Dr. Antonio-manual Practico de Micro 2016-17

Universidad técnica de Manabí Facultad ciencias de la Salud Escuela de medicina

MANUAL DE PRACTICA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Ms.Dr. ANTONIO GONZÁLEZ VELÁZQUEZ

PORTOVIEJO MANABÍ-DICIEMBRE-2016

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Antonio González Velázquez. Dr en Medicina Especialista en Medicina General Integral Especialista en Medicina Intensiva y Emergencias Pediátricas Master en Infectología y Enfermedades Tropicales Roman Camba July Doctorado en MEDICINA y CIRUGIA. DIPLOMADO SUPERIOR EN ENFERMEDADES ZOONOSICAS. ESPECIALISTA EN MEDICINA INTERNA

COLABORADORES: Estudiantes de la Facultad Ciencias de la Salud, Escuela de Medicina. Universidad Técnica de Manabí

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MANABÍ Av. Urbina y Che Guevara Manabí, 130103. Ecuador, Portoviejo.

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INDICE PRÓLOGO

1

INDICE

2

INTRODUCCIÓN

4

INSTRUCCIONES GENERALES

5

SEGURIDAD DEL LABORATORIO MICROBIOLÓGICO.

7

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA. Normativas especificas del estudiante de Medicina. Protocolos de BIOSEGURIDAD.

10

UNIDAD I: MICROBIOLOGÍA GENERALIDADES PRACTICA N° 01 INTRODUCCION A LA MICROBIOLOGIA. Normas de bioseguridad especifica en Bacteriología Acondicionamiento de MATERIALES. MICROSCOPIO OPTICO MICROSCOPIO ELECTRONICO PRACTICA N° 02 MORFOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS. Estructuras Bacterianas.

12

PRACTICA N° 03 DESINFECCION y ESTERILIZACION DE MATERIALES Métodos de esterilización. Mecanismos de Acción.

26

34

PRACTICA N° 04 MEDIOS DE CULTIVOS Clasificación de los medios de cultivos. Constituyentes principales de los medios de cultivos. PREPARACION.

44

PRACTICA N° 05 AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE BACTERIAS, AEROBIAS Y ANAEROBIAS Análisis Cualitativo y Cuantitativo Bacteriano. Toma de muestras. INOCULO. SIEMBRA y AISLAMIENTO.

51

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. PRACTICA N° 06 LOS COLORANTES. Técnicas de TINCION. Tinción simple. Tinción compuesta y diferencial.

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62

PRACTICA N° 07 CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS. TINCION DE GRAM. Estructuras de las células EUCARIOTAS Preparación y Fijación de Frotis

66

PRACTICA N° 08 IDENTIFICACION – CLASIFICACION Y TIPIFICACION BACTERIANA. CULTIVOS PUROS PCR.

74

PRACTICA N° 09 ANTIBIOGRAMAS. Técnicas y Procedimientos estandarizados. Sensibilidad y Resistencia. METODO DE KYRBY BAUR.

83

PRACTICA N° 10 PRUEBAS BIOQUIMICAS BACTERIOLOGICAS. Hemólisis, Catalasa, Coagulasa, Bacitracina, Metabolismo azucares.

89

PRACTICA N° 11 PROTOCOLO DE TOMA DE MUESTRAS.

Oxidasa,

Lactosa, 97

PRACTICA N° 12 LAS MICROBACTERIAS. BAAR. Tinción de ZIEHL NEELSEN.

103

PRACTICA N° 13 PARASITOLOGIA. IDENTIFICACION DE LOS PARASITOS Examen macroscópico Examen microscópico.

108

PRACTICA N° 14 ESTUDIO MORFOLOGICO DE LOS PARASITOS. Taxonomía PARASITARIA. MICROSCOPIA. TRABAJO DE PREVENCION. Educación para la Salud

119

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

131

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PROLOGO A los estudiantes y profesores: El presente Manual de Prácticas del Laboratorio de Salud e Infección Microbiología y Parasitología, se ha realizado para ser un material didáctico del laboratorio, el cual será utilizado en la Universidad Técnica De Manabí (UTM) en el marco referencial de los cambios significativos de la sociedad del conocimiento y contemporánea. Se presentará las normas y procedimiento básicos de trabajo en el Laboratorio de Microbiología, para comprender la importancia de realizar un buen manejo y el reconocimiento del objeto de estudio, desarrollando habilidades y destrezas, que orientará a la lectura independiente continua. De antemano se inicia con la introducción a las Normas de Bioseguridad dentro del Laboratorio, para un mejor manejo de los diferentes materiales, instrumentos, equipos, y reactivos químicos. La guía cuenta con catorce prácticas explicadas de forma sencilla y ordenada, para realizar el adecuado procedimiento. Los estudiantes deben leer detenidamente cada uno de los procedimientos, antes de realizar la práctica respectiva, obteniendo una mejor comprensión en la observación del fenómeno biológico de cada uno de los seres microscópicos en estudio. Las prácticas detalladas abordan temas sobre el manejo de bacterias, parásitos, medios de cultivo, y pruebas bioquímicas, siendo los pilares básicos y fundamentales para el aprendizaje de los alumnos en su futura vida profesional. La Guía cuenta con una práctica específica estructurada de la siguiente manera, en: Objetivos y Marco Teórico para realizar una conceptualización del tema a abordar, seguidamente se indican los materiales que se utilizarán y su respectivo procedimiento a manera de pasos enumerados complementados con gráficos de fácil entendimiento. En la sección final de la práctica, se redacta la Conclusión en base en los objetivos planteados, y los resultados propuestos. De igual manera, se encontrarán las instrucciones para llevar a cabo los procedimientos de preparación de soluciones y medios de cultivos comunes utilizados en el Laboratorio. Sugerimos este manual para que les pueda servir como una guía y así utilizar los experimentos propuestos con un gran entusiasmo y perseverancia hacia el éxito de la misma, cumpliendo así con el proceso de enseñanza aprendizaje a los futuros profesionales competentes en su formación científica académica y satisfacer todas sus necesidades, bajo estrictos criterios de estándares de calidad y pertinencia.

El autor agradece anticipadamente la(s) crítica(s) o sugerencia(s) que puedan tenerlos lectores que sirvan para mejorar el presente trabajo.

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INTRODUCCIÓN. El conocimiento del mundo bacteriano y su organización de acuerdo a un modelo de estirpe filogenético es un anhelo tan antiguo como la propia bacteriología.Con la llegada delas técnicas de secuenciación molecular se pudo disponer de las herramientasadecuadas para construir un modelo taxonómico fundamentado en una auténticafilogenia estructura en evolución. La Microbiología es la ciencia encargada del estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros(pequeño), bios(vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica. Son estudiados identificados y considerados Microbios todos los seres vivos microscópicos consistentes en una sola célula, es decir unicelulares. Los microorganismos pueden ser Eucariotas (Las células poseen núcleo), tales como los hongos y los protistas, o Procariotas (células carentes de núcleo), como las Bacterias y los Virus (Aunque los virus no son considerados seres vivos estrictamente hablando). Las infecciones intrahospitalarias cada vez más constituyen un serio problema de salud pública, ya sea por su efecto sobre la salud de los pacientes, como por los costos que este problema implica. Esto hace, que en el país se estén aunando esfuerzos para implementar sistemas de vigilancia, prevención y control, orientados a enfrentar este problema. Por lo que el Medico debe basar su diagnóstico en evidencias disponibles, como son los aspectos epidemiológicos, y la importante contribución del Laboratorio de Microbiología, que además de permitir el diagnóstico etiológico, orienta el manejo clínico terapéutico del paciente. El estudiante de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Salud, Escuela de Medicina de la Universidad Técnica de Manabí será el profesional, quien con los conocimientos presentes en este manual estará en la capacidad de poder afrontar y resolver con criterio los problemas presentados ya sea en el desenvolvimiento de sus competencias basados en evidencias, como realizando medicina preventiva.

