFGE (Allardet-Servent, 1989). PFGE utiliza la restricción de enzimas para cortar el ADN en secuencias, lo que ocurre poco frecuentemente, produciendo un número limitado de fragmentos de ADN grandes. Este método requiere que las fuerzas que causan las roturas aleatorias en el cromosoma bacteriano se eviten durante la preparación del ADN para la digestión. Esto se acompaña de la inmersión de la bacteria en tapones de agar antes de la digestión de la pared celular. También se debe emplear un sistema de electroforesis capaz de separar los grandes fragmentos de ADN. La separación de los fragmentos grandes es posible gracias a una alteración periódica de la dirección del campo eléctrico utilizado en la cámara de electroforesis. La PFGE permite la separación de cromosomas enteros, por lo que para las levaduras, que son eucarióticas, debe generarse un cariotipo sin la digestión de la enzima de restricción. La PFGE está considerada por algunos como el método más aplicable y el más aceptado para la tipificación molecular. Los principios para la interpretación de los geles de PFGE han sido propuestos, y para muchos organismos es el estándar de fado pata la tipificación molecular entre otros métodos que han sido comparados (Tenover, 1993). Las limitaciones principales de PFGE son que es un método relativamente lento y costoso; sin embargo, se ha avanzado al desarrollar protocolos rápidos de PFGE (Matushek. 1996). La PFGE es aplicable al estudio de la epidemiología de

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muchos patógenos, incluido S. áureos resistente a la meticilina (van Belkum, 1997), E faecium resistente a la vancomicína (Fridkin, 1998), Streptococcus pneumoniae penicilin resistente a la penicilina (Rudolph, 1998). Klebsiella pneumoniae productora de |í lactamasa de amplio espectro (Lin. 1998). E. CO//0157 (Grif. 1998). Stenotrophomonas maltophilia (Sader. 1994) y especies Candida para las que se puede utilizar tanto el cariotipo como el análisis RFLP (Cotmican. 1996). La amplificación ADN por PCR se aplica para la tipificación molecular en una variedad de modos. Una ventaja de las estrategias de tipificación utilizando PCR es que sólo se necesitan cantidades de ADN pequeñas. De modo adicional, el ADN templado puede ser una preparación bastante ordinaria, que generalmente no es el caso de los sistemas digestivos de enzimas de restricción. De modo más sencillo, las tipificaciones basadas en PCR incluyen el uso de uno o varios principios genéricos que terminan en la amplificación de varios fragmentos de varios tamaños. El número y tamaño de los fragmentos amplificados depende de la secuencia del genoma microbiano, y se revela un patrón de unión especifico para el tipo de electroforesis en gel (NiRiain, 1994). Este método de variaciones, con una titulación aleatoria de la amplificación del ADN polimorfo (RAPD) o amplificación de la huella dactilar de ADN (DAF). tiene una gran aplicación para una variedad de patógenos actuales, incluidos Enterobacter cloacae y Neisseriae meningitidis (NiRiain, 1994; Barí. 1998; Woods, 1994). La reproducibilidad de los patrones de unión utilizando textos genéricos puede ser problemática. Las uniones débiles pueden aparecer y desaparecer fácilmente; sin embargo, parece que algunos grupos han superado estas dificultades (Barí. 1998). Por lo general, estas técnicas puede que sean más aplicables a una caracterización rápida y preliminar de un número pequeño de cadenas dentro de una institución sencilla. También está surgiendo una variedad de aplicaciones de PCR para la tipificación de bacterias que usan la diversidad de secuencias repetitivas, como el consenso intergénico repetitivo de enterobacterias (ERIC-PCR) y las secuencias repetidas extragénicas palindrómicas (REPS). Estos empleos han sido válidos para tipilicar Acinetobacter spp. y otras muchas especies gramnegativas (Vila, 1996). La PCR también se ha utilizado en combinación con la digestión de la endonucleasa de restricción de todo el ADN cromosómico como polimorfismo amplificado de la longitud de los fragmentos (AFLP) tipificados. En esta técnica, se amplifica un subgrupo de los fragmentos generados por una digestión de ADN cromosómico con frecuentes enzimas cortadoras. En el caso de E. coli, la utilización de cebadores con titulaciones fluorescentes necesita conocer el tamaño de lodos los fragmentos en un secuenciador automatizado de ADN. y la disponibilidad de la secuencia completa del genoma E. coli K-12 ha resultado ser un método muy sofisticado (Arnold. 1999). El conocimiento de la secuencia del genoma del Haemophilus influenzae cadena Rd ha sido explotado de un modo similar para desarrollar un método de tipificación de PCR basado en el número variable de secuencias en tándem repetidas (VNTR) (van Belkum, 1997). El test de tipificación de MTBC es otro método que se asemeja bastante a la PCR. basada en la amplificación de las secuencias espadadoras no repetidas situadas entre las pequeñas unidades repetidoras (Sola. 1998). La PCR también se utiliza para amplificar zonas del genoma microbiano que evolucionan rápidamente, de modo que la conexión puede valorarse por una evaluación de los producios para una variación de la secuencia. Las zonas diana incluyen las regiones de espacio entre genes para ARN ribosómico en Aspergillus fumigatus y el gen coagulasa de S. aureus (Hookey. 1998: Radford. 1998). La variación de la secuencia puede verse por la evaluación de los patrones de unión producidos en la digestión del producto amplificado con enzimas de restricción o secuenciación del producto de PCR. Métodos de tipificación similares han servido para clasificar virus. La tipificación del VHC es de particular interés, asi como un genotipo viral es significativo para predecir una respuesta parecida al tratamienlo con interlerón-«. La realización del genotipo del VHC se basa Irecuentemenle en la detección de la variación de la secuencia en la región 5 conservada sin traducir del genoma por RFLP. hibridación para pruebas específicas del genotipo (Line Probé Assay. Innogenetics). por secuenciación o por polimorfismo de la longitud de los fragmentos (Davidson, 1995; Murphy. 1994; Seme, 1997: Sreevatsan, 1998: Stuyver, 1996). Se ha reconocido la posibilidad de una clasificación errónea de algunas cadenas donde la distinción se basa

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

en una sola diferencia de los nucleólidos. y puede que sea necesaria la determinación de la secuencia en la región central para algunos subtipos (Seme, 1998). La secuenciación directa del producto PCR obtenido con el equipo Roche Amplicor ha sido publicada y puede ser un acercamiento coste-beneficio para la determinación del genotipo VHC (Holland, 1998). Unos métodos similares han entrado en vigor para tipificar VIH y otros virus (Peltola. 1998). Los perfiles del plásmido se utilizan hoy día mucho menos que antes para la tipificación molecular, aunque el estudio del resto del ADN del plasmado es importante para definir la epidemiología de la difusión de los mecanismos de resistencia antimicrobiana. El estudio de los perfiles del plásmido conjuntamente con la tipificación basada en el ADN cromosómico ha revelado que en algunos casos la propagación nosocomial de las resistencias antimicrobianas puede reflejar la propagación simultánea de las resistencias ocultas en un plásmido y su facilidad de difusión (Liu, 1998).

Tipificaciones moleculares no ADN-dependientes Se han utilizado varios métodos de tipificación no basados en ácidos nucleicos para estudios epidemiológicos. La electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida (PAGE) se ha utilizado para muchas bacterias, pero ya no se utiliza (Mulligan. 1988). La electroforesis enzimática multilocus (MLEE) se basa en la movilidad electrotorética de un número de enzimas informativas. Las variaciones en la movilidad de las enzimas es la base de la tipificación. La MLEE es demandada técnicamente y puede verse como un modo de examinar las relaciones entre organismos en una escala de tiempo de evolución más larga que la que se proporciona por una inspección visual de los patrones de unión en muchos de los métodos de tipilicación basados en ADN. El estudio de la motilidad electrotorética de las enzimas informativas puede sustituirse por la determinación de la secuencia de los fragmentos amplificados de los genes codificando las respectivas enzimas, una técnica conocida como una secuencia tipificada multilocus (Vogel, 1998). Con el uso de los análisis asistidos por ordenador de los patrones de unión obtenidos por métodos de tipificación basados en el ADN o de una secuencia de datos de ADN. se pueden definir los grados de relación durante una escala de un periodo de evolución grande de modo similar a MLEE (Arnold, 1999: Bart, 1998).

ESTANDARIZACIÓN. CONTROL DE CALIDAD Y VALORACIÓN DE LA COMPETENCIA DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR Como para todo diagnóstico, la calidad de los resultados comienza con el acierto de la petición de la prueba y la calidad de la recogida de las muestras y su transporte. El laboratorio deberá dar al médico las directrices para saber qué muestras se pueden permitir, cómo recogerlas y cómo conservarlas, así como el tiempo necesario para ser remitida al laboratorio (véanse Caps. 1 y 57). En el laboratorio, el primer escalón en la valoración de la calidad es la adecuada validación de un test particular antes de su uso diagnóstico y. cuando se emplee, se debe prestar mucha atención para mantener los estándares de calidad. Estas directrices se han estipulado en recientes publicaciones de la Association for Molecular Pathology (1999) y del National Committee tor Clinical Laboratory Standards (NCCLS,1995). Pueden surgir problemas a diferentes niveles. El diseño de los test puede no ser capaz de distinguir toda la diversidad genética de los taxones (clasificación errónea del VHC subtipo 2c como 2b [Seme, 1987]) o bien solapar las características con taxones conocidos (falsos positivos de MTBC en pacientes con infección pulmonar por M. kansasiiy M. avium [Jorgensen. 1999]). Los problemas en el diseño pueden no ser reconocidos y su realización puede ser sobrestimada en las evaluaciones que no empleen adecuados test de referencia (Koumans. 1998). Un reciente informe de la pobre concordancia entre los laboratorios es el estudio de muestras ciegas para MTBC y para VHC mediante PCR (Noordhoek. 1994; Zaaijerr. 1993). donde se sugieren problemas operacionales en el diagnóstico de laboratorio. En un estudio más reciente. 4 de cada 15 laboratorios informaron de uno o más falsos positivos en el diagnóstico de toxoplasmosis med'ante prueba de

PCR (Pelloux. 1998). y lo mismo pasaba con la detección de enterovirus (Muir, 1999). El potencial de incrementar la concordancia entre los laboratorios gracias a la estandarización de los reactantes y a los protocolos se enfatiza en un informe para lograr una realización satisfactoria de la PCR para Chlamydia trachomatis (Mahony, 1994) y el mayor empleo de los sistemas comerciales con reactivos estandarizados, asi como de los análisis automatizados, pudiendo. en un futuro, reducir estos problemas. La preparación de las muestras es un asunto critico en el que se busca un equilibrio entre la simplicidad de la preparación (para lograr ser prácticos y disminuir los riesgos de contaminación) y la profundidad (para asegurar la liberación de los ácidos nucleicos y la eliminación de las sustancias inhibidores). Los controles se deben hacer para detectar la contaminación (p. ej.; el examen por duplicado, controles negativos múltiples) y para monitorizar la degradación de la diana o la existencia de inhibidores (control positivo en los límites de detección, estándar interno para la amplificación). El número adecuado de controles negativos es esencial y se deben llevar a cabo durante el proceso de preparación de las muestras. Tan sólo una parte de una muestra negativa es adecuada para este fin. La selección de controles y normas es muy problemática cuando el agente infeccioso diana es muy diverso (VIH y VHC) y cuando se requieren muchos resultados. La complejidad de estos asuntos es evidente en publicaciones de sistemas comerciales para la cuantilicacion de VHC en que pueden no detectar los genotipos 2 y 3 de un modo tan eficiente como el genotipo 1 (Hawkins, 1997) y en las diferencias en la eficiencia de la hibridación de clones de viriones derivados de ADN en ensayos para la cuantificación de ADN VHB (Heerman, 1999). Una evaluación detallada de parámetros que afectan el resultado de los ensayos para la cuantificación ARN VIH está disponibles, y muchos de los principios identificados son por lo general aplicables (Lew. 1998). Para asegurarse de que ios reactivos son de una gran calidad y están libres de contaminación, es conveniente comprar lampones preparados en otro lugar. En este caso, el fabricante es el responsable de proporcionar los datos de la calidad analítica de los reactivos. Una valoración de la calidad funcional relativa a los lotes previos puede ser adecuada. La contaminación es un problema considerable para los laboratorios que utilizan PCR diagnósticas. Los estudios entre laboratorios han mostrado que las muestras negativas pueden dar resultados positivos en algunos laboratorios, y la explicación más probable es el sobrediagnóstico de resultado. Claramente, las consecuencias sobre el cuidado de un paciente con un resultado falso positivo para VHC. VIH o MTBC son importantes. El fundamento de la prevención de este sobrediagnóstico en la mayoría de los laboratorios en este punto es la separación física de la reacción PCR establecida y las zonas de análisis del producto PCR con un flujo de trabajo estrictamente unidireccional. La automatización de PCR puede también ayudar en la prevención de este fenómeno (Wilke, 1995), y la mayoría de los fabricantes de equipos comerciales de diagnóstico molecular han desarrollado, o están en proceso de desarrollo, sistemas automatizados o semiautomatizados para minimizar la posibilidad de un error humano. Los resultados falsos positivos parecen ser poco frecuentes con el uso de sistemas de test comerciales automatizados (Víncelette, 1999). Además de la prevención del sobrediagnóstico, los métodos para prevenir la amplificación de productos que contaminan la PCR están disponibles. Los dos métodos principales son aquellos que utilizan isopsoralen para modificar los resultados a un estado no amplificable, y la ADN uracilo-glucosilasa, para degradar lo generado antes de la amplificación (Rys, 1993). En cualquiera de los sistemas que se utilicen, debería determinarse el impacto de la técnica en el límite de la detección de PCR. También es importante para demostrar la electividad de la medida dar el coste añadido al procedimiento. La comprobación funcional en cada uno de los lotes nuevos de enzimas es una comprobación adecuada en la producción y el procedimiento de reparto. Para la ADN pohmerasa, puede ser adecuada la comparación con un lote previo de enzimas utilizando pruebas en el límite de detección. Para la endonucleasa de restricción se recomienda la digestión de ADN lambda. La reproducibilidad en muchas técnicas moleculares es muy dependiente de un control preciso de la temperatura y del uso de un reactivo exacto. Lo primero y esencial para asegurar la calidad es la adquisición de un instrumento de alta calidad. Dos veces al año, o con más frecuencia, se recomienda la monitorización de la temperatura y su correcta realización (Kopp, 1994). Las pipetas deben calibrarse dos veces al año.

CAPÍTULO 56

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PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

El servicio de calidad del laboratorio no termina con la generación del resultado. El tiempo que tarda en darlo es un elemento esencial. Las guías para la interpretación del resultado son particularmente importantes en relación a los métodos nuevos, ya que los médicos pueden no estar familiarizados con las limitaciones de estos métodos. Las guias para la limitación apropiada del empleo de los test son importantes por razones financieras, estando implicados los asuntos de reembolso. Sólo recientemente la Health Care Financing Administration (HCFA) ha asignado códigos de pago para la detección e identificación de un número limitado de patógenos específicos [Health Care Financing Administration. 1999) Además, no se sabe con certeza los test que serán reembolsados. Dada una realización previa, es improbable que el nivel de reembolso cubra completamente los costes de los test en todas las circunstancias. La participación en programas de test de competencia es. obviamente, un aspecto importante y necesario para mantener la calidad de los servicios de diagnóstico en el laboratorio de microbiología. Los test de competencia para los métodos moleculares utilizados en la detección e identificación de agentes infecciosos están solamente disponibles para unos pocos organismos. El College of American Pathologists (CAP) proporciona modelos de test para la prueba basada en ácidos nucleicos para la detección e identificación de N. gonorrhoeae y C. trachomatis (CAP Inspección HC5): identificación de cultivos de micobacterias; y amplificación basada en la detección de una variedad de organismos, incluidos VIH, VHC, CMV. MTBC y Borrelia burgdorferi (CAP Inspección ID). La seguridad de la calidad en el diagnóstico molecular no es esencialmente diferente de los principios aplicados en otras áreas de patología clínica. La atención a los detalles, los controles adecuados y un conocimiento de los problemas potenciales, junto con una cuidadosa conservación, son esenciales.

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PATOLOGÍA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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C A P Í T U L O

57

Manejo y recogida de muestras para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas • Goil L. Woods, M.D.

SANGRE

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TRACTO URINARIO

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FLUIDOS CORPORALES

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TRACTO GENITAL

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TEJIDOS

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HECES

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OJO

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PIEL Y LESIONES SUBCUTÁNEAS

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TRACTO RESPIRATORIO

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BIBLIOGRAFÍA

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Las claves para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas son una adecuada recogida y un adecuado manejo de las muestras. Las guias para la recogida y transporte de muestras y el procedimiento se explican en este capítulo. Los principios generales se revisarán primero, seguidos de la explicación de los tipos más comunes de ejemplares encontrados en el laboratorio de microbiología. Para una detección óptima de los patógenos responsables de la enfermedad infecciosa, las muestras deberían tomarse cuando la probabilidad de recoger el agente sospechoso sea mayor. Por ejemplo, la probabilidad de recoger la mayoría de los virus es en la fase aguda de la enfermedad. Las muestras para bacterias se deberían recoger antes de la toma de antibióticos. El volumen de muestras recogido debe ser adecuado para el estudio microbíológico solicitado. Si el volumen recibido es insuficiente, el médico o enfermera de la sala deben informar, y se deberá sacar una muestra adicional o el médico debe priorizar las peticiones solicitadas. Si la muestra se recoge con una torunda, la punta de poliéster vale para todos los microorganismos. El alginato calcico debería evitarse para recoger muestras para el cultivo de virus, porque podria inactivar el herpes simple, el algodón podría ser tóxico para Neisseria gonorrhoeae y los depresores de madera deberían evitarse porque la madera podría ser tóxica para Chlamydia trachomatis. Las torundas no son adecuadas para la detección de anaerobios, micobacterias u hongos, y su uso no debería permitirse cuando se sospechan estos microorganismos. Las muestras deberían obtenerse del sitio de la infección sin que se contaminaran con otros tejidos adyacentes ni secreciones. Todas las muestras, excepto las heces, deberían recogerse en un recipiente estéril y ser etiquetadas con el nombre y el número de identificación de la persona a la que pertenece la muestra, la fuente de la muestra y la hora a la que fue recogida. Después de recogidas, las muestras deben ponerse en una bolsa de residuos biológicos y ser transportadas al laboratorio tan pronto como sea posible. Si el retraso es inevitable, la orina, el esputo y otras muestras respiratorias, heces y muestras para la detección de Chlamydia trachomatis o virus deben ser puestas en el frigorífico para prevenir un crecimiento de la flora normal. El líquido cefalorraquídeo (LCR) y otros fluidos corporales, la sangre y muestras recogidas para determinar Neisseria gonorrohoeae deben dejarse a temperatura ambiente, porque el frío afecta adversamente a la determinación de patógenos potenciales en estas fuentes.

Cada director de laboratorio debe establecer unos criterios para rechazar muestras Inadecuadas para cultivo. La mayoría de los microbiólogos coinciden en que las siguientes muestras deberían ser rechazadas. • • • •

Cualquier muestra recibida en formol. Esputos recogidos hace 24 horas. Muestras de contenedores en los que se ha derramado la muestra. Muestras que han sido inyectadas en placas de agar que se han secado o están caducadas. • Muestras contaminadas con bario, tintes químicos o agentes grasos. • Muestras de sondas Foley. • Muestras duplicadas (excepto hemocultivos) recibidas en un período de 24 horas. Las siguientes muestras deberían ser rechazadas para el cultivo de anaerobios: lavados gástricos, la orina de la mitad de la micción, heces (excepto para determinar Clostridium difficile) para estudios epidemiológicos o para el diagnóstico de la bacteria asociada a la intoxicación alimentaria (se explicará posteriormente), muestras orofaríngeas. excepto las muestras obtenidas de tejidos profundos durante un procedimiento quirúrgico, esputos, muestras de colostomía o ileostomía obtenidas con torunda y muestras superficiales de piel. Además, deberían establecerse unas normas para el manejo de muestras que no están etiquetadas o mal etiquetadas; dichas muestras no deberían ser analizadas hasta que se hubieran resuelto las diferencias. Con el manejo de todas las mueslras deben seguirse unas precauciones universales. Esto significa que hay que usar barreras adecuadas para prevenir la exposición de piel y mucosas a las muestras. En todo momento deben llevarse guantes, mascarillas y gafas (o trabajar detrás de una protección de plástico), y deben llevarse trajes o delantales impermeables en situaciones que haya riesgo de que se derrame el contenido. Lo deseable sería que todos los recipientes para muestras, como minimo esos que contienen secreciones respiratorias y los que se someten especialmente para la detección de una micobacteria u hongo, se abrieran en una cabina de seguridad. Las muestras recogidas para aislar un virus deberían ser manejadas en una cabina de seguridad biológica para evitar la contaminación de los cultivos celulares. Cuando las muestras o cultivos tienen que ser transportados a través del servicio postal de EE.UU. a un laboratorio de referencia, deben ser empaquetados de acuerdo al código interestatal de transporte de agentes biológicos.

CAPÍTULO 57

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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Las muestras deben estar limitadas a no más de 40 mi. Los cultivos de bacterias y hongos deberían crecer en unos tubos en un medio sólido. El cierre del recipiente primario (tubo o vial) debería ser sellado con una cinta resistente al agua e introducido en un segundo contenedor (preferiblemente metal) rodeado por una cantidad de material suficiente para absorber el volumen total de la muestra por si el primer contenedor se rompiera o saliera. El segundo contenedor debe ser cerrado y puesto en un recipiente para transportar (hecho de cartón, fibra mecanizada o poliestireno), y etiquetado con una etiqueta oficial de agentes etiológicos (disponible en los centros para la prevención y control de enfermedades). Si una muestra debe ser transportada en hielo seco (que está considerado como material de riesgo), debe decir "Hielo seco, muestra clínica congelada". El hielo seco debería ponerse luera del segundo recipiente con el material empaquetado, de manera que el material no se pierda dentro del recipiente extemo si el hielo seco se evapora.

SANGRE La detección de patógenos en la sangre es una de las (unciones más importantes del laboratorio de microbiología. El hemocultivo es imprescindible para identificar la bacteria responsable de la bacteriemia, la sepsis, las infecciones de válvulas nativas y protésicas, la tromboflebitis infecciosa, los aneurismas fúngicos y las infecciones de injertos vasculares. Los hemocultivos también son útiles en el diagnóstico de algunas infecciones víricas e infecciones invasivas o diseminadas causadas por ciertos hongos, especialmente especies de Candida. Cryptococcus neolormans. especies de Fusarium e Histoplasma capsutalum. Los parásitos son detectados en la sangre por un examen microscópico de frotis de sangre periférica. En general, la sangre deberia ser recogida para cultivo antes de empezar el tratamiento con antibióticos o cuando esté presente uno o una combinación de los siguientes síntomas: fiebre (38"C o más), hipotermia (36"C o menos), leucocitosis (especialmente con desviación a la izquierda), granulocitopenia o hipotensión. El tiempo de detección y la identificación exacta de los organismos en la sangre depende de una adecuada recogida, del transporte y del proceso de la muestra. La técnica para detectar todos los microorganismos en la sangre es la flebotomía. Para minimizar la contaminación de la muestra sanguínea con la flora de la piel, el lugar de la venopunción deberia prepararse con un agente bactericida (el 70% de isopropanol o alcohol etílico) y después con 1%-2% de solución yodada o clorhexidina. Para una asepsia mayor, el lugar debería estar seco 1 ó 2 minutos antes de la venopunción Otros aspectos de la recogida de muestras varían para bacterias, virus y parásitos. Detección de bacterias y hongos. El momento óptimo para sacar los hemocultivos cuando se sospecha una bacteriemia o funguemia es antes del resfriado, pero como eso no se puede predecir, la mayoría de los hemocultivos se recogen después de comenzar con fiebre o catarro. La sangre se extrae con una aguja y una jeringa y, sin cambiar la aguja, se inyecta directamente en los frascos de hemocultivo o en otro sistema de hemocultivo (Krumholz. 1990). Los frascos o tubos inyectados deben invertirse inmediatamente varias veces para asegurar la mezcla, y ésta deberá transportarse al laboratorio a temperatura ambiente lo antes posible después de haber sido recogida. Los hemocultivos nunca deben ponerse en el frigorífico. En adultos con bacteriemia, el número de unidades formadoras de colonias (CFU) por mi de sangre generalmente es bajo. En un estudio, por ejemplo, el 25% de los pacientes con Staphilococcus aureus y más del 50% con Escherichia coli o Pseudomonas aeruginosa tienen menos de una colonia por mililitro de sangre (Henry. 1986). Dado este bajo nivel de bacteriemias en adultos, es recomendable recoger de 20 mi a 30 mi de sangre para el hemocultivo (Washington, 1986; llstrup, 1983). En recién nacidos y niños, la concentración de microorganismos en la sangre es mayor, por lo que con recoger de 1 mi a 5 mi es suficiente (Dietzman, 1974). Las recomendaciones relacionadas con el número de muestras que hay que tomar están basadas en la naturaleza de la bacteriemia. dependiendo de si es transitona, intermitente o continua. La bacteriemia transitoria sigue a un proceso de manipulación de un foco de infección (un absceso, un forúnculo o

1255

celulitis), instrumentación de una superficie mucosa infectada (como ocurre en procesos dentales, cistoscopías, sondaje vesical, aborto provocado o sigmoidoscopia) o un procedimiento quirúrgico de una zona contaminada (como resección transuretral de la próstata (RTU), histerectomía, resección de colon y desbridamiento de quemaduras infectadas). La bacteriemia transitoria también aparece al principio de muchas infecciones sistémicas y locales, como meningitis, neumonía, artritis piógena y osteomielitis. La mayor parte de las bacteriemías intermitentes se asocian con abscesos que no se han drenado, mientras que una bactenemia continua es evidencia de una infección intravascular, como endocarditis bacteriana, aneurisma fúngico. o un catéter intravascular infectado. Una bacteriemia continua también se produce durante las primeras semanas de una fiebre tifoidea y brucelosis. Dos hemocultivos separados son casi siempre los adecuados para descubrir los patógenos responsables de las infecciones intravasculares (Werner, 1967). En un estudio de personas con infección intravascular, los porcentajes de positividad del primero, de los dos primeros y tres primeros hemocultivos por episodio séptico eran del 80%. 90%. 99%. respectivamente (Washington, 1975). Los datos de otro estudio mostraron que el 91% de los episodios sépticos eran detectados en el primero hemocullivo, porcentaje que aumentaba hasta el 99% con el segundo hemocultivo (Weinstein. 1983). Por tanto, tres hemocultivos en un período de 24 horas deberían ser suficientes para detectar casi todas las bacterias potencialmente patógenas. El intervalo adecuado entre hemocultivos es desconocido, pero se ha sugerido que es de 30 a 60 minutos. Sin embargo, si es urgente el comienzo del tratamiento con antibiótico, los hemocultivos deberían recogerse de sitios diferentes con un intervalo de pocos minutos antes de empezar el tratamiento. Los organismos como el estafilococo coagulasa negativo. Streptococcus viridans. Corinebactenum. Bacillus spp. y Propiontbacterium son contaminantes frecuentes de los hemocultivos, pero también podrían ser verdaderos patógenos. Recoger dos grupos de hemocultivos por episodio febril ayuda a distinguir probables patógenos de contaminantes. Los últimos, generalmente, están presentes en un solo frasco del cultivo, mientras que los patógenos se recogen en más de un frasco. Como puede haber más de un episodio febril en un período de 24 horas y deben sacarse dos muestras de hemocultivo por episodio, debería estar permitido un máximo de 4 muestras. La mayoría de las muestras sanguíneas son extraídas por venopunción periférica. La recogida de muestra arterial no parece que muestre mejor los microorganismos, y el hemocultivo recogido a través de un catéter intravascular se asocia con un aumento de supuestos contaminantes. Como con este último método con frecuencia se necesitan más cultivos y tratamiento antibiótico innecesario, no se recomienda hacer la recogida de sangre para cultivos de un catéter intravascular, excepto para catéteres umbilicales arteriales en niños (Reller. 1982: Cowett. 1976). Sin embargo, varios cultivos recogidos de un catéter intravascular podrían ser útiles para determinar si el catéter es el foco de infección (Wmg. 1979). Los factores del huésped tales como anticuerpos, complemento, células blancas fagocíticas y agentes antimicrobianos podrían impedir el crecimiento de los microorganismos en la sangre; por tanto, se han usado varios modos de contrarrestar estos factores. Diluir la sangre en un medio en una proporción 1:10 produce una adecuada neutralización de la actividad bactericida en el suero (Washington, 1986). Incorpora de 0,025% a 0,05% de sodio pohanetolsulfonato en el medio del cultivo inhibe la coagulación, la fagocitosis y la activación del complemento e inactiva los aminoglucósidos. Entre los métodos que contrarrestan la presencia de agentes antimicrobianos se incluye añadir penicilinasas al caldo para inactivar las penicilinas: usar resinas que se adsorban a los antibióticos o usar el sistema de centrifugación para la lisis, por el cual se produce la Nsis de las células blancas y rojas, los microorganismos se concentran por medio de la centrifugación y la concentración se cultiva en un medio libre de antibióticos. Existen varios sistemas para analizar la sangre, cada uno con sus ventajas y desventajas (Wilson, 1996; Reimer, 1997). En los sistemas convencionales para analizar los cultivos, que usan un medio liquido enriquecido con nutrientes, se pueden cultivar la mayoría de las bacterias. Para recuperar aerobios y anaerobios facultativos se utiliza soja triplica, peptona suplementada. infusión de cerebro-corazón. Columbia o caldo de brúcela y lioglucato (THIOl o caldo de infusión de corazón anaerobio se usa para aislar anaero-

SECCIÓN VI

1256

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

bios. Por lo general se inoculan dos frascos, y uno de ellos se abre para asegurar el crecimiento de los aerobios. Dada la disminución de las bacteriemias producidas por anaerobios, se está cuestionando la técnica de usar un Irasco para aerobios y otro para anaerobios (Murray, 1992: Sharp, 1991), La inoculación sistemática en dos frascos para aerobios y hacer cultivos selectivos de anaerobios podría permitir la detección de más bacteriemias y funguemias. Los frascos de cultivo se revisan diariamente durante 7 días para ver si hay crecimiento, indicado bien por turbidez, hemolisis, producción de gas, un número discreto de colonias o por la combinación de éstos. Cuando el crecimiento es aparente, una extensión del cultivo se tiñe con una tinción de Gram y se examina al microscopio, y el caldo es subcultivado en un medio agar apropiado. Un subcultivo habitual de las muestras macroscópicamente negativas debería ser realizado del frasco abierto, y de 6 a 18 horas después de haber inyectado. Hacer un subcultivo del Irasco de anaerobios es innecesario. Las ventajas de los cultivos convencionales son un coste más bajo de material y un porcentaje menor de contaminación. El principal inconveniente es el tiempo que se utiliza en los subcultivos periódicos. Un método menos laborioso consiste en una botella con medio de cultivo al que se le añade una cámara que contiene un medio agar. Para subcultivar este sistema bilásico hay que dar la vuelta al frasco varias veces, permitiendo que la sangre y el medio agar se mezclen. Las colonias en el medio agar se usan para identificar y hacer test de sensibilidad. Para cultivar aerobios, bacterias resistentes y levaduras, este sistema es comparable a otros sistemas, siendo igual o mejor que ellos (Murray, 1991). Sin embargo, la rentabilidad para anaerobios podría ser mayor que en los medios de cultivo convencionales. El sistema de lisis por centrilugación consiste en un tubo que contiene reactantes que inhiben la coagulación y la cascada del complemento, produce la lisis de las células sanguíneas y tampona los microorganismos durante la centrifugación. Se añade la sangre al tubo, que se invierte varias veces para evitar la coagulación, y se transporta al laboratorio lo antes posible. Lo ideal es que la muestra se procese inmediatamente, pero puede ser retrasada 8 horas sin efectos adversos para la recuperación de los microorganismos. Para realizar el cultivo, el tubo es centrifugado durante 30 minutos a 3.000 x g, el sobrenadante se desecha y el sedimento se mezcla en una mezcladora colocándose en medio agar. También se puede hacer lo mismo con los tubos más pequeños de menor volumen de muestras de recién nacidos y niños. Las ventajas de la lisis por centrifugación incluyen una recuperación mayor de Staphylococcus aureus, algunas enterobactenas y hongos (es el mejor sistema para recolectar mohos, como el Histoplasma capsulatum), la disponibilidad directa de colonias para la identificación y el test de sensibilidad y la capacidad de llevar a cabo varios cultivos. Además, este sistema es flexible porque se pueden inyectar medios de cultivo especiales para recuperar organismos con unos requerimientos específicos de crecimiento, tales como especies para Legionelta y micobacterias. Sin embargo, el sistema es muy laborioso y es menos probable encontrar Streptococcus pneumonieae. Haemophilus influenzae o anaerobios y el riesgo de contaminación aumenta. Están disponibles en el mercado varios sistemas automáticos para tener la sangre continuamente monitorizada (Wilson, 1996). La ventaja de estos sistemas es que eliminan la necesidad de hacer un subcultivo y acortan el período de incubación habitual de 7 a 5 días (Woods. 1994; Reisner, 1999). Uno de estos sistemas está basado en el cambio de color ante la detección de CO, (Thorpe, 1990), gracias a una membrana que es impermeable para la mayoría de los iones y componentes del medio y de la sangre, pero permeable al CO . Los frascos de aerobios y anaerobios con el inoculo se colocan en celdas en el aparato, proporcionándoles un movimiento continuo. Si hay bacterias, éstas generan C0 que se libera en el medio; el pH entonces disminuye haciendo que el sensor cambie de verde a amarillo. Los cambios de color se monitorizan una vez cada 10 minutos por un detector del cambio de color. Los medios disponibles para utilizar con este sistema incluyen los medios habituales de aerobios y anaerobios que necesitan de 5 mi a 10 mi de sangre, el Pedi-BacT, que necesita 4 mi de sangre o menos, y FAN (neutralización cuidadosa de antibióticos), que intensifica el crecimiento de hongos y bacterias en pacientes con tratamiento antibiótico. ?