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INSTRUCCIONES GENERALES NORMAS GENERALES PARA EL ESTUDIANTE DE MICROBIOLOGIA MEDICA 1) El estudiante deberá previamente conocer su ubicación de grupo y el local asignado para las prácticas respectivas de laboratorio de Microbiología. 2)Todo estudiante debe de tener la competencia objetiva y la destreza necesaria con cada uno de los equipos de trabajo que va a tener a su cargo y responsabilizarse durante las prácticas de laboratorio en el nivel respectivo. Debe cuidar que los equipos e instrumentos de trabajo no sufran daño, deterioro, ni destrucción alguna, cuidando el patrimonio institucional universitario. 3)Antes de iniciar actividad o práctica en el laboratorio de microbiología, cada uno de los estudiantes deberá realizar las consultas con su profesor o ayudante asignado y en equipo reunir la información necesaria y pertinente. 4)El estudiante deberá revisar el contenido de cada una de los temas en la guía y cumplir con cada paso del manual de instrucciones para realizar la prácticarespectiva, deberá conocer los fundamentos teóricos-científicos en cada proceso y solicitar información respectiva, fundamentada y pertinente. 5)Cada uno de los alumnos deberá anotar con precisión, detalles de cada uno de los procedimientos de cada practica y los resultados obtenidos en cada práctica, responder adecuadamente en la revisión y evaluación de cada uno los conceptos tratados, revisados y aprendidos, 6)En cada una de las observaciones microscópicas, debe cumplir con la tarea de la limpieza y controlar el buen funcionamiento del microscopio, la fuente de iluminación los lentes oculares y los lentes objetivos, anotar y dibujar los caracteres fundamentales desarrollados en cada práctica. 7)El alumno podrá ser requerido para efectuar trabajos de investigación sobre temas específicos en microbiología, intra o extra aula, que será entregado y calificado por el profesor en un plazo determinado como lo indica el silabo respectivo. 8)Todo estudiante deberá conservar el buen estado y funcionamiento de cada equipo y del material de cada práctica que se le hay confiado, evitando causar daño total o parcial, deterioro o pérdida del mismo. 9)El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que estén realizando las prácticas. No se admiten visitas por razones de seguridad. 10) Los laboratorios de investigación son de acceso restringido al personal del Departamento. 11) Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se esté trabajando en el laboratorio. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio.

12) Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningún objeto (bolígrafos...) o tocarse los ojos y nariz. 13) En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u objetos personales.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA 14) Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, así como de los microscopios que haya usado. 15) Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio. 16) Está prohibido pipetear con la boca. 17) Ante un vertido accidental de material microbiológico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo. 18) No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las manos. 19) No se manejarán los autoclaves o el material recién esterilizado si no se dispone de guantes apropiados. 20) La eliminación de residuos, material desechable y material reciclable se realizará siguiendo las pautas de la práctica 1, utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto. 21) Se deben lavar las manos con jabón antiséptico ante cualquier sospecha de contaminación y siempre antes de marcharse del laboratorio.

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Seguridad En El Laboratorio Antecedentes La Organización Mundial de La Salud (OMS), publicó en 1983 el primer Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, detallando los principios básicos en cuanto a seguridad biológica, en el año 2005 se publica la tercera edición de este manual explicando de una manera más amplia y extensiva la materia de Bioseguridad, en cuanto a una mala manipulación de agentes infecciosos. Al realizar trabajos con cualquier microorganismo hay que tomar en cuenta que: “Toda muestra biológica debe ser considerada como infecciosa”, no se puede establecer opiniones personales ante toda manipulación, por tal motivo es importante conocer los peligros que implica el manejo de estos agentes, de acuerdo a su capacidad de riesgo. Tabla 1. Microorganismos clasificados según su riesgo.

Microorganismos clasificados según su riesgo Microorganismos que tienen pocas Grupo de riesgo 1 probabilidades de provocar enfermedades en el ser (riesgo individual y humano o los poblacional escaso o nulo) animales. Agentes patógenos que pueden Grupo de riesgo 2 provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, animales o el medio (riesgo individual ambiente. La moderado, exposición en el laboratorio puede provocar una riesgo poblacional bajo) infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado.

Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero (riesgo individual que de ordinario no se propagan de un elevado, individuo a otro. Existen medidas preventivas y riesgo poblacional bajo) terapéuticas eficaces. Agentes patógenos que suelen Grupo de riesgo 4 provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten con facilidad de un (riesgo individual y individuo a otro, directa o indirectamente. Por lo poblacional elevado) regular no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces Grupo de riesgo 3

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Tabla 2. Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las práctica y equipo Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las práctica y equipo

GRUPOS DE RIESGO 1

2

3

4

PRÁCTICAS NIVEL DE TIPO DE DE BIOSEGURID LBORATOR LABORTAOR AD IO IO Básico Nivel 1 Enseñanza TMA Básica, Investigació n.

Básico Nivel 2 Servicios de Atención

TMA y Ropa protectora; señal de Primaria; riesgo Diagnóstico, biológico Investigació n.

Contención Nivel 3

Diagnóstico especial, investigació n.

Prácticas de Nivel 2 más ropa especial, acceso

EQUIPO DE SEGURIDA D Ninguno; trabajo en mesa de laboratorio al descubierto Trabajo en Mesa al descubierto y CSB para posibles aerosoles CSB además de otros

medios de contención primaria controlado y para flujo todas las direccional del actividades aire CSB de clase Unidades de Prácticas de III

Contención Máxima Nivel 4 Patógenos peligrosos

Nivel 3 más Cámara de Entrada con cierre hermético,

o trajes presurizados junto con CSB de Clase II, autoclave de

salida con

doble puerta (a través de la pared), aire filtrado.

ducha y eliminación especial de residuos TMA: Técnicas Microbiológicas apropiadas. CBS: Cámara de Seguridad Biológica

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Tabla 3. Clasificación de los laboratorios según el nivel de riesgo de los microorganismos

Nivel de Bioseguri dad 1 (BS-1)

Nivel de Bioseguri dad 2 (BS-2)

Nivel de Bioseguri dad 3 (BS-2)

Clasificación de los Laboratorios Se trabaja con organismos reconocidos como patógenos. Lugar utilizado para enseñanza, no se manejan especímenes clínicos por lo tanto no se requieren barreras primarias importantes y solo se necesitan mesas de laboratorio. Equipo de bioseguridad como cámaras de flujo laminar, recipientes apropiados anti-aerosoles, guantes, anteojos, cubiertas faciales, respiradoras, mandil. Los agentes son de riesgo moderado como pueden ser: Virus de la hepatitis B, Salmonella, Toxoplasma, manipulación de sangre y muestras clínicas para diagnóstico clínico y prácticas de laboratorio, en la cual una buena técnica de manipulación, apegada a las normas de bioseguridad, garantiza la seguridad del trabajador. Además de vacunación contra la hepatitis B, el tétano, la tuberculosis, y otros. Uso de barreras primarias de bioseguridad, mandil, guantes. Debe haber sistemas de descontaminación de utensilios y autoclave. Manejo de agentes transmisibles por aerosoles o por contacto con piel y mucosa, incluye diagnóstico e investigación. Entre los agentes están: el Mycobacterium tuberculosis, Coxiella, Virus de la Encefalitis de San Luis. Los residuos deben descontaminarse antes de desecharse, la ropa de laboratorio debe esterilizarse antes de enviarla a

Nivel de Bioseguri dad 4 (BS-4)

lavandería. Facilidad de las instalaciones, corredores de acceso, puertas con cierres automáticos, presión negativa, el aire no recirculará y saldrá expelido por un sistema removedor de partículas HEPA o tipo N95. Manejo de muestras siempre con guantes, mandil, protectores faciales. Manejo de microorganismos muy peligrosos o causantes de enfermedades. Uso obligatorio de cabinas de Bioseguridad tipo III. El personal debe ducharse, y cambiarse de ropa antes de entrar y salir del área de trabajo. El edificio debe estar alejado de otras instalaciones y el aire de salida debe esterilizarse lo mismo que todos los desechos. Acceso restringido solo al personal de trabajo.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Mantener la seguridad y la integridad del personal que labora dentro de las instalaciones del laboratorio es primordial el uso de medidas de protección sin llevarlas a cabo no deberá realizarse ninguna práctica o proceso experimental sin cumplir con las disposiciones anteriores. Por lo que se detallan a continuación las siguientes reglas a seguir dentro del Laboratorio. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. 1. El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que estén realizando las prácticas. No se admiten visitas por razones de seguridad. 2. Los Laboratorios de investigación son de acceso restringido al personal del departamento. 3. Es obligatorio utilizar batas o mandil abrochados siempre que se esté trabajando en el laboratorio. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio. 4. Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningún objeto (bolígrafos…) o tocarse los ojos y la nariz. 5. En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u objetos personales. 6. Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, así como de los microscopios que haya usado. 7. Se deben usar los mecheros o lámparas de alcohol con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio. 8. Está prohibido pipetear con la boca. 9. Ante un vertido accidental de material microbiológico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo. 10. No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las manos. 11. No se manejarán los autoclaves o el material recién esterilizado si no se dispone de guantes apropiados. 12. La eliminación de residuos, material desechable y material reciclable se realizará siguiendo las pautas de la Práctica N°1, utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto. 13. Se deben lavar las manos con jabón antiséptico ante cualquier sospecha de contaminación y siempre antes de marcharse del laboratorio. El trabajo en el laboratorio de microbiología requiere de unas normas básicas en el manejo, orden, y cuidado del material de las personas que laboran allí. Las anteriores normas deben ser empleadas en todo momento. Las siguientes indicaciones generales, son necesarias para llevar a cabo la práctica de laboratorio.

1. ORGANIZACIÓN Conforme a grupos de 8 personas en cada mesa de trabajo cada una deberá estar coordinado y organizado por un líder, ya que de todos los miembros dependerá el resultado de la práctica. Se delegará una función a cada integrante del grupo.

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2. EL ÁREA DE TRABAJO El laboratorio de microbiología dispone de mesas de trabajo, cada una de ellas equipadas con microscopios, asas, aceite de inmersión, soluciones, gradilla de tinción, colorantes, lámparas de alcohol industrial. 3. UNIDADES DE SERVICIO El laboratorio dispone de servicio de agua o lavadero que se encuentra al costado del laboratorio, lavarse las manos antes y después de cada práctica es primordial. 4. EQUIPO PERSONAL Cada alumno debe traer a la práctica: una bata de laboratorio, un lápiz vidriografo, una toallita de manos y una libreta de apuntes. Las personas de pelo largo deben sujetárselo o usar un grupo debe disponer de cinta de enmascarar de media pulgada, jabón de manos y las muestras para cada sesión de trabajo. 5. MATERIALES Y EQUIPOS Los materiales utilizados para cada práctica serán repartidos por el profesor o líder de cada grupo antes de comenzar. Rotúlelos adecuadamente, indicando su número de grupo, mesa, fecha, número de muestra. Después de que haya realizado la siembra lleve el material a la incubadora – al final de la sesión-. Encienda el microscopio solo el tiempo que lo utilice, guarde la funda y aléjelo de las lámparas de alcohol. 6. LECTURA DE LOS RESULTADOS Muchas prácticas están dedicadas a observar el crecimiento de los microbios, este solo es visible al cabo de varias horas o días de realizar las siembras, por tal motivo cada laboratorio conlleva una sesión de lectura de los resultados, esta se realiza durante todo el semestre, las lecturas serán semanales y corresponderán al laboratorio inmediatamente anterior, el material no leído también será desechado semanalmente. Una vez tomados los datos de los resultados entregue los cultivos para su eliminación. 7. PRECAUCIÓN DE ACCIDENTES Informe cualquier accidente o lesión sufrida, en el laboratorio al profesor. Si llega a romper algo no lo recoja con las manos e informe inmediatamente del accidente (RECUERDE QUE TODO MATERIAL ES INFECCIOSO SEA CUIDADOSO). No se debe usar el pelo suelto, use sujetadores para el cabello. Si tiene lesiones en las manos evite el contacto con el material contaminado, utilice guantes. 8. RECOMENDACIONES ACADÉMICAS Antes de cada sesión entérese sobre el tema de la práctica, lea las instrucciones y consiga el material solicitado. En el transcurso del laboratorio

tome apuntes constantemente, realice dibujos esquemas de lo observado. Periódicamente el profesor revisará el manual de laboratorio, el cual se llevará de forma individual.

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PRACTICA #1 INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA OBJETIVOS  Aprender la rutina y las técnicas de seguridad en el laboratorio de microbiología.  Conocer los principales instrumentos utilizados en el laboratorio de microbiología.  Aprender Técnicas en el manejo de microorganismos.  Montar correctamente una muestra al microscopio, en seco y húmedo. INTRODUCCION Células Eucariotas y Procariotas Los hombres poseemos una idea intuitiva de los seres vivos, a los que reconocemos por su capacidad de crecer, reproducirse y morir, y los identificamos como vegetales o animales. Los seres vivos están formados por células; algunos son pluricelulares, como las plantas y los animales, pero otros y, por tanto invisibles, por lo que no pudieron ser observados hasta la introducción del microscopio. Existen dos clases de células: las procariotas y las eucariotas. Tabla 4. Características de los tipos de Células

Características de las Células Característic as Ejemplo

Cuerpo nuclear ADN

Célula Eucariota Célula Epitelial

Célula Procariota EscherichiaColi

No hay membrana nuclear; No hay mitosis Molécula simple, no Varios o muchos cromosomas, acomplejada habitualmente acomplejados con con histonas histonas Verdadero Núcleo, membrana nuclear, mitosis.

Composición de Tienen esteroles

Carecen de esteroles

las membranas Sistema

Presente en orgánulos con

respiratorio membranas los cloroplastos

Aparato

Presente en orgánulos con

Fotosintético membranas los cloroplastos

El sistema respiratorio es parte de la membrana plasmática o del mesosoma; no hay mitocondrias Aparato fotosintético en membranas internas organizadas; no hay cloroplastos

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA La Microbiología La Microbiología estudia los organismos que son demasiados pequeños para ser claramente percibidos a simple vista, y que se denominan microorganismos, entre ellos bacterias, virus, algas y hongos. Normas De Bioseguridad Del Laboratorio Como objetivo principal de esta guía práctica es enseñar a manipular los microorganismos adecuadamente. Aunque los microorganismos deben ser manejados con precaución. Por ello, nunca debe olvidarse la necesidad de cumplir estos dos requisitos básicos. 1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminación. 2. Evitar que los microorganismos ambientales presentes en la piel, pelo, aire, ropa, etc. Contaminen nuestras muestras. Para realizar una buena práctica en el laboratorio de Microbiología, se debe tomar en cuenta entre las siguientes reglas de seguridad e indicaciones: 1. Trabajar con calma y concentración. 2. Uso de bata de laboratorio. 3. Lavarse las manos con agua y jabón. 4. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. 5. Como cualquier laboratorio, está prohibido comer, beber, y fumar. 6. No se debe nunca pipetear con la boca. 7. Uno de los riesgos principales en un laboratorio de microbiología en la generación de aerosoles que contengan microorganismos, ya que son fácilmente inhalados. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama del mechero o en una campana de seguridad biológica. 8. El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contienen cultivos representan un riesgo evidente. 9. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio. 10. Nunca se usará una fregadera, papelera o basura común para deshacerse del material contaminado. Los desechos contaminados deben ser esterilizados en el laboratorio antes de procesarlos como residuos. 11. En el laboratorio de microbiología debe estar siempre presente y disponible un botiquín básico de primeros auxilios. 12. En caso de accidente se debe avisar inmediatamente al responsable del laboratorio, dejando a una persona que vigile para evitar que otros se contaminen, y se deberá cubrir el derrame con un desinfectante.

Un laboratorio de microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo se lleva a cabo con una buena técnica aséptica y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Tabla 5. Clasificación de los agentes infecciosos según su riesgo biológico

Clasificación de Microorganismos según su riesgo biológico Riesgo de Profilaxis o Grupo de Riesgo Propagació tratamiento Riesgo Infeccioso na eficaz la Colectivida d Poco probable que causen una No Innecesario 1 enfermedad Pueden causar una enfermedad y Generalmente Poco constituir un probable 2 posible peligro para los manipuladores Pueden provocar una enfermedad grave y constituir Generalmente 3 Probable un serio peligro posible para los manipuladores Provocan una enfermedad No conocido en grave la y constituyen un Elevado 4 actualidad serio peligro para los manipuladores

Materiales De Laboratorio (Generalidades) En el laboratorio encontramos distintos tipos de materiales: vidrio, plástico, porcelana…Ninguno de ellos, cumple todas las exigencias de laboratorio; así pues debemos elegir entre ellos, la elección va a depender de la aplicación, del tipo de producto y de la economía.

El Vidrio Uno de los requisitos más importantes que debe cumplir el material de vidrio es poseer una gran resistencia química al agua, ácido, bases, y temperatura. Entre ellos: UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Tabla 6. Materiales de Vidrio más usados en el Laboratorio de Microbiología.

Materiales de Vidrio más usados en el Laboratorio de Microbiología Material Descripción Gráfico Recipientes calibrado aproximado o Vaso no precipitad calibrado, habitualment o usados e para contener soluciones, realización de mezclas. Al igual que los vasos precipitados se Matraz trata de Erlenmeye material de calibración aproximada, r no precisa, pero que permite agitar de manera circular mezclas sin que estas se re rieguen. Generalmente se trata de un tubo de Varillas de vidrio hueco y cerrado en los extremos. Se agitación emplea para agitar soluciones.

Pequeña barra magnética cubierta por una capa de plástico (teflón) y una placa Magnético debajo de la cual se tiene un magneto rotatorio a fin de crear un campo magnético Agitador

rotatorio Portaobjet Es una lámina de vidrio, os generalmente de forma rectangular, empleado para depositar muestras que han de ser observadas al microscopio. Cubreobje Son láminas de vidrio que se colocan tos sobre muestras que se han de mirar al microscopio Permiten la succión de pequeñas Pipetas de cantidades de sustancia. No están calibradas, Pasteur permiten dispensar el líquido gota a gota.

Tubo de ensayo

Pequeño tubo cilíndrico de vidrio con un extremo abierto (que puede poseer una tapa) y el otro cerrado y redondeado, que se utiliza en los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas o sólidas.

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Caja Petri

Gradilla

Recipiente redondo, de cristal o plástico, con una cubierta de la misma forma que la placa. Se colocar emplea para tubos de ensayo y mantenerlos en posición vertical.