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Un segundo sistema de monitorízación continua se basa en una tecnología de lluorescencia (Nolte, 1993). Hay un sensor de CO en la base de ?

cada vial que es impermeable para los iones, los componentes del medio y la sangre, pero permeable para el C0 . Si hay organismos presentes, liberan CO, en el medio, se difunde por la matriz del sensor y genera iones hidrógeno. El consiguiente descenso del pH aumenta la fluorescencia del sensor cambiando la señal transmitida a los componentes ópticos y electrónicos del aparato. El ordenador genera curvas de crecimiento y los datos se analizan de acuerdo con unos algoritmos crecientes. Las botellas que han sido inoculadas se ponen en celdas individuales del aparato, donde los frascos de aerobios y anaerobios están continuamente en movimiento. Los medios aerobios y anaerobios de poco volumen (de 5 mi a 7 mi de sangre) y de gran volumen (8 mi o 10 mi de sangre), el medio Peds-Plus (de 0,5 mi a 5 mi de sangre) y el medio Myco F Lytic son válidos para hallar hongos y micobacterias (Waite. 1998). 2

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Un tercer sistema detecta el crecimiento de los organismos en el caldo midiendo el consumo y/o producción de gas (Zwadyx. 1994). Cada vial inoculado se ajusta con un conector desechable que contiene una aguja hueca. La aguja penetra en el tapón de la botella y conecta el cuello de la botella con el sensor. Los monitores del sensor cambian dentro del cuello de la botella por el consumo y/o producción de gases (CO „ H y H,) producidos por el crecimiento de organismos y crea unos datos dentro del ordenador. Hay dos medios básicos disponibles (medio aeróbico y anaeróbico) que contienen 80 mi de caldo y alojan de 0.1 mi a 10 mi de sangre, y frascos aeróbicos y anaeróbicos EZ Draw que contienen 40 mi de caldo y alojan de 0.1 mi a 5 mi de sangre. r

}

El hallazgo de algunas bacterias requiere un medio especial o una incubación larga. Por ejemplo, cuando se sospecha brucelosis, la sangre debería sacarse al principio de la enfermedad y los hemocultivos deberían incubarse durante 3 ó 4 semanas, aunque con los sistemas automáticos la Brucella con frecuencia crece en menos de una semana (Bannatyne. 1997). Las infecciones producidas por Borrelia, excepto Borrelia burgdorferi (causante de la enfermedad de Lyme, más frecuentemente diagnosticada serológicamente), se diagnostican por la detección de espiroquetas en sangre periférica durante un periodo febril. Los organismos se visualizan al microscopio de campo claro u oscuro en preparaciones en fresco mezclando una gota de sangre con una gota de citrato sódico, o bien en frotis grueso o fino teñidos con Giemsa o tinte de Wright examinados por un microscopio de luz. Para aislar la Leptospira mterrogans en sangre, se debe añadir unas gotas de sangre fresca o anticoagulada, recogida durante la primera semana de la enfermedad, a cada uno de los 3 ó 4 tubos de medio de cultivo semisólido de leptospiras (el medio de Fletcher o el de Ellinghausen-McColloughJohnson-Harris). Podemos utilizar diferentes métodos para aislar las micobacterias en las muestras de sangre. Un modo es mediante la lisis por centrifugación, colocando el sedimento en un medio sólido y/o líquido y, posteriormente, los cultivos se incuban durante ocho o más semanas. Otra posibilidad, y quizás un método más rápido, es la inoculación directa del medio Myco-F Lytic (momtorizado para el crecimiento por el apáralo BACTEC 9000) o el medio 13 A (monitorizado por el BACTEC 460TB). Detección de virus. Las muestras de sangre son útiles en el diagnóstico tan sólo en un número limitado de infecciones por virus (Tabla 57-1). La viremia generalmente se produce durante el periodo de incubación o los dos primeros días después de que los síntomas comiencen, por lo que la muestra de sangre debe tomarse al comienzo de la enfermedad. Una excepción es la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que se detecta con facilidad en sangre periférica, células mononucleares y plasma de la mayoría de las personas seropositivas y, además, en casi cualquier fase de la enfermedad. Una muestra de sangre recogida de una vena periférica o de un catéter intravascular es adecuada para detectar el virus. Los requisitos de la muestra dependen de cada virus (Tabla 57-1). Todas las muestras de sangre deberían ser llevadas al laboratorio lo antes posible. Si es inevitable un retraso en el análisis, las muestras deberían estar toda la noche a 4°C, excepto las muestras de plasma para la detección del ARN del VIH, que debe ser analizado dentro de las 6 primeras horas de la recogida de la muestra. Aquí vamos a hacer hincapié en la técnica de detección del CMV y de los enterovirus empleados en la mayoría de los laboratorios. Para la detección de otros virus, los de la Tabla 57-1, por lo general las muestras se mandan a un laboratorio de referencia.

CAPÍTULO 57

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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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Tabla 57-1 R e q u e r i m i e n t o s d e las m u e s t r a s para u n a óptima detección d e los virus hallados e n sangre Requerimientos de las muestras de sangre Virus Citomeqalovirus Enlorovirus Virus de la inmunodehciencia humana' Virus del herpes humano-6 Parvovirus B 1 9 Virus transmitidos por artrópodos'

Modo de recolección Con anticoagulante' Con o sin anticoagulante' EDTA Heparinizado Sin anticoagulante Con o sin anlicoagulante

Parte empleada para la detección Leucocitos Suero o leucocitos Células mononuclearcs o plasma Células mononucleadas Suero Leucocitos o coágulo homogeneizado

Vo lumen (mi) 5 - 1 0 5 - 1 0 2 - 5 5 - 1 0 5 - 1 0 5 - 1 0

"Se puede utilizar hepanna o EDTA para ciloinegalovirus: para los enterovirus se puede usar heparina. citrato o EDTA 'Para monilorizar la carga viral de VIH en pacientes en tratamiento con terapia anlirretroviral •Incluye a los v i r u s del este, oesle y la encefalitis equina venezolana, encefalitis de San Luis y California, fiebre amarilla, dengue y liebre de la garrapa la de Colorado EDTA: acido etileriediarninoletraacético, VIH: virus de la mmunodeficiencia humana.

Para la detección de CMV y enterovirus en sangre, se debe separar el componente sanguíneo que tenga más probabilidad de contener el virus y su inoculación en un cultivo de células en monocapa que aguanten la replicación viral o preparar una extensión para teñir con anticuerpos monoclonales. El CMV se detecta con más frecuencia en los neutrófilos, pero podría estar presente en las células mononucleares de la sangre periférica; de este modo, para una detección adecuada, los neutrófilos y células mononucleares debehan ser cultivados o teñidos (Howell, 1979). Los enterovirus se pueden obtener con igual probabilidad tanto de los leucocitos o células mononucleares como a partir del suero (Prather, 1984). Para separar los leucocitos hay que recoger sangre con anticoagulante, siendo el citrato o la hepanna sódica los anticoagulantes permitidos (Woods. 1987; Storch, 1994). Para separar el suero, la sangre se recoge en un tubo sin anticoagulante y se coagula a 4 C. Cuando se forma un coágulo, la sangre se centrifuga a 2.000 x g durante 10 minutos a 4 C y el suero se separa de un modo aséptico. El tipo de cultivo celular para aislar el virus se debe seleccionar en función del virus que esperemos encontrar. Para aislar el CMV se recomienda emplear dos tubos de MRC-5 u otras células fibroblásticas humanas para cultivo. La incubación celular en un medio que contenga 10 M dexametasona. durante un mínimo de 24 horas antes de la inoculación, aumenta el porcentaje de detección de CMV y disminuye el tiempo para la aparición del efecto citopático (Thiele. 1988). Para aislar enterovirus. debería inyectarse MRC-5 y células primarias de riñon de mono, y el porcentaje de aislamiento podria aumentar también mediante el empleo de células de riñon de búfalo y células humanas de rabdomiosarcoma (Dagan. 1986). Las muestras de suero incubadas deben ser posteriormente examinadas para el efecto citopático especifico del virus. Para las muestras de leucocitos, la capa celular de cultivo debe ser inoculada con 0,5 mi de muestra, añadiendo 1 mi de medio de mantenimiento y dejando en incubación toda la noche. Posteriormente, la suspensión celular se coge y se lava con salmo estéril amortiguado con fosfato, añadiéndose 1,5 mi de medio de mantenimiento, y se vuelve a colocar a cultivar. 5

Además de un cultivo convencional de las células debería realizarse un cultivo del centrifugado cuando se solicite CMV (Woods. 1987). Un método más sensible para detectar CMV en sangre es el test de la antigenemia, que se realiza tiñendo la preparación del citocenlrifugado de leucocitos con anticuerpos monoclonales contra proteínas virales (pp 65) (Van Der Bij, 1988; Brumback, 1997), Detección de parásitos. Las muestras de sangre son útiles para el diagnóstico de malaria, babesiosis. tripanosomiasis y algunas diarias. Las muestras deberían ser recogidas en tubos con anticoagulante y transportadas rápidamente al laboratorio. Si las extensiones deben ser enviadas a un laboratorio de referencia, deben fijarse con alcohol inmediatamente tras su preparación. Las técnicas utilizadas en el laboratorio para detectar esos

parásitos son las mismas y se van a exponer aquí, desde la más simple a la más compleja. La técnica más sencilla para detectar parásitos en la sangre es el examen directo. Para prepararlo se coloca una gota de sangre en un porta de cristal, se tapa con un cubre portas y se analiza inmediatamente. La observación directa es excelente para el diagnóstico de tripanosomiasis, ya que los tripomasligotes y las microfilarias pueden, con frecuencia, verse en movimiento con un bajo o mediano aumento. El diagnóstico definitivo se hace por la tinción de las muestras. La extensión usada en hematología, teñida de un modo similar, es una preparación habitual para determinar las especies de Plasmodium. Babesia. Trypanosoma y microfilarias. Las extensiones para la búsqueda de parásitos se deben fijar y después teñirse manualmente con Giemsa. aunque la tinción hematológica automática es también válida. Las muestras se deben observar inicialmente a bajo aumento para detectar microfilarias, que son objetos grandes (entre 100 pm y 200 pm) y que por lo general se ven con facilidad en los bordes de la extensión. Después de localizadas, las microfilarias deberían estudiarse bajo una lente de aceite de inmersión para su correcta identificación (véase Cap. 55). Después de observarla con bajo aumento, la extensión se examina con un objetivo de gran aumento para buscar tripanosomas, y finalmente con el uso de aceite de inmersión para buscar e identificar Plasmodium, Babesia y Trypanosoma. Las extensiones más grandes son útiles para detectar todos los parásitos antes mencionados y son parte de los requisitos minimos para su diagnóstico. Se coloca una gota de sangre en un porta y con la esquina de otro porta se separa cuidadosamente para que ocupe 1 cm-. La preparación se deja secar y sin fijarla se tiñe con Giemsa, permitiendo su deshemoglobinización.

FLUIDOS CORPORALES Líquido cefalorraquídeo (LCR). El LCR se recoge para el diagnóstico de meningitis y. menos frecuentemente, de encefalitis víricas. Una meningitis infecciosa es una emergencia médica que requiere tratamiento urgente para evitar la muerte o secuelas neurológicas serias; se divide en aguda, subaguda y crónica en función de la duración de los síntomas (Tabla 57-2). Una presentación aguda se produce en el 10% de los casos y la causa más frecuente es infección bacteriana. Casi todas las personas con meningitis viral y el 75% de los que tienen meningitis bacteriana tienen un cuadro subagudo. mientras que el resto presentan meningitis crónica (los patógenos responsables están recogidos en la Tabla 57-2). Los enterovirus son los causantes más comunes de la meningitis y deberían ser los primeros en ser considerados en el diagnóstico diferencial de meningitis en un niño o adolescente al linal de

SECCIÓN VI

1258

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MICROBIOLOGÍA MÉDICA

Tabla 57-2 Pruebas c o m e r c i a l e s de A D N para la identificación de cultivos* Duración

Síndrome Agudo ; Subagudo Crónico

Probables patógenos



q

1

7

14

Y

Figura 62-4. Ejemplos de ideogramas de los cromosomas 1.7,14 e Y que muestran el patrón estándar de las bandas claras y de las bandas oscuras.

del cromosoma Y en el paciente. El bandeo C, constitutivo o bandeo de centrómero. se utiliza para evaluar la heterocromatina constitutiva o para determinar si un cromosoma tiene dos centrómeros (dicéntrico). Normalmente el centrómero aparece como un solo punto oscuro en un cromosoma teñido en su totalidad con una coloración clara (Holmquist, 1979) En el caso de un cromosoma dicéntrico, la presencia de dos regiones oscuras permitirá identificar con claridad a los dos centrómeros (Fig. 62-5S). El bandeo R, o bandeo inverso, presenta a los cromosomas con el mismo patrón de bandeo que el que hemos visto en el bandeo G, pero las bandas claras y las oscuras están invertidas, de ahí su nombre. Debido a que los telómeros de los cromosomas tienen tendencia a ser pequeños, bandas de tinción claras, si se utiliza un bandeo G estándar puede que no sea fácil detectar una deleción. Sin embargo, en el bandeo R los telómeros se colorearían como bandas oscuras y su ausencia, como resultado de una deleción, es más obvia.

Análisis del carie-tipo Para efectuar un análisis citogenético es esencial poder identilicar cada cromosoma, rápida y exactamente, y determinar cuándo se presentan anomalías cromosómicas. El primer paso que hay que dar es contar el número de cromosomas presentes en la célula que se está evaluando. El número de centrómeros activos define el número total de cromosomas, que serán 46 en una célula diploide humana normal. El que haya cromosomas de más o de menos indica una anomalía numérica potencial. El cultivo in vitro puede dar como resultado artefactos de cultivo, por eso no se utiliza una sola célula para definir el complemento de cromosomas de un paciente, asi que para un estudio clinico típico se necesitan analizar de 15 a 20 células: en los casos de mosaicismo o para otras situaciones especiales tal vez haya que evaluar de 10 a 30 células adicionales. Los cromosomas individuales se identifican basándose en el tamaño total de cada cromosoma, en la posición de su centrómero y en el patrón de bandeo. En este momento se debería detectar cualquier variación en la estructu-

ra del cromosoma. Para cumplir con los objetivos diagnósticos clínicos, en casi todas las circunstancias es suficiente el bandeo G de los cromosomas metafásicos. Sin embargo, quizá no se puedan resolver algunos desórdenes que están asociados con deleciones muy pequeñas del material cromosómico a este nivel. En estas situaciones se utilizan análisis de alta resolución. Las células se cultivan de manera que se puedan recolectar en una etapa ligeramente más temprana de la división celular, la prometafase. En este momento de la división celular, los cromosomas están menos condensados. haciendo que sea más fácil detectar la presencia de pequeñas anomalías. El análisis lo ejecuta un leenólogo examinando las células a través del microscopio, y una vez que se ha completado el estudio se hace una determinación de si el complemento de cromosomas es "normal" o "anormal". Para la documentación se fotografían las células de la metafase utilizando una cámara de 35 mm montada en un microscopio. Luego se revela la película, se hacen las copias, se recortan los cromosomas y se pegan en una hoja de papel con cinta adhesiva o con pegamento. Los pares homólogos están organizados, de mayor a menor, en siete grupos a los que se les designan letras de la A la G. más el par de cromosomas sexuales. Siguiendo la costumbre, el brazo más corto, denominado brazo p, está orientado hacia arriba y el brazo más largo, o brazo q, está orientado hacia abajo. El producto final es una ilustración de los cromosomas de una célula especifica y se la conoce como cariotipo (Fig. 62-1).

Imagen asistida por ordenador Los cariotipos que proceden de fotografías dan una imagen de alta resolución, pero requieren tiempo y esfuerzos significativos. En los últimos años los ordenadores han tenido un gran impacto en los laboratorios clínicos, ya que permiten la automatización de muchas tareas tediosas y se han hecho un hueco en los laboratorios de citogenética bajo el formato de sistemas para hacer cariotipos asistidos por ordenador. En lugar de una cámara de 35 mm, se monta en el microscopio una videocámara DCA (dispositivo de carga acó-

CAPÍTULO 62

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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA

piada). Utilizando un software especialmente diseñado, se capta la imagen de una célula en metafase usando un captador de imágenes estándar, se dígitaliza y aparece en el monitor del ordenador. Llegados a este punto, el software permite modificar la imagen, aclarándola, oscureciéndola o cambiando el contraste, de modo que se pueden hacer múltiples modificaciones de los cromosomas, incluso enderezarlos e importar cromosomas de otros campos. Después se puede hacer un cariotipo, utilizando una sub-rutina de reconocimiento del patrón que reconocerá los cromosomas, automáticamente, y los emplazará en sus lugares adecuados, en forma de cariotipo. La precisión de este procedimiento puede variar entre un 10% y un 85%, dependiendo del software y de la calidad de la imagen. Después de que el ordenador haya capturado a su "mejor huésped", las correcciones adecuadas las debe hacer un tecnólogo citogenético especializado. Una vez que los cromosomas están correctamente posicionados se pueden hacer las amplificaciones cosméticas adicionales para eliminar los bordes rasgados o residuos de posos. Luego se imprime la versión final del cariotipo en una impresora de alta resolución. Aunque la calidad total no es tan alta como la de una presentación fotográfica, la utilización del sistema por ordenador conlleva un enorme ahorro de tiempo. Un tecnólogo especializado puede tardar en hacer un cariotipo ordinario, desde la captura hasta la impresión, de 15 a 20 minutos por término medio. Otra gran ventaja de los sistemas asistidos por ordenador se encuentra en la microscopía de fluorescencia.

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Hibridación in situ fluorescente Los tipos clásicos de coloración citogenética que se han descrito son el resultado de los tintes que se unen al ADN o a las proteínas de un cromosoma y que permiten su visualización por medio de la microscopía óptica. La hibridación in situ. que es la combinación de la biología molecular y de la citogenética, abrió otra puerta que hizo posible las investigaciones de las anomalías cromosómicas posteriores. En éstas, en lugar de un tinte, es una sonda molecular (esto es, un fragmento de ADN) la que se une al cromosoma. En los primeros estudios se marcó a la sonda con una mezcla radiactiva (normalmente tritio), de manera que, después de su exposición a un película de rayos X durante un tiempo de 5 a 10 días, se pudo detectar un patrón de granos de plata que identificaban la localización cromosómica de la sonda. Esta técnica facilitó el poder hacer el mapa génico por medio de la identificación de los locus del gen (Trask. 1991). La autorradiografía tuvo su utilidad, pero sólo se podía utilizar una sonda cada vez. necesitaba una cantidad de tiempo significativa y había un grado de dispersión de los granos de plata que requería un análisis estadístico de los datos obtenidos. A mediados de los años 80 (del siglo xx), se desarrolló una variante de esta técnica que ha demostrado ser extremadamente útil en las aplicaciones clínicas. Esta nueva tecnología, la hibridación in situ fluorescente (HISF), es más rápida, más específica y permite la utilización de múltiples sondas en un solo procedimiento de hibridación. Además, en vez de sondas marcadas con radiactividad, se utiliza una tinción fluorescente que se visualiza a través de la microscopía de fluorescencia (Ledbetter, 1989). A pesar de que la HISF se puede utilizar para hacer mapas de genes, la meta, en las aplicaciones clínicas, es determinar si hay un gen o una mutación específica, por eso la sonda molecular tiene que estar bien caracterizada y tiene que ser específica para el locus en cuestión. Hay tres tipos básicos de sondas. La sonda de secuencia única aislada de un gen causante de la enfermedad clonado y que se utiliza para identificar la presencia o ausencia de ese gen (Cheríf, 1989; Lindsay, 1993). Las sondas de coloración del cromosoma son, en realidad, un cóctel de muchos fragmentos de ADN únicos recogidos a lo largo de toda la longitud de un cromosoma, de modo que en la hibridación siguiente todo el cromosoma emite luz fluorescente (Fig. 62-6A). Las sondas de secuencias repetitivas son aisladas de las regiones de telómeros o de centrómeros. Las sondas de centrómeros se utilizan, generalmente, para la enumeración de los cromosomas (es decir, para detectar el aumento o la pérdida de cromosomas específicos) (Figs. 62-66 y C) (Lichter, 1990). Las sondas de telómeros se utilizan, a menudo, para caracterizar los reordenamientos crípticos (esto es, para determinar si ambos telómeros de un cromosoma están presentes y localizados en el cromosoma correcto o si se ha producido una deleción o reordenamiento). Técnica HISF. La HISF combina los métodos de la biología molecular y de la citogenética, como en la hibridación in situ original. Las células se cultivan y se recolectan, y se preparan las placas exactamente igual que para un estudio citogenético clásico. Luego se desnaturaliza el ADN de las placas y se deja que una sonda molecular de una sola hebra marcada con fluorescencia hibride al ADN cromosómico. utilizando una temperatura de anillamiento que favorece la hibridación de las regiones homologas del ADN (Fig. 62-7A). Después de un periodo de hibridación adecuado, se eliminan los restos de la sonda por medio del lavado y al ADN no hibridado se le aplica una contracoloración con otro fluorocromo para poder visualizar el complemento de cromosoma en su totalidad. La evaluación de la célula se hace utilizando un microscopio fluorescente con la luz de una bombilla de mercurio de 100 W combinado con juegos de filtros excitadores apropiados. En un microscopio fluorescente típico sólo se pueden visualizar tres colores como máximo, debido a las limitaciones ópticas de los filtros de cristal. Se puede utilizar una cámara de 35 mm unida al microscopio para la documentación del estudio. Sin embargo, si se utiliza un sistema asistido por ordenador para obtener las imágenes fluorescentes, se obtienen resultados muy superiores. Además, los paquetes de software adecuados permiten la amplificación de las señales débiles y la nitidez de la imagen.

Figura 62-5. A. Metalase de bandeo-0 que muestra la fluorescencia brillante del cromosoma Y (flecha). 6, Cromosomas de bandeo-C que muestran a los centrómeros teñidos de oscuro. Se detectó un cromosoma dicéntrico con dos bandas oscuras (dos flechas).

Uno de los elementos de la HISF más críticos es la elección de una sonda o sondas específicas, ya que ayudarán a dar respuesta a las preguntas clínicas. Por ejemplo, una de las aplicaciones clínicas de la HISF más útiles es la detección de microdeleciones que son demasiado pequeñas para poder ser vistas utilizando la citogenética clásica (Figs. 62-76 a D). El gen debe ser conocido y la sonda utilizada debe ser homologa a la región del gen que es eli-

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SECCIÓN VII

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PATOLOGÍA MOLECULAR

minado, la región critica. La hibridación con la sonda deberia aparecer como una señal fluorescente sólo en el locus diana. Si aparece una señal, es que está presente el ADN complementario a la sonda, por tanto no hay deleción. Sin embargo, la ausencia de la señal indica que existe la deleción (esto es, no hay secuencia de ADN presente en el cromosoma que es complementario a la sonda, por tanto la hibridación no puede producirse). Un individuo no afectado deberia tener dos señales por célula en cada gen autosómico, una señal en cada cromosoma del par (Fig. 62-8A). Un individuo afectado por una deleción deberia tener una sola señal por célula, mostrando un cromosoma normal y otro delecionado (Fig. 62-86).

dor para los cromosomas de interés (Fig. 62-70). Se puede hacer el estudio en células en metalase, asi como en las de mterfaz. si se utiliza un sistema de color dual. Las sondas de coloración de cromosomas son muy útiles para identificar reordenamientos complejos o cromosomas marcadores. Si un paciente tiene un cromosoma anormal con material extra de origen desconocido, se podría utilizar la tinción del cromosoma para identificar la fuente del ADN extra. Esto puede ayudar en el diagnóstico o en el pronóstico del individuo. En el caso de un paciente con 46 cromosomas, incluyendo un cromosoma X y un cromosoma marcador no identificado pequeño, será importante determinar si el origen del marcador es un cromosoma X o uno Y. Esto se puede hacer utilizando tintes de cromosomas en los cromosomas X y en los Y marcados con lluorocromos diferentes.

Uno de los problemas de los análisis de deleción es que lee la ausencia de señal como una indicación positiva de la deleción. El fracaso de la hibridación también puede tener como resultado la ausencia de la señal. Para eliminar esto como fuente de errores, se deben evaluar 20 células como minimo y todas las células deben concordar en el cómputo de la señal. Si se sospecha de que existe mosaicismo, se deben examinar células adicionales. Además, las sondas de secuencia única se utilizan actualmente en combinación con una sonda control (Fig. 62-7C). La segunda sonda se localiza en el mismo brazo del cromosoma que el locus de deleción. Se puede marcar con el mismo lluorocromo que a la sonda de locus de deleción, pero se ha visto que resulta más fácil interpretar los resultados de la hibridación si se marca a la sonda de control del sitio con un íluorocromo de color diferente.

Las sondas HISF proporcionan mucha información cuando se evalúan en las células en metalase, donde es posible identificar al cromosoma especifico al que híbrida la sonda. Sin embargo, en algunas preparaciones celulares quizás estén presentes muy pocas células en metalase, y en estos casos se puede obtener información con sondas de secuencia única o de secuencia repetida en los núcleos de inlerfaz. Pero aquí aumentan los problemas técnicos, debidos a la pérdida azarosa de la señal, a las señales extra y a las señales solapadas en las células, asi que se deben contar células adicionales (un total de 50 a 200) para obtener un resultado estadístico significativo.

Se deben ver dos señales de control claras en todas las células evaluadas y luego se pueden registrar las señales que se corresponden con el locus de enfermedad. Esto proporciona un control de hibridación, asi como un marca-

HISF multicolor. Una de las ventajas que tiene la HISF sobre la vieja hibridación in silu es su capacidad de hibridar múltiples sondas a una sola

Figura 62-6. A. Sonda de tinción del cromosoma completo que hace resaltar a los dos cromosomas X en una célula de mujer B y C. Sonda de centrómero de secuencia repetida para el cromosoma 21. B. A la izquierda se ve la tnsomía 21 en un núcleo de mterfaz y a la derecha en una metalase. C, Complemento normal de dos copas del cromosoma 21 visto en mterfaz (derecha e izquierda) y en una melafase (centro).

CAPÍTUIO 62

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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA

Figura 62-7. A. Esquema de la tecnología HISF. El ADN derivado de un gen conocido se separa quedando una sola hebra, se marca con una señal fluorescente y luego se le híbrida de vuelta a los cromosomas de una célula en metafase. B.CyD. Dibujos de cromosomas metalásicos fluorescentes con sondas marcadas que hibridan a las dianas (flechas) 6. Señales duales que indican la hibndación de ambos alelos del gen diana. C. El gen diana está señalado en rojo y la sonda de control en verde. Hibridación completa de todos los alelos. D, Hibridación de ambos controles (verde), pero la presencia de un único gen diana solamente indica la deleción de un alelo.

Figura 62-8. Detección medíame HISF de una microdeleción del cromosoma 22 asociada al síndrome DiGeorge y al síndrome velocardiotacial. A. Un individuo "normal" con no deleción muestra la presencia de una señal roja (locus de gen) y de una señal verde (locus de control) en cada cromosoma 22 B. Paciente con una deleción que se visualiza en un cromosoma con una única señal verde solamente. El cromosoma 22 homólogo es "normal", con una señal roía y una señal verde.