Pinza hecha de platino y un filamento de nicromo que en un arito de 5 termina mm o en punta. Se emplea para transportar o Asa Bacteriológi arrastrar o trasvasar inóculo ca (pequeño volumen que contiene microorganismos en suspensión). Instrumento de plástico o de madera con los extremos rodeados de algodón utilizado para recoger muestras y Hisopo hacer extendidos en medios de cultivo.

Palillo de diente

Rotulador

Pequeño trozo mader s s de a extremos para puntiagudos, tomar emulsiones en los portaobjetos.

redondeada con muestra s y

Resistente al agua, al alcohol y a la formalina, ciertos pueden ser a base de ceras. Sirven para detallar la fecha, nombre, procedencia de la

muestra, cultivo, frotis. Es un recipiente ovalado de vidrio resistente al calor, que almacena alcohol industrial que Lámpara de empapa un cordón de algodón hacia el exterior. Sirve alcohol para calentar y esterilizar pequeños materiales. El plástico Cada vez son más útiles de laboratorio que se fabrican en material de este tipo. Generalmente se trata de material desechable, en los que se debe evitar de forma especial las contaminaciones. UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Tabla 7. Equipos Básicos de Laboratorio de Microbiología

Material Balanzas

Equipos Básicos del Laboratorio de Microbiología Descripció n Gráfico Es un sistema de análisis que se usan para medir la masa.

Aparato que pone en Centrífuga rotación una muestra para acelerar la decantación o la sedimentación de sus componentes o fases, según su densidad por medio de la fuerza centrífuga.

Recipiente de presión Autoclave metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción o una esterilización con vapor de agua. Incubador Dispositiv sirv a o que e para manten er y hacer crecer microbiológico cultivos s o cultivos celulares.

Plato

Aparato con el de poder calenta Calentador r y mezclar fluidos contenido s en recipientes de laboratori Erlenmeye o como r, tubos de ensayo y tubos de precipita do. Cronómetr Aparato para medir el o tiempo.

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El Microscopio Los microscopios ópticos comúnmente usados en microbiología comprenden varios tipos: de campo claro, de contraste de fases, de campo oscuro, y de florescencia. El microscopio corriente se denomina de campo claro, porque forma una imagen oscura frente a un fondo claro; en el de contraste de fases las pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad de la muestra se convierten en variaciones de intensidad de luz; en el de campo oscuro, el campo oscuro rodea la muestra aparece negro y el objeto intensamente iluminado; en el de fluorescencia, la imagen se forma cuando la muestra marcada con flúocromos emite luz.

Microscopio de Campo Claro

En esta sección se dará a conocer el manejo del microscopio de campo claro. Todos los microscopios son de alto costo, fácilmente dañables, por lo cual su cuidado es indispensable para mantenerlo en buenas condiciones. Para ellos es necesario la familiaridad con sus partes y tener los conocimientos teóricos de la función de cada una. Así mismo, deben seguirse instrucciones para su transporte, limpieza, encendido, y apagado y enfoque de la preparación que se indican posteriormente. El microscopio de campo claro está formado por un cuerpo metálico compacto que incluye una base o soporte y un brazo, donde se fijan el resto de las partes. En la base se encuentra la fuente de luz; en la parte inferior del brazo se encuentra la platina, donde se coloca el portaobjetos o revólver, que sostiene 4 o 5 objetivos de diferentes magnificaciones y en el extremo, la cabeza portaoculares y los oculares. Los microorganismos son seres microscópicos. Su tamaño se mide en micras (micrómetro: µm), nanómetro (nm) y el angstrom (Ǻ)

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Sistema de Lentes Presenta tres lentes colocados a partir de una fuente de luz en el siguiente orden: un condensador, un juego de objetivos instalado en un soporte denominado revólver y uno, dos o tres oculares, según se trate de un cabeza monocular, binocular o triocular; en este último caso el tercer lente está dispuesto para un equipo fotográfico u otro aditamento óptico. Objetivos. Usualmente los microscopios de luz tienen 4 - 5 objetivos. El de menor aumento es opcional (mal llamado lupa) y generalmente es de 2,5 o 4X; luego se incluyen objetivos de 10X, 20X, 40X, 100X, ese último también denominado lente de inmersión, por requerir aceite de inmersión. Los objetivos de menor aumento son más cortos que los de mayor aumento. A la vez, los primeros tienen valores pequeños de abertura numérica (AN); por lo tanto, el lente de inmersión tienen el máximo valor de AN, que generalmente oscila entre 1.2 a 1.3. Condensador. El condensador está localizado bajo la platina, tiene la función de condensar la luz en el objeto. Diafragma Iris. Permite cerrar y abrir regulando el AN del condensador Oculares. Están colocados en una cabeza de portaoculares. El aumento final de la imagen está dado por la combinación del poder magnificante del objetivo y el ocular. Sistema de Iluminación Los dos sistemas más comunes son el bombillo de filamento y la lámpara de halógeno. En ambos casos la fuente de luz está localizada en un espejo parabólico que produce un haz de luz dirigido hacia el condensador. Limpieza Asegurarse de dejar el microscopio siempre limpio, teniendo especial cuidado con el objetivo de inmersión. Cubrir el microscopio con un protector para el polvo, que en nuestro medio debería ser de tela.

El Microscopio electrónico:

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El microscopio electrónico (1934) 1. 2. 3. 4.

Mayor número de aumentos Acceso a ultraestructura El primero, 1931 Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm; violeta - rojo).

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. Microscopio de barrido: 1965

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Microscopía de criofractura 1979

Las dos caras de fractura de la membrana nuclear

Otras técnicas Reconstrucción tridimensional a partir de imágenes de Microscopia Electrónica

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA MATERIALES Para el reconocimiento de materiales de Laboratorio 1. Vaso Precipitado. 2. Pipeta de Pasteur. 3. Tubos de ensayo. 4. Cajas Petri. 5. Portaobjetos. 6. Cubreobjetos. 7. Varilla de Vidrio. 8. Matraz Erlenmeyer. 9. Asa Bacteriológica. Para el reconocimiento de Equipo Básico de Laboratorio 1. Incubadora. 2. Autoclave Horizontal, Vertical. 3. Centrífuga. 4. Balanza. 5. Calentador. 6. Cronómetro. 7. Microscopio. MEDIOS Y REACTIVOS 1. Aceite de Inmersión. PROCEDIMIENTOS 1. Con las descripciones anteriores de los materiales que se requieren en el laboratorio, se procederá a identificarlos y reconocerlos, en cada una de los grupos de trabajo en sus respectivas mesas correspondientes. 2. Para realizar el enfoque de las placas de los frotis se realizan los siguientes pasos: 2.1. Colocar el portaobjetos sobre la platina; con el material a examinar hacia arriba, Escoger el lente objetivo de bajo poder (10X si se van a observar bacterias). Cerciorarse que el condensador esté colocado arriba y el diafragma cerrado, para luego regular paulatinamente la cantidad de luz. Encender el microscopio; si se tiene un regulador de intensidad de luz, girar progresivamente el control desde cero hasta el punto deseado, sin sobrepasar el límite indicado en el regulador. 2.2. Iniciar el enfoque con el control macrométrico y ajustar con el micrométrico. Mantener ambos ojos abiertos, aun cuando el microscopio sea monocular; si es binocular, ajustar la distancia entre los de acuerdo con la distancia entre los ojos. Examinar siempre la preparación en bajo poder; esto permitirá obtener una visión panorámica, evaluar la calidad de la preparación en bajo poder; esto

permitirá obtener una visión panorámica, evaluar la calidad de la preparación y escoger la zona a observar.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA 2.3. Regular la cantidad de luz con el diafragma; notar que cuando se cierra se reduce la intensidad de la luz, mejora el contraste y aumenta la profundidad de campo; sin embargo, pierde poder de resolución, por lo que debe manejarse cuidadosamente. 2.4. Mover la preparación al girar los tornillos del carro mecánico, colocadas a un lado de la platina. Cuando se haya localizado el sitio que se desea examinar, proceder a aumentar la magnificación. Para la observación de bacterias usualmente se pasa del objetivo que se está utilizando (10X) al de 4X para colocar fácilmente el aceite de inmersión y luego se gira el portaobjetivos hasta el objetivo de 100X (o de inmersión). Abrir el diafragma iris; si no se hace, perderá poder de resolución y en esta magnificación esto es crítico. 2.5. Nuevamente cerciorarse que el condensador esté colocado “arriba”. Si el enfoque previo en 10X ha sido correcto, únicamente se necesitará ajustar el enfoque girando suavemente el micrométrico. Si el microscopio es de buena calidad estará parfolizado, (manteniendo la imagen en foco aunque cambie de objetivo) y no será necesario hacer ajustes groseros con el macrométrico para enfocar. GRÁFICOS Reconocimiento de las partes del microscopio.

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CONCLUSIÓN  Los individuos que trabajan en el laboratorio, corren el riesgo de infección, por lo que se debe adoptar un conjunto de normas de seguridad que sirven para reducir a un nivel aceptablemente bajo el riesgo inherente a la manipulación de todo el material peligroso, sea físico o químico o biológico.  Entre los materiales de laboratorio más importantes y que serán utilizados en el laboratorio son: portaobjetos, asa bacteriológica, lámpara de alcohol; equipo de laboratorio: autoclave, cronómetro, incubadora y microscopio.  Las Normas de Bioseguridad tiene en consideración la protección de la integridad del individuo con el fin de mantener seguro las instalaciones disponibles, el equipo, las prácticas y los procedimientos necesarios en contra de la exposición de posibles microorganismos o agentes patógenos.  Los elementos mínimos que componen el microscopio óptico son una lente objetivo y otra ocular que produce imágenes ampliadas. Además del sistema óptico de lentes, los microscopios ópticos poseen un sistema de soporte, un sistema mecánico de ajuste y un sistema de iluminación. El principio de funcionamiento del microscopio óptico es el de utilizar dos juegos de lentes convergentes que se encuentran situados en los extremos de un tubo para amplificar una imagen. CONCEPTOS BÁSICOS Asepsia: Ausencia de microorganismos patógenos. Microorganismos Patógenos: Es causante de enfermedad. Contaminación: Presencia de agentes infecciosos vivos en la superficie del cuerpo, prendas de vestir o artículos sucios (no constituye infección). Infección: penetración y desarrollo o multiplicación de un agente infecciosos en el organismo de una persona o animal. Enfermedad infecciosa: Enfermedad clínicamente manifiesta del hombre resultados de una infección. Asepsia médica: Normas ideadas para reducir el número de transmisión de microorganismos patógenos, ej.: lavado de manos. Desinfección: proceso por el que se da muerte a microorganismos patógenos pero no necesariamente a sus esporas, aplicado sobre un objeto inanimado (inerte). Desinfectante: Sustancia empleada para la desinfección, ej.: alcohol yodado, sablón. Antisepsia: Proceso de lisis o inhibición del crecimiento bacteriano sobre la superficie de tejidos vivos. Antiséptico: Sustancia empleada para la antisepsia. Por lo general su uso es inocuo en las personas ej.: alcohol 70°, agua oxigenada. Espora: Microorganismos que en determinadas circunstancias producen una especie de cápsula que le permite pasar por una fase de inactividad, que

más tardeen situaciones adecuadas recuperan su actividad, ej.: Clostridium tetan, causante del tétanos. Limpieza: Es la remoción mecánica de toda materia extraña en el ambiente, en superficies y objetos utilizando para ello el lavado manual o mecánico. Normalmente se usa agua y

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA detergente para este proceso. El propósito de la limpieza es disminuir el número de microorganismos a través de arrastre mecánico y no asegura la destrucción de éstos. Bactericida: Sustancia química que elimina todas las bacterias, patógenas y no patógenas, pero no necesariamente las esporas bacterianas. Bacteriostático: Sustancia química que previene el crecimiento de bacterias, pero no necesariamente las destruye. En muchas ocasiones la diferencia entre bactericida y bacteriostático únicamente depende de las condiciones de aplicación: tiempo, temperatura, pH. CUESTIONARIO. 1. Cite 5 normas de bioseguridad de mayor importancia en el laboratorio de microbiología. 2. Verdadero o Falso Entre los materiales y quipos más utilizados de microbiología tenemos: Cucharón, espátula, asa bacteriológica. ( ) Lámpara de alcohol, autoclave, incubadora. ( ) Varilla, cucharón y portaobjetos. ( ) Portaobjetos, asa bacteriológica, microscopio. ( ) 3. Observar al Microscopio asignado y rotular adecuadamente el gráfico siguiente:

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PRACTICA #2 MORFOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS OBJETIVOS  Definir las características de las formas bacterianas, describiendo sus respectivas agrupaciones, microscópicamente.  Identificar los aspectos fundamentales de la morfología bacteriana macroscópicamente. INTRODUCCION Entre las principales características de las bacterias se encuentran, su tamaño, forma, estructura, y tipo o modo de agrupación. Todas estas características van a constituir la morfología propia de las células bacterianas. Las bacterias son de pequeño tamaño, por lo que para su observación es preciso utilizar el microscopio óptico. Su tamaño se mide en µm (0.000001) y oscila entre 0,2 y 2 µm. La morfología nos da una información primaria sobre el tipo de bacteria, pero no de forma concluyente. Las formas básicas son: esférica (coco), bastoncillo o cilíndrica (bacilo), helicoidal (espirilo), en forma de coma (Vibrio), espiral (espiroqueta), estrella y cuadrangular. Tabla 8. Morfología Bacteriana

Morfología Bacteriana Formas

Descripción Micrococcus Dispuestos de manera individual y separados de unos de los otros. Diplococos

Cocos Forma Esférica Esferoides, ovoides, lanceolados ,

Son cocos dispuestos en parejas. Ejemplo: Neisseria meningitidis

Gráfico

reniformes.

Estreptococos Son cocos dispuestos en cadenas. Ejemplo: Streptococcus pyogenes Tétrada

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Son cuatro cocos agrupados Sarcina Es la Agrupación de 8 cocos en forma de cubo. Ejemplo: Micrococcus. Estafilococos Son agrupaciones de cocos en racimos irregulares. Ejemplo: Staphylococcus aureus. Diplobacilos Bacilos en parejas Estreptobacilos

Bacilos en cadenas Bacilos Forma alargada Rectos, ahusados, ramificados , curvos, espirales.

Empalizada.

Cocobacilos. Extremos en Maza. Extremos Redondos. Extremos Cuadrados. Fusiformes.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Espirilo.

Vibriones. Helicoidale s También llamadas espirales, son las espiroquet as que tienen espiras flexibles y ondulantes .

Borrelia.

Treponema.

Leptospira.

Estructuras Externas de las Bacterias Una célula bacteriana típica presenta una serie de estructuras fuera y dentro de su pared celular. No todas las estructuras se encuentran en todas las bacterias, pero alguna si son comunes. En el exterior de una célula bacteriana pueden encontrarse tres tipos de estructuras: los flagelos, los cuales permiten la movilidad o locomoción, los Pili también llamados fimbrias, pequeños “pelos” con funciones diversas y la cápsula, que es una capa mucoide que rodea a la célula. Flagelos Una bacteria puede tener uno o más flagelos, y la localización de este último en la célula puede varias, dependiendo de la especie bacteriana. Si los flagelos se localizan en un extremo o en ambos extremos de la bacteria, reciben el nombre de flagelos polares. Si se presentan un solo flagelo, la bacteria se denomina monotrica; si posee dos o más flagelos en solo uno de los extremos, se llaman lofotrica; si posee dos o más flagelos en ambos extremos, reciben el nombre de anfitricas; y si posee flagelos en toda la superficie se denominan peritricas.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Tabla 9. Disposición de los Flagelos.

Disposición de los Flagelos Monotric as

Anfitricas

Lofotricas

Peritricas

Pilis o Fimbrias Apéndices diminutos, también filamentosos, rectos y cortos, distribuidos por toda la superficie, y le permiten a la bacteria la transferir material genético (Pili sexual), otros sirven para adherirse a las superficies.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Cápsula La Cápsula está formada por una sustancia viscosa, en sí polisacáridos segregados por la célula bacteriana, sirven para proteger a la bacteria de la desecación, la protege de virus bacterianos y de los efectos de metales pesados que le son tóxicos.

Colonias Bacterianas. Una colonia es una agrupación de bacterias, que se desarrollan en un medio propicio con nutrientes. Forma de las Colonias Según el espesor, se dividen en: planas, elevadas, semiconvexas, cóncavas, semicóncavas, semiesféricas, en meseta. Según los bordes, se dividen en: lobuladas, onduladas, rizoides, redondeadas, filamentosas, espiculadas. Superficie de Colonia Corresponde al aspecto de la colonia y se dividen en: – Lisa, rugosa, acuminada, mucosa, seca, es importante diferenciarlas, ya que éstas suelen presentar cápsulas según su superficie lisas o rugosas, donde las segundas suelen presentar cápsulas u otros componentes superficiales que proporcionan un aspecto más compacto o rugoso, relacionando este tipo de bacterias con una mayor virulencia. Consistencia de la Colonia Las colonias pueden ser duras, viscosas, mucosas, secas, muy secas, cremosas, etc. Las colonias mucosas, son muy típicas de levaduras y menos frecuentes en bacterias. En general, la mayor parte de las bacterias producen colonias de consistencia más o menos mantecosa, aunque existen excepciones.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. MATERIALES  Portaobjetos.  Cubreobjetos.  Palillos.  Lámpara de alcohol.  Guantes.  Mascarilla.  Mandil. Equipo Microscopio.