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SECCIÓN VII

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PATOLOGÍA MOLECULAR

rojo:amanllo 13

100:0

13

rojo

21

75:25

21

verde

IX

25:75

IX

rosa

Y

5(1:50

Y

blanco

\

(l:l(K)

X

amando

Figura 62-9. HISF multicolor A. Diagrama de tinción real de cinco sondas de combinación. La tabla de la derecha muestra las proporciones de colores relativas para cada sonda utilizada. 8, Diagrama de la imagen obtenida de un ordenador de la misma célula que muestra el color artificial que se le ha asignado (la clave se nuestra en el recuadro a la izquierda de la imagen).

placa y obtener un conocimiento mejor de los reordenamientos de cromosomas (Schrock. 1996; Speicher. 1996). Sin embargo, incluso aqui existen límites. Una imagen fluorescente se produce por la luz de una bombilla de mercurio que pasa a través del filtro estimulador, da en el fluorocromo de la placa y transmite la imagen del color adecuado a la lente del microscopio para su visionado. Cada fluorocromo requiere su propio filtro, por eso. para cada color adicional que se desee conseguir, la luz debe pasar a través de diferentes grosores del cristal. Por tanto, las propiedades ópticas de la luz y del cristal limitan a tres el número de colores que pueden verse. Sin embargo, con el advenimiento de los sistemas asistidos por ordenador, ya es posible distinguir múltiples colores en una sola hibridación El ordenador no "ve" realmente más colores, pero puede detectar, meior que el OJO humano, diferencias sutiles en las tonalidades. Para hacer un examen relativamente sencillo, se utilizan dos fluorocromos, que, mezclados en proporciones variables, dan una gama de colores (Fig. 62-9A). El ordenador registra cada color como una tonalidad diferente de gris y luego asigna un color único a esa tonalidad para su presentación en el monitor (Fig. 62-98). Esa imagen multicolor se puede imprimir después, aunque los colores de la impresión son completamente diferentes a los que en realidad había visto el sistema. A partir de la asignación de un color único por ordenador, se han desarrollado combinaciones de fluorocromos que permiten la detección de cada uno de los 24 cromosomas diferentes (Reíd. 1992a. 1992b; Divane. 1994).

Anomalías cromosómicas Los análisis citogenéticos clínicos se han convertido en una parte importante de la medicina clínica, ya que el descubrimiento de una anomalía cromosómica específica puede explicar un problema físico o una anomalía fenotípica en el paciente y se la puede asociar directamente con el diagnóstico de la enfermedad. El propósito del ensayo clínico es determinar si un individuo tiene un complemento de cromosoma diferente del patrón estándar de 23 pares de cromosomas de morfología conocida. Hay dos categorías básicas de vanaciones detectables a través de la citogenética; 1) numérica y 2) de cambio estructural.

Anomalías

numéricas

En el hombre y en otros mamíferos los cromosomas se producen en pares, por lo que de los 46 cromosomas sólo hay 23 especialmente diferentes. Un conjunto de 23 incluye el número haploide (N) de cromosomas, que es el número de cromosomas en un gameto. En el momento de la fertilización, se unen dos complementos haploides para formar un zigoto con 46 cromosomas, que es el complemento diploide (2N). Los errores en la división pueden dar lugar a complementos de cromosoma que tengan más de 46 cromosomas o menos de esta cantidad. A los múltiplos exactos del conjunto haploide del cromosoma se le denomina euploidia. Y aneuploidia al aumento o a la pérdida de uno o unos cuantos cromosomas Euploidia. La diploidía, que es el estado normal de las células humanas, es una lorma de euploidia. Las euploidías anormales incluyen la triploidía (3N = 69 cromosomas) y a la tetraploidía (4N = 92 cromosomas), que no son com-

patibles con la vida y que se detectan, principalmente, en tejidos procedentes de abortos espontáneos. La triploidía (Fig 62-1OA) puede estar causada por un error en la gametogénesis de una de las divisiones meióticas que da origen a un gameto 2N. el cual, al ser fertilizado por un gameto haploide del otro progenitor, produce un zigoto triploide. Por otro lado, un complemento 3N puede estar derivado de la dispermia (fertilización de un huevo haploide por dos espermatozoides), y esto, generalmente, da como resultado una masa parcial hidatidiforme (véase Cap. 20) La tetraploidía es un acontecimiento posmeiótico y se presenta como una duplicación de un complemento diploide (XXXX o XXYY). que seguramente se debe al error de una escisión de la división mitótica temprana en el zigoto. Aneuploidia. Los errores de no separación que dan como resultado la aneuploidia son más corrientes. En estos casos un solo par de cromosomas no logra separarse correctamente en la división, originando un cromosoma extra o perdiendo un cromosoma por célula. Algunas veces pueden verse involucrados más de un par de cromosomas, pero estos casos son extremadamente raros. Los errores de la no disociación pueden producirse tanto en la meiosís como en la mitosis. La no disociación mitótica temprana en el zigoto puede dar lugar a un individuo con el complemento de cromosoma aberrante en todas las células del cuerpo, pero un error en la división más tardío produce un mosaico (un individuo con dos lineas de células que únicamente se diferencian en un solo cromosoma). Los errores meiósicos producen gametos, bien con un cromosoma extra o bien con uno de menos (Fig. 62-11) (Angelí. 1994). Una vez fertilizados, el primero dará una concepción trisómica al cromosoma no disociado (Fig. 62-1 Ofi) y el ultimo dará una monosomía. Tanto la trisomia como la monosomía pueden producirse en cualquier cromosoma, pero la mayoría de éslas son incompatibles con la vida y se eliminarán de forma espontánea. Por ejemplo, la trisomia 16 es la trisomia que se detecta, más frecuentemente, en los tejidos procedentes de abortos espontáneos, pero no se ha informado de ningún caso en seres nacidos vivos. Las trisomias autosómicas de seres nacidos vivos incluyen los cromosomas 13.18 y 21. Muy raramente se identifican pacientes con un complemento de cromosoma mosaico de trisomías 8. 9 ó 22. Las tnsomías de los cromosomas sexuales son viables y están bien documentadas (vide mira). La única monosomia viable es la del cromosoma X (45,X). Más adelante, en este capitulo se describirán las aneuploidías clínicamente significativas. En los últimos años se ha detectado un efecto secundario de las concepciones aneuploides. Dado que las trisomias y las monosomias son, en gran parte, incompatibles con la vida, se asumió que podrían dar lugar a la pérdida del feto. Pero ahora se sabe que un pequeño fragmento de estas concepciones aneuploides es "rescatado" y sigue adelante para originar niños nacidos vivos. En caso de una monosomía. el rescate se produce por la duplicación del único cromosoma existente, que da como resultado un complemento de cromosoma con isodisomia uniparental para ese cromosoma (dos copias del mismo cromosoma heredado de un progenitor) (Fig. 62-12) (Ledbetter. 1995). Esto está desento en vanos casos publicados, en los que se demuestra que un niño afectado de fibrosis cistica (FC) es homocigoto a la mutación AF508, aunque los análisis moleculares de ambos progenitores revelaron que sólo uno de ellos era el portador de AF508 (Spence, 1988; Voss, 1989). Esto se interpreta como que la

CAPÍTULO 62

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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA

concepción fue una monosomia 7 no viable rescatada por la duplicación del cromosoma 7 existente, que por casualidad era el portador de la FC. En el caso de una trisomía también es posible una situación similar. Volvemos a repetir que la mayoría de las tnsomías no son viables, pero si se pierde uno de los tres cromosomas, se restablece una disomía para ese par de cromosomas. En un conjunto de tres cromosomas la pérdida de un solo cromosoma originará, dos de cada tres veces, un complemento con un cromosoma paterno y uno materno Iheterodisomia biparental). La tercera vez. los dos cromosomas restantes son de un solo progenitor (esto es, disomía uniparental). En esta situación, la diferencia está en cuál de las divisiones meióticas se produjo el error. Una disociación en la primera división tendrá como consecuencia una heterodisomía, es decir, dos cromosomas homólogos pero heterocigotos (uno de la abuela y otro del abuelo): sin embargo, un error en la segunda división originará copias duplicadas de un solo cromosoma, esto es, la isodisomia (Figs. 62-11 y 62-13). Podria pensarse que mientras que estén presentes un par de cromosomas no debería importar su origen específico, pero los datos indican, firmemente, que la evidencia es otra. Los problemas de disomía uniparental frente a biparental y de isodisomía frente a heterodisomía tienen una enorme importancia para comprender los fenómenos de impronta, un tema descrito con detalle en el Capitulo 66 (Nichols. 1998; Hall. 1990; Cassidy. 1992: Petersen, 1992).

Anomalías estructurales del cromosoma Los cromosomas no son estructuras estáticas, sino que experimentan recombinaciones tanto en la meiosis como en la mitosis. Este es un proceso natural que es vital para generar variaciones en las especies, por eso está altamente regulado y rara vez se producen errores. Sin embargo, es posible que se produzcan reordenamientos cromosómicos que cambien la estructura de uno o de varios cromosomas. Estas anomalías son bastante variadas y con frecuencia son especificas del paciente. Las reordenaciones pueden ser

A

19

20

21

1313

1) equilibradas, si todo el material cromosómico está presente y es funcional, pero está ordenado en una conformación diferente, o 2) desequilibradas, si hay pérdida y/o adición de material cromosómico. Las reordenaciones equilibradas son, en general, clínicamente benignas y tienen tendencia a ser trasmitidas de forma estable, aunque pueden aumentar el riego de errores en la meiosis. que originarán desequilibrios cromosómicos en los letos o en los niños nacidos vivos. Los complementos de cromosoma desequilibrados están, generalmente, asociados a un fenotipo clínico anormal que a menudo incluye el retraso en el desarrollo y el retraso mental. La deleción es la pérdida de una parte de un cromosoma y produce la monosomia parcial del cromosoma involucrado (Fig. 62-14). Las deleciones varían en tamaño, desde bastante grandes a muy pequeñas, y pueden ser terminales (Fig. 62-15A). la pérdida de un fragmento del cromosoma que contiene al telómero, o intersticiales (Fig. 62-156), la pérdida de un trozo interno del cromosoma. Las roturas de los cromosomas, sobrecruzamientos desiguales, o los errores de no separación comprendidos en las reordenaciones cromosómicas pueden dar como resultado una deleción. En general, las deleciones mayores originarán anomalías clínicas más graves, debido a que faltan un mayor número de locus genéticos. La duplicación es la presencia de una copia adicional de un segmento del cromosoma, que origina una trisomía parcial en ese cromosoma (Fig. 62-14). Esta anomalía puede ser también terminal o intersticial. Las duplicaciones auténticas parecen ser bastante raras y son, normalmente, esporádicas. Las duplicaciones están generadas por los mismos mecanismos que las deleciones y quizá sean la consecuencia recíproca de estos procesos. Al igual que en las deleciones. cuanto mayor sea el fragmento duplicado del cromosoma, las anomalías clínicas tenderán a ser más graves. La inversión es el cambio de un segmento cromosómico respecto al ordenamiento génico normal y necesita un mínimo de dos roturas en un cromosoma (Fig. 62-14). Las inversiones están clasificadas como 1) paracéntricas,

22

X

T

Figura 62-10. Anomalías cromosómicas numéricas. A. Complemento de cromosoma triploide (3N) con tres copias de cada cromosoma |69,XXY). Esta ilustración continúa en la página siguiente.

1314

SECCIÓN VII

PATOLOGÍA MOLECULAR

dos roturas que tienen lugar en el mismo lado del cenlrómero (esto es, en el mismo brazo), o 2) pericéntricas, las roturas se producen en lados opuestos del centrómero y la inversión involucra a ambos brazos (Fig. 62-16/4). La mayoría de las inversiones son equilibradas, pero se pueden detectar anomalías clínicas si el cromosoma se rompe dentro de un gen e interrumpe la producción normal de un producto génico necesario. Existe un aumento del riesgo de error meiótico y los portadores de la inversión muestran, frecuentemente, infertilidad o pérdida fetal espontánea temprana debido a los productos cromosómicos desequilibrados. En la meiosis I, los cromosomas homólogos se emparejan y se origina la recombinación. Para que un cromosoma invertido se empareje con su homólogo, se debe formar una estructura conocida como asa de inversión (Fig. 62166). Los gametos no serán impactados negativamente si no se produce la recombinación y los cromosomas se separan normalmente. Sin embargo, el sobrecruzamiento dentro del asa de inversión puede originar producios meióticos desequilibrados. En la inversión paracéntrica, los resultados de la recombinación son, normalmente, no viables, por lo que hay una supresión de la recombinación aparente (es decir, los únicos gametos viables producidos

proceden de cromosomas no recombmados) (Fig, 62-168). En las inversiones pericéntricas es posible que los gametos con duplicación cromosómica y deleción, o ambas, puedan ser derivados. En general, las inversiones pericéntricas mayores pueden originar deficiencias en las duplicaciones más pequeñas y aumentan las probabilidades de que un niño nazca vivo, a pesar de que el desequilibrio cromosómico puede generar anomalías en ese niño. Una vez que se ha identificado al portador de la inversión, se puede utilizar el diagnóstico prenatal para valorar los cromosomas del feto. Las translocaciones son las reordenaciones de dos o más cromosomas no homólogos. Cada cromosoma se rompe una vez y los fragmentos se intercambian de lugar, originando dos (o más) cromosomas derivados (Fig. 6214). Al igual que en las inversiones, la mayoría de las translocaciones son equilibradas, y sólo tienen ramificaciones clínicas cuando se elimina un gen estructural importante. Por otra parte, el peligro principal de una translocación equilibrada es el de que el portador tiene un mayor riesgo de tener hijos vivos con anomalías cromosómicas. En la primera división meiótica los cromosomas translocados adoptan una estructura en forma de cruz para que todos los alelos se empa-

CAPÍTULO 62

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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA

No s e p a r a c i ó n - M e i o s i s I

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No separación - Meiosis

II

A Figura 62-11. Los errores de la no separación en la meiosis generan gamelos aneuploides. A, La no separación en la meiosis I produce una copia extra del cromosoma A (heterodisomía) en dos gametos, pero también la falta de cualquier cromosoma A en los dos gametos restantes S. La no separación en la meiosis II origina dos gametos con un complemento de cromosoma normal (abajo a a derecha), la falla de un gameto en el cromosoma A y un gameto con un cromosoma extra duplicado (dos copias del cromosoma A1 producen isodisomia en el cromosoma Al)

No separación

Figura 62-12. Generación de disomía uniparental por los errores de la no separación. A la izquierda del diagrama se puede ver la heterodisomia originada por la reducción de una trisomia a una disomía A la derecha se observa la isodisomia producida por el rescate de la monosomía (la duplicación del único cromosoma que existe).

Heteródísomfa uniparental

Heteródísomfa hiparcntal

Isodisomia uniparental

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Isodisomia uniparental

SECCIÓN V I I

Heterodisomia uniparental

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PATOLOGÍA MOLECULAR

Heterodisomia biparental

Figura 62-13. Isodisomía Irente a heterodisomia. La conformación nalural de una célula es la heterodisomia biparental: un cromosoma de cada padre. Los errores en la división pueden originar una distribución aberrante de los cromosomas de ambos padres, de forma que se pueden producir dos copias de un cromosoma de uno de los padres (isodisomía uniparental) o dos cromosomas diferentes del mismo padre (heterodisomia uniparental).

rejen adecuadamente (Fig. 62-17). En la anafase los cromosomas altemos se deben segregar juntos para generar gametos equilibrados. Una de cada tres veces los cromosomas no se segregarán de esta manera y producirán gametos desequilibrados. A los errores más corrientes se les denomina segregación adyacente 1 y segregación adyacente 2. A pesar de que ambos patrones producen deficiencias en la duplicación del material cromosómico, la segregación adyacente 2 es más deletérea, ya que está caracterizada por la presencia de centrómeros homólogos en una sola célula. La viabilidad de un feto que recibe un gameto desequilibrado depende de los cromosomas y de los genes involucrados en la translocación y del tamaño de la duplicación o de la deleción. Los cromosomas también pueden seguir un patrón de segregación 3:1, en el cual tres cromosomas se separan en una célula y el resto de los cromosomas en una segunda célula. Esto produce desequilibrios totales del material cromosómico y por lo general es letal in útero. El diagnóstico prenatal es posible una vez que se ha identificado al portador de la translocación. Las translocaciones Robertsonian son una variación de la translocación clásica. Se producen, solamente, entre dos cromosomas acrocéntricos y se presentan como una fusión de los brazos largos al centrómero, cuyo resultado es la pérdida de los dos brazos cortos (Fig. 62-14). La pérdida de los brazos cortos no es deletérea, dado que se localizan múltiples copias de los genes de ARNr en todos los cromosomas acrocéntricos. Una persona portadora de la translocación Robertsonian tiene 45 cromosomas, ya que dos cromosomas se han convertido en uno que es funcional. Estas personas están más expuestas a los errores de la no separación meiótica, cuyo resultado son hijos con una trisomia en uno de los cromosomas reordenados. El ejemplo más corriente de esto es el de una persona con una translocación Robertsonian en los cromosomas 13 y 14 que tiene hijos vivos con trisomia 13 (Fig. 6218). El hijo afectado tendrá 46 cromosomas con dos copias libres de cromosomas 13 y la translocación Robertsonian. Otra reordenación corriente es la translocación Robertsonian 14;21. que podria dar lugar a que su progenie tuviera una trisomia 21. Aunque las translocaciones robertsonianas más corrientes se producen entre cromosomas acrocéntricos no homólogos, es posible que se produzcan estas reordenaciones entre cromosomas homólogos. Por ejemplo, un individuo con una translocación robertsoniana 21;21 tendrá un total de 45 cromosomas, incluida la translocación en la que los dos 21 están unidos al centrómero. Este tipo de reordenación es siempre virtualmente de novo, ya que los portadores de esta anomalía, no es probable que tengan una progenie normal. Los gametos viables incluyen 1) una célula con la translocación Robertsonian (dos copias del cromosoma 21), que si es fertilizada dará lugar a un niño con síndrome de Down, o 2) una célula sin copias del cromosoma 21, que si es fertilizada dará como resultado una monosomía 21, que es incompatible con la vida.

El cromosoma que es el resultado de la división errónea del centrómero durante la división celular que produce dos copias de uno de los brazos del cromosoma pero al que le falta el otro brazo es un isocromosoma (Fig. 6214). Por tanto, el portador de esta reordenación tiene una trisomia en el brazo duplicado y una monosomia en el otro brazo. El ejemplo mejor conocido es el isocromosoma del brazo largo del X. Esta configuración produce una trisomia en el brazo largo y una monosomía en el brazo corto del X, y dado que se necesitan dos copias funcionales del brazo corto del X para que se desarrolle un ser del sexo femenino, esta anomalía cromosómica es coherente con el síndrome de Turner (véase más adelante en Aneuploidias cromosómicas sexuales). Los cromosomas acrocéntricos también pueden formar isocromosomas (duplicación inversa del brazo largo), pero esto produce la homocigosidad de todos los locus presentes, lo que puede llevar a expresar desórdenes recesivos que de otra manera no habrían sido evidentes. Un cromosoma de anillo se produce cuando se pierden los dos telómeros de un cromosoma y el fragmento del cromosoma que queda se hace un circulo para restablecer la estabilidad cromosómica (Figs. 62-14 y 62-19). Desafortunadamente, estas construcciones son, por lo general, inestables, ya que la replicación puede producir círculos entrelazados que llevan a la rotura del cromosoma y a su pérdida cuando los homólogos intentan separarse en la anafase. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, los anillos pueden ser transmitidos de forma estable en lineas celulares. Esto se produce cuando el anillo contiene material genético, que es esencial para la función celular normal. El cromosoma marcador es un cromosoma con un centrómero que se transmite de forma estable a las células hijas, pero no puede ser claramente identificado debido a que es demasiado pequeño o a que el patrón de bandeo es demasiado ambiguo. La HISF ha sido de gran ayuda para determinar el origen de los marcadores. Conclusiones. Las anomalías cromosómicas, tanto las numéricas como las estructurales, que producen un complemento de cromosoma desequilibrado están asociadas a algún tipo de descubrimiento clínico anormal, y el tamaño del desequilibrio es proporcional a la gravedad del problema. La mayoría de los individuos a los que les han diagnosticado una anomalía cromosómica constitucional sólo tienen un único defecto cromosómico. Sin embargo, hay casos raros de personas que tienen dos o más errores cromosómicos. Las anomalías cromosómicas adquiridas (vistas en células cancerígenas) pueden ser más complejas y pueden tener múltiples cambios, numéricos y estructurales, en una sola linea celular.

Nomenclatura Con un campo tan amplio de variaciones cromosómicas. se hizo necesario desarrollar un sistema de clasificación que hiciera posible que el complemento de cromosoma de cada individuo fuera descrito sucintamente y comprendido por todo el mundo. La primera nomenclatura citogenética proporcionó una línea de trabajo y desde entonces se ha ido desarrollando el "idioma". Actualmente, el estándar reconocido es el Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética (SINC). y la última revisión ha sido en 1995. La nomenclatura que describe a un complemento de cromosoma se divide en tres partes básicas: 1) el número total de cromosomas, 2) el complemento de cromosoma sexual y 3) cualquier anomalía cromosómica. Estas unidades están enumeradas por orden y separadas por comas. Así, una mujer o hembra aparentemente normal se debe codificar como 46.XX y un hombre o macho será 46.XY. Si hay dos o más líneas presentes, se enumeran secuencialmente separadas por una barra inclinada, y si está presente un clon diploide normal, siempre se le enumera al final (45,X/46,XX). A otros clones se les ordena por tamaño, poniendo primero al clon más grande. El número de células en cada clon se indica por un número encerrado en un paréntesis angular (45,X[15]/47.XXX[3J/46,XX[12]. Para las anomalías numéricas, el número de cromosomas se aumenta o se disminuye para indicar el cambio total, y el cromosoma especifico adquirido o perdido se anota al final. Por ejemplo, la trisomia 13 en una mujer o en una hembra se debe escribir 47,XX,+13 y la monosomía 8 en un hombre o en un macho se debe escribir 45.XY.-8. Sin embargo, para una variación cromosómica sexual que se sabe que es constitucional, no es necesario utilizar el símbolo + o el -, ya que se puede notar directamente el cambio en el complemento de cromosoma. La monosomía X

CAPÍTULO 62

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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA

1317

Figura 62-14. Represeniación esquemálica de las diferentes anomalías cromosómicas estructurales, descritas en el texto, asociadas con ejemplos de cada anomalía. El primer panel muestra la conliguración normal de un cromosoma generalizado, donde las letras A. B. C. D y E indican a los diferentes locus de genes y el centrómero está indicado por un punto entre los locus B y C Deleaon La delación cromosbmica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la deleción terminal del brazo codo del cromosoma 4. Duplicación: La duplicación cromosómica muestra las conliguraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la duplicación terminal del brazo corto del cromosoma 5 (las dos flechas indican la banda duplicada). El isocromosoma está originado por una división errónea del centrómero que produce duplicaciones invertidas del brazo corto y del brazo largo del cromosoma original. Ejemplo: el isocromosoma del brazo largo del cromosoma X Inversión: La inversión cromosómica muestra las formas paracéntnca y pencéntrica. Ejemplo: la inversión pericéntrica del cromosoma 9 (las flechas indican los centrómeros) Translocación: Translocación reciproca frente a Iranslocación Robertsonian. Ejemplo: la transiocactón Robertsonian de los cromosomas 14 y 21. Cromosoma anillo. Ejemplo: el anillo 18.

La ilustración continua en el pagina siguiente.

8

SECCIÓN V I I

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PATOLOGÍA MOLECULAR

18

a(18)

Figura 62-14. Continuación. Representación esquemática de las diferentes anomalías cromosómicas, descritas en el texto, asociadas con ejemplos de cada anomalía. El primer panel muestra la configuración normal de un cromosoma generalizado, donde las letras A. B, C, D y E indican a los diferentes locus de genes y donde el cenlrómero está indicado por un punto entre los locus B y C. Delación: La deleción cromosómica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la deleción terminal del brazo corto del cromosoma 4. Duplicación: La duplicación cromosómica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la duplicación terminal del brazo corto del cromosoma 5 (las dos flechas indican la banda duplicada). El isocromosoma está originado por una división errónea del centrómero que produce duplicaciones invertidas del brazo corto y del brazo largo del cromosoma original. Ejemplo: el isocromosoma del brazo largo del cromosoma X. Inversión: La inversión cromosómica muestra las formas paracénlrica y pericéntrica. Ejemplo: la inversión pericéntrica del cromosoma 9 (las flechas indican los centrómeros). Translocación: translocación recíproca frente a translocación Robertsonian. Ejemplo: la Iranslocación Robertsonian de los cromosomas 14 y 21. Cromosoma anillo. Ejemplo: anillo 18.

CAPÍTULO 6 2

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APLICACIONES DE LA CITOGENÈTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA

Figura 62-15. Ejemplos de deleciones cromosómicas A. Deleción del brazo largo disial del cromosoma 4 El cromosoma de la derecha es significativamente más cono (Hecha) que el cromosoma normal de la izquierda, fl. Deleción intersticial del brazo largo del cromosoma 11. El ideograma de la izquierda muestra la región de ADN que falta en el cromosoma que ha sufrido la deleción. A la derecha están los cromosomas bandeados reales con el cromosoma 11 que ha sufrido la deleción a su derecha (las Hechas indican la deleción).

Figura 62-16. Inversión cromosómica. A. Diagrama de la inversión pericéntrica del cromosoma 9 que utiliza los ideogramas para indicar los mecanismos de inversión. A la derecha se ven los cromosomas bandeados que demuestran esta inversión. 8 . Asa de inversión que indica el emparejamiento de homólogos en la meiosis de un cromosoma normal y uno con una inversión paracéntrica. Si la recombinación se produce en el punto indicado por el cromosoma X en el asa, se generarán cromosomas recombinantes como se muestra abajo. En el caso de una recombinación paracéntrica. los cromosomas que se producen son dicénlncos o acéntncos.

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SECCIÓN V I I

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PATOLOGÍA MOLECULAR

Figura 62-17. Translocación cromosómica. En el diagrama se muestra la generación de gametos procedentes de una translocación hipotética durante la meiosis. Los cromosomas se emparejan, en la meiosis 1. con una configuración en lorma de cruz. La segregación alterna generará gametos equilibrados. La segregación adyacente 1. la adyacente 2 o la adyacente 3:1 producirán gametos desequilibrados, los cuales pueden originar un niño nacido con vida anormal. (Sólo se muestra una de las distintas segregaciones 3:1 posibles.)

se pone 45.X y la adquisición de un cromosoma sexual será 47.XXY.47.XXX o 47.XYY. Por otro lado, si el cambio cromosómico sexual es adquirido, como en algunas líneas celulares cancerígenas, se necesita un + o un - para indicarlo (es decir, 45.X-Y para un hombre o macho que haya perdido su cromosoma Y como resultado de su enfermedad). Los cambios estructurales en los cromosomas no afectan a los cromosomas presentes, pero se deben anotar al final para clarificar el estatus del o de

los cromosomas reordenados. Para no alargar la nomenclatura, se han generado una serie de abreviaciones para las anomalías estructurales corrientes que acortan el total de la misma (Tabla 62-1). Una anomalía estructural se indica con la abreviatura de la anomalía seguida del cromosoma implicado y el punto de ruptura en el mismo. Para las reordenaciones en las que hay dos cromosomas implicados, los cromosomas se dan en un primer conjunto de paréntesis (primero el número más bajo o el cromosema sexual), seguido de

Figura 62-18. Los cromosomas bandeados y los de ascendencia muestran la herencia de una translocación Robertsonian de los cromosomas 13 y 14. La madre es la portadora de la translocación (tlecha larga) en una lorma equilibrada, pero un error mekótico origina la transmisión, de la madre al hijo, de un cromosoma con la translocación Robertsonian y de otro cromosoma 13. El niño tiene trisomia 13 (las flechas cortas indican el 13S normal, la Hecha larga indica la translocación Robertsonian). Nota: la segunda copia del cromosoma 14 no falta, sino que está unida al centrómero del tercer cromosoma 13.

CAPÍTULO 62

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APLICACIONES DE LA CITOGENETICA EN LA PATOLOGÌA MODERNA Tabla 62-2

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A n o m a l í a s c r o m o s ó m i c a s en las pérdidas fetales e s p o n t á n e a s y en niños nacidos con vida

Anomalías 45.X Triploidia Tetraploidía Tnsomias 16 22 21 15 14 18 13 Translocación desequilibrada Reordenamiento equilibrado

Pérdidas fetales espontáneas %

Incidencia en los nacidos vivos

18 17 6,0

1/10.000 1/60 000 0

16 5.7 4,7 4,2 3.7 3.0 2.0 3.0 4,0

0 0 1/700 0 0 1/8.000 1/10.000 1/2.100 2/1.000

Figura 62-19. Cromosoma anillo. El cromosoma 18 normal está a la izquierda. A la derecha se indica el cromosoma de un solo anillo y el cromosoma de doble anillo. Los dalos proceden de Hook (1977). Jacobs ( 1992) y Mueller ( 1998) El cromosoma anillo de la parte superior es de un solo anillo, como confirma la imagen de banda-C de la derecha (un solo centrómero oscuro). El cromosoma anillo de la parte inferior es mucho más grande y la tinción de banda-C indica dos cenCitogenètica prenatal trómeros oscuros, lo que lo confirma como un cromosoma de doble anillo.

los puntos de ruptura de la reordenación en el mismo orden relativo; esto es, t(4;9)(q21,2;p22) es una translocación entre los cromosomas 4 y 9 con los puntos de ruptura 4q21,2 y 9p22. Los siguientes ejemplos incluyen a: Deleción: 46,XX.del(4)(p15) Duplicación:

46,XX,dup(11)(q23)

Translocación: Inversión:

46.XY,t(4:9)(q21,2;p22) 46.XY,mv(9)(p11q21.1)

Deleción terminal del brazo corto del 4 en la banda 15 Duplicación terminal del brazo largo del 11 en la banda 23 Translocación entre el 4 y el 9 Inversión pericéntrica entre las bandas p11 yq21.1

CLINICA Aplicaciones clínicas Las anomalías citogenéticas se pueden encontrar en individuos aparentemente normales, asi como en pacientes con anomalías fenotipicas o con desórdenes genéticos diagnosticados. El diagnóstico se puede producir en cualquier etapa de la vida. Se puede establecer la existencia de un síndrome cuando se observa que varios individuos, no emparentados, tienen un conjunto de rasgos iguales. Ya se sabe que las características asociadas a un síndrome tienen una base común, las cuales son, con frecuencia, una anomalía cromosómica especifica. Sin embargo, aunque un síndrome está definido por un conjunto de caracteres, los individuos afectados pueden ser viables y no todos mostrarán un fenotipo idéntico.