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MEDIOS Y REACTIVOS  Aceite de Inmersión.  Suero Fisiológico.  Muestra de Heces. PROCEDIMIENTOS Para poder realizar diferenciar la morfología bacteriana, es necesario realiza un frotis en fresco, el cual es un método de observación in vivo de bacterias, el cual se realiza de la siguiente manera. 1. Utilizar los guantes, mascarilla, mandil. 2. Encender la lámpara de alcohol, disponer la muestra de heces atrás de la lámpara encendida. 3. Disponer el portaobjetos delante de la lámpara de alcohol, colocando una pequeña gota de suero fisiológico. 4. Con ayuda de un palillo sacar una pequeña muestra de heces detrás de la lámpara de alcohol, y extender encima de la gota de suero fisiológico, emulsionando la muestra. 5. Colocar un portaobjetos encima del frotis en fresco, y llevar a observar al microscopio, y dibujar en una hoja bond las bacterias. 6. Si se requiere observar con mayor detenimiento amplificando más la imagen usar el aceite de inmersión. GRÁFICOS Realización del frotis en fresco. Emulsión de la muestra de heces con la gota de suero fisiológico.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Tabla 10. Ejemplos de la Morfología y Agrupaciones de las bacterias en la Observación al Microscopio

Morfología y Agrupaciones de las Bacterias Cocos Grampositivos

Staphylococcus

Micrococcus

Streptococcus

Neumococo

Peptococcus Cocos Negativos

Peptostreptococcus

Neisseria

Moraxella Bacilos Grampositivos

Acinetobacter

Corynebacterium

Propionibacterium

Listeria

Lactobacillus

Bacillus

Clostridium

Actynomices

Nocardia Bacilos Gramnegativos

Borrelia

Gardnerella

Haemophilus

Brucella

Enterobacterias

Pseudomonas

Vibrio

Campylobacter

Bacteroides

Fusobacterium

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CONCLUSIÓN  Los cocos se agrupan en parejas (diplococos), en cadenas más o menos largas (estreptococos), en racimos (estafilococos), y en tétradas o paquetes cúbicos (micrococos), los bacilos se agrupan en parejas (diplobacilos), raramente en cadenas (Estreptobacilos), en empalizada, letras (X,L, V) y caracteres chinos (corinebacterias); los espirilos suelen agruparse pero pueden distinguirse formas con una sola curvatura, semejantes a una coma (vibrios), y con varias curvaturas y aspecto ondulado (campilobacterias). Algunas bacterias presentan un gran polimorfismo; otras, formas filamentosas y ramificadas semejantes a micelios de hongos (actinomicetos), unas pocas, formas largas, finas o gruesas, enrolladas en espiral (espiroquetas).  El frotis directo obtenido por disolución de una partícula muy pequeña de heces en una gota de agua o de solución fisiológica, constituye un método sencillo y rápido de examen de parasitología (protozoarios, huevos de tenia) más no de bacteriología.  La morfología y agrupaciones típicas de las bacterias solamente se observan cuando las células son jóvenes. En los cultivos o cuando las bacterias están sometidas a condiciones desfavorables, surgen las llamadas formas de involución: los cocos se hinchan, los bacilos se curvan o parecen ramificarse y las estructuras internas desaparecen. CUESTIONARIO 1. Elabore un mapa conceptual acerca de la distinta morfología bacteriana de los cocos. 2. Cite ejemplos de géneros bacterianos de Cocos Grampositivos. 3. Esquematice la diferente disposición de los flagelos en una bacteria.

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PRACTICA #3 DESINFECCION Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES OBJETIVOS  Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización de vidrios de uso común en Microbiología.  Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el laboratorio. INTRODUCCION Todo material que va a ser utilizado en el laboratorio de microbiología deberá cumplir una serie de condiciones entre ellas, y de forma esencial, una total asepsia del material que se va a utilizar, aunque no siempre es estrictamente necesario. Esto dependerá de las prácticas que se realicen en cada momento. Así pues, en todo laboratorio de microbiología se deberá tener en cuenta que:  Todo material utilizado para la recogida de cualquier tipo de muestra que posteriormente será procesada ene laboratorio deberá estar totalmente esterilizado.  Todo material utilizado para la realización de las pruebas oportunas (placas petri, tubos de ensayo, medios de cultivo, pipetas, asas de siembra), en un laboratorio de microbiología deberá estar estéril.  Es fundamental que todo material que tenga que estar en contacto con un gérmen problema esté estéril.  Antes de cualquier esterilización, el material deberá estar limpio y/o desinfectado.  Conviene, si es económicamente viable, utilizar material desechable.  En el laboratorio de microbiología, el material de uso aséptico deberá guardarse separadamente del de uso séptico.  La manipulación de todo material y/o muestra deberá ser la adecuada siguiendo el protocolo de trabajo preciso, teniendo en cuenta las medidas cautelares para la prevención de accidentes laborales.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Bioseguridad “Conjunto de procedimientos y normas para conservar la salud de las personas con actividad de riesgo para adquirir enfermedades”. Para aislar un microorganismo de un proceso infeccioso es necesario inocularlo en un sistema estéril. La Desinfección y la Antisepsia Son elementos claves en cada una de las actividades en que se desarrolla un acto médico. Esterilización Es la condición de estar libre de microorganismos en cualquiera de sus formas puede realizarse por métodos físicos y químicos. Es un estado absoluto de pureza. Desinfección Es la eliminación selectiva de ciertos microorganismos indeseables a fin de impedir su transmisión por interferencia en su estructura o metabolismo. Es selectiva y se aplica a objetos inanimados o superficies. En general se usan agentes químicos desinfectantes o germicidas. Antisepsia Es el uso de una sustancia química, no tóxica (antiséptico) sobre tejidos vivos, para prevenir o detener el crecimiento o la acción de los microorganismos, ya sea inhibiendo su actividad o destruyéndolos. Asepsia Estado libre de microorganismos. Métodos de Esterilización Físicos Calor. Radiaciones. Filtración. Ultrasonido. Químicos Distintas sustancias: como óxido de etileno, glutaraldehído y formaldehído. Mecanismos de Acción 1.

Alterando el ADN. Radiaciones como UV, ionizantes. Alquilantes, como el glutaraldehído, formaldehido y óxido de etileno.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA 2. Alterando las proteínas y enzimas. Calor, ácidos y álcalis. Oxidantes, como el peróxido de hidrógeno y Iodo. Metales pesados, como el mercurio. 3. Alterando la membrana celular. Mediante el uso de: Alcoholes. Fenoles. Agentes Tenso-activos, como amonios cuaternarios, jabones y detergentes. Factores que afectan la potencia desinfectante 1. Tiempo 2. Temperatura 3. PH 4. Concentración del agente. 5. Presencia de Materia Orgánica 6. Características del Microorganismo. Esterilización Físicos Calor Seco: Incineración. Flameado. Aire caliente. Húmedo: Vapor. Fluente. A presión. Tindalización. Aire Caliente Horno de Pasteur o Estufas Material de Vidrio, metales, objetos termoestables, a una temperatura de: 160°C X 2 hs 170°C X 1 hs 180°C X 3 min Calor Húmedo Autoclave Vapor Fluente:

100°C X 30 min, para sustancias termolábiles a más de 100°C.

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Vapor a Presión: Más utilizado y más seguro: Todo tipo de material de laboratorio como medios, instrumental, ropa. 121°C X 15 min 134°C X 7 min Las temperaturas alcanzadas son: 1 at: 121°C; 1,5 at: 126°C y 2 at: 134°C. Agentes Químicos Desinfectantes: Alcohol. Fenol. Jabones. Detergentes catiónicos. Soluciones cloradas. Ácidos y Álcalis. Formaldehído. Antisépticos: Alcohol Etílico al 70%. Clorhexidina. Jabones. Detergentes. Soluciones Yodadas. Metales Pesados. Peróxido de Hidrógeno 3-6%. Fenoles y Derivados Actúan en presencia de materia orgánica. Al 5% excelente desinfectante para Mycobacterium tuberculosis, es de olor muy picante y tóxico. Alcoholes Etílico o isopropílico al 70%. Concentraciones menores al 45% tienen una actividad incierta. Desinfección y antisepsia 2 minutos de contacto mata casi al 90% de los microorganismos cutáneos. Clorhexidina Potente antiséptico para G+ y G-.

Actúa en presencia de materia orgánica. Puede utilizarse en solución acuosa o alcohólica al 1%.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Detergentes catiónicos (amonios cuaternarios) Mayor actividad a PH alcalino. No son esporicidas, ni tuberculicidas. En la actualidad las Pseudomonas son refractarias. Su acción es interferida por la presencia de materia orgánica, y son neutralizados pro jabones y detergentes aniónicos. Se usan como “desinfectantes” (saneamiento ambiental). Cloro y Compuesto El más usado: Hipoclorito de Na. Se usan como “desinfectantes” de superficie de instrumentos de laboratorio, en solución acuosa, material contaminado 1/10, sino al 0.3%. Inestable, las soluciones se deben preparar en el momento y proteger de la luz y el calor. Iodo y Compuestos Para antisepsia de heridas y piel. Peróxido de Hidrógeno Se utiliza al 3-6%. Solución madre al 30%, a partir de aquí se hace la solución final. Se debe preparar antes de usar. Guardar en frasco caramelo. Para antisepsia de heridas y desinfección (dispositivos médicoquirúrgicos y lentes de contacto blandos) Formaldehído Se presenta comercialmente en solución acuosa al 40%, a partir de ella se realiza la solución final al 3 u 8 % según su uso. Formalina al 8% esporicida, no menos de 18 hs. A temperatura ambiente. Para “desinfección” (laboratorio, instrumental, guantes). Preparación de vacunas al 0,2% - 0,4%. Los materiales deben seguir el mismo tratamiento que para el óxido de etileno y glutaraldehído. MATERIALES Portaobjetos. Hisopos. Paletas o baja-lenguas. Pipetas de 10 ml. Cajas Petri. Papel de Empaque. Piola de algodón. Matraz Erlenmeyer. Vaso de Precipitación. Equipo

Autoclave.

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MEDIOS Y REACTIVOS Hipoclorito de sodio. (NaClO). Agua destilada (H2O) PROCEDIMIENTOS 1. Revisar que la válvula de seguridad del autoclave funcione normalmente. 2. Proceder a colocar una cantidad necesaria en el recipiente del autoclave, seguidamente colocar la rejilla base de la olla que sostendrá los materiales que se pretenden esterilizar. 3. Con ayuda de papel de empaque, y piola de algodón, proceder a envolver cada uno de los materiales a esterilizar. 4. Colocar todos los materiales envueltos en la olla del autoclave. 5. Colocar la tapa del autoclave encima de la olla que contiene los materiales. 6. Tomando en cuenta la seguridad del autoclave, cerrar las válvulas a la par, es decir cada válvula del lado contrario se cerrarán dos a la vez. 7. Encender el autoclave vertical y esperar a que comience a subir la temperatura. 8. Revisar que la válvula de seguridad se encuentre en perfecto estado, y que el registro de presión sea de 15 libras de presión durante 30 min. 9. Colocar los materiales dentro del autoclave horizontal, y abrir la compuerta. 10. Guardar los materiales en el autoclave horizontal y cerrar la puerta. 11. Encender el autoclave y revisar que la presión y la temperatura se mantengan constante. 12. Verificar que la presión del autoclave horizontal sea de 15 lb de presión por 30 min. 13. Una vez que ambos autoclaves ya llegaron a la presión y temperatura óptima de esterilización, dejar reposar y esperar a que el vapor interno se disipe. Una vez que haya toda la seguridad de haber extraído la mayor parte de vapor, abrir el autoclave y sacar los materiales empaquetados. 14. Una vez que se requiera de algún material de laboratorio se buscará en los estantes de materiales, y durante la práctica si se va a utilizar en ese momento se sacará el material del empaque y se trabaja solo con el material esterilizado.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA GRÁFICOS Tabla 11. Procedimiento de esterilización de Materiales de Laboratorio.

Procedimiento De Esterilización De Materiales De Laboratorio Paso N° 1 Paso N° 2

Paso N° 3

Paso N° 4

Paso N° 5

Paso N° 6

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Paso N° 11

Paso N° 7

Paso N° 8

Paso N° 9

Paso N° 10

Paso N° 12

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Paso N° 13

Paso N° 14

CONCLUSIÓN  Todo material antes de ser ingresado en el autoclave debe ser sanitificado o higienizado, y debe ser sometido a una temperatura de 120°C por 15 libras de presión: 15 min, y es una de los métodos más eficaces.  La ebullición de 100°C destruye a muchas células vegetativas y virus en el plazo de 10 min, además de la esterilización por medio del autoclave, existe el mecanismo de pasteurización, en la cual se usa una temperatura elevada y después se la baja súbitamente a temperaturas bajas.  La esterilización es un estado absoluto, y no relativo, para realizarla se la puede realizar utilizando vapor, en este caso calor húmedo, en la cual para poder desorganizar a las proteínas que forman parte de la pared de peptidoglucano de las bacterias, es gracias a la presión que actúa de manera negativa sobre la superficie bacteriana.  La presión del autoclave al principio debe ser purgada liberando las primeras cantidades de aire comprimido y cerrando la válvula de control,

para así una vez que alcance su temperatura óptima, se proceda a apagar y dejar reposar hasta que se libere el vapor

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA contenido, porque se basa en la relación inversamente proporcional de que: “A mayor temperatura, menor tiempo necesita un material en el autoclave para ser esterilizado”.  En relación con los materiales de vidrio, estos se proceden a lavar con un agente químico, en este caso hipoclorito de sodio (NaClO), para desinfectarlos, y reducir el número de microorganismos presentes en ellos, y se los seca con toallas desechables. CUESTIONARIO 1. ¿Qué tipos de sustancias son utilizadas en el proceso de esterilización? 2. ¿Cuáles son los mecanismos de Acción de los Antimicrobianos? 3. ¿Cuál es el concepto de la palabra Antiséptico, y Desinfección?

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PRACTICA #4 MEDIOS DE CULTIVO OBJETIVOS: • Conocer la clasificación, preparación, esterilización y distribución de los mediosde cultivos. • Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparación delmedio de cultivo en la práctica microbiológica médica. • Adquirir práctica en el preparado de algunos medios de cultivo a partir de suscomponentes individuales. • Reconocer la necesidad de evitar la contaminación tanto de los medios decultivo como de los elementos utilizados en el laboratorio demicrobiología médica. INTRODUCCIÓN Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razónpor la cual es difícil aislarlas. A menudo nuestro interés es caracterizar una especiebacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a lamisma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremosexaminando los medios de cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otroscomponentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de losmicroorganismos. Es decir, es cualquier “medio” que proporcione substanciasnutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidadmetabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios decultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todosellos. El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos esfundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el habitad o ambiente natural en el que se desarrollan. Las características de los microorganismos a tener en cuenta al momento depreparar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son:  Tipo trófico: se refiere a los requerimientos de carbono y energía, según los cuales se los clasifica en autótrofos, heterótrofos, quimiotrofos (litotrofos u Organotrofos) y fototrofos.  Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerófilos.

 Temperatura óptima de crecimiento: según el rango de temperatura al cual cada microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en sicrófilos, mesófilos y termófilos.  Rango de pH: en general el rango óptimo de pH para la mayoría de las células bacterianas oscila entre 6,6 y 7,2.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU ORIGEN Los medios de cultivos pueden clasificarse en:  Naturales: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo: agua, suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc.  Artificiales: Están compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre en el laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en: sintéticos y complejos. Un medio del cual se conoce exactamente su composiciónquímica se denomina sintético o químicamente definido; puede ser una simplesolución de sales con una fuente de carbono o puede contener muchos compuestos orgánicos. Un medio no sintético o complejo es aquel del que sedesconoce su composición química exacta; se trata básicamente de extractos detejidos vegetales, animales o microbianos, cuya concentración no se conoce conexactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios, como por ejemplo el caldo nutritivo. Clasificación de los Medios ARTIFICIALES COMPLEJOS según su Finalidad Medios Artificiales I. COMUNES Complejos II. ESPECIALES II.a. Enriquecidos II.b. Selectivos II.c. Diferenciales

I. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos,como el caldo carne y agar carne. II. Medios especiales: se los clasifica según su finalidad. II.a Medios enriquecidos o mejorados: se obtienen a partir de un medio común, conel agregado de elementos nutritivos elegidos según las necesidades. Se menciona a la sangre, albúmina, yema de huevo etc. Se utilizan para el cultivo de microorganismosexigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales. Se citan como ejemplos elagar sangre y el agar chocolate. II.b Medios selectivos: Estos medios han sido modificados de alguna manera paraque, en una flora mixta, permitan el desarrollo de determinadas especies y al mismotiempo inhiban la proliferación de la flora acompañante. Para esto último se buscaestablecer condiciones desfavorables de pH, nutrientes y de temperatura, o por elagregado de inhibidores. El agar Saburaud es un ejemplo de medio selectivo, en el que el pH de 5,6 favorece eldesarrollo de hongos al mismo tiempo frena el desarrollo de la mayoría de lasbacterias. Ejemplos de sustancias inhibidoras son algunos colorantes (cristal violeta, verdebrillante), los antibióticos, el alcohol fenil etílico y la azida de sodio. II.b.1 Medios selectivos para enriquecimiento: Son medios en que losmicroorganismos crecen en libre competencia, viéndose favorecidos aquellos para loscuales las condiciones de desarrollo son las más apropiadas,

no llegándose a microorganismos.

inhibirtotalmente

el

crecimiento

del

resto

de

II.b.2 Medios selectivos para aislamiento: son medios selectivos sólidos, se utilizanpara sembrar directamente con la muestra incógnita o a partir del medio de cultivo selectivo paraenriquecimiento.