Tabla 62-1

Abreviaturas c o m u n e s de a n o m a l í a s cromosómicas

Abreviatura cen del dup

Signiticado Centrómero Deleción Duplicación

ins mv

Inserción Inversión

i marcador a

Isocromosoma Mar Anillo

rob l

TranslocacíOn Robertsonian TranslocaciOn

Los estudios han demostrado que 1 de cada 13 productos de la concepción tiene una anomalía cromosómica, pero de éstos, sólo 6 de cada 1.000 nacen vivos, lo cual indica que son reconocidos y eliminados la mayoría de los errores. Por ejemplo, de todas las concepciones 45.X, el 95% acabará espontáneamente. La misma frecuencia en el fin del embarazo se registra en las trisomías de los nacidos vivos (no llegarán a término el 90% de las concepciones con trisomía 13. el 80% de las concepciones con trisomía 18 y el 65% de las concepciones con trisomía 21). Por término medio, el 15% de todos los embarazos reconocidos termina con la pérdida fetal de manera espontánea, y el 80% de éstos se producen durante los tres primeros meses. De todos los abortos espontáneos, el 60% se deben a anomalías cromosómicas (Tabla 62-2), y de éstos el 52% se deben a trisomías autosómícas. La tnsomia más comente que se ve en material procedente de un aborto, es la tnsomia 16. pero el tipo más frecuente de error cromosomico en las pérdidas espontáneas es el 45,X. El diagnóstico prenatal se ha convertido en el área más importante de los esludios citogenéticos clínicos, debido a esta clase de información y a los conocimientos, cada vez más amplios, de la genética. Los datos de referencia más corrientes deben contar con una historia familiar del o de los hijos anteriores con una anomalía cromosómica. de niveles anormales de AFP en un análisis (véase Cap. 22), de una anomalía detectada por ecografia y de la edad de la madre. La razón exacta de este fenómeno no está clara, aunque los estudios sobre la población han demostrado que en las mujeres de más de 35 años está aumentando la frecuencia de hijos nacidos con anomalías cromosómicas, especialmente trisomías (Hassold. 1985) El análisis estadístico se ha realizado, debido a la frecuencia relativamente alta de nacimientos con síndrome de Down, y muestra, claramente, la correlación entre los niños afectados y la mayor edad de la madre (Fig, 62-20). Esto se está convirtiendo en un problema para una sociedad en la que las mujeres están dejando los embarazos para edades más tardías. Las anomalías cromosómicas más comentes detectadas en los análisis prenatales son las trisomías en los nacidos vivos y las aneuploidías de los cromosomas sexuales. Pero debido a que éstas son, normalmente, el resultado de un error de la no separación meiótica, el nesgo de reincidencia es muy bajo. Ocasionalmente se identifica a un niño con una anomalía cromosómica estructural equilibrada o desequilibrada. En estas circunstancias, se hace un análisis del cariotipo de los dos progenitores biológicos para diferenciar si el niño tiene una reordenación heredada o una anomalía de novo. Por ejemplo, en un niño con una translocación equilibrada heredada, el nesgo de que la reordenación cromosómica plantee cualquier problema es menor de un 1%. Sm embargo, si la translocación aparentemente equilibrada que se ha visto en el feto no es detectada en ninguno de los padres biológicos, se ha tenido que originar de novo en el niño y hay de un 5% a un 10% de nesgo de perjuicio para el niño. Desafortunadamente, encontrar una translocación no equilibrada en un feto, a pesar del estatus portador de los padres, es una situación grave y casi siempre origina algún tipo de defecto genético en el

1322

SECCIÓN V I I

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PATOLOGÍA MOLECULAR

Figura 62-20. Aumento del riesgo de una concepción con sindrome de Down relacionado con el aumento de la edad materna. El número de niños nacidos con vida de madres con más edad es menor, debido a la intervención de los diagnósticos prenatales, seguido de la interrupción de embarazos anormales.

niño. Sin embargo, en esta situación, el determinar si uno de los padres es el portador de la translocación equilibrada proporcionará información sobre el riesgo de reincidencia en embarazos futuros.

Posnatal Aproximadamente el 0,6% de los recién nacidos tienen una anomalía cromosómica. Estos niños pueden presentar señales o síntomas de un síndrome definido o pueden tener anomalías clínicas no relacionadas con un desorden específico, pero de las que, sin embargo, se puede sospechar que se deben a una anomalía cromosómica. Los genitales ambiguos son un síntoma para examinar el complemento de cromosoma sexual de un recién nacido. Si un niño muere poco después de su nacimiento, el análisis citogenético puede proporcionar la información necesaria para comprender el porqué de esa muerte. Los hallazgos cítogénicos para establecer el diagnóstico deberán estar correlacionados, siempre que sea posible, con los resultados de la autopsia.

Infancia y edad adulta Un malentendido corriente sobre los desórdenes genéticos es que porque son heredados el diagnóstico será obvio al nacer. De hecho, la presencia clínica de muchos desórdenes tarda en manifestarse y puede no ser expresada completamente hasta más tarde en la vida. En consecuencia, algunos de los problemas diagnósticos más difíciles se dan en niños y adultos. Además, para considerar el amplio alcance de las posibilidades citogenéticas, también se deben tomar en consideración las opciones bioquímicas y moleculares.

Genética del cáncer Otra área de la medicina en la que la citogenética está siendo cada vez más importante es la oncología. A pesar de que la amplitud de variabilidad en los hallazgos cariotípicos de la mayoría de los tumores sólidos hace que las decisiones sobre los tratamientos sean difíciles, existen datos clínicos excelentes, de las leucemias y de los linfomas, que incluyen a reordenaciones cromosómicas específicas que están directamente asociadas a la tumorigénesis (Tabla 62-3; véase Cap. 65; Block, 1998). Al identificar estas anomalías se podrá hacer un diagnóstico a nivel citogenético, aunque en la práctica la citogenética es, generalmente, sólo una parte de los datos que se utilizan para hacer un diagnóstico. Una vez que se ha detectado una anomalía cromosómica, se puede monitorizar el progreso de la enfermedad del paciente. Si el tratamiento tiene éxito, la mayoría de las anomalías cromosómicas ya no serán evidentes en la médula ósea y se dirá que el paciente está en remisión, mientras el cariotipo sea aparentemente "normal". Sin embargo, si el tratamiento no elimina completamente la línea celular aberrante, la remisión puede ser sólo un intervalo, en el cual las células causantes de la enfermedad pueden estar detenidas a unos niveles tan bajos que no son detectables a través de los análisis de cariotipo rutinarios. Después, en la recaída, reaparecerán las mismas anomalías cromosómicas, que pueden ir acompañadas de ano-

malías adicionales y/o de líneas celulares más complejas, resultados acordes con progresión de la enfermedad. Un aumento en la complejidad de la recuperación es lo que se conoce como la evolución del cariotipo y. por lo general, el número y el tipo de las anomalías cromosómicas vistas están correlacionados con un mal pronóstico y con la gravedad de la enfermedad. La HISF de interfaz ha sido un elemento valioso para los estudios oncológicos clínicos (Cremer, 1988: Anastasi, 1991). Muchas de las anomalías citogenéticas importantes que se han visto en las leucemias son translocaciones, y se han desarrollado sondas HISF de combinación que hibridan a los lados opuestos de los puntos de ruptura de la translocación. Por ejemplo, la leucemia mielógena crónica (LMC) está caracterizada por una translocación entre el proto-oncogen ABL en el cromosoma 9 (9q22.3) y el gen BCR en el cromosoma 22 (22q11.2). La reordenación origina un gen quimérico en el cromosoma 22 derivativo. Para detectar la translocación se utilizan un par de sondas: 1) se localiza al lado distal del locus ABL en el cromosoma 9 (rojo) y 2) situada en el lado proximal del locus BCR en el cromosoma 22 (verde). Cuando hay no translocación presente, deberían estar presentes en cada célula dos señales verdes (que detectan cada alelo ASÍ.) y dos señales rojas (que detectan cada alelo BCR) (Fig. 62-21 A). La presencia de una translocación da una señal verde y una señal roja contiguas la una a la otra, y con la resolución del microscopio de luz, las dos señales se unen, dando una sola señal amarilla. Por tanto, una célula con una translocación tendrá sólo tres señales, una verde, una roja y una amarilla (Fig. 62-216). Aunque se puede hacer este estudio en células en metafase, la utilización de células de interfaz proporciona una muestra mucho más grande con la que se puede hacer el ensayo más rápidamente (Werner, 1997). De la misma manera se pueden comprobar otras translocaciones leucémicas. Otras aplicaciones de la HISF en oncología incluyen 1) la utilización de una sonda de centrómero específica del cromosoma 12 para análisis de una población de células de interfaz para las células de trisomia 12 indicativas de LLC. 2) la utilización de una sonda de cromosoma 7 para detectar la monosomía 7 en el síndrome mielodisplásico (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA) y 3) la utilización de una sonda de cromosoma 8 para identificar la trisomia 8 en los desórdenes agudos y en los crónicos. También ha tenido mucho éxito la utilización de sondas de X e Y de diferentes colores, para evaluar el éxito de un trasplante de médula ósea en el que el donante y el receptor eran de sexos diferenles. Después del trasplante, el hombre que ha recibido células de un donante femenino debería tener un complemento XX, pero si se encuentra un número significativo de células XY, indicaría un problema potencial o posiblemente el fallo del injerto, La HISF se puede repetir, a intervalos regulares, para monitorizar el progreso y para advertir de que empieza a proliferar la población de células leucémicas del paciente. La HISF multicolor también se ha utilizado para evaluar las líneas celulares leucémicas. Es interesante hacer notar la discrepancia que hay, a menudo, entre lo que se detecta a través de la citogenética habitual y lo que se ve utilizando la HISF (Veldman, 1997). Se ha sugerido que las células cancerige-

CAPÍTUIO 62

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APLICACIONES DE LA CITOGENÈTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA

Tabla 62-3 R e o r d e n a m i e n t o s cltogenéticos c o m u n e s e n la leucemia y en el linfoma Desorden LMC (leucemia mielógena crónica)

LMA (leucemia mieloide aguda) MI M2

M3 (APL) M4 (AMMoL)

Reordenamiento cromosomico t(9;22)(q34 1q11 2) +8 'd 7q) segundo Ph' + 19 t(9;22)(q34 1;q11 2) + 11 t(8:21)(q22:q22) t(9.22)(q34.1;q11.2) I(6.9)(p23q34) t(7.11)(p15;p15) +8 t(15;17Kq22;q11-22) t(11;17Kq23:q21) mv(16)(p12q22) t(16:16)(p13:q22) del(16)(q22) mv(3)(q21q26).

I(3;3)(q21;q26)

M5 (AMoL)

M6 t(3;3)(q2l;q26) M7 Cualquier subtipo

I(11;19)(q23:p13) +8 +22 I(8;16)(p11;p13) I(9;11)(p21-22:q23) t(11;19)(q23;p13) t/del(11q23) t(3.5)(q21-25:q31-35) inv(3)(q21q26). t(1.22)(p13;q13) +8 -7

Y

20q9q K17q) LLA (leucemia linfoblástica aguda) hiperdiploidía L1 L I , L2

L3

LLC (desórdenes imloproliferativos crónicos) Célula B Célula T Síndromes mielodisplásicos

I(1;19)(q23;p13) del/t(12p) 1(4:11)(q21;q23) del(6q) I(9:22)(q34.1;q11.2) I(11:19)(q23:p13) +21 hiperdiploide, mn 50-56 I(8;14)(q24;q32) 1(8;22)(q24;q11) I(2:8)(p12:q23)

+ 12 14q+ 14q+ 14q 11 reordenamientos 5q del(5)(q13q33) -7, del(7q) +8 + 19 dcl(20q)

ñas experimentan, realmente, un grado significativamente mayor de reordenaciones cromosómicas de las que se habían apreciado previamente y que algunas de las nuevas reordenaciones que se han detectado pueden evidenciar nuevos genes relacionados con el cáncer. Sin embargo, llevará algún tiempo antes de que se pueda recoger un conjunto de datos significativos que proporcionen las correlaciones clínicas de estas nuevas reordenaciones.

1323

Desórdenes citogenéticos Síndromes de aneuploidías cromosómicas Aneuploidías autosómicas. La causa más común del retraso mental es la trisomía 21 o síndrome de Down. La incidencia de este desorden es de 1 de cada 700 nacimientos y está caracterizado por hipotonia. caras aplanadas, cisuras palpebrales oblicuas, orejas pequeñas, lengua protuberante, pliegue palmar transversal, defectos del corazón e hipogonadismo. Aproximadamente el 92.5% de todos los individuos con síndrome de Down tienen 47 cromosomas, incluidas tres copias del cromosoma 21 originadas por un error de no separación en la meiosis (Tabla 62-4). Sin embargo, sólo menos del 3% de los pacientes tienden a expresar un fenotipo menos severo y se manifiestan como mosaicos con dos líneas celulares que pueden incluir una línea 46.XX o una 46.XY. Además, alrededor de un 5% de los pacientes con síndrome de Down sólo tienen 46 cromosomas, dado que el 21 extra es parte de una translocación Robertsonian o de otras translocaciones. Con frecuencia, un niño con una translocación indica la presencia de un padre portador de una translocación, por lo que en estos casos es recomendable hacer un análisis de cariotipo a ambos padres, para determinar si la pareja tiene un riesgo mayor de tener más hijos con síndrome de Down en futuros embarazos. Los estudios citogenéticos de los individuos con reordenaciones del cromosoma 21 han revelado que no es necesario que se triplique el cromosoma 21 en su totalidad para que esté presente el fenotipo del síndrome de Down. A menudo, tres copias del brazo largo proximal producen presentaciones clínicas distintas de las del síndrome de Down. A la inversa, la triplicación del brazo largo distal está directamente correlacionada con un claro fenotipo del síndrome de Down. Los análisis de pacientes con reordenaciones citogenéticas diferentes han identificado una región conocida como la región crítica del síndrome de Down. la cual incluye bandas de la 21q22.12 a la 21q22.3 (Fig. 62-22). La presencia de tres copias de este fragmento del 21 es suficiente para establecer un diagnóstico claro del síndrome de Down (Korenberg. 1990; Delabar, 1993). A pesar de que al hacer el mapa cromosómico se ha estrechado la región crítica del síndrome de Down, los esludios comparativos entre pacientes con síndrome de Down e individuos con otros desórdenes asociados a genes localizados en el cromosoma 21 (Fig. 62-22) han dado correlaciones interesantes. Los análisis de la estructura cerebral de pacientes con síndrome de Down o con Alzheimer, en particular, han revelado una anomalía arquitectónica similar, lo que sugiere que la triplicación y la mutación del locus del gen de la proteina |3-precursora amiloide (PPA) pueden producir resultados negativos similares. Las otras dos trisomías de los nacidos vivos son la trisomía 13 y la tnsomia 18. La trisomía 13, el síndrome de Patau, con una frecuencia de 1 de cada 4.000 a 1 de cada 10.000 nacimientos, está caracterizado por cabeza pequeña, labio leporino o paladar hendido, o ambos, ciclopía. pliegue palmar transversal, polidactilia de las manos, de los pies, o ambas, talón prominente, defecto septal ventricular y cuero cabelludo puntiagudo. Aproximadamente se diagnostica de trisomía 18 o síndrome de Edwards (Fig. 62-23A) a uno de cada 8.000 recién nacidos, que tienen poco peso al nacer, boca y mandíbulas pequeñas, delecto septal ventricular, hipoplasia de los músculos, un occipucio prominente, orejas malformadas y bajas, pies de base basculante y dedos cruzados. Por lo general, el síndrome de Down es bastante manejable, a pesar de que tiene, frecuentemente, consecuencias clínicas graves y los pacientes llegan a vivir veinte o treinta años. La trisomía 13 y la trisomía 18 son mucho menos compatibles con la vida y los pacientes suelen morir durante el primer mes de vida. Si un individuo sobrevive al primer año, el porvenir es sombrío, ya que esos pacientes no aprenden a hablar, a caminar o a cuidar de sí mismos. Por este motivo, la opción de la interrupción del embarazo, está entre los consejos para los casos con diagnóstico prenatal de trisomía 13 y trisomía 18. Aneuploidías cromosómicas sexuales. Las aneuploidías cromosómicas sexuales son relativamente comentes (su Irecuencia, por lo general, es de 1 de cada 500 nacimientos) y son fenotipicamente más leves que las aneuploidías autosómicas, debido al efecto de la inactivación del cromosoma X y al número limitado de genes presentes en el cromosoma Y. La

SECCIÓN VII

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PATOLOGÍA MOLECULAR

Figura 62-21. Detección mediante la HISF de la translocación 9:22 en la LMC. A. No hay translocación presente, como se ve por dos copias de cada sonda del cromosoma 9 (en rojo) y del cromosoma 22 (en verde) en la célula en metalase (a la derecha) y en la de interfaz (a la izquierda). 8. Translocación en un paciente que ha sido detectada mediante la señal amarilla (Hecha) más una señal verde y una roja (en células de interfaz).

causa, en la mayoria de los casos, es debida a cuatro desórdenes, tres trisomías y una monosomía. Todos son originados por errores de no separación durante la meiosis y excepto el XYY. que es exclusivamente paterno, los otros desórdenes pueden ser originados tanto por el error materno como por el paterno. Los cariotipos aberrantes de los individuos con tres cromosomas X [47,XXX mujeres] o con un cromosoma X y dos cromosomas Y [47.XYY homTabla 62-4 Errores d e n o s e p a r a c i ó n q u e p r o d u c e n trisomia 21 detectados mediante tecnología citogenética y molecular Citogenéticos Meiosis materna I Meiosis materna II Meiosis paterna I Meiosis paterna II

70% 10% 10% 10%

Dalos de Sherman (1991. 1994) Anlonarakls 11992)

Moleculares 75% 20,6% 1,2% 3,2%

bres] a menudo no son detectados en toda la vida. La incidencia de los nacimientos es relativamente alta. 1 de cada 1.000, pero salvo que son algo más altos que la mayoría, no tienen rasgos chocantes que pudieran indicar una anomalía cromosómica. Algunas de estas personas tienen dificultades de aprendizaje generalizadas, por lo que pueden ser identificadas mediante los programas de rendimiento escolar. También se puede detectar a las mujeres XXX y a los hombres XYY en las clínicas de infertilidad, aunque la anomalía citogenética no está, generalmente, relacionada con el motivo de referencia, ya que las evaluaciones globales muestran que estas personas son completamente fértiles y que, por lo general, tienen hijos cromosómicamente normales. Los hombres XYY tienen más riesgo de padecer problemas de conducta, y los primeros estudios sugirieron que también tienen tendencias criminales debido a la incidencia, más alta de lo que se esperaba, de XYY en presos de instituciones penales (Jacobs, 1968; Price, 1970). Sin embargo, los trabajos posteriores muestran que la criminalidad, más probablemente, se deba a la combinación de múltiples causas y que los hombres XYY no son más propensos a tener una conducta criminal que cualquier otro hombre (Witkm, 1976; Pitcher, 1982; Theilgaard, 1984).

Figura 62-22. A la derecha se ve el mapa del cromosoma 21. que muestra la región critica del síndrome de Down y las posiciones relativas de los locus asociados a vanos rasgos clínicos. A la izquierda se muestra otro mapa de los locus (SUH1E = sindrome de Usher PPA = proteína |5-precursora amiloidea [asociada a la enfermeoad de Alzheimer; DS01 = dismutasa superóxida-1; ELA1 = esclerosis lateral amilrópica; DFNB8 = sordera 8: ETS2 = oncogén ETS-2; HPE1 = holoprosencefalia alobar-1 : COL6A1'COL6A2500 kb) que la deleción molecular típica (1 par de bases [pb] a varios cientos pb), que sólo se pueden resolver por medio de la tecnología molecular (véase Cap. 66). El tamaño real de una micro-deleción puede variar de un paciente a otro, y algunas pueden ser lo suficientemente grandes para identificarlas mediante un análisis citogenético, aunque la mayoría para ser detectadas necesitarán la utilización de la HISF. Aunque al principio se creía que las deleciones estaban dentro de los genes solos, ahora se ha demostrado que ciertos síndromes se deben, en realidad, a deleciones que abarcan porciones de varios genes no relacionados adyacentes. La presentación clínica, por tanto, puede ser una combinación de características, debido a la ausencia de varios productos génicos diferentes. El tamaño de la deleción y el número de genes afectados puede variar tanto que el fenotipo expresado puede ser significativamente diferente entre los individuos. A estos síndromes se les denomina colectivamente síndromes de genes contiguos y representan una serie dentro de la categoría más amplia de los síndromes de microdeleción (Tabla 62-6).

La deleción 15q se puede detectar en casi un 60% de los individuos con el SPW. y en los pacientes con SA sólo entre un 10% y un 20%, por medio de un análisis ordinario o criogénico de alta resolución. La utilización de la HISF ha proporcionado una herramienta para el diagnóstico mucho mejor, y ahora se pueden establecer las deleciones en el 80% a 85% de los casos. Aunque se aceptaba que no todas las deleciones fueran visibles a nivel citogenético, parecía extraño que la HISF no fuera capaz de detectar una delación en el 100% de los casos. Esto, unido al hecho de que el SPW y el SA parecen compartir la misma deleción aunque tienen fenotipos completamente diferentes,

El síndrome de Miiler-Dieker ilustra con claridad el solapamiento entre la microdeleción y los síndromes de genes contiguos. Este desorden se ha asociado con una microdeleción del brazo corto distal del cromosoma 17 (17p13.3), y los rasgos clínicos esenciales son lisencefalia (cerebro liso) y anomalías craneofaciales. La lisencefalia aislada (LSA) ha sido reconocida como una entidad independiente, así que el síndrome de Miiler-Dieker es una presenlación más compleja que une el defecto cerebral con los rasgos faciales característicos. El análisis molecular muestra que hay al menos dos genes

Tabla 62-6 Microdeleción y síndromes de genes contiguos Localización

Trastorno Angelman (SA)

15q11.2

DiGeorge (SDG)

22q1l.2. 10p, 4q, 6q

Rasgos clínicos

Genes UBE3A

RM agudo, retraso en el desarrollo, boca grande, progriatia, ataxia, convulsiones

¿

?GCSL y otros

Cara caracteristica. paladar hendido, hipoplasia del limo y paratiroides, corazón delectuoso e hipocalcemia

7

Icliosis

Xp22.32

STS

Piel escamosa, estatura baja, hipogonadismo, RM

Kallmann

Xp22.3

KAL1

Hipogonadismo, incapacidad para oler

Larger-Giedion (SLG)

8q24 11-q24.13

TRPSI TRPSII EXT

Dismorfismo craneofacial. anomalías esqueléticas, deficiencia mental de moderada a aguda

Lisencefalia (SIL)

17p13,3

LISI

Cerebro liso, retraso mental profundo, convulsiones

Miiler-Dieker (SMD)

17p13.3

Lisencefalia. microcefalia, trente alta, nariz pequeña, micrognatia, orejas bajas

Prader-Willi (SPW)

15q11.2

LIS1 ¿y otros? SNRPN

Retinoblastoma

13q14.1-q14.2

Rb1

Tumores del relinoblasto del ojo

Rubinstein-Taybi (SRT)

16p13.3

CBP

Nariz rota, columela prominente, maxilar superior hipoplásico, fisuras palpebrales inclinadas hacia abajo, dedos pulgar y primero del pie anchos, RM y lenhtud al hablar

Smith-Magenis (SSM)

17p11.2

Hipotonia al nacer, ojos almendrados, RM de moderado a agudo, ausencia de saciedad, lo que lleva a comer de más. manos y pies pequeños, hipogonadismo

Braquicefalia, hipoplasia en media cara, puente nasal ancho. mandíbula prominente, manos pequeñas y anchas, hiperactividad. lentitud al hablar, conducta autodestructiva, RM

Síndrome velocardiofacial (SVCF)

22q11.2

?GCSL

Defectos en el paladar, alae nasi hipoplásica con nariz larga, incapacidad para el aprendizaje, enfermedad cardiaca congénita

WAGR

11p13.3

WT1 AN2 ¿y otros?

Tumor de Wilms, aniridia, defectos genitourinarios y retraso mental

Síndrome de Williams (SEW)

7q11?

ELN

Cl bajo, hipersensibilidad auditiva, oíos azules con un patrón en forma de estrella en iris, labios prominentes, voz ronca, estenosis aórtica supravalvular u otro defecto cardíaco, hipercalcemia y envejecimiento prematuro de la piel

RM = retraso mental. v

...

CAPÍTULO 62

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APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA

WAGR

1329

entre repeticiones directas que están contiguas a la región de deleción común. Esta recombinación intercromosómica generará una estructura de asa que, si se escinde, producirá la deleción del segmento intermedio. También se han detectado recombinaciones intercromosómicas entre repeticiones directas (Edelman, 1998).

Otros fenómenos citogenéticos Síndrome del cromosoma X frágil

11

Figura 62-25. Diagrama del síndrome de genes contiguos WAGR que muestra la posición relativa de los diferentes genes en el brazo corto del cromosoma 11.

sugería que pudiera haber otra causa que originara estos desórdenes. Ahora se sabe que el SPW y el SA son ejemplos de impresión genética y que el proceso de la mutación que origina las enfermedades es mucho más complejo que una simple deleción del ADN (Nicholls, 1989; Robinson, 1991) (véase el Cap. 66 donde se explica la detección molecular y de impresión de los genes impresos). El síndrome de Williams ha sido asociado a una deleción del gen de elaslina (ELN) del brazo largo proximal del cromosoma 7 (7q11.23). Este desorden se caracteriza por anomalías cardíacas, hipertensión, voz ronca, envejecimiento prematuro de la piel y anomalías en el comportamiento. La ausencia de elastina explica muchas de las anomalías físicas asociadas a este síndrome, ya que se sabe que es una proteína importante que da elasticidad a tejidos, como los del corazón, vasos sanguíneos, piel y cuerdas vocales. Sin embargo, los problemas de conducta no se pueden atribuir a la falta de elastina, por eso actualmente se cree que el síndrome de Williams es, en realidad, un síndrome de genes contiguos y que la variabilidad del fenotipo está relacionada con el número de genes adyacentes que se delecionan en combinación con el gen ELN. El síndrome de WAGR (tumor de Wlms, aniridia. defectos genitourinarios, y retraso mental) es un síndrome de genes contiguos muy bien caracterizado y está localizado en el brazo corto del cromosoma 11 (11 p13). Excepto por los defectos genitourinarios, que parecen ser debidos a una mutación variante en el locus del tumor de Wilms. cada una de las otras tres anomalías han sido asociadas a un gen específico, y éstos están ordenados en tándem en el brazo corto del cromosoma 11 (Fig. 62-25). El fenotipo de un individuo afectado variará dependiendo del tamaño de la deleción. Estadísticamente, alrededor de uno de cada tres niños diagnosticados de aniridia desarrollarán también el tumor de Wilms. Por el contrarío, sólo 1 de cada 50 pacientes con tumor de Wilms tiene aniridia. Con deleciones más grandes, también se pueden ver defectos genitourinarios y retraso mental. El síndrome velocardioíacial es. posiblemente, el síndrome de microdeleción más común en los humanos, pero, muy a menudo, pasa desapercibido, debido al amplio espectro de los rasgos clínicos y a que puede presentarse de forma bastante leve. Este desorden se diagnostica, normalmente, en niños lactantes, debido a las dificultades que tienen para alimentarse, a los detectas cardiacos y a las dismorfologías faciales características. Cuando el individuo crece, se advierten discapacidades en el aprendizaje, poca estatura y pérdida de audición conductiva. Es interesante hacer notar que entre un 10% y un 15% de estos pacientes tienen un progenitor afectado, pero mucho más levemente, por la misma deleción. Se cree que la deleción 3 Mb del brazo largo proximal del cromosoma 22 (22q11.2q11.2) se debe a la recombinación

El síndrome del cromosoma X frágil es la segunda causa más importante de retraso mental y la primera de retraso mental heredado. Herbert Lubs describió por primera vez este desorden en 1969, cuando se dio cuenta de que en los miembros de la familia afectados había una correlación entre el retraso mental y un cromosoma X "marcador" (Lubs, 1969). Posteriormente se conoce al cromosoma X marcador como el cromosoma X frágil, que es una rotura o abertura en la estructura del cromosoma X que se puede delectar por medio de la citogenética cultivando células en el medio de inducción adecuado (Fig. 62-26). Desgraciadamente no todos los individuos afectados expresan el cromosoma X frágil por medio de la citogenética, por lo que el análisis clínico es imperfecto. Sin embargo, durante muchos años fue el único ensayo disponible y proporcionó una muy necesaria confirmación de los diagnósticos de muchos pacientes. En 1991 se clonó el gen asociado al síndrome del cromosoma X frágil y se identificó a la mutación como la amplificación de una secuencia repetida de tnnucleótidos, algo que nunca antes se había visto o asociado como un mecanismo causante de la enfermedad. Afortunadamente, esta mutación se puede detectar a nivel molecular, y se ha desarrollado un análisis clínico, altamente competente, que permite la detección directa de la mutación del síndrome del cromosoma X frágil (Rousseau. 1991; Verkerk. 1991).

Síndromes de rotura Los síndromes de rotura cromosómicos (Tabla 62-7) son un conjunto de desórdenes recesivos autosómicos que se agruparon juntos al principio a causa de que los resultados tenían en común la fragilidad o inestabilidad cromosómica (Ariett. 1978). Por esta razón, los análisis citogenéticos fueron de gran ayuda para los diagnósticos. Los estudios moleculares han demostrado una causa común adicional entre estos desórdenes, y es que la mutación en cada uno de ellos origina un defecto en los mecanismos de reparación del ADN de las células. Esto ayudó a explicar otras características de los síndromes, ya que la incapacidad para reparar el ADN puede llevar a 1) la rotura o al aumento de la recombinación, que se puede caracterizar por medio de la inestabilidad cromosómica, y 2) a mutaciones adicionales y defectos en la secuencia del ADN, que pueden originar el cáncer. Con un mejor conocimiento de la mutación específica, la terapia génica para el tratamiento se convierte en una posibilidad.

\

Figura 62-26. Cromosoma X frágil. Ideograma del cromosoma X frágil (izquierda) y un par de cromosomas con bandeo-G representativos que muestran, a la derecha, al cromosoma X frágil.

Tabla 62-7 Síndromes de rotura cromosomica Trastorno

Características clínicas

Locus gènico

Manifestaciones citogenétícas

Tipo de cáncer

Defecto de reparación del ADN

Miscelánea

Pancitopenia, retraso en el crecimiento pre o posnatal, hipopiasia o falta de dedos pulgares, posibilidad de deformación en ios brazos, pigmentación oscura de la piel Retraso en el crecimienio. erupción en la piel en forma de mariposa, posiblemente maligna

1. Grupo A— I6q24.3 2. Grupo C—9q22.3 3. Grupo D—3p22-p26 4. Grupo E—6p21-p22 5. Grupos B E H sin mapa I5q26 1

Aumento de roturas cromosómicas detectadas mediante tratamiento con MMC y DEB

Ataxia telangiectasia (AT)

Ataxia con degeneración del SNC, telangiectasia en la cara, deficiencia de inmunidad celular, degenerativo, retraso en el crecimiento

11q22.3

Vanas leucemias y tumores sólidos

Xeroderma pigmentos (XP)

Sensibilidad a los rayos solares, anomalías neurologicas. ataxia y espasticidad

Aumento en la incidencia de cancer de piel

i Falta de escisión de los los dímeros de timina 2. Defecto en la reparación posreplicación

Síndrome de Cockayne

Enanismo, envejecimiento prematuro, microcefalia, déficit neurològico, degeneración de la pigmentación, sordera, sensibilidad a la luz del sol. RM

incidencia: 1 en 250 000 1. A-9q22.3 2. C-653p25 3. D—19q13.2-ql3.3 4. E—11p11.1-p12 5. F-16p13.1-13.2, 16p13.13-p13.3 5. G—13q33 Cromosoma 5

Aumento de las roturas espontáneas, aumento de anillos tnrradiaies y translocaciones, especialmente en el cromosoma 7 y en el 14 inducidas con bleomicma o con radiaciones ionizantes Aumento del CCH y reordenamiento cromosomico en respuesta a los rayos ultravioletas

Sensibilidad a los rayos ultravioletas

Aumento en la incidencia de cáncer de piel

Posible deficiencia de ADN ligasa o defecto de la reparación de la transcripción asociada emparejada

Anemia de Fanconi (AF)

Sindrome de Bloom (BLM)

Aumento del riesgo de LMA y fallo progresivo de la médula ósea

Aumento de CCH en respuesta a los rayos ultravioleta o incorporación de BrdU

Terapia actual trasplante de medula ósea

Actividad anormal de la ADN ligasa I

MMC • mitomicma C: DEB = diepoxybutano: CCH = camOio de la cromdtida hermana: SNC = sistema nervioso central. RM • retraso mental: BrdU = bromodesoxiuridma: LMA = leucemia mieloide aguda

Alta frecuencia en la población ludía ashkenazi: 1/110 es portadora de esa frecuencia

CAPÍTULO 62

•

APLICACIONES DE LA CITOGENÉTICA EN LA PATOLOGÍA MODERNA

RESUMEN La citogenética es una ciencia de laboratorio de trabajo intensivo, relativamente antigua, que todavía se ejecuta de la misma manera en la que siempre se ha hecho, a pesar de que la llegada de los sistemas asistidos por ordenador para hacer cariotipos y el recolector robótico han añadido un elemento de tecnología avanzada al laboratorio. Aunque una vez se vaticinó que los diagnósticos moleculares eliminarían a la citogenética. eso no ha ocurrido, ya que la citogenética es aún el único ensayo clínico que puede proporcionar una visión general rápida de todo el genoma humano. En lugar de ser reemplazada, la citogenética ha cambiado con los tiempos para hacer (rente a los retos de las enfermedades que se han identificado recientemente y de las nuevas tecnologías. La utilización de la HISF ha rellenado el hueco entre la citogenética y los diagnósticos moleculares de tal manera que los dos campos proporcionan información complementaria para muchos casos. La citogenética continúa siendo importante en la valoración de las anomalías cromosómicas estructurales y numéricas, y es el estándar oro para diagnosticar muchos desórdenes. Su lugar en la medicina de laboratorio clínica está asegurado (por lo menos hasta el momento en el que el escáner tipo "Star Trek" está disponible).

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1332

SECCIÓN V I I

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PATOLOGÍA MOLECULAR

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C A P Í T U L O

63

Organizando un laboratorio de diagnóstico molecular Andrea Ferreira-Gonzalez, Ph.D. David S. Wilkinson, M.D., Ph.D. Carleton T. Garrett, M.D., Ph.D.

INSTALACIONES DEL LABORATORIO

1333

LAS PRUEBAS MOLECULARES

Diseño del laboratorio

EQUIPAMIENTO

1335

PERSONAL DE LABORATORIO

1335

Limitaciones especiales en relación con las pruebas genéticas CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD

Director del laboratorio

DE LA CALIDAD

Supervisor técnico

1341

Control de calidad en el proceso de las pruebas

Técnicos médicos y técnicos en biología molecular

Control de calidad del equipo de laboratorio

Residentes, becanos y estudiantes graduados

Elementos del programa de seguridad de la calidad

Adiestramiento y acreditación 1337

ACREDITACIÓN DEL LABORATORIO

Pruebas de desarrollo propio

Pruebas de los laboratorios clínicos

Métodos manuales basados en equipos

Pruebas forenses de identidad humana y de paternidad

Sistemas automatizados basados en equipos para pruebas moleculares SELECCIÓN DE PRUEBAS

1339

Reactivos específicos del sustrato

Métodos de ayuda en el control de contaminación

FORMATOS DE PRUEBAS CLÍNICAS

VALIDACIÓN ANALÍTICA Y CLÍNICA DE

1342

CONCLUSIÓN

1343

BIBLIOGRAFÍA

1343

1337

Codificación CPT e ICD-9 Patentes

Durante la última década se ha adquirido una enorme cantidad de conocimientos con respecto a los genes y a sus funciones en las enfermedades humanas. Esle conocimiento nos ha permitido una mejor comprensión del proceso de muchas enfermedades. Como consecuencia, las enfermedades se definen cada vez más en términos de su patogenia molecular. Esto ha conducido al desarrollo de nuevos métodos clínicos moleculares para su utilización en el diagnóstico, pronóstico, selección de modalidades terapéuticas y vigilancia de las enfermedades (Ferreira-González, 1996; Fredericks. 1999; Hodinka, 1998; Hruban. 1998; Sawyers, 1999; Tsongalis. 1999). Los métodos clínicos moleculares representan una serie de técnicas y reactivos en los que el principal analizado es el ácido nucleico. Los ácidos nucleicos pueden ser ácido deoximbonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Existen múltiples aplicaciones de esta tecnología a diferentes áreas del laboratorio clínico. Una de las principales ventajas de utilizar ácidos nucleicos como sustrato analizado es que representa el marcador natural más especifico de todos los organismos vivientes, esto es. el orden de los nucleótidos que comprenden el genoma de un organismo. El número de disposiciones diferentes de los cuatro diferentes nucleótidos, que puede estar presente en una molécula de ADN que sólo es tan grande como el virus de menor tamaño, es muchas veces superior al número total de los diferentes tipos de organismos vivos de esle planeta. Así. la secuencia del ADN de cada organismo vivo contiene una información peculiar que se puede utilizar para su identificación. Además, los cambios en las secuencias del ADN son la causa de enfermedades genéticas y malignas; por tanto, proporcionan una infor-

mación diagnóstica y pronostica muy importante Hasta hace poco, los principales métodos de laboratorio para detectar diferencias en la secuencia de los ácidos nucleicos no habían sido lo suficientemente sencillos o fiables como para utilizarlos en el laboratorio clínico. Los avances recientes en la tecnología y en la instrumentación, asi como los esfuerzos para su normalización, han podido vencer muchas de estas limitaciones.

INSTALACIONES DEL LABORATORIO La potencia del diagnóstico molecular se deriva de la exquisita sensibilidad y especificidad proporcionada por el uso de ácidos nucleicos como sustrato analizado. La alta sensibilidad se deriva de la amplificación m vitro de secuencias especificas diana de ácidos nucleicos presentes en la muestra procedente del paciente. La amplificación in vitro crea millones o billones de copias de la secuencia blanco y permite asi detectar hasta una única molécula diana en el espécimen del paciente. Al mismo liempo, sin embargo, esta alta sensibilidad presenta importantes desafios para el uso de esta tecnología. Asi, una de las principales ventajas de esta tecnología es también una de sus principales limitaciones. El cierre y apertura de los tubos de la microcenlrilugadora que contienen productos amplificados pueden producir microgotas en forma de aerosol que pueden transportar entre 10 y 100 copias de la secuencia diana amplificada. Estas microgotas pueden posteriormente depositarse en

1334

SECCIÓN V I I

•

PATOLOGÍA MOLECULAR

los puntos de trabajo, instrumentos, mobiliario, suelo, polvo, pelos, piel expuesta: virtualmente cualquier superficie. Otra importante fuente de contaminación puede ser el propio ácido nucleico diana. Los métodos de manejo de las muestras siempre deben estar protegidos contra la contaminación cruzada de las muestras de los pacientes. La contaminación por el propio ácido nucleico diana nativo puede ser también el resultado del procesado de muestras de pacientes en un ambiente en el que el ácido nucleico diana sea amplificado biológicamente bien por clonación o cultivando la célula o los microorganismos que lo contienen. Así, es necesario diseñar cuidadosamente las instalaciones del laboratorio de diagnóstico molecular para asegurar que hay un espacio suficiente y adecuado para el personal y el equipo, y también para minimizar el potencial problema de la contaminación de especímenes con ácido nucleico diana natural y/o ácido nucleico procedente de una amplificación m v//ra(Porter-Jordan. 1990).

Diseño del laboratorio El espacio de laboratorio debe diseñarse para minimizar el riesgo de contaminación y maximizar el flujo de trabajo. El uso de barreras de contención mediante la utilización de áreas de trabajo separadas físicamente para el preparado de reactivos, acceso de muestras, extracción de ácidos nucleicos y análisis del material amplificado es altamente deseable. Un laboratorio ideal está compuesto de tres habitaciones completamente independientes. Dos de estas habitaciones se consideran habitaciones limpias, dado que todas las tareas y ocupaciones antes de la amplificación in vitro se realizan en estos cuartos. Estos cuartos se llaman habitaciones de preampliíicación. El tercer cuarto se considera un cuarto sucio, dado que se dedica a la amplificación in vitro y al análisis del material amplificado. Esta habitación se llama la habitación postamplificación. Los sistemas de tratamiento del aire de cada uno de estos cuartos deben ser completamente independientes uno de otro. Si ello no es posible, el laboratorio de preampliíicación debe localizarse lo más próximo posible a la fuente del aire. Si ello es posible, los laboratorios de preampliíicación deben estar dotados de filtros electrostáticos de aire instalados en la entrada de aire a cada laboratorio. Estos filtros deben vigilarse de forma periódica, incorporando el cambio y limpieza de los filtros de aire en el programa de control de calidad del laboratorio. Ademas de los filtros de aire, los laboratorios de preamplificación deben estar a presión positiva de aire. Esto impedirá la entrada de cualquier contaminante aéreo en el laboratorio de preamplificación cuando se abra la puerta. El laboratorio de postamplificación debe estar a presión de aire negativa para impedir la salida de cualquier partícula de este laboratorio, con la consiguiente contaminación del ambiente circundante. La construcción de una antesala en cada laboratorio es una forma barata de crear una presión diferencial en el laboratorio. Una antesala a presión positiva para el laboratorio de preamplificación se puede crear utilizando un ventilador en el techo de la antesala que extraiga el área de dentro del laboratorio y lo empuje hacia la antesala. Esta antesala a presión positiva tiene a grandes rasgos la misma función que tener todo el laboratorio bajo presión positiva. De lorma parecida, se puede construir fácilmente una antesala a presión negativa para la habitación de postamplificación haciendo que la turbina extraiga el aire de la antesala y lo sople hacia dentro del laboratorio. Esta antesala debe disponer de un método de sellado alrededor de la puerta que separe la antesala del laboratorio para evitar que el aire que está dentro del laboratorio vuelva a salir hacia la antesala. Un punto importante es que la puerta que conduce hacia la antesala desde fuera y la puerta que comunica con el interior del laboratorio nunca deben abrirse a la vez. Un método de seguridad adicional es añadir un suelo adherente en la entrada de cada antesala o laboratorio. El tamaño de la antesala lo determina las actividades que se llevarán a cabo en la misma. Las antesalas deben tener suficiente espacio como para permitir que por lo menos dos individuos entren o salgan del laboratorio y se cambien las ropas de laboratorio a la vez. Además, si se utilizan batas, gorros y cubrezapatos desechables especiales para el laboratorio, se necesitará espacio para su almacenamiento. En cada uno de los tres laboratorios se llevan a cabo diferentes actividades. La amplificación m vitro nunca se lleva a cabo en los dos laboratorios de preamplificación. Uno de estos últimos se dedica a la preparación de reactivos, y el otro al acceso y procesado de especímenes y al preparado de la reacción. En caso de que el espacio sea limitado, las dos habitaciones de preamplificación se pueden combinar en un solo laboratorio. Se recomienda alta-

mente el uso de campanas de "aire muerto" para el preparado de reactivos y organización de las reacciones, lo cual es aún más crítico en el caso de que ambos laboratorios deban estar combinados. Las campanas de aire muerto proporcionan un medio altamente controlado donde se pueden llevar a cabo el preparado de reactivos y reacciones. Es importante intentar localizar esta zona en una sección de laboratorio que tenga poco tráfico. No se deben introducir ARN, ADN o especímenes de pacientes tanto genómicos como plásmidos dentro de la caja de aire muerto donde se realiza la preparación de los reactivos. Esta caja de aire muerto debe estar provisla de una luz ultravioleta para colaborar a esterilizar las superficies interiores. Las superficies de las cajas de aire muerto también se deben tratar con una solución recién preparada de hipoclorilo sódico al 10% (lejía) y posteriormente con una solución de etanol al 75% después de trabajar en la zona. Estas áreas deberían contener un equipo e instrumentación específicos que no se deben compartir con ninguna otra área Esto debería comprender las pipetas, el agitador, las puntas, los tubos y otro instrumental similar. Se debe utilizar un traje y guantes específicos de laboratorio antes de trabajar en esta zona. La segunda área o habitación limpia dentro del laboratorio de preamplificación es donde se lleva a cabo el acceso de los especímenes, su procesado y la adición de ácido nucleico a los tubos de reacción adecuados. Esta área debe estar provista con por lo menos un gabinete de bioseguridad ambiental para procesado de muestras y extracción de ácidos nucleicos además del equipo de laboratorio especifico, que sólo se debe utilizar para estos fines. Debería disponerse de otra cabina de bioseguridad medioambiental completamente separada si en este laboratorio se lleva a cabo cualquier tipo de cultivo tisular, y debería existir equipo de laboratorio separado dedicado a esta labor. Si en el laboratorio se utilizan extracciones de ácidos orgánicos nucleicos, se debería disponer de una cabina de seguridad química para manejar los pasos que comprenden lenol y cloroformo durante el proceso de extracción. Si se llevan a cabo extracciones tanto de ARN como de ADN en el mismo laboratorio de preampliíicación. se deberían realizar estos procedimientos en áreas separadas del laboratorio y tener instrumentos específicos para cada uno. así como pipetas y puntas para cada método. En circunstancias donde hay problemas de espacio y no es posible dedicar dos áreas completamente separadas, la extracción del ADN y del ARN debe llevarse a cabo en momentos diferentes o en días diferentes después de limpiar a fondo las áreas antes de trabajar. Como ya se ha descrito, todas las áreas deberian limpiarse con una solución al 10% de hipoclorito sódico preparado en el día y con una solución de etanol al 75%. El laboratorio de postamplificación es donde se realiza la amplilicación in vitro y el análisis de ácido nucleico. Los instrumentos que se utilizan en este laboratorio no se deben compartir con las áreas de preamplificación Si se utilizan termocicladores para la amplificación in vitro de los ácidos nucleicos, se recomienda que se coloquen en este laboratorio. Si los termocicladores se colocan en el laboratorio de preamplificación. bajo ninguna circunstancia se deben abrir los tubos de reacción después de la amplificación en este cuarto. Además, los termocicladores deben enchufarse en líneas específicas con su propio disyuntor de circuito para evitar cualquier fluctuación en la electricidad que pudiera afectar a su funcionamiento. Normalmente, este laboratorio necesitará de más espacio que los laboratorios de preamplificación debido a los requerimientos de espacio de la instrumentación y de los métodos de análisis del producto amplificado. La electroforesis en gel. por ejemplo, utiliza con frecuencia una cantidad significativa de espacio. Se recomienda disponer de una cabina de seguridad biológica y de una incubadora por agitación si se van a llevar a cabo métodos de clonación. También es altamente deseable disponer de un cuarto oscuro con una procesadora automática de radiografías y un congelador. Sin embargo, es preferible colocar el cuarto oscuro fuera del laboratorio de postamplificación, de manera que se pueda tener acceso al mismo sin tener que entrar en el laboratorio de postamplilicación.

Métodos de ayuda en el control de contaminación La introducción de prácticas sencillas en las actividades ordinarias puede ser útil en el control de la contaminación, tanto de las muestras como de la amplificación. Se debe seguir estrictamente un flujo de trabajo unidireccional en el que el personal lleve a cabo sus tareas primero en los cuartos limpios, y sólo después de completar su trabajo se muevan a la habitación de postamplificación. Ningún personal que haya trabajado en el laboratorio de postamplifi-

CAPÍTULO 63

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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

cación debe volver al área de preamplificación antes de ducharse y cambiarse de ropa. Se recomienda el uso de batas de laboratorio, gorros y cubrezapatos de un solo uso. Si se utilizan batas de laboratorio de tela, es necesario tener batas de laboratorio especiales para cada laboratorio, que deben mantenerse dentro de cada laboratorio y no se debe utilizar en las áreas externas. El uso de batas con diterentes colores para cada zona es una forma de recordar al personal el estricto flujo de trabajo. Otro factor importante en el flujo de trabajo del laboratorio es la limpieza. El método más seguro es hacer que el personal del laboratorio guarde en bolsas la ropa sucia de cada laboratorio y lo coloque fuera del mismo para ser llevado a la lavandería. Si el personal de lavandería entra en los laboratorios, debe recibir las instrucciones de quitar primero la ropa sucia del cuarto de preamplificación, después del espacio de oficinas y después de la sala de postamplificación. No se recomienda proteger los mostradores de trabajo con papel absorbente que lleve plástico detrás, dado que el papel puede recoger polvo y, con él, material amplificado si no se cambia a menudo. Si se utiliza, este tipo de papel debe descartarse de forma inmediata después de cada uso. El uso de lejía parece ser el método más aceptado de descontaminar superficies. La descontaminación de los mostradores, equipos de laboratorio y muebles debe llevarse a cabo enjuagándolos con una solución fresca de lejía al 10% y después con una solución de etanol al 75%, o incluso con agua para diluir la lejía que podría corroer las superficies. Todas las puntas de pipeta deben contener un filtro hidrófobo para evitar cualquier contaminación de la punta de la pipeta con las plantillas o con el material amplificado. La evaluación de la hidrofobicidad puede conseguirse haciendo que la pipeta aspire por encima de su límite superior una solución coloreada, para determinar entonces si la punta de la pipeta se ha teñido. Las puntas de pipeta deben desecharse en bolsas de plástico sellables, asegurándose de que las bolsas están completamente selladas antes de desecharlas. Los guantes se deben cambiar de forma periódica o tan pronto como se sospeche cualquier contaminación. Otro método de prevenir la contaminación por amplicones es tratarlos químicamente de manera que no sean capaces de soportar amplificación incluso si se transfieren de forma accidental a otra muestra. La contaminación por amplicones se identifica por la presencia de señal positiva en un control negativo. El amplicón se puede destruir por vanos métodos. El método más utilizado es por el uso de irradiación UV. El tratamiento con UV del ADN induce el entrecruzamiento de las dos cadenas por formación de dimeros de timidina. Este ADN entrecruzado ya no sirve como una plantilla eficaz. Una desventaja del tratamiento con UV es que es más eficaz cuando el amplicón es de más de 700 nucleótidos de largo, y muchas pruebas comerciales utilizan amplicones de tamaño más pequeño. Otro método para inaclivar o esterilizar amplicones es por medio de la incorporación de trifosfato de desoxiuridina en vez de trifosfato de desoxitimidina en el amplicón durante la amplificación (Udaykumar, 1993). En este método se incorpora al amplicón trifosfato de desoxiuridina en vez de timidina. Después de la amplificación, si este amplicón que contiene uracilo se transfiere accidentalmente a otra muestra, el tratamiento de la muestra antes de la amplificación con uracil-rV-glucosilasa (UNG) dará lugar a la destrucción del amplicón que contiene uracilo. El amplicón que contiene uracilo es un sustrato para el UNG, mientras que el ADN nativo que contiene timidina no lo es. El UNG elimina los residuos de uracilo del amplicón mientras que inicialmente deja intacta la estructura de fosfodiésler del amplicón. Sin embargo, durante el primer paso de desnaturalización del método de amplificación, las uniones foslodiésler se rompen en los puntos donde se localizaron los residuos de uracilo. El amplicón fragmentado ya no es por tanto capaz de actual como plantilla. El uso de UTP y de UNG ha demostrado ser eficaz si el amplicón que contiene uracilo no supera las 10M0 copias por reacción (Espy. 1993). También se han utilizado los isopsoralenos con cierto éxito. Después de la amplificación, la exposición a la luz UV de onda larga produce uniones entre los isopsoralenos y la citosina que existe en el material amplificado, haciendo ineficaz al amplicón como plantilla para la amplificación (Jinno, 1990). 7

La transferencia de papel entre los laboratorios y la parte administrativa constituye una preocupación. Esto debe reducirse tanto como sea posible, en especial para el papel de trabajo utilizado en el laboratorio de postamplificación. Es muy recomendable la instalación de una red de ordenadores en el laboratorio con un cierto número de terminales en los diterentes laboratorios y en las áreas administrativas para reducir o eliminar el movimiento de pape-

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les a través de laboratorio y de vuelta hacia el área administraliva. Es importante que el servidor de la red se someta diariamente a copias de seguridad.

EQUIPAMIENTO El equipamiento de laboratorio necesario para llevar a cabo con éxito las actuales pruebas diagnósticas moleculares puede incluir instrumentación que no se suele encontrar en el típico laboratorio clínico. Incluso donde hay una superposición, es importante que el laboratorio de diagnostico molecular contenga su propio equipo a fines de control de la contaminación. En la Tabla 63-1 se proporciona una extensa lista de equipo de laboratorio junto con sus precios aproximados. Algún equipo adicional especializado no incluido en esta lista, que pudiera ser útil dependiendo de la perspectiva del menú de pruebas, comprende un secuenciador automático de ADN (45.000-125.000 dólares), un termociclador en tiempo real de la reacción de polimerasa en cadena (PCR) (45.000-95.000 dólares), instrumentos de electroforesis capilar (50.000 dólares) e instrumentación para la cromatografía líquida de alta resolución (20.000-40.000 dólares).

PERSONAL DE LABORATORIO Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnostico molecular se clasifican como laboratorios de pruebas de alta complejidad según la enmienda de

,

,

Tabla 63-1 Necesidades y c o s t e s a p r o x i m a d o s de equipamiento Descripción Cantidad Coste' Termociclador de ADN Campanas de flujo laminar Refrigerador/congelador Congelador sin escarcha manual de 20"C Congelador a 70"C Microcentrifuga de cabeza angular. 14 OOO rpm Microcentrifuga horizontal. 14.000 rpm j Placa lavadora de micropocillos Lector de placa de micropocillos Balanzas electrónicas Medidor de pH Agitador/calentador de placas ! Baño de agua Alimentador de electioloresis j Apáralos de electroforesis mmi-PAGE Torres de moldeado de geles mini-PAGE Sistema de fotodocumentación Aparatos de electroforesis en gel de agarosa Procesador automático de placas radiográficas l Placas para aulorradiogratia (17 x 14 pulgadas) | Placas de autorradiografia (8x10 pulgadas) | Micropipetas normalizadas (tres tamaños) Sistema do verificación de temperatura para el termociclador Estación de trabajo de PCR Mezcladores por agitación Sistema de pipetas neumáticas Contador radiactivo Espectrofotómetro UV Contador Geiger Aparato secuenciador de ADN Alimentador para el secuenciador de ADN Hornos de hibridación Computadoras y programas Centrifuga refrigerada de sobremesa Incubadora Baño de agua en seco Microcentrifuga refrigerada TOTAL |^ "Los precios son sólo aproximados

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17 000$ 8 000$ 1.600$ 900$ 7000$ 3.200$ 2.500$ 6.500$ 7.500$ 2.000$ 1.000$ 500$ 2.000$ 2.000$ 3.200$ 990$ 9 000$ 1.600$ 3.800$ 1.600$ 800$ 3.780$ 1.400$ 1.500$ 750$ 800$ 2.500$ 8.000$ 485$ 1 600$ 2 000$ 4 000$ 10000$ 6 000$ 1 000$ 800$ 2800$ 128.105S

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SECCIÓN V I I

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PATOLOGÌA MOLECULAR

mejora de laboratorios clínicos de 1998 (CLIA'88) (Bachner. 1988: CLIA'88.1992). Esta ley impone unos requerimientos específicos de educación y entrenamiento para el personal que trabaja en estos laboratorios. Además, es importante tener en mente que estas pruebas no sólo son más complejas que las pruebas habituales de laboratorio, sino que también algunas de ellas se han desarrollado dentro de los mismos. Es más. eslas pruebas se modifican constantemente para mejorar factores como la especificidad, la sensibilidad, el tiempo de realización y el flujo de trabajo como resultado de la introducción de nuevas tecnologías.

Director del laboratorio Según CLIA'88. los directores de laboratorio de laboratorios de pruebas de alta complejidad deben ser bien un MD o un DO con experiencia en patología clínica o anatómica, un MD o DO con dos años de experiencia en dirección o supervisión de un laboratorio de pruebas de alta complejidad, o bien disponer de un grado doctoral en alguna de las ciencias biológicas y tener dos años de experiencia supervisando un laboratorio de alta complejidad. Las responsabilidades del director de laboratorio son la selección de pruebas, su implementación y la resolución de dificultades técnicas. El director de laboratorio es también el responsable del desarrollo de programas de laboratorio para la validación clínica y analítica de las nuevas pruebas moleculares y el desarrollo de guías y métodos de acción que aseguren la realización fiable de las pruebas clínicas. Además, el director de laboratorio debe ser responsable del desarrollo, implementación y revisión del control de calidad y de los programas de calidad del laboratorio.

Supervisor técnico Según CLIA'88. un supervisor técnico debe cumplir uno de los siguientes criterios para calificarse para este puesto. El individuo debe poseer bien un MD o DO con un año de experiencia en un laboratorio de pruebas de alta complejidad, un grado de maestro con dos años de experiencia o un grado intermedio con cuatro años de experiencia.

Técnicos médicos y técnicos en biología molecular Los técnicos médicos y técnicos en biología molecular son los responsables de las tareas necesarias para las operaciones diarias de la agenda de pruebas de laboratorio. Son los individuos responsables del acceso y procesado de los especímenes, de llevar a cabo diariamente las pruebas, mantener los registros adecuados de pruebas y control de calidad, adherirse a los procedimientos escritos y a las políticas de control de calidad, identificar problemas y documentar el mantenimiento de los equipos. El mantenimiento de registros de los métodos de laboratorio está complicado por el hecho de que los métodos desarrollados en el propio laboratorio se modifican constantemente para mejorar el proceso de las pruebas. Además, algunos instrumentos de laboratorio se usan solamente para las pruebas de diagnóstico molecular y existe poca experiencia del laboratorio clínico con ellas. Debido a estos factores, es importante que el personal técnico, y en particular el personal técnico superior, tenga un alto sentido de entrega profesional y que muestre un constante interés y esfuerzo en mejorar su educación y adiestramiento Es también importante que adquieran todas las habilidades avanzadas de laboratorio que sea posible y que reciban un adiestramiento cruzado en la mayoría o todas las diferentes pruebas que se usen en el laboratorio. Es crucial para el personal técnico comprender plenamente las bases científicas de la metodología y las aplicaciones e implicaciones clínicas de las diferentes pruebas moleculares.

Residentes, becarios y estudiantes graduados La captación de residentes, becarios y estudiantes de últimos años puede contribuir de forma significativa al éxito de un laboratorio de diagnóstico molecular. El valor de estos individuos proviene de su alto nivel de entrega profesional y de su visión acerca de la utilidad clínica de las pruebas individuales. Si tales individuos disponen de tiempo para trabajar en el laboratorio de diagnóstico molecular, con frecuencia son capaces de desarrollar y validar rápidamente un nuevo método de diagnóstico molecular. A cambio, estos

individuos ganan experiencia en un área de la medicina de laboratorio de rápido crecimiento, y esto les puede proporcionar una ventaja cuando busquen empleo en el futuro. Como parte de su adiestramiento en diagnóstico molecular, es importante para los residentes, becarios y estudiantes ganar experiencia en cada una de las diferentes áreas de pruebas, incluyendo las enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas y cáncer. El adiestramiento debe incluir los principios básicos de biología molecular: experiencia manual en optimizar, validar y llevar a cabo pruebas de diagnóstico molecular, en interpretación de resultados de las pruebas y en preparación de informes para su revisión. Los directores de laboratorio deben familiarizar a aquellos que se están adiestrando con los diferentes temas de tratamientos del laboratorio.

Adiestramiento y acreditación La certificación del nivel doctoral del personal que trabaja en los laboratorios de diagnóstico molecular puede seguir varias rutas diferentes dependiendo del tipo de grado doctoral, así como de otra experiencia en el adiestramiento. Una vía abierta a los individuos que tienen bien un grado de licenciatura o que ya son doctores lo proporciona el Consejo Americano de Genética Médica (ABMG), que está destinado a individuos que proporcionan servicios en genética médica. El Consejo Americano de Genética Médica es un miembro del consejo americano de especialidades médicas, que es la organización "madre" de estas sociedades y que proporciona certificados en patologia, pediatría, medicina interna, cirugía y aproximadamente otras 20 especialidades médicas. La certificación en genética consiste en un examen general seguido de un examen de subespecialidad en genética clínica, genética médica, citogenética clínica, genética clínica bioquímica o genética clínica molecular. Para ser candidato a un certificado por el ABMG. un individuo debe cumplir los criterios en el área de la certificación deseada. Para la certificación en genética clínica molecular, el candidato debe poseer un grado doctoral adecuado y haber completado dos años de adiestramiento en un programa acreditado. El candidato debe presentar un libro de trabajo de 150 casos clínicos moleculares, haber completado una prueba en genética clínica molecular y tener una lisia de competencia en varios métodos firmada por el director del laboratorio en donde se ha invertido la milad del tiempo del adiestramiento. El examen se ofrece cada tres años Recientemente, el Consejo Americano de Especialidades Médicas aprobó la solicitud de la Sociedad Americana de Patología y de la Sociedad Amencana de Genética Médica con respecto a crear un certificado conjunto de su especialidad en patología genética molecular. Los candidatos para este certificado deben tener un grado de MD o de DO, haber sido certificados por sus respectivos consejos, tener una licencia en vigor sin restricciones para practicar la medicina o la osteopatia en EE.UU. y haber completado un año de adiestramiento en un programa acreditado. Al día de hoy todavía no hay programas acreditados, pero se ha anticipado que la primera aprobación de un programa de adiestramiento tendrá lugar aproximadamente en junio de 2000, con la aceptación de los primeros candidatos tan pronto como en julio de 2001. Se espera que el examen de candidatos para el certificado de la subespecialidad en patología genética molecular tenga lugar en el año 2002. Las normas de adiestramiento en patología genética molecular están siendo todavía definidas por las diferentes organizaciones que participan en el certificado. Además del programa de certificación anterior, el Consejo Americano de Bioquímica Clínica (ABCC) ha aprobado un programa de certificación en diagnóstico molecular que será ofrecido por primera vez en junio de 2000. La ABCC es una corporación independiente, sin ánimo de lucro, que certifica a profesionales con nivel de doctor en bioquímica clínica y bioquímica toxicológica. Las normas y regulaciones de la ABCC para certificar en diagnóstico molecular se han establecido recientemente. Antes de la admisión al examen, el solicitante debe tener algún certificado en cualquiera de los siguientes consejos: ABCC. Sociedad Americana de Microbiología Médica, Sociedad Americana de Patología, Sociedad Americana de Inmunología de Laboratorio Médico. Sociedad Americana de Bioanálisis o Sociedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogenética. Los solicitantes deben cumplir unos requisitos de experiencia y de formación además de proporcionar tres cartas de recomendación que certifiquen la experiencia profesional del solicitante, su duración de experiencia en ese campo, y asi sucesivamente. El examen se realizará dos veces al año.

CAPÍTULO 63

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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

El certificado de subespecialidad en diagnóstico molecular está siendo ofrecido a individuos con nivel no doctoral, incluyendo técnicos médicos y técnicos de biología molecular a través de la Agencia Nacional de Credenciales para el Personal de Laboratorio (NCA). La NCA es una organización no lucrativa y no gubernamental que lleva a cabo el certificado del personal de laboratorio. Los técnicos médicos y los técnicos en biología molecular quedan certificados como especialistas de laboratorio en biología molecular [LSp (MB)]. Existen tres vías para llegar al examen de la NCA. En una, los candidatos deben haber completado un mínimo de experiencia de trabajo de doce meses en un laboratorio de diagnóstico molecular con todos los servicios. Otra vía es haber completado un programa de licenciatura o poslicenciatura en biología molecular patrocinado por una institución o universidad acreditadas, que incluya seis meses de experiencia de trabajo en un laboratorio de diagnóstico molecular con todos los servicios. La última vía es ser un científico de laboratorio clínico certificado o equivalente y completar un programa de certificación poslicenciatura en biología molecular patrocinado por una facultad o universidad acreditadas y completar un equivalente de seis meses de experiencia a tiempo completo en un laboratorio de biología molecular con todos los servicios. Este examen se ofrece dos veces al año en más de 80 centros a través del país e incluso en centros extranjeros seleccionados. Es probablemente deseable que todos los técnicos que trabajen en un laboratorio de diagnóstico molecular con todos los servicios, en particular el personal técnico superior, dispongan de acreditación en diagnóstico molecular.

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paso de la totalidad del método es la responsabilidad del laboratorio que ofrece el test y se comenta más adelante en otra sección

Sistemas automatizados basados en equipos para pruebas moleculares La disponibilidad de sistemas automatizados para desempeñar pruebas moleculares va en aumento. Estos instrumentos pueden desempeñar funciones únicas o múltiples en relación con las pruebas moleculares. El ejemplo típico de un instrumento automatizado de función única es un termociclador, que lleva a cabo todos los pasos necesarios para la amplificación de los ácidos nucleicos. Otros instrumentos automatizados de función única comprenden los extractores de ácidos nucleicos, los sistemas automáticos para la preparación y dosificación de reactivos y los secuenciadores automáticos de ADN. Más recientemente se han desarrollado también instrumentos automáticos que realizan más de una función. Un sistema automático introducido por sistemas moleculares Roche es el analizador COBAS Amplicor. Este instrumento contiene un termociclador, un brazo robótico cartesiano en tres dimensiones, bloques de calentamiento, estaciones de lavado e incluso un lector de colorimetría. Se ha previsto que en un futuro próximo estén disponibles instrumentos completamente automatizados que incluyan estas tres funciones, así como la extracción automática de ácidos nucleicos.

SELECCIÓN DE PRUEBAS FORMATOS DE PRUEBAS CLÍNICAS Existen dos principales formatos de pruebas utilizados en la mayoría de los laboratorios que realizan pruebas de diagnóstico molecular. Los dos formatos son las pruebas propias desarrolladas por cada laboratorio, conocidas también como ensayos de recela propia, y los basados en reactivos proporcionados en forma de equipo por los fabricantes de sistemas médicos.

Pruebas de desarrollo propio Las pruebas de desarrollo propio son aquellos análisis que se han desarrollado y validado por completo en el laboratorio que las lleva a cabo. Por lo general, estos análisis utilizan una combinación de reactivos que se compran por separado de diferentes fabricantes. Cada laboratorio determina las características de realización del análisis para un estudio clínico y para una población en particular de pacientes. La validación analítica y clínica de la totalidad del proceso es responsabilidad de cada laboratorio.

Métodos manuales basados en equipos Con respecto a los métodos manuales basados en equipos, el fabricante del sistema médico puede proporcionar todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la prueba, o simplemente proporcionar reactivos de calidad controlada para llevar a cabo cualquier paso particular de la prueba. Un ejemplo del primer grupo es el equipo para controlar la carga viral en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Estos equipos proporcionan reactivos necesarios para todos los pasos del proceso de la prueba, incluyendo el aislamiento de los ácidos nucleicos, la amplificación y la detección. Incluyen también información con respecto a la sensibilidad, especificidad y limites de tolerancia para cada proceso clínico en particular. Estos equipos pueden estar etiquetados por el fabricante como aprobados por la Food and Drug Administralion (FDA), como despachados por la FDA, solamente para uso de investigación o para fines científicos. La validación analítica y clínica de estos equipos por los diferentes laboratorios es diferente dependiendo del etiquetado. Los métodos de validación serán analizados en una sección posterior. Un ejemplo de la segunda categoría de métodos basados en equipos son aquellos disponibles comercialmente para la extracción de ácidos nucleicos, reactivos de amplificación que comprenden controles y sistemas de detección para ácidos nucleicos amplificados m vilro. En algunos casos un laboratorio desarrollará una prueba molecular combinando dos o más equipos de fabricantes iguales o incluso diferentes. La validación analítica y clínica de cada

El objetivo principal del laboratorio de diagnóstico molecular es proporcionar de forma fiable y en tiempo adecuado resultados de pruebas referentes a muestras que parecen ser importantes para la atención de los pacientes. Cuando se considera qué pruebas se deben ofrecer, se deben tener en mente algunas consideraciones clave. Es importante que cualquier nueva prueba mejore de alguna forma el tratamiento de los pacientes, y que esto sea además eficaz con respecto al coste. Una nueva prueba puede proporcionar un método más barato o más eficaz para diagnosticar o controlar una enfermedad. Es importante que las decisiones referentes a elegir pruebas se basen no solamente en el coste de realizar la prueba sino también en cómo la nueva prueba pueda afectar de forma global a los cuidados y atenciones del paciente. Hay algunas circunstancias donde las pruebas moleculares puede que parezcan aumentar el coste del tratamiento de los pacientes añadiendo una prueba nueva a la batería ya existente de análisis para un proceso clínico particular. Sin embargo, al introducir la nueva prueba, el tratamiento de los pacientes podría ser más eficaz. Por ejemplo, la introducción de las pruebas de carga viral para el VIH-1 para controlar la progresión de la enfermedad y la eficacia del tratamiento farmacológico en individuos infectados por VIH-1 han colaborado de forma significativa al tratamiento de estos pacientes. Un gran número de pacientes inleclados por el VIH-1 están siendo tratados actualmente con una combinación de entre dos y cinco fármacos diferentes, que incluyen inhibidores de las proteasas y fármacos no-nucleosidicos. que han resultado ser muy eficaces en reducir la morbilidad y la mortalidad en un gran número de pacientes infectados por VIH-1. Sin embargo, estos fármacos son muy caros, por lo que es importante tener medios eficaces de controlar su efectividad si deben proporcionar el máximo beneficio al paciente. Sin pruebas de carga viral los clínicos deberían basarse en recuentos de CD4 y en los síntomas clínicos, que pueden ser en ambos casos marcadores poco sensibles de efectividad farmacológica hasta que uno se encuentra en las últimas fases de la enfermedad por VIH (Ferreira-González, 1995). El ejemplo anterior muestra el impacto sobre el tratamiento de los pacientes y la introducción de una nueva prueba, pero hay otros ejemplos en los que la rentabilidad se ve favorecida sustituyendo pruebas ya existentes de laboratorio. Esto puede producirse si la prueba molecular proporciona una mejor sensibilidad o especificidad, o un tiempo de realización reducido que impacte directamente sobre el tratamiento del paciente. Por ejemplo, el tratamiento de pacientes con una posible infección por Mycobacterium tuberculosis necesita que sean tratados con fármacos que tengan una potencial toxicidad hepática y que sean aislados hasta que se confirme en el laboratorio el diagnostico de presunción. La prueba habitual de laboratorio de examinar directamente un espécimen del paciente buscando la presencia de Mycobacterium tubérculo-

SECCIÓN V I I

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PAIOIOGÍA MOLECULAR

sis carece de sensibilidad pero es extremadamente rápida Por otro lado, el cultivo es exquisitamente sensible, pero puede tardar hasta seis semanas en proporcionar resultados. A la vista de este dilema, una prueba molecular que permita un diagnóstico más rápido con un mayor grado de sensibilidad y especificidad permitiría interrumpir un tratamiento farmacológico y un aislamiento en aquellos pacientes que no tienen la enfermedad, reduciendo así los costes para el paciente y mejorando la atención médica. La identificación de las pruebas que se deben ofrecer en un centro médico es sobre todo la responsabilidad de los directores médico y técnico del laboratorio de diagnóstico molecular. A veces se puede ayudar en este aspecto revisando la lista de pruebas que el cenlro médico realiza fuera del mismo. En otros casos, individuos clave como clínicos y patólogos pueden ser una fuente valiosa para identificar las necesidades de un centro médico en particular. Es importante para los directores de laboratorio identificar claramente un área donde exista una necesidad percibida de mejorar las herramientas disponibles para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes. Durante el proceso de selección de pruebas, se debe llevar a cabo un ajuste real de las capacidades técnicas dentro del laboratorio con las necesidades del mundo clínico real en cuanto a volumen de las pruebas, tiempo de realización necesario y costes asociados para llevar a cabo el análisis. Una vez que se ha identificado un análisis en particular, se deben abordar los diferentes sistemas para llevar a cabo el análisis. Por ejemplo, se puede utilizar la hibridización de tipo Southern blot, métodos de amplificación in vitro de ácidos nucleicos o incluso análisis citogenético o de fluorescencia de hibridación in situ (HISF) para realizar algunos análisis. Asi. es importante tener en cuenta la condición clínica y las ventajas e inconvenientes de cada uno de los diferentes sistemas para diagnosticar un proceso clínico en particular cuando se hace la elección final. El establecimiento de un periodo de pruebas para evaluar la utilidad clínica de una prueba en particular es una importante herramienta. Sí se diseña con cuidado, este período permitirá al laboratorio trabajar directamente con el usuario final de la prueba y proporcionar una vía para que estos individuos comprendan la utilidad clínica de la prueba y sus limitaciones. Es importante definir con claridad las medidas que se puedan evaluar al final del periodo del estudio clínico y que dará lugar en última instancia a la realización o exclusión de la prueba.

nerar una factura. Hasta hace poco sólo existía un nUmero limitado de códigos CPT para las pruebas de diagnóstico molecular. Los códigos originales identificaban métodos generales que comprendían partes de un estudio molecular, como la extracción de ácidos nucleicos, la digestión enzimática, la amplificación in vitro, y así sucesivamente. Más recientemente, se ha añadido un número de nuevos códigos CPT especilicos de prueba". Sesenta de estos nuevos códigos son códigos específicos de reactivos utilizados para las pruebas moleculares microbiólogos. Los códigos específicos de análisis, como el que se utiliza para la detección del VIH mediante PCR, están diseñados para incorporar todos los pasos, procedimientos y reactivos utilizados en el análisis. También hay diferentes códigos CPT para la detección del mismo microorganismo utilizando diferentes métodos. Por ejemplo, la delección mediante una técnica de sonda directa frente a la detección mediante amplificación in vitro o la cuantificación del organismo necesitan cada uno un código CPT dilerente. Para las pruebas moleculares sin un código CPT específico del análisis sigue siendo necesario utilizar una combinación de códigos generales CPT de procedimiento. En la Tabla 63-2 se listan ejemplos de cómo se pueden facturar pruebas con códigos CPT especilicos del análisis y pruebas que todavía necesitan una combinación de códigos generales CPT de procedimiento. Los niveles de reembolso para cualquier prueba individual están establecidos por los terceros pagadores y pueden tener poca relación con el coste real de llevar a cabo la prueba. En general, los terceros pagadores tienden a establecer niveles de reembolso de acuerdo con las tarifas establecidas por Medicare y por Medicaid. Para la facturación de estas pruebas no se necesita la aprobación de la FDA Recientemente, la FDA ha ordenado que para las pruebas no aprobadas por la FDA, donde se utilizan reactivos específicos del análisis, y que incluyen esencialmente todas las pruebas moleculares, se debe añadir al informe una nota que indique que la prueba se desarrolló, que sus características de capacidad se han determinado en el laboratorio y que esta prueba no ha sido ni prohibida ni aprobada por la FDA. Algunos terceros pagadores pueden negarse al reembolso de las pruebas que llevan una nota de este estilo, dado que creen que el coste de llevar a cabo tales pruebas debe ser soportado mediante ayudas de investigación, incluso aunque las características y la utilidad clínica de la prueba hayan sido validadas por el laboratorio.

Codificación CPT e ICD-9 Patentes

La facturación de las pruebas de diagnóstico molecular siguen el mismo procedimiento que cualquier otra prueba de laboratorio. Por lo general, se necesitan un código de terminología de procedimiento de facturación (CPT) y un código diagnóstico de la clasificación internacional de enfermedades (ICD9). Más allá de esto, el procedimiento es por lo general específico de cada centro, basándose en los métodos de facturación manual e informatizada que tengan lugar en la institución. Es importante determinar por anticipado la documentación necesaria y los accesos informáticos imprescindibles para ge-

Tabla 63-2

La inmensa mayoría de los sistemas de amplilicación in vitro son procesos patentados, y se debe obtener una licencia formal para el uso de estos procedimientos, o el laboratorio que los use será susceptible de ser perseguido por inlracción de patente. De forma tradicional, la licencia se obtiene para un procedimiento en particular adquiriendo un conjunto de reactivos, aprobado por la FDA y vendido por un fabricante que tiene la patente del proceso de amplificación. Este abordaje es muy limitado para las pruebas de diagnóstico

Facturación de diagnóstico molecular

Nombre de la prueba Factor V Leiden por PCR-RFLP

Código CPT

Número de veces que se factura el código CPT

Nombre o procedimiento de la prueba

83890

1

Aislamiento de ácidos nucleicos

83898 83892 83894 83912 t(9:22) por RT-PCR

VIH-1 carga viral CMV carga viral VHC carga viral

83890 83902 83898 83894 83912 87536 87497 87522

Amplilicación con sonda Digestión enzimática Electroloresis en gel Interpretación e informe

I •

1 2 2 1 1

1 1 •

t

Aislamiento de ácidos nucleicos Transcripción inversa Amplificación con sonda Electroforesis en gel Interpretación e informe VIH cuantitativo CMV cuantitativo VHC cuantitativo

CAPÍTULO 63

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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

molecular, dado que existe un número muy limitado de pruebas que hayan sido aprobadas por la FDA. Asi. un laboratorio que utilice un proceso particular patentado para pruebas clínicas debe primero negociar una licencia con el propietario de la patente. Es muy importante darse cuenta de que. dependiendo de la complepdad de la institución que busca el acuerdo y de la complejidad del propio acuerdo, este proceso puede tardar entre tres meses y un año para obtener una licencia que permita llevar a cabo y facturar el procedimiento con fines clínicos. Se deben tener unas consideraciones prácticamente idénticas con respecto al uso de información de secuencias necesarias para diseñar un estudio molecular. El uso para fines clínicos de información de secuencias para muchos genes de nuevo descubrimiento está frecuentemente patentado por los descubridores del gen, y el uso de la información de la secuencia sin una licencia incurre en las mismas responsabilidades de infracción de patentes. Por desgracia, dado el actual medio y la diversidad de las fuentes de información de secuencias, no está siempre claro si la secuencia se ha patentado o quién es el propietario de la patente. Es recomendable, antes de llevar a cabo desarrollos de cualquier prueba basada en secuencias publicadas y donde se está pensando destinar una gran cantidad de recursos, verificar con los investigadores que primero descubrieron la secuencia el estado real de las patentes.

VALIDACIÓN ANALÍTICA Y CLÍNICA DE LAS PRUEBAS MOLECULARES La implementación de una nueva prueba clínica necesita que sea validada tanto analítica como clínicamente. Durante la validación analítica se determinan la sensibilidad analítica, la especificidad, la precisión y. para los estudios cuantitativos, la linealidad del método. La sensibilidad analítica de la prueba es una medida del limite inferior de detección del método en el sustrato diana. La especificidad analítica mide el grado en el que la prueba reacciona de forma cruzada con ácidos nucleicos que no son la secuencia diana pretendida. La validación clínica se centra en determinar la utilidad clínica de una prueba positiva o negativa en una enfermedad especifica. Es importante cuando se lleva a cabo la validación clínica examinar una muestra transversal completa de los individuos que serán parte de la población en la que se va a utilizar la prueba. La CLIA'88 define importantes diferencias entre la implementación de una prueba aprobada por la FDA y una que no lo esté. Los laboratorios que implementan una prueba aprobada por la FDA sólo necesitan verificar las características de capacidad de la prueba para las indicaciones en poblaciones parecidas a aquellas para las que ha establecido el fabricante. Por otro lado, la implementación de pruebas desarrolladas en el laboratorio necesitan una extensa documentación de la capacidad de la prueba, además de los pertinentes programas de control de calidad, para asegurar la capacidad diaria de la prueba (Ferreira-González, 1997). El primer paso para introducir un análisis molecular propio es optimizar cada paso del proceso analítico, lo cual incluye la extracción de ácidos nucleicos, amplificación, detección, cálculos e interpretación de resultados. Cuando se optimizan por separado cada una de las fases, es importante darse cuenta de que en la mayoría de los casos será necesario volver a optimizar cuando todas las lases se realizan de forma conjunta. Después de optimizar el análisis, es importante valorar el impacto sobre las características de los resultados del método de las diferentes variables preanalíticas. como la clase de espécimen, el transporte, el manejo y la conservación de la muestra y las sustancias que interfieren, como lipidos, hemoglobina, bilirrubina y así sucesivamente. Después de la optimización, los laboratorios deben llevar a cabo una validación analítica del método. Esto puede ser difícil debido a la falta de normalización, paulas y materiales normalizados de referencia para un gran número de ácidos nucleicos diana. Esto impacta de lorma negativa sobre la capacidad de un laboratorio para determinar la sensibilidad y precisión del método. Diferentes organizaciones nacionales e internacionales están dando pasos para desarrollar estándares, pautas y materiales normalizados de referencia. Diferentes sociedades profesionales, agencias federales y organizaciones sin ánimo de lucro han desarrollado pautas y normativas para los diagnósticos moleculares (Tabla 63-3). Con respecto a los materiales norma-

133?

lizados de referencia, el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) ha desarrollado uno de los primeros materiales normalizados de referencia de ácidos nucleicos para las pruebas de identidad humana Más recientemente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) introdujo un material normalizado de referencia para la hepatitis C para la validación de pruebas de ácidos nucleicos (NAT) para el estudio de sangre y productos sanguíneos. Están disponibles en el comercio paneles de referencia calibrados con respecto al material de referencia normalizado de la OMS (Boston Biomedica Inc, Boston, MA). Además, se ha hecho un esfuerzo para desarrollar reactivos de referencia para el VIH-1 tanto por la FDA como por otras diferentes compañías. En ausencia de materiales normalizados de referencia, los laboratorios deben desarrollar su propio material de referencia para sus estudios de valoración analítica y para la posterior vigilancia de los resultados de la prueba. La creación de un material de referencia propio comprende el uso de métodos establecidos de forma independiente para determinar la concentración de ácidos nucleicos diana. De forma alternativa, los laboratorios pueden llevar a cabo estudios que comparen sus resultados con otros métodos ya establecidos. Por ejemplo, las muestras se pueden dividir para un estudio de comparación con otro laboratorio que lleve a cabo una prueba molecular parecida. Las muestras utilizadas para la validación analítica pueden ser de disposición propia o puede ser necesario obtenerlas de una fuente externa, como de un laboratorio colaborador, una agencia gubernamental (centros para el control y prevención de enfermedades [CDC], FDA o el Instituto Nacional de la Salud [NIH]) o incluso de un suministrador comercial. Una vez que se ha organizado un grupo adecuado de muestras, la validación analítica sigue las normas habituales utilizadas en otra clase de pruebas. La determinación de la sensibilidad y linealidad analítica se puede abordar llevando a cabo diluciones seriadas de muestras positivas para la diana que han sido estudiadas ya mediante otro método, o analizando especímenes diananegativos a los que se han añadido ácidos nucleicos diana purificados, microorganismos u otras células. La precisión de la prueba se valora haciendo determinaciones en un número de muestras de pacientes muchas veces en el mismo lote o en diferentes lotes a lo largo de varios días. Las muestras utilizadas para los estudios de precisión deberían abarcar el rango lineal dinámico de la prueba. Al igual que la precisión, la validación de la linealidad puede llevarse a cabo utilizando diluciones seriadas de un espécimen positivo en un espécimen negativo. La valoración de variables preanalíticas. como lipidos. hemoglobina, bilirrubina. fármacos terapéuticos y anticoagulantes presentes en el espécimen, puede realizarse añadiendo estas sustancias a especímenes negativos a los que se ha añadido una cantidad conocida de microorganismos, células o "diana" purificada (Lion. 1996). La validación clínica requiere la determinación de dos probabilidades: la primera, la probabilidad de que si la muestra procede de un paciente con la enfermedad la prueba sea positiva (sensibilidad clínica); y segundo, la probabilidad de que si la muestra proviene de un paciente que no tiene la enfermedad la prueba sea negativa (especificidad clínica). La evaluación de la sensibilidad clínica necesita pruebas de una cantidad adecuada de muestras de pacientes que hayan sido diagnosticados de la enlermedad La especificidad clínica se determina analizando muestras de pacientes diagnosticados con una enfermedad diferente que pudiera confundirse con la enlermedad indicada y que aparezca en el diagnóstico diferencial. Basándose de forma conjunta en la especificidad y sensibilidad clínica de la prueba, junto con el conocimiento de la prevalencia de la enfermedad, se pueden calcular los valores predictivos positivos y negativos de la prueba y evaluar la probable utilidad clínica del análisis. Desde el punto de vista práctico, la mayoría de los estudios de validación clínica son llevados a cabo comparando la sensibilidad y especificidad clínica del nuevo método frente a un grupo de muestras procedentes de la población objetivo que han sido estudiados mediante un "estándar oro" con respecto al sustrato analítico en cuestión. En algunos casos, las pruebas moleculares han parecido ser más sensibles y/o específicas que las actuales pruebas "estándar oro". La resolución de discrepancias entre la nueva prueba y la que se usa actualmente como método "estándar oro" puede en un cierto número de casos dar lugar a dilemas que necesitan la utilización de un método molecular diferente para resolver las discrepancias. Recientemente, la Association lor Molecular Pathology publicó un programa detallado de implementación

SECCIÓN VII

1340 Tabla 63-3

PATOLOGÍA MOLECULAR

Guías y estándares de las pruebas de diagnóstico molecular N o r m a s o estándares

Organización

Dirección

NCCLS

MM1-P Meiodos de diagnóstico molecular para enfermedades genéticas NCCLS 940 West Valley Rd. M M 2 - A Análisis de redisposiciún de genes de mmunoglobulinas y Suile 1400 receptores de células T Wayne. PA M M 3 - A Métodos de diagnóstico molecular para enfermedades infecciosas 19087-1898 M M - 5 Análisis de amplificación de ácidos nucleicos para hematología Wayne. PA molecular www nccls.org M M - 6 Diagnóstico molecular cuantitativo para enfermedades infecciosas M M - 7 Hibrídización in situ fluorescente para genética médica M M - 8 Medida e interpretación de repeticiones de trinucleOtidos

ACMG

Política de normas de estándares y pautas para los laboratorios de genética clínica ABMG/ABGC/ACMG. Hibridización in situ fluorescente de mterfaz prenatal Administrative office. Declaración de la ACMG sobre detección de marcadores múltiples en 9650 Rockville Pike. Bethesda. MD mujeres de 35 años y mayores 20814-3998 Síndrome de X frágil: pruebas de diagnóstico y portadores Normas de almacenamiento y uso de materiales genéticos Normas sobre detección de marcadores múltiples en mujeres gestantes Normas sobre el uso de pruebas de apolipoproteína E para la enfermedad de Alzheimer Puntos a considerar: éticos, legales e implicaciones psicosociales de las pruebas genéticas en niños y adolescentes Pruebas diagnósticas para los síndromes de Angelman y de Prader-Willi Declaración sobre detección poblacional para la mutación BRCA-1 en muieres judias ashkenazi Principios de detección: comunicado del subcomité sobre la detección del comilé de practica clínica de la Sociedad Americana de Genética Médica Comunicado sobre pruebas en portadores de la enfermedad de Canavan Declaración sobre pruebas genéticas para la fibrosis quistica

ASHI

Normas para la histocompatibilidad molecular y pruebas ¡nmunogenéticas

ASHI PO Box 15804 Lenexa. KS 66285-5804

NIII-DOI

Grupo de trabajo de pruebas genéticas que promueve unas pruebas genéticas seguras y efectivas en Estados Unidos: comunicado final del grupo de trabajo sobre pruebas genéticas

www nhgri.nih.gov/ELSI/TFGT-linal

FDA

Días para la industria sobre la manufactura y valoración clinica de pruebas m vitro para detectar in vitro secuencias de acido nucleico del VIH-1 www.fda.gov/cber/gdlns/nashivpdf Borrador de la gula para la industria y/o personal inspector de la FDA. normas previas a la comercialización para análisis en relación con www.fda.gov/cdrh/ode/1353pdl el virus de la hepatitis C (VHC) que están indicadas para el diagnóstico o monitorización de la infección por VHC o enfermedades asociadas: borrador de guias

AMP

Recomendaciones para desarrollo y operatividad doméstica de pruebas de diagnóstico molecular

Technical Working Group on DNA Analysis Methods

Guías para un control de mantenimiento de calidad para el análisis de ADN

para la introducción de la nueva prueba molecular (recomendaciones de 1999 de la AMP). La Tabla 63-4 proporciona una lista de tareas para llevar a cabo el proceso de pruebas clínicas.

Reactivos específicos del sustrato El término reactivo analítico del sustrato (ASR) fue desarrollado por la FDA para referirse a los reactivos utilizados en las pruebas clínicas que confieren especificidad para detectar el sustrato objetivo. La FDA define los ASR como "anticuerpos, monoclonales y policlonales. receptores especilicos. proteínas, lígandos. secuencias de ácidos nucleicos y reactivos similares que por medio de unión especifica o reacción química con sustancias de un espécimen están diseñados para su uso en una aplicación diagnóstica para la identificación y cuantificación de una sustancia química individual o ligando en especímenes biológicos". Las sondas y cebadores utilizados para detectar ADN o ARN objetivos se consideran ASR. A fecha de

Am J Clin Pathol 1999. 111 449 Crime laboratory Digest 1991; 18 44

noviembre de 1998, los laboratorios clínicos que utilizan métodos de tecnología propia que contienen ASR deben cumplir la normativa final de la FDA acerca de ASR publicados en el Registro Federal. Como parte de esta norma final, los laboratorios son requeridos para incluir una advertencia específica en sus informes afirmando que "Esta prueba ha sido desarrollada y sus características de capacidad determinadas por (nombre del laboratorio). No ha sido aprobada por la administración de fármacos y alimentos de Estados Unidos". Pero, al mismo tiempo, la FDA ha permitido a los laboratorios que añadan a esta coletilla que la prueba que utiliza ASR no precisa la aprobación de la FDA, que la prueba se utiliza con fines clínicos y que el laboratorio ha sido certificado por la CLIA'88 para llevar a cabo pruebas de alta complejidad. Además de la definición de los ASR, la FDA ha propuesto un coniunto de controles y restricciones que deben aplicarse a su uso para asegurar su calidad y uniformidad, y para aclarar que los laboratorios que desarrollan ensayos propios son los responsables de vigilar las capacidades de la prue-

CAPITULO 63

•

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

ba. De forma interesante, estos controles se aplican tanto a los laboratorios que desarrollan ensayos propios que utilizan ASR como a los fabricantes de los reactivos para estos ensayos. Se solicita a los laboratorios que cumplan

Tabla 63-4

Llevando a c a b o el proceso d e p r u e b a s clínicas Consideraciones

Actividad Preparación de los reactivos

4. Recogida de especímenes

I

2.

3.

Procesado de los especímenes

1.

2.

Análisis del espécimen a Método de extracción

1.

b Organización del mCtodo, amplificación y detección 2.

Interpretación e informe

1 2.

Trabajar en el ambiente más limpio Almacenar las soluciones de trabajo en alícuotas de un solo uso. Realizar control de calidad en cada nuevo grupo de reactivos antes de su uso en pruebas clínicas Utilizar una muestra con un bajo número de copias para valorar la sensibilidad Preparación de las mezclas patrón para reducir errores y variabilidad. Establecer unos limites de tolerancia aceptables para cada tipo de espécimen que se deba analizar (temperatura de almacenamiento, tiempo de transporte, anticoagulanles, etc.) Distribuir protocolos para un adecuado manejo de las muestras a todos los usuarios potenciales. Recoger información clínica y analítica en formularios Los especímenes deben ser recibidos y almacenados en el laboratorio de preamplificación (limpio). Desarrollar pautas para asegurarse contra la mezcla de muestras y para mantener la integridad de la secuencia objetivo Valorar los métodos de extracción buscando la presencia de inhibidores y tactores que disminuyen el rendimiento del objetivo Control interno añadido a la muestra en el momento de la extracción para buscar falsos negativos debidos a inhibidores o determinar esta tasa por algún otro método Si no se va a evaluar un control interno con cada muestra de un paciente, entonces la tasa de falsos negativos deberia figurar en el informe en una nota, en caso de que el resultado sea negativo. Optimizar las concentraciones de cebadores MgCl.., dNTP; volumen; condiciones del ciclado y del sistema de detección. Desarrollar pautas para reducir al minimo la posibilidad de contaminación por el ácido nucleico plantilla o el amplicón (véanse secciones del control de calidad) Los controles deben procesarse de la misma forma que las muestras de los pacientes Desarrollar pautas para organizar el análisis y evitar la contaminación cruzada de la muestra y los controles. Desarrollar guias para la interpretación y los informes La interpretación debo ser realizada por lo menos por dos individuos y de forma independiente. Desarrollar pautas para la distribución de los informes.

1341

los requisitos de certificación de alta complejidad de la CLIA'88 y que determinen las características de los métodos propios siguiendo las regulaciones de CLIA'88 Los fabricantes de ASR son requeridos para registrarse ante la FDA, para seguir las normas de buena manufactura y para que restrinjan la venta de esta clase de reactivo a los laboratorios certificados bajo la CLIA'88 para pruebas de alta complejidad. Además, los fabricantes son responsables de comunicar a la FDA cualquier efecto adverso debido a fallos en el proceso de manufactura.

Limitaciones especiales en relación con las pruebas genéticas Las pruebas genéticas se llevan a cabo para el diagnóstico y/o valorar el pronóstico de trastornos de expresión fenotípica. para el diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas, determinación del estado de portador, y para realizar pruebas predictivas que valoren la probabilidad del futuro desarrollo del trastorno genético. Cuando se ofrecen pruebas genéticas se debe considerar un cierto número de limitaciones. La primera es que una prueba pudiera no detectar todas las posibles mutaciones que puedan estar presentes en un gen en particular que produce una enfermedad. Entre ejemplos de esto figuran el vasto número de mutaciones que se han identificado en el gen de la fibrosis quística y los dos genes principales para el cáncer de mama. Así. una prueba negativa pudiera no asegurar completamente que la persona examinada no transporta una mutación en un gen en particular. Al mismo tiempo, una prueba positiva puede comportar diferentes riesgos para el paciente en relación con diferentes frecuencias de penetración del trastorno en los distintos pacientes. Debido a la potencial complejidad con respecto a la interpretación de resultados de pruebas genéticas, es recomendable que un laboratorio que considere ofertar pruebas genéticas coordine estrechamente el desarrollo y la oferta de la prueba con el personal profesional clínico que utilizará los resultados de las pruebas para el cuidado de los pacientes. Una consideración añadida en relación con las pruebas genéticas son los esfuerzos a niveles tanto estatal como federal para imponer restricciones especiales en la realización de las pruebas genéticas. Esto ha sido expresado de la manera más frecuente con la proposición de normas que necesiten un especial consentimiento informado de los pacientes antes de que su muestra pueda utilizarse en cualquier prueba que estudie directamente el ADN del paciente en busca de mutaciones o polimorfismos genéticos. Es mas. estas normas propuestas podrían restringir el uso de todas las muestras de cualquier tipo para la investigación o para controles de pruebas clínicas a menos que se haya obtenido un consentimiento informado especifico para tal uso de lo que quede de las muestras de los pacientes. Esto hace preciso que los laboratorios que se propongan ofrecer pruebas de consejo genético estudien los requerimientos reguladores actuales de las autoridades tanto federales como estatales y de las sociedades profesionales pertinentes.

CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD DE LA CALIDAD

Control de calidad en el proceso de las pruebas El establecimiento de pruebas de diagnóstico molecular, en particular de los métodos de amplificación, necesita una especial consideración de cada fase del proceso, incluyendo la preparación de reactivos, la recogida de muestras, la separación de las mismas, la realización real del método y la comunicación de los resultados. Un método de laboratorio bien elaborado y correctamente escrito es un factor clave para asegurar que el método es reproducible. Es una de las ayudas más importantes durante el adiestramiento práctico del nuevo personal o cuando el método no se lleva a cabo con mucha frecuencia. El protocolo del método debe escribirse siguiendo guias especificas del Comité Nacional de Normalización de Laboratorios Clinicos (NCCLS). como figura en sus guías GP-A2 para escribir un manual de procedimiento técnico de laboratorio clínico. Para la interpretación de los resultados es vital una cuidadosa selección de controles. Se utilizan varios tipos de controles durante la ejecución de un

1342

SECCIÓN V I I

•

PATOLOGÍA MOLECULAR

método para asegurar que un método específico funciona de manera adediferir en más de un par de minutos. Las fluctuaciones en los tiempos de ciclacuada. La CLIA'88 precisa controles positivos y negativos que deben llevarse do son un aviso de que el termociclador necesita ser ajustado y restaurado a a cabo en cada prueba clínica. El no ser capaz de obtener el resultado correcsu situación original. Además, el funcionamiento de las neveras y calentadoto para cualquiera de los controles invalida la prueba y necesita que se vuelres junto con la uniformidad del bloque de temperatura también se deben verivan a estudiar todas las muestras. Siempre que ello sea posible, los controficar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La verificación de la les positivos y negativos deberían parecerse al espécimen del paciente. Es uniformidad del bloque de temperatura se debe llevar a cabo utilizando un más. un control positivo debería contener la secuencia diana de ácidos nucleitermopar con una sonda térmica. cos a una concentración clínicamente relevante en un trasfondo de secuenOtros elementos importantes del equipo que se utiliza en práclicamenle cias negativas de ácidos nucleicos diana. El control negativo debe contener cualquier fase del análisis son las pipetas. Se debe poner un énfasis especial secuencias de ácidos nucleicos que se espere estén presentes en una muesen su control de calidad y en su mantenimiento, dado que pueden ser una tra negativa. Además de los controles positivos y negativos, en cada análisis importante fuente de error. Todo el resto de equipo debe ser igualmente condebería incluirse un control "blanco" que contenga todos los componentes de trolado y mantenido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. la mezcla de reacción a excepción de ácidos nucleicos. En circunstancias Siempre que ello sea posible, el calibrado del equipo se debe llevar a cabo donde un resultado negativo influya de forma significativa sobre el diagnóstiutilizando normas certificadas o materiales de referencia certificados. co, se debe incluir un control positivo interno. De otra forma, cuando se obtenga un resultado negativo, no estará claro si la ausencia de un amplicón se deElementos del programa de seguridad de la calidad be a la ausencia de la secuencia diana en la muestra del paciente o si se debe Todos los laboratorios de diagnóstico molecular deben desarrollar un proa la presencia de inhibidores que supriman la reacción de amplificación. Este grama de seguridad de la calidad exlenso y por escrito. El objetivo del progracontrol positivo interno puede ser otro gen que siempre esté presente en cada ma de seguridad de la calidad es vigilar y valorar, de lorma objetiva y sisteespécimen de ADN o ARN purificado del huésped. De forma alternativa, pomática, la calidad y adecuación de los resultados de las pruebas. El programa dría ser una secuencia incluida dentro de la muestra de lorma específica para de seguridad de calidad (QA) debe tratar cada una de las lacetas del proceevaluar la inhibición del método. Estos controles positivos internos son muy so de la prueba, desde la fase preanalitica hasta la fase analítica y postanaútiles para valorar la presencia de ácido nucleico amplíficable. la ausencia de lítica del proceso. El programa debe incluir unas políticas y documentación inhibidores y si las reacciones de detección y amplificación se llevan a cabo escritas de la educación y el adiestramiento del personal, educación médica de acuerdo con las normas. continuada, pruebas de eficiencia, inspecciones internas y externas, incluEl añadir controles para juzgar la sensibilidad de la reacción también es yendo la documentación o acciones correctoras de las deficiencias ciladas. importante. Se construyen tres o más diluciones en las que no se pueda programas de control de calidad para las pruebas clínicas, luncionamiento del detectar la dilución más baja. Esle control es muy útil para vigilar no sólo la equipo y seguridad. realización de la prueba a lo largo del tiempo sino también la presencia de El programa QA vigila los aspectos de pruebas clínicas que no inciden niveles bajos de contaminación del amplicón. directamente en la validación analítica de los resultados de las pruebas y que Es importante que los métodos de desarrollo propio implementen un prono son asi por lo general parte del programa del control de calidad. Algunos grama de control de calidad para valorar la potencia, la pureza y la capacide estos parámetros son el tiempo mensual de rotación, las revisiones mendad de cada reactivo crítico utilizado en el proceso del análisis. Cada reacsuales de los resultados anormales y normales, el desarrollo de criterios de tivo critico debe estudiarse antes de ser utilizado para pruebas clínicas. Se exclusión de muestras, la revisión del registro de especímenes rechazados y deben establecer límites de tolerancia para cada reaclivo crítico, Siempre los indicadores de calidad de las pruebas. Además, y como ya se ha mencioque ello sea posible, se deben establecer los niveles de tolerancia utilizannado, el laboratorio debe participar en programas de estudio de eficiencia. do una medida cuantitativa para evitar una valoración sujetiva de la caliHay un cierto nUmero de pruebas para las que las diferentes asociaciones dad del reactivo critico. profesionales han desarrollado programas de eficiencia. La Coitege ot Amencan Pathologists ofrece diferentes programas independientes y combinados Control de calidad del equipo de laboratorio para el diagnóstico molecular en enfermedades infecciosas, oncología y Todo el equipo utilizado en los laboratorios de diagnóstico molecular debe genética. El programa de eficiencia en genética se ofrece en colaboración con tener un método escrito de control de calidad que describa para cada parte la American Cotlege of Medical Genetics. Recientemente, el CDC ha hecho del equipo los métodos de mantenimiento con sus registros asi como sus disponible un programa de evaluación de resultados para Mycobacterium calibraciones. El método de control de calidad debe estar escrito de acuertuberculosis y para el VIH-1. Para aquellas pruebas en donde no se ofrece un do con las normas publicadas por la NCCLS. Al igual que con otro equipo programa oficial de eficiencia, se recomienda altamente que se establezcan de laboratorio clínico, los límites de tolerancia para juzgar la adecuación de programas informales de eficiencia por medio del intercambio de muestras su funcionamiento y calibración clínica, que se debe utilizar durante las entre los laboratorios que ofrecen los mismos sen/icios. pruebas clínicas, también deben estar claramente definidos y vigilados de manera periódica. Cuando las verificaciones de capacidad o calibración caen fuera de los limites de tolerancia definidos para cualquier equipo en ACREDITACIÓN DEL LABORATORIO particular, el instrumento debe quedar inmediatamente fuera de servicio para reparación. Después de la reparación, el equipo debe ser calibrado antes de volverlo a utilizar. Como parte del programa del control de calidad Pruebas de laboratorios clínicos desarrollado en cada laboratorio, todo el equipamiento, revisiones, calibraLos laboratorios que realizan pruebas en especímenes humanos con fines ciones y reparación de cada parte del equipo deben estar documentados y de diagnóstico, prevención o tratamiento de una enfermedad están sujetos a guardados de acuerdo con la política del laboratorio de retención de doculas regulaciones federales impuestas por CLIA'88. CLIA'88 establece normamentos. tivas diseñadas para mejorar la calidad en los laboratorios y expande la Los termocicladores son un elemento crucial en cualquier laboratorio de supervisión federal a prácticamente cualquier laboratorio clínico en EE.UU. Es diagnóstico molecular que realiza amplificación in vitro. Cualquier cambio en importante señalar que los laboratorios que llevan a cabo investigaciones no la capacidad de los termocicladores tiene un impacto directo en la precisión y están sujetos a la CLIA'88 a menos que el laboratorio de investigación expida sensibilidad del método que se lleva a cabo con ese aparato. Al igual que con resultados específicos a los individuos analizados, a sus familiares y a los cualquier otro instrumento, el mantenimiento, el control de calidad y el calimédicos que los tratan. Esto se aplica incluso si en el informe final hay colebrado de los termocicladores deben seguir las recomendaciones del fabritillas que establezcan que los resultados de las pruebas deben utilizarse con cante. De forma breve, y como parte de la vigilancia del funcionamiento de los fines de investigación solamente, o que la prueba sea gratuita CLIA'88 protermocicladores, la determinación y documentación del tiempo de ciclado, la porciona normativas específicas que se aplican a lodas las áreas del proceso verificación del punto de error y cualquier mensaje de error deberían también de la prueba, adiestramiento del personal, pruebas de eficiencia, control de quedar registrados. Los tiempos de ciclado entre diferentes lotes no deberían calidad y aseguramiento de la calidad. La legislación y sus regulaciones aso-

CAPÍTULO 63

•

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

ciadas establecen un sistema de registro, así como sanciones y métodos disuasorios para asegurarse de que se mantienen las normativas establecidas

1343

CONCLUSIÓN

por las normas federales. Las regulaciones para implementar CLIA'88 fueron desarrolladas por el departamento de salud y servicios humanos (HHS) a tra-

Los mayores conocimientos y las mejoras en la tecnología han facilitado

vés del servicio de salud pública. Se ha asignado al CDC la tarea de clasifi-

el rápido desarrollo de nuevas pruebas moleculares que ya se han hecho

car la complejidad de varias pruebas para sustratos analíticos y para supervi-

habituales en la práctica médica (p. ej.. carga viral del VIH-1. pruebas de

sar la implementación de normativas. Recientemente, esta responsabilidad se

ADN para enfermedades genéticas). La secuenciación del genoma huma-

ha transiendo a la FDA. La FDA estaba encargada de revisar y garantizar la

no, que llegó a ser una prioridad nacional con la creación del Proyecto

seguridad y eficacia de las pruebas, y la administración de finanzas sanitarias

Genoma Humano de fundación general, se anticipa que estará completa

se destinaba a recoger tasas, expedir permisos, investigar a los laboratorios

para el año 2002 ó 2003. Más recientemente, diferentes compañías priva-

e iniciar acciones punitivas cuando era necesario. Bajo CLIA'88. las pruebas

das (Ciencias del Genoma Humano, Millenium Pharmaceuticals, Incyte

se han dividido como obsoletas, de microscopia, de moderada complejidad y

Pharmaceuticals y Celera Genomics) se han unido a los esfuerzos de se-

de alta complejidad. La clasificación de las pruebas en pruebas de compleji-

cuenciar el genoma humano. Además, la creciente disponibilidad de tecno-

dad moderada y elevada se desarrolló asignando una puntuación numérica a

logía fiable de alto nivel, como los secuenciadores automáticos de ADN, la

cada prueba Una prueba se considera como de complejidad moderada

PCR en tiempo real y los chips de ADN (Kunan. 1999). y asi sucesivamen-

cuando recibe una puntuación de 13 o menos. Cualquier puntuación superior

te, debería afectar de forma drástica a las pruebas de diagnóstico molecu-

se considera como altamente compleja. El sistema de puntuación tiene en

lar, proporcionando una tecnología más sólida, un menor tiempo de ciclado

cuenta algunos de los siguientes criterios: conocimientos necesarios para lle-

y una reducción de los costes. Las ciencias clínicas y básicas se combinan

var a cabo la prueba, adiestramiento y experiencia, disponibilidad de calibra-

para identificar nuevos marcadores moleculares que se puedan utilizar para

ciones, control de calidad, pruebas de eficiencia, características operativas,

el diagnóstico de enfermedades infecciosas, genéticas y neoplasias, asi

grado de interpretación y JUICIO, y asi sucesivamente.

como para la ciencia forense y la tipificación de tejidos. Analizando cambios

Las pruebas de diagnóstico molecular se consideran pruebas de alta complejidad y. como tales, los laboratorios que llevan a cabo estas pruebas deben buscar la acreditación del HHS. El HHS ha otorgado a la College ol American Pathologisls un nivel adecuado como agencia de refuerzo con respecto a estas normas aceptando el programa de acreditación de la sociedad como equivalente o más estricto en áreas de control y aseguramiento de calidad que las normativas descritas en CLIA'88. Otras organizaciones, que también han recibido un nivel similar, incluyen la comisión sobre acreditación de laboratorios, la comisión conjunta de acreditación de organizaciones sanitarias, la Asociación Americana de Osteopatía, la Asociación Americana de Bancos de Sangre (AABB) y la Sociedad Americana de Inmunogenética e Histocompatibilidad. Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnós-

sutiles en los genes y/o la expresión de los mismos cuando una célula se infecta por un virus o se transforma, es posible ganar una información importante no solamente para ayudar al diagnóstico sino también para el pronóstico o incluso vigilar la progresión de la enfermedad. Los actuales esfuerzos en la estadificación molecular de las neoplasias tanto sólidas como hematopoyéticas apuntan en esta dirección. Además, el nuevo campo de la farmacogenómica. que busca interpretar la influencia del polimorfismo genético sobre la eficacia y/o efectos secundarios de los agentes terapéuticos, tendrá un tremendo impacto en la futura atención sanitaria. El diagnóstico molecular esta todavía en su infancia. El crecimiento y los cambios en este campo serán una característica habitual en las pruebas clínicas y en un futuro previsible.

tico molecular buscan en general la acreditación a través del programa de acreditación CAP o de alguna de las demás organizaciones como un medio para cumplir las normativas reguladoras ya descritas. El CAP introdujo en 1993 una lista de patología molecular que ha sido puesta anualmente al día desde entonces. Además, la lista de revisión de patología molecular constituye un buen recurso cuando se está desarrollando un laboratorio de diagnóstico molecular con respecto al desarrollo de control de calidad, programas de aseguramiento de calidad, requisitos de los especímenes, misión de informes y temas similares.

Pruebas forenses de identidad humana y de paternidad Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de identidad con ADN o estudios forenses con ADN también deben estar acreditados para estos fines. Un medio de obtener la acreditación es a través de un programa ofrecido por la Sociedad Americana de Directores de Laboratorios Forenses (ASCLD) ASCLD ofrece un programa de acreditación de laboratorios criminales. Esta acreditación es un programa voluntario en el que puede participar cualquier laboratorio forense que realice análisis con ADN para demostrar que sus procedimientos, operaciones, personal, métodos, equipo, plan de seguridad física y métodos de seguridad cumplen con las normas propuestas por el grupo técnico de trabajo sobre métodos de análisis de ADN (TWGDAM). El Centro Nacional de Tecnología en Ciencia Forense (NFSTC) ofrece ayuda a los laboratorios forenses que se están preparando para la acreditación ASCLD/Lab .además de proporcionar certificados a los laboratorios de ADN que cumplen con las guias de la TWGDAM. Además, la Asociación Americana de Bancos de Sangre ha desarrollado pautas para las pruebas de paternidad que utilizan ADN y ofrece a través de su organización acreditaciones adecuadas. El programa de acreditación en pruebas de paternidad se basa en normas para realizar las pruebas de paternidad y cuida de la acreditación y valoración de los laboratorios que realizan estas pruebas. Hay más de 40 laboratorios acreditados por la AABB para pruebas de paternidad. Esta acreditación ayuda a los laboratorios a conseguir un control de calidad.

BIBLIOGRAFÍA AMP: Recommendations for in-house developmeni and operation ol molecular diagnostic tesis. Am J Clin Pathol 1999 111 449. Bachner P. Hamlin W: Federal regulation ol clinical laboratories and the clinical laboratory improvement amendments of 1988—Partll. Clin Lab Med 1993; 13:987-994, CLIA'88: Final Rule. College of American Pathologists, 1992. 325 Waukegan Road. Northlield. IL 60093-2750. Espy MJ, Smith TF. Persmg DH: Dependence ot polymerase chain reaction product inactivation protocols on amplicón length and sequence composition. J Clin Microbiol 1993. 31 2361-2365. Ferreira-González A, Fisher L, Lehman C, et al: Molecular detection of resistance to activated protein C due to a common mutation in the coagulation factor V gene causing hereditary predisposition to thrombosis. J Clin Lab Analysis 1997: 11:328-335. Ferreira-Gonzalez A. Garrett CT: Pittalls in establishing a molecular diagnsotics laboratory. Hum Pathol 1996: 27:437 440. Ferreira-Gonzalez A, Shiftman ML, Lofland DH. et al: Assessing clinical utility ol hepatits C virus quantitative RT-PCR data Implications lor identification ol responders among alpha-interferon-treated patients. Mol Diagn 1996: 1:109120. Fredricks DN. Relman DA: Application of polymerase chain reaction to the diagnosis of infectious diseases. Clin Infect Dis 1999; 29:475-486 Hodinka RL: The clinical utility of viral quantitation using molecular methods. Clin Diagn Virol 1998:10:25-47. Hruban RH, Offerhaus GJ: Molecular diagnosis ot cancer and micrometaslases. AdvAnal Pathol 1998; 5:175-178. Jinuo Y. Yoshiura K, Niikawa N: Use of psoralen as extinguisher of contaminated DNA in PCR. Nucl Acids Res 1990; 18:6739-6759 Kurian KM. Watson CJ. Wyllie AH: DNA chip technology. J Pathol 1999: 187:267271 Lion T: Appropriate controls lor RT-PCR Leukemia 1996; 10:1843 Porter-Jordan K. Rosenherg EL. Keiser J, et al: Nested polymerase chain reaction assay for the detection of cytomegalovirus overcomes false positives due lo contamination with fragmented DNA. J Med Virol 1990; 30:35-59. Sawyers CL: Chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 1999; 340:1330-1340. Tsongalis GJ. Wu AH. Silver H. Ricci A Jr. Applications of forensic identity testing in the clinical laboratory. Am J Clin Pathol 1999; 112|Suppl 1):S93-103 Udaykumar. Epstein JS. Hewlett IK: A novel method employing UNG lo avoid carryover contamination in RNA-PCR. Nucl Acids Res 1993; 21:3917-3918.

C A P Í T U L O

64

Oncoproteins y detección tumoral precoz • Matthew R. Pincus, M.D., Ph.D. • Paul W. Brandt-Rauf, M.D., Ph.D., D.P.H. • William Koslosky, M.D. • William Appruzzse, Ph.D.

BIOLOGÍA CELULAR Y MITOGÉNESIS

1344

1351

Eficacia diagnóstica de las oncoproteínas del suero

Marcadores tumorales ONCOPROTEÍNAS EN LA DETECCIÓN TUMORAL

EVALUACIÓN Y CONCLUSIONES

1345

Factores de crecimiento

Orígenes de los tumores malignos Tamaño tumoral y niveles de oncoproteína

Receptores de factores de crecimiento Proteínas G

BIBLIOGRAFÍA

1353

Oncoproteínas nucleares Detección de tumores mediante la medición de la proteína p53 Anticuerpos anti-p53 circulantes en la detección tumoral

un proceso de pasos múltiples que comienza en la membrana celular como resultado de la activación de un receptor de factor de crecimiento, que activa entonces a otras proteínas citosólicas y de membrana y a moléculas segundas mensajeras que transducen la "señal" mitogénica hacia el núcleo. Vías de transducción de señales. Se han podido aclarar algunos Marcadores tumorales pasos en la "via de transducción de señales" implicados en la transducción de la señal iniciada por el factor de crecimiento y que va hasta el núcleo, pero El control del proceso de la división celular en las células eucarióticas. en especial en las formas superiores de vida, es vital para los procesos de proli- muchos otros pasos no están completamente aclarados. Una vía bien establecida se resume en la Figura 64-1 para la vía señalizadora mitogénica induferación y diferenciación celulares. El delicado equilibrio entre estos dos procida por el oncogén ras. Esta figura muestra que cuando un receptor de faccesos está regulado por numerosas proteínas que interactúan en la célula tor de crecimiento se activa por su factor de crecimiento, activa a su vez para asegurarse de que éste se mantiene. Casi todas estas proteínas, muvarías proteínas intermediarias (grb-2 y SOS) que activan la importante prochas de las cuales son críticas en la regulación del ciclo celular, están codificadas por oncogenes. Las mutaciones en los oncogenes pueden resultar en teína G (esto es, la proteína ligadora de GTP) lamada ras-p21. Esta proteina de 21 kDa unida a la membrana, que contiene 189 aminoácidos, se activa la producción de proteínas que, o bien se activan de forma permanente para cuando la proteína SOS la induce para ligar GTP en lugar de GDP. En su estaestimular el crecimiento celular y su proliferación (como la proteína p21 codido activado (unida a GTP) ras-p21 activa directamente a ras (Moodie. 1993: ficada por el gen ras), o quedan inactivas para inhibir la proliferación celular Slokoe, 1994), que a su vez inducen una cascada secuencial de proleincina(como la proteína p53). Ambos sucesos dan lugar a células tumorales maligsas: esto es, MAP cinasa (MEQ) y la cínasa activada por mitógenos (MAP) nas. El conocimiento no sólo de la existencia de estos oncogenes y de las codificada por el gen ERK, como se muestra en la Figura 64-1. La MAP cinaoncoproteínas codificadas por ellos, sino también de los mecanismos mediansa activa directamente los factores de transcripción nuclear, siendo ios uno de te los cuales ejercen sus efectos, ha dado lugar a unas nuevas series de análisis altamente sensitivos, tanto de los oncogenes mutados como de sus pro- ellos. Esta importante proteína forma un complejo heterodimérico con otro factor de transcripción nuclear, jun. que se activa directamente por la cinasa, teínas mutantes codificadas. Los métodos que utilizan la amplificación, como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para los oncogenes mutados, se ¡un cinasa (jnk). El complejo los-jun. lamado también AP1, se une a las regiones específicas del ADN genómico, induciendo la transcripción de proteínas exponen en otro punto de este texto. En este capítulo veremos cómo la detecmitogénicas tales como las ciclinas. De forma interesante, la transcripción de ción de estas proteínas oncogénicas, u oncoproteínas. que se encuentran en estas proteínas se bloquea por la proteína antioncogén p53 (Fig. 64-1), que a el suero de los pacientes con tumores malignos, permite diagnosticar un tumor maligno, a menudo en una fase precoz del desarrollo tumoral. Debido su vez induce la transcripción de proteínas antimitóticas tales como baxy waf. que inducen la apoptosis. a que el hallazgo de niveles elevados de cualquiera de estas oncoproteínas o formas mutadas de estas proteínas en el suero de un ser humano indica la En la Figura 64-1 se presentan también otras diferentes proteínas nucleapresencia probable de un tumor maligno, nos referiremos en esta capítulo a res importantes codificadas por oncogenes tales como myc. una proteína de estas proteínas como marcadores tumorales. 64 kDa que se sobreexpresa en el linfoma de Burkitt. Este oncogén proteínico no está directamente en la vía ras de transducción de señal. De forma inteLa oncogenesis, el proceso por el que las células normales se convierten resante, hay líneas celulares que. cuando se transfectan bien con el oncogén en malignas, comprende múltiples pasos, que se pueden clasificar grosso ras o con el oncogén myc. no sufren transformación celular, pero cuando se modo como iniciación tumoral y promoción tumoral. La propia mitogénesis es BIOLOGÍA CELULAR Y MITOGÉNESIS

CAPÍTULO 64

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ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ

1345

Figura 64-1. Esquema de algunos de los componentes conocidos de la vía de transducción de señales ras empezando (arriba, a la izquierda) cuando un faclot de crecimiento se une a su receptor celular. El resto de los acontecimientos se explican en el texto. Abreviaturas: grb-2 = proteína adaptadora que une a la vez p2l y la proteina o tactor de intercambio de nucleótidos de guanina. SOS: proteína ras-p2i. definida en el texto: PLC = fosfolipasa C; DAG = diacil glicerol: PKC = proteina cinasa C; IP3 = mositol trifosfato: rat-\ = proteína codificada por el oncogén p74. que funciona como cinasa que fosforila otra cinasa de peso molecular 43 kDa. lamada MAP-2 cinasa cinasa. MEK. o MAP-KK en la ligura: MAP-2 kinasa = proteina cinasa activada por mitógenos o proteína cinasa-2 asociada a los microtúbulos (MAP-2K en la figura); GAP = proteína activadora de GTPasa [GAP], que promueve la hidrólisis del GTP a GDP unido a p2l : myc. tos y ¡un = oncogenes nucleares que codifican proteínas nucleares; NMP = proteínas de la matriz nuclear

transfectan a la vez con ambos oncogenes. experimentan transformación celular. Estos resultados indican que ras y myp pueden ser interdependientes, y son un excelente ejemplo prototipico de la naturaleza multifásica de la oncogenesis. Una característica central de los fenómenos de transducción de señal que se resumen en la Figura 64-1 es que las cascadas de activación están ordenadas y se encuentran bajo un estricto control regulador. Asi. por ejemplo, mientras SOS activa a ras-p21. la proteína activadora de GTPasa (GAP) induce la hidrólisis del GTP unido a ras-p21, dando lugar a su inactivación (Fig. 64-1). El MEK activado regula a la baja a SOS, disminuyendo el intercambio GDP; GTP por ras-p21 (Holt. 1996). Si una o más proteínas de vías como la que se muestra en la Figura 64-1 mutan de manera que no se puedan regular a la baja, es posible que se produzca una señal mitogénica continua que en última instancia de lugar a neoplasia. Cuantas más mutaciones de este tipo se produzcan, mas probable es que la célula sufra una transformación maligna. Así, lesiones progresivas en la via mitogénica pueden corresponder con las múltiples fases de la carcinogenesis. La Tabla 64-1 resume los mecanismos por los que cada tipo de elemento de transducción de señal ha resultado inducir la transformación celular, empezando por los factores de crecimiento, progresando a los receptores de factor de crecimiento, después a las proteínas G y a las cascadas de cinasas. y finalmente a las proteínas nucleares. Estos mecanismos se explican con más detalle en cada sección de este capitulo destinada a estas diferentes proteínas de transducción de señal.

ONCOPROTEÍNAS EN LA DETECCIÓN TUMORAL La detección de proteínas muladas de Iransducción de señal o de niveles elevados de proteínas de tipo "salvaie' en el suero o en los líquidos corporales es altamente sugerente de neoplasia: por tanto, se dispone ahora de muchos análisis para diferentes oncoproteínas en forma de kit. incluyendo determinaciones de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) para los factores de crecimiento como el factor-» transformador de crecimiento (TGF-a) y factor de crecimiento fibrobláslico (FGF). las proteínas EGFr y neu/HER-2. ras-p-21 del receptor de factor de crecimiento y las proteínas nucleares p53. myc y NMP22 de compañías tales como Oncogene Science (Uniondale. NY). Tritón

Bioscience (Houston. TX) y Matritech (Newton. MA) Diferentes estudios utilizan también la técnica de Western Blot o de Inmunoblot. como se ha descrito en otro capítulo de este libro. Numerosos estudios han documentado alteraciones en los oncogenes, oncoproteínas o expresión de factores de crecimiento en lo que se refiere tanto a ácido ribonucleico mensajero (ARNm) o proteínas, en tejido tumoral en com-

Tabla 64-1

M e c a n i s m o s para la inducción de la carcinogenesis por e l e m e n t o s de la vía mitogénica

Elemento de la via

Mecanismo de acción

1 Factores de crecimiento

a) Sobreproducción desde la célula y hacia sus proximidades b) Interacción con factores de crecimiento con receptores de elevada afinidad

2. Receptores de factores de crecimiento

a) Sobreexpresión que conduce a elevadas concentraciones de dimeros b) Pérdida del dominio extracelular que da lugar a una dimerizacíón permanente del receptor del factor de crecimiento y a una producción continua de señales c) Sustituciones de aminoácidos en el dominio transmembranoso que dan lugar a una dimerización permanente

3

a) Sobreexpresión de proteina normal b) Sustituciones de aminoácidos que cambian de forma permanente su conformación a una lorma activada c) Mutaciones que eliminan dominios reguladores de las cinasas

Proteínas cilosólicas proteínas G y cinasas

I 4 Oncoproteínas nucleares

a) Sobreexpresión de las proteínas de transcripción y replicación b) Mutaciones de proteínas antioncogénicas que las mactivan c) Mutaciones que eliminan dominios requladores

1346

SECCIÓN VII

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PATOLOGÌA MOLECULAR

paración con el tejido normal (Pimentel. 1989: Brandt-Rauf. 1998). Diferentes estudios han estudiado las oncoproteinas o la expresión de factor de crecimiento en líquidos biológicos tales como orina o derrames, y han demostrado la posibilidad de utilizar estos péptidos y proteínas como marcadores para la presencia de neoplasia (Niman. 1985; Yeh. 1989). Los siguientes estudios han confirmado estos hallazgos iniciales, dando lugar al uso clínico de estos marcadores para detectar la presencia de tumores malignos. El enfoque de este capítulo se centrará por tanto en la identificación de diferentes oncoproteinas y factores de crecimiento en el suero, plasma u orina de pacientes con cáncer o con riesgo de desarrollar un cáncer. En la Tabla 64-2 se presenta un resumen de algunos de los muchos (más de 50) oncogenes conocidos y sus funciones en la célula. Aquellos de la Tabla 64-2 para los que se dispone de algún método comercial se marcan con un asterisco.

Factores de crecimiento Dado que varios factores de crecimiento parecen tener una función en la proliferación celular durante la tumorogénesis. y dado que los factores de crecimiento son segregados de forma activa al medio extracelular. son potencialmente objetivos atractivos para su detección en la sangre durante el desarrollo del cáncer. Hasta la fecha, son vanos los esludios que han sido capaces de demostrar diferencias en los niveles sanguíneos de factores de crecimiento entre los pacientes con cáncer y los pacientes control que no lo tienen. Factor transformador de crecimiento (TGF) a y 13. TGF-u es un polipéptido con 50 aminoácidos que se une al receptor EGF. que se dimeriza tras unirse con EGF. TFG-|i es una familia de proteínas etiquetadas desde |S. hasta |i . TGF-|Í, es un homodimero de dos subunidades de 12 kDa unidas por puentes disulfuro. Mientras que TGF-p" ha resultado ser elaborado por muchos tipos diferentes de tumores humanos malignos, se han encontrado niveles séricos elevados de este factor de crecimiento de forma predominante en tumores hepáticos y de vejiga. Curiosamente, se ha encontrado que TGF-|) inhibe la mitosis de ciertas lineas celulares especificas en cultivo, tales como las células epiteliales bronquiales del visón. Asi. el suero de los pacientes que tienen tumores que elaboran este factor de crecimiento se puede analizar en su busca midiendo el grado de inhibición de crecimiento celular. s

La actividad TGF-ji. determinada por medio de esta técnica, ha resultado estar notablemente elevada en pacientes con carcinoma hepatocelular pero no en pacientes control de la misma edad (Shirai, 1992). En el suero de los pacientes que se han sometido a una resección quirúrgica de estos tumores,

la actividad de TGF-ji es escasamente detectable, sugiriendo que el tumor era la fuente de los niveles elevados del factor de crecimiento del suero. De forma interesante, en muchos pacientes con carcinoma hepatocelular se ha observado que TGF-|i está elevado en orina (Tsai. 1997). El uso de un ELISA con un anticuerpo monoclonal dirigido contra TGF-|j. ha revelado que TGF-p\ está elevado en una gran proporción de pacientes con un cáncer de vejiga invasivo pero no en pacientes con tumores de vejiga no invasivos ni en pacientes sin cáncer (Klocker, 1994). Recientemente, se ha descrito un nuevo marcador tumoral para el cáncer de vejiga que parece ser más exacto para detectar los cánceres de vejiga tanto invasivos como no invasivos, y que es la proteína de matriz nuclear NMP22. detectada en orina y de la que se habla más adelante. Asi, los estudios séricos en busca de TGF-|i son muy utiles para diagnosticar y hacer seguimiento de carcinomas hepatocelulares. Son menos útiles para el diagnóstico de carcinoma de vejiga aunque, para el cáncer de vejiga invasivo, este factor de crecimiento tiene una elevada sensibilidad y especificidad. TGF-u ha resultado estar elevado en un gran número de pacientes con tumores de células epiteliales (Chakrabarty, 1994: Katoh, 1990), de forma predominante en mama (casi el 100%), pulmón, estómago, colon e higado. A diferencia de ellos, los individuos normales tienen unos niveles séricos muy baios. En lo que se refiere al higado. TGF-u ha resultado estar elevado en el suero de pacientes con carcinoma hepatocelular. pero no en pacientes con cirrosis. Los niveles elevados se redujeron en los pacientes que se habian tratado por un carcinoma hepatocelular (Tomiya. 1996). Estudios recientes confirman que TGF-u es un predictor eficaz de la producción de tumores malignos en una fase precoz. Por ejemplo, de 36 pacientes que tenían una historia de asbestosis y que posteriormente desarrollaron un cáncer, sobre todo un adenocarcinoma o un carcinoma pulmonar de células escamosas, más de un tercio resultaron ser seropositives para TGF-u. Las muestras sanguíneas de todos estos pacientes se recogieron y después se guardaron en el momento del diagnóstico de la asbestosis y antes del diagnóstico de un tumor maligno. De forma significativa, todos salvo uno de estos pacientes seropositives resultaron tener niveles elevados de TGF-u en la sangre almacenada (Brandt-Rauf. 1998). TGF-u parece ser así un excelente marcador para la presencia de tumores malignos. A diferencia del caso de TGF-p. estas elevaciones no son tumor-específicas. Aun así. parece claro que TGF-u es extremadamente útil como herramienta de detección en pacientes en los que se busca un lumor maligno.

CAPÍTULO 64

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ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ

Factores de crecimiento derivados de las plaquetas. El factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, una proteína de un peso molecular de 28 kDa, exisle como un dímero de cadenas A y B. en forma de dímeros A-A. A-B o B-B. Cada cadena se puede glucosilar aumentando su masa molecular hasta 30 kDa. Este factor de crecimiento, que se aisló originalmente de plaquetas, se une a un receptor de factor de crecimiento transmembranoso. La cadena B se codifica por el oncogén sis. Se ha encontrado que es un potente mitógeno en lineas celulares linfoides. mieloides y de fibroblastos. También se ha estudiado en la sangre de pacientes con cáncer. De forma global, este factor de crecimiento ha resultado estar elevado de forma significativa en más de un 15% de pacientes con carcinomas, sarcomas y linfomas. pero en ninguno de los individuos normales. En pacientes con cáncer de mama exisle una excelente correlación entre la fase del tumor y el nivel sérico del factor de crecimiento (Ariad. 1991). Los niveles más elevados predijeron supervivencias más cortas. Factor de crecimiento fibroblástico básico. El factor básico de crecimiento fibroblástico (bFGF) es una proteína que contiene 155 aminoácidos. Es un factor de crecimiento para las células mesenquimales, pero también tiene concentraciones relativamente elevadas en el sistema nervioso central (SNC). De forma notable, se ha encontrado que bFGF está presente en altas concentraciones en el suero de pacientes con tumores de células epiteliales. De entre estos tumores, llama la atención el carcinoma de células renales. Más de un 50% de pacientes con esta enfermedad tienen niveles séricos muy elevados de bFGF (Fujimoto. 1991; li. 1993), bien se mida mediante ELISA o mediante métodos potenciados de quimioluminíscencia. Este factor de crecimiento está también elevado en el suero de más del 50% de pacientes con tumores del SNC. en el 90% de pacientes con cánceres de pulmón (li. 1993) y en alrededor del 60% de pacientes con linfomas (Kurobe, 1993). No está elevado, sin embargo, en el suero de grandes poblaciones de individuos normales (control). Recientemente, los niveles séricos elevados de bFGF han resultado ser un buen factor pro nóstico en pacientes con carcinomas de pulmón de células no pequeñas (Brattstrom, 1998). As. TGF-u y TGF-|i. PDGF y bFGF parecen todos ellos estar elevados en el suero de un número significativo de pacientes con tumores de células epiteliales, aunque no son completamente tumor-específicos. TGF-« tiene una cierta especificidad para el cáncer de mama y TGF-|5 para el carcinoma hepatocelular. bFGF se eleva en diferentes tumores malignos, incluyendo tumores de células no epiteliales, como los tumores del SNC y los linfomas. PDGF muestra poca especificidad en cuanto al tipo del tumor, pero sus niveles elevados en el suero indican la presencia de tumor maligno. Factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento hepatocitario. Se ha observado que el factor de crecimiento epidérmico está elevado en el suero de algunos pacientes con cáncer de estómago (Pawlikowski. 1989) y cáncer de lengua (Bhatavdekar. 1993), pero ha resultado estar normal o disminuido en otros tumores (Nedvidkova, 1992). Se han descrito niveles séricos elevados de tactor de crecimiento hepatocitano en pacientes con carcinoma hepatocelular. Sin embargo, este factor de crecimiento parece ser único en cuanto a que se encuentran también niveles elevados en enfermedades hepáticas no malignas (Hioki. 1993), disminuyendo su utilidad como marcador tumoral.

Receptores de factores de crecimiento En cuanto a los receptores de factores de crecimiento, existen varios mecanismos por los que puede iniciarse una mitogénesis incontrolada. Estos mecanismos se resumen en la Figura 64-2. Tanto para el receptor EGF como para la proleina del receptor del factor de crecimiento pl85. codificada por el oncogén neu (HER-2), y que se asocia intensamente con el cáncer de mama (Slamon. 1989), el receptor dimeriza y activa las tirosmas cinasas que están involucradas en la fosforilación de proteínas que transducen la señal mitogénica hasta el núcleo. Existen tres mecanismos patológicos conocidos que pueden dar lugar a una dimerización del receptor anormalmente prolongada y que produce una señal continua mitogénica. Estos mecanismos son la pérdida del dominio de unión extracelular (ECD); las mutaciones en el dominio transmembranoso que promueve la dimerización (Brandt-Rauf, 1990) y la sobreexpresión del receptor.

1347

Los receptores transmembranosos del factor de crecimiento codificados por la familia erbB de oncogenes (por ejemplo, erbS. que codifica el receptor EGF, también llamado EGFr. y neuvHER-2 [erbB-2]), son objetivos particularmente atractivos para la detección en sangre durante el desarrollo del cáncer, ya que se ha observado que. en los tumores humanos inducidos por estos receptores, el mecanismo parece ser la proteólisis del dominio extracelular de unión con el receptor (Figura 64-2, tercera ilustración). Los dominios extracelulares liberados, llamados ECD, entran entonces en la circulación y se pueden detectar lácilmente en el suero utilizando técnicas convencionales de inmunoanálisis (Brandt-Rauf, 1994a. 1994b. 1998) Receptor EGF (EGFr). En pacientes con asbestosis se han estudiado las elevaciones de los niveles circulantes del ECD de este receptor de factor de crecimiento (Brandt-Rauf, 1992). que se sabe predispone a tumores malignos. Se ha encontrado que en estos pacientes, aquellos con niveles séricos de ECD de 636 fmol'ml o más altos, o bien tienen un tumor maligno asociado al asbesto (carcinoma de pulmón o mesíotelioma). o bien posteriormente desarrollan un tumor de esta clase. Se ha observado que muchos individuos normales tienen unos niveles séricos de ECD mucho más bajos. Así. EGFr parece ser un excelente marcador para los tumores inducidos por el asbesto, Estos resultados tienen también interés porque sugieren que el electo principal del asbesto como carcinógeno es producir mutaciones en el gen EGFr. Receptor neu HER-2. Debido a la asociación firmemente documentada entre el cáncer de mama y las mutaciones en el gen neu'HER-2. muchos estudios han examinado el p185 erbB-2 ECD en la sangre de pacientes con cáncer, en particular cáncer de mama. En estudios previos sobre la sobreexpresión inducida por el oncogén neu de la proteina pl85 (Slamon. 1989). se encontró que el nivel de expresión del oncogén neu en el tejido de biopsias de cáncer de mama se correlacionaba con la extensión del tumor, siendo el mejor indicador pronóstico de tasas de supervivencia, excediendo la extensión de la afectación de ganglios linfáticos como indicador pronóstico. Los resultados de la cuantificación del p185 ECD en el suero de pacientes con cáncer de mama corren paralelos con los resultados genéticos previos Entre un 25% y un 50% de los pacientes con un cáncer de mama en estadios III o IV tienen niveles elevados de p185 ECD en su suero (entre 40 y 190 veces más altos que en el suero de los individuos control normales (Morí, 1990: Carney, 1991: Kath, 1993). En los pacientes de los que se dispone de un material de biopsia tumoral. hay una excelente correlación entre los niveles séricos de ECD y la expresión a nivel lisular (Breuer. 1993.1994). Exisle también una excelente correlación entre los niveles séricos de ECD y la recurrencia de la enfermedad (Brandt-Rauf, 1998), Los niveles de ECD en el suero también han resultado ser un excelente indicador pronóstico para el cáncer de mama (Molina, 1996). Dado que los niveles séricos de p185 ECD se correlacionan con la carga y con la fase del tumor, la detección del cáncer de mama incipiente, utilizando los niveles séricos de p185 ECD. es menos eficaz para estos pacientes. De forma global, la tasa de delección de los tumores mamarios en estadios I y II utilizando los niveles séricos de ECD, basados en técnicas ELISA convencionales, oscila entre un 10% y un 15%. Sin embargo, el uso de un método ELISA sensible para el p185 ECD en pacientes con cáncer de mama dio lugar al descubrimiento de un carcinoma in situ en un 43% de los pacientes con esta enfermedad (Breuer, 1993). Este último resultado indica que el uso de análisis más sensibles para p185 ECD identifica un aumento significativo en el número de pacientes con carcinoma in situ (esto es, en una fase precoz de su desarrollo). Neoplasias pulmonares, pl 85 ECD está también elevado en un alto porcentaje de pacientes con cáncer de pulmón. Las elevaciones de los niveles séricos de EGFr para la detección tumoral precoz se han empleado para estudiar a pacientes con una predisposición conocida, como los que tienen neumoconiosis, a desarrollar estos tumores. En el 70% de los pacientes con neumoconiosis, se han encontrado niveles séricos elevados de p185 ECD antes del desarrollo manifiesto del tumor maligno. En casi el 100% de los pacientes con este factor predisponente que tienen cáncer de pulmón, el p 185 ECD del suero está bastante elevado (Brandt-Rauf, 1994a). Claramente, esta proteina es un indicador muy sensible de cáncer de pulmón. Por el contrario, no se han encontrado elevaciones de pl 85 ECD en el suero de muchos individuos normales.

1348

SECCIÓN V I I

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PATOLOGÍA MOLECULAR

Figura 64-2. Mecanismos de la producción continua de señales mitogémeas por parte de los receptores de factores de crecimiento. El esquema 1 muestra que estos receptores tienen tres dominios: un dominio extracelular, donde se une el factor de crecimiento (ECD): un dominio transmembranoso (TMD| y un dominio intracitoplásmico (ICD). Un lactor de crecimiento. GF. se une al receptor haciendo que se dimerice. poniendo en marcha una cascada de fenómenos mtracelulares que se transducen hasta el núcleo (N). descrito en la Figura 64-1. Hay tres formas conocidas por las que se puede producir una señal celular continua a partir del receptor de factor de crecimiento, dando lugar a una transformación maligna de las células. El esquema 2 muestra el primero de ellos: sobreexpresión del receptor que da lugar a muchos procesos de activación y a señales continuas hacia el núcleo. El esquema 3 muestra el segundo mecanismo, donde ECD o bien está ausente o bien es eliminado por proleasas intracelulares, dando lugar a una dimerización espontánea. El esquema 4 muestra el tercer mecanismo, en el que una mutación del gen del receptor del lactor de crecimiento da lugar a una sustitución de aminoácidos (X en la Figura) en el dominio transmembranoso. dando lugar a la formación de hélices-ix que se asocian (Brandt-Rauf, 1990) y dando lugar a una dimerización espontánea que puede lener lugar en ausencia o presencia del ligando.

Carcinomas hepatocelulares. Se ha observado previamente que el factor de crecimiento TGF-p' puede ser un buen marcador del carcinoma hepatocelular. Hay ahora fuertes indicios de que p185 ECD es también un marcador sensible para esta enfermedad. Se ha encontrado que el p185 ECD del suero está elevado en casi un 100% en los individuos de raza oriental que tienen factores de riesgo conocidos de desarrollar esta enfermedad (Luo, 1 9 9 3 : Yu, 1994). Sin embargo, no se han observado elevaciones en individuos normales de edad y raza similares o en aquellos con factores de riesgo de tipo

exposición para esta enfermedad pero que no desarrollaron posteriormente cáncer. erbB-2 (p185) ECD en otros tumores. Se han encontrado también elevaciones en los niveles séricos de erbB-2 ECD en pacientes con cánceres colorrectales. pancreáticos, prostéticos, hepáticos y ováricos (Wu, 1993) con frecuencias de detección más bajas (del 15% al 20%). En estos casos se ha encontrado una excelente correlación entre los niveles séricos y los niveles tisulares. Hay una correlación directa entre los niveles séricos del p185 ECD y

CAPÍTULO 64

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ONCOPROTEÍNAS Y DETECCIÓN TUMORAL PRECOZ

el tamaño del tumor para los adenomas premaligos de colon (Brandt-Rauf. 1994b). Dado que las neoplasias de colon progresan por lo general a través de fases bien definidas desde adenoma a carcinoma, aumentando el potencial maligno de los adenomas con el tamaño, los niveles séricos de erbB-2 ECD pueden ser útiles para el seguimiento de esta progresión.

Proteínas G Como ocurre con los receptores de tactor de crecimiento, las proteínas señalizadoras que se producen aguas abajo de los receptores de crecimiento se hacen oncogénicas sobre todo por la sobreexpresión y sustituciones de aminoácidos en posiciones críticas en sus cadenas polipeptídicas. Con menos frecuencia, y para algunas proteínas, como raí (Figura 64-1; Tabla 64-2), la pérdida de los dominios de regulación también puede conducir a la oncogenesis. Las sustituciones de aminoácidos en las proteínas transductoras de señal hacen que estas proteínas sufran cambios de conformación que pueden dar lugar a que queden activadas de forma permanente para estimular la división celular (Pincus, 1992,1999). Este mecanismo se ha documentado bien para la proleína p21 codificada por el oncogén ras. en el que las sustituciones de la mayoría de los aminoácidos por glicina 12 o glutamina 61 dan lugar a una proteína oncogénica. Muchas proteínas p21 con tal sustitución han sido clonadas y microinyectadas directamente en células normales de cultivo tales como las células NIH 3T3 (Barbacid. 1987). Las células sufren una transformación maligna que dura hasta que se melaboliza la proteína mulante añadida y se elimina de las células. Las tormas mulantes oncogénicas del gen ras y de su proteína p2i codificada se han encontrado en aproximadamente uno de cada tres tumores de células epiteliales humanos habituales, en más de un 90% de los tumores pancreáticos humanos y en un 75% de los cánceres de colon humanos (Almoguerra, 1988; Forester. 1987). Una de las consecuencias de las sustituciones de aminoácidos en p21 y presumiblemente en otras proteínas transductoras de señal es la activación anómala de vías alternativas y no reguladas de transducción de señal. La proteina oncogénica ras-p21 (p21 * en la Figura 64-1) ha resultado unirse directamente a ¡un, el tactor de transcripción nuclear y su cinasa activadora. ¡un cinasa (JNK). Este proceso de unión da lugar a la activación directa de estas proteínas nucleares inductoras de transcripción, cortocircuitanto así los controles celulares normales. Esta derivación o via en cortocircuito se muestra en la parte derecha de la Figura 64-1 para p21' (Adler. 1995: Amar. 1997). Además, la proteína oncogénica ras-p21 activa la proteína cinasa C (Pincus. 1992), como se ilustra en la Figura 64-1. Como se mencionó previamente, las proteínas p21 codilicadas por el oncogén ras son proteínas G asociadas a las membranas de 21 kDa que se han implicado en el proceso de transducción de señales de crecimiento desde la membrana celular a las cinasas del citoplasma. Los cambios cualitativos (por ejemplo, mutaciones puntuales) y cuantitativas (por ejemplo, sobreexpresión i en p21 han sido identificadas como contribuidoras a la carcinogenesis humana (Barbacid. 1987). Gracias a mecanismos aún sin definir, las proteínas p21 ganan acceso al ambiente extracelular. Así, las mayores cantidades de p2l o las formas muladas de lorma puntual de p21 pueden detectarse mediante inmunoblot con anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de células cultivadas que se sabe sobreexpresan p21 o que expresan p21 mulante, respectivamente (Brandt-Rauf, 1991). De forma análoga, realizando inmunoblot en ratones con tumores que sobreexpresan p21 o que expresan un p21 mutante se encuentran mayores cantidades de p2i o formas muíanles de p21 en su suero, respectivamente (Hamer. 1991). Estos resultados sugieren que es posible realizar la detección de un aumento en p2l o encontrar p21 mutante en sangre de seres humanos. Debido a su papel central en la transducción de señales mitogénicas. se podría esperar encontrar proteína p2l mulada y'o sobreexpresada en una amplia variedad de tumores humanos. De hecho, se ha identificado un p2l sérico elevado en el suero de hasta un 68% de los pacientes con muchos cánceres diferentes, incluyendo cánceres de mama, próstata, colon, pulmón e higado. Por otro lado, sólo un pequeño porcentaje de individuos normales han resultado tener niveles séricos detectables (Weissfeld, 1994). En cánceres humanos de páncreas y colon se ha encontrado una incidencia muy alta de ocurrencia de formas oncogénicas del gen K-ras. Nuevos aná-

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lisis basados en la PCR han detectado en oncogén ras en las heces de un alto porcentaje de pacientes con cáncer de colon. Se han encontrado resultados igualmente aleccionadores utilizando el esputo de pacientes con cáncer de pulmón. Se han obtenido ahora resultados paralelos utilizando ELISA para la proteina p21 utilizando el suero de pacientes con carcinomas de colon y de pulmón. Se han encontrado niveles elevados (cinco veces superiores al del control) de p21 sérico en hasta un 83% de pacientes con cancer de pulmón, mientras que en los sueros de individuos normales sólo se han encontrado niveles bajos (Brandt-Rauf. 1991. 1998) Además, se han realizado estudios en los que se ha llevado a cabo una PCR para genes mutantes k-ras con cambios de bases en los codones 12 y 13. de forma simultánea en el tejido tumoral y en el suero de pacientes con diferentes fases de cáncer colorrectal (De Kok. 1997). En más de un 90% de los pacientes con genes ras mulantes específicos encontrados en tejidos tumorales, se descubrió el mismo gen mulado ras en sus sueros, de forma indiferente de la fase del tumor Previamente, cuando se habló de la proteína p185 codificada por el oncogén neu, se hizo notar que se habían encontrado elevaciones en los n veles séricos de esta proteina en pacientes con neumoconiosis que progresaron después hasta desarrollar tumores malignos sintomáticos. Un estudio similar en los niveles séricos de p2l se ha llevado a cabo en pacientes con neumoconiosis. Para los pacientes con esla predisposición, en un 39% se ha encontrado mediante inmunoblot (Western blot) que tenían niveles séricos elevados de la proteina p21. Casi todos estos pacientes desarrollaron un tumor de pulmón maligno después de haberse observado elevaciones de la proteina p21. Así, y al igual que p185 ECD, el p21 sérico elevado es un marcador biológico precoz de enfermedad maligna en pacientes con una predisposición conocida. Los estudios precedentes están relacionados con la detección de niveles séricos elevados de p2l como indicadores de tumores malignos. Como se ha observado antes, un importante mecanismo de la oncogenesis inducida por la proteína ras-p2l son las sustituciones de aminoácidos en su secuencia que dan lugar a su activación permanente. La identificación de genes ras mutantes mediante PCR y secuenciación directa del ADN aislado del suero o plasma en tres pacientes con cáncer de páncreas ya se ha descrito (Sorenson. 1994). pero, hasta hace poco, no se habia comunicado la detección directa de proteínas p2l mutantes en sangre humana (De Kok. 1997). Actualmente, sin embargo, las sustituciones oncogénicas de aminoácidos en la proteína p21 se pueden identificar mediante el uso de anticuerpos monoclonales que reconocen sustituciones oncogénicas especificas. Se ha encontrado p21 mutado en el suero de pacientes con una historia conocida de exposición a cloruro de vinilo. un carcinógeno. Este produelo químico ha resultado predisponer a las personas a desarrollar angiosarcomas. Los estudios tisulares de estos angiosarcomas revelan que en las células tumorales un gen ras mutante coditica ácido aspártico en lugar de la glicina que está normalmente en la posición 13 en la cadena polipeplidica. Un anticuerpo monoclonal que reconoce la forma Aspl3 de la proteina p21 ha podido desarrollarse (Oncogene Science). Esta proteína p2l mutante ha sido identificada en el suero del 80% de pacientes con angiosarcomas hepáticos inducidos por cloruro de polivinilo. pero no en individuos normales (DeVivo, 1994). Es más. existe una correlación directa entre el grado de exposición de los pacientes al cloruro de vmilo y la probabilidad de descubrir en su suero la forma oncogénica de la proteína. Se han obtenido otros anticuerpos monoclonales anti-p21 mutantes altamente específicos que reconocen sustituciones especílicas de aminoácidos en las posiciones 12. 13, 59 y 61. El uso de estos anticuerpos en el suero de pacientes con factores de riesgo conocidos de desarrollar cáncer parece ser muy prometedor para la detección precoz de los tumores.

Oncoproteínas nucleares Como ya se ha mencionado, dos importantes proteínas nucleares que parecen tener funciones críticas en la regulación del crecimiento celular y la división celular son la proteina p53 que suprime el gen tumoral y la proteina p62'64 codificada por el oncogén c-m/epara la que se han desarrollado análisis en suero. Además, las proteínas de matriz o esqueleto nuclear son los objetivos de las cinasas transductoras de señal tales como la cinasa MAP, según se indica en la Figura 64-1.

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SECCIÓN V I I

•

PATOLOGIA MOLECULAR

Proteina p53. Se sabe que esta proteina funciona como un homotetrámero y, de esta forma, se une a secuencias especificas del ADN. El efecto es reprimir el proceso de la mitosis. Así. p53 es una proteína antíoncogén. Se pueden producir mutaciones en p53 que lo ¡nactiven. Esta inactivación puede por sí misma ser oncogénica debido a que se elimina el control vital que esta proteína ejerce sobre la mitogénesis. Entre las mutaciones inactivantes están las deleciones de todo el gen, como se ha encontrado en un número de cánceres de colon. Las mutaciones del gen p53 pueden producir sustituciones de aminoácidos en la proteína que, como en la proteína p21, dan lugar a cambios de conformación en la proteína que resultan en su incapacidad para llevar a cabo su función antioncogénica en la célula (BrandtRauf, 1996). Se han identificado muchas diferentes mutaciones puntuales en p53 en tumores humanos (Soussi, 1994). El efecto de estas mutaciones es la pérdida de la función inhibitoria del crecimiento normal de p53 y. al mismo tiempo, algunas de estas mutaciones dan lugar a proteínas p53 con unas vidas medias considerablemente aumentadas, de manera que las proteínas muladas se acumulan en las células transformadas (Soussi, 1994). La oncoproteína c-myc se activa para dar lugar a la transformación celular mediante sobreexpresión, de manera que, además, se acumula en las células transformadas (Field. 1990). Así, tanto para p53 como para myc p62 5 nmol/l 376-1.450 nmol/l > 317 nmol/l

l ,5-5.0% saturación 5,0-9.0% saturación 40-200 ug/dl 23-50 mg/dl 95-103 mEq/l

55-170 U/l a 37° C 30-135 U/l a 37" C 0,6-1,2 mg/dl (adulto) 0,3-0.6 mg/dl (niños < 2 años)

i 52,05

1 88,40

> 3,5 ng/ml (análisis isotópico) 166-640 ng/ml (bioensayo) > 140 ng/ml (análisis isotópico) Ninguna < 20 mg/dl 0,5-1,6 g/dl 2,3-3,5 g/dl 70-110 mg/dl 60-100 mg/dl

0,05551 10 10 0,05551

Ninguna < 1,11 mmol/l 5-16 g/l 23-35 g/l 3.9-6,1 mmol/l 3,3-5.6 mmol/l J

La tabla continúa en la pàgina siguiente

Tabla A5-4

P a r á m e t r o s q u í m i c o s en sangre total, suero y plasma (continuación) I N T E R V A L O S DE R E F E R E N C I A TÍPICOS

COMPONENTE Tolerancia a la glucosa oral

intravenosa

Glucosa- 6-loslato deshidrogenasa (G6PD) •y-Glulamiltransferasa Gluiatión Hormona del crecimiento Guanasa Haptoglobina Hemoglobina

(i-hiúroxibutirico deshiclrogenasa 17- hidroxicosticosleroides

Inmunoglobulinas: IgG IgA

IgM IgM igD igE Insulina Tolerancia a la insulina (0.1 unidades/kg)

SISTEMA Suero o plasma en ayunas 30 min

20-50 mg/dl sobre nivel en ayunas

120 min

5-15 mg/dl sobro nivel en ayunas

180 min Suero o plasma en ayunas 5 min 60 min 120 min 180 min Eritrocitos Suero Sangre total Suero Suero Suero Suero o plasma cualitativo cuantitativo Sangre total varón mujer Suero

Plasma análisis isotópico bioensayo Suero en ayunas 30 min

Suero

Cuerpos cetónicos 17-Ketosteroids Ácido láctico (como lactato)

Suero Plasma Sangre total venosa arterial Suero

Factor*

Unidades del SI r e c o m e n d a d a s

0,05551

3.9-6.1 mmol/l 1.7-3.3 mmol/l por encima de nivel en ayunas 1.1-2.8 mmol/l por encima de nivel en ayunas 0.3-0.8 mmol/l por encima de nivel en ayunas Nivel en ayunas o inferior

Igual o inferior al nivel en ayunas 70-110 mg/dl Máximo de 250 mg/dl Descenso signiticativo Inferior a 120 mg/dl Nivel en ayunas 250-500 unidades/10' células 1 200-2 000 mlU/ml de concentrado de eritrocitos 5-40 IU/I 24-37 mg/dl < 10 ng/ml < 3 nmol/ml/min 60-270 mg/dl

I 0,03254 1 1 0,01

Negativa 0.5-5.0 mg/dl

10

12.0-16,0 g/dl 13,5-18,0 g/dl 140-350 U/ml

Plasma varón 7-19 ug/dl mu|er 9-21 ug/dl tras 24 unidades USP de ACTH IM (tniramuscular) 35-55 ug/dl Suero 800-1,801 mg/dl 113-563 mg/dl 54-222 mg/dl 0,5-3,0 mg/dl 0,01-0.04 mg/dl

Isocitrico deshidrogenasa

Láclalo deshidrogenasa isoenzimas LD.(ánodo) LD, LD, LD, LD, (cátodo)

70-1l0mg/dl 30-60 mg/dl sobre nivel en ayunas

60 min

90 min Hierro lotal Suero Capacidad de fijación de hierro Suero Saturación de hierro Suero

Lactato deshidrogenasa (LD)

Unidades c o n v e n c i o n a l e s

1 1

10 1 25,59'

1

3.9-6.1 mmol/l Máximo de 13.9 mmol/l Descenso significativo Inlenor a 6.7 mmol/l Nivel en ayunas 250-500 punidades/célula 1 200-2 000 U/1 de concentrado de eritrocitos 5-40 U/1 a 37° C 0,78-1.20 mmol/l

35 IU/I 0,7-4,3 g/l 0,65-1,05 mmol/l 0,74-1,23 mmol/l < 2,4 g/l Fracción de hemoglobinal total