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II.c Medios diferenciales: permiten el desarrollo de muchas de las especies quecoexisten en una mezcla que se desea aislar. Aunque dos o más tipos demicroorganismos pueden crecer en este medio, algún elemento presente en él permitediferenciarlos, por ejemplo un indicador. Estas diferencias se basan en algunapropiedad bioquímica que unos poseen y otros no. Un ejemplo de este tipo es el agarcon eosina azul de metileno que diferencia Escherichiacolide Enterobacteraerogenes, sobre la base de la diferencia de color de sus respectivas colonias. Cuando se cultivan ambas especies sobre agar nutritivo, forman colonias de colorblanco grisáceo. Sin embargo en agar con azul de metileno las colonias de E. colisonoscuras y con brillo metálico, en cambio las colonias de E. aerogenesson rosadas conun centro azul y rara vez presentan brillo. En su mayor parte los medios diferenciales son asimismo selectivos, por el agregadode agentes que inhiben el crecimiento. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE UN BUEN MEDIO DE CULTIVO Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos losnutrientes indispensables en la concentración adecuada, cantidad necesaria desales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estéril y que nocontenga sustancias inhibidoras. Como ya se ha señalado, la provisión de elementos nutritivos en concentraciónadecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrolloen el hábitat natural. La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relacionadirectamente con el pH, la fluidez y la presión osmótica que se le quiera brindar a cada uno de los microorganismos y sus colonias. En función de la consistencia se puede clasificar a los medio enlíquidos y sólidos. Enel laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma líquida, en cuyocaso se los denomina caldos, o en forma sólida si se le agrega agar al caldo. En cuanto a la esterilización, este procedimiento garantiza la destrucción de todos losmicroorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparacióndel medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al autoclave (121 ºC, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibióticos y compuestos fácilmente oxidables al calor, se los esteriliza por separado por otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado cuando se haya enfriado a 500C. En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar comoinhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Los elementos citados a continuación, son los más frecuentemente usados en lapreparación de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los únicos e inclusoalguno de ellos puede estar ausente de la preparación.  Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento.  Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacárido, al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98 °C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42 °C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación. Con la excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12- 18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3%.  Extractos. Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hígado, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrógeno y carbono.  Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad química definida; se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteasas,peptonas,polipéptidos y aminoácidos.  Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambiéncon sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.  Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano.Los microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH.  Indicadores de pH. Indicadores ácido- base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.

 Agentes reductores. Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que seañaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollode los gérmenes microaerófilos o anaerobios.  Agentes selectivos. La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo (ver más adelante, clasificación de los medios de cultivo). Por ejemplo,

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivosfrente a determinados microorganismos.

PREPARACIÓN En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados,normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, lapreparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidaddeseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones delfabricante y luego esterilizarlo. En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparación de unmedio de cultivo comienza por hacer un estudio de la fórmula que constituye unareceta que deberá respetarse estrictamente. Primero se agrega agua destilada o desionizada a un recipiente, luego se vanincorporando todos los ingredientes de la lista en el orden en el que se encuentran. Generalmente figura en primer término el compuesto que actúa como tampón, comopuede ser el PO4H2K, que además provee fósforo y potasio. Es conveniente añadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de auno antes de agregar el siguiente. Al finalizar la preparación y una vez que ésta se enfríe, se debe verificar que el pH seael adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N).

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Preparación de medios de cultivo Materiales: Erlenmeyer Pipetas de 10 ml Tubos de ensayo con sus tapones Gradillas Tiras de pH Drogas correspondientes a cada fórmula Balanza Autoclave A. Caldo nutritivo (Caldo carne) Es el medio complejo más común para el cultivo de microorganismos. Fórmula: Peptona.................... 5 ............. g Extracto de carne.... ……………...... 3 g Agua c.s.p.................……………… 1000 ml pH................................. ………. 7,2

Preparación: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)

Colocar un volumen medido de agua destilada en un recipiente. Disolver los ingredientes de a uno y por orden. Llevar a ebullición agitando periódicamente con una varilla de vidrio. Completar el volumen hasta 1000 ml. Dejar enfriar y medir pH. Si hace falta corregir con HONa 1M. Colocar 10 ml del caldo en tubos de ensayo y volúmenes apropiados en frascos. Tapar, colocar capuchón de papel y esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm.

B. Agar nutritivo Fórmula: Agar......................... 20 ............. g Caldo nutritivo.....……………... 1000 ml.

Preparación: 1) 2) 3) 4) 5)

Colocar 1000 ml de caldo en un recipiente. Agregar el agar calentando a baño maría agitando hasta disolución total. Ajustar pH hasta 7,2. Llevar 10 ml a tubos de ensayo. Esterilizar.

Cuando se prepara agar nutritivo no es necesario usar caldo estéril, la esterilización selleva a cabo una vez que se ha envasado el caldo compuesto agarizado.

Se prepararán tubos con agar inclinado o en pico de flauta (slant), para ello secolocan 5 ml del agar en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan. Una vez afuera del autoclave, cuando están aún líquidos, se apoyan sobre la mesada con un ciertoángulo hasta que solidifiquen.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Se prepararán también tubos con agar para punción. En este caso, una vez que lostubos fueron retirados del autoclave se dejan solidificar en posición vertical. Por último se prepararán cajas de Petri con agar nutritivo. Para ello se puede utilizarmedio de cultivo recién esterilizado y todavía líquido, o bien medio solidificado yfundido a ebullición en Baño María. Se deja enfriar el agar hasta 45ºC, luego se lovuelca asépticamente en caja de Petri estéril, teniendo la precaución de flamearpreviamente la boca del tubo o recipiente a la llama del mechero. Se deja solidificar en posición horizontal

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PRACTICA #5 AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE BACTERIAS AEROBIAS OBJETIVO Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra y aislamiento de microorganismos bacterianos. INTRODUCCIÓN. En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menoscomplejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismosque dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservaciónque se requiera. Para ello existen técnicas de siembra, conservación y mantenimientode los cultivos microbianos. Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros, a partir delos cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poderobtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento. SIEMBRA Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicación, sise incuba en condiciones adecuadas, un tiempo conveniente. Para ello una pequeña porción de cultivo o muestra, que se denomina inóculo setransfiere al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar laintroducción de otros microorganismos ajenos al inóculo. El conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta, se conoce comotécnica aséptica. PROTOCOLO DE TOMA DE MUESTRA/INOCULO La toma del inóculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente: 1) La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar bienpuertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad y sin hablar. 2) Coloque frente a usted el mechero y la preparación o muestra que contiene losmicroorganismos, así como el resto del material necesario (portaobjetos,tubos,placas). Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos. 3) Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un mechero.

4) El ansa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo (flaméelo hasta que alcance un rojo incandescente) y antes de retirar el inóculo debe facilitarse su enfriamiento, a fin de evitar el deterioro del material a sembrar (enfríelo en laproximidad de la llama unos 10 segundos).

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA 5) Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el ansa o aguja a la llamadel mechero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo. 6) Nunca debe depositarse un tapón sobre la mesada o gradilla, pues estos elementos están cargados de microorganismos. Cuando esté destapado, mantener el tubo en la forma más horizontal posible para evitar que los microorganismos del ambiente, en su caída, tengan acceso alinterior. 7) Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde serán transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de que el ansa o aguja sea introducida (Figura 1). También se debe flamear la boca del tubo antes de taparlo. Este procedimiento fija al vidrio los microorganismos que pueden estar en dicha boca y tiende a crear corrientes haciaafuera (el aire tiende a salir), disminuyendo así el riesgo de contaminación. 8) Para retirar el inóculo o sembrar medios de cultivos en cajas de Petri, coloque la placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llévela a la proximidad de la llama del mechero y tome el inóculo con el ansa de siembra. Otro método permitido consiste en retirar el inóculo o sembrar, levantando la tapa solo lo suficiente para permitir la introducción del ansa o aguja, para evitar que los microorganismos ambientales sedepositen en la superficie del medio. 9) Si la siembra se realiza con pipeta, ésta debe estar convenientemente preparada yesterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se descarta introduciéndola en una solución antiséptica. 10) Transfiera el inóculo a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en laproximidad de la llama, etc.) La finalidad de una siembra puede ser la de realizar una transferencia o unaislamiento. La primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana), yasea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie, o bien paraconocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas. El aislamiento, encambio, se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especiesbacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros.

TOMA DEL INÓCULO.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Si la muestra proviene de un medio líquido, el inóculo se toma agitando el suavementeel ansa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión superficial en elextremo del filamento del ansa de siembra. Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (caja de Petri),tome una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el ansa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico deflauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de lamisma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el soporte necesario. TRANSFERENCIA. La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipode recipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos: A) Siembra de medio líquido a medio líquido: El procedimiento se puede realizarcon ansa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos. B) Siembra de medio sólido a medio líquido: El procedimiento se puede realizarcon ansa en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos. C) Siembra de medio sólido a medio sólido: El procedimiento se puede realizar con ansa o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en cajade Petri, en superficie. D) Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se puede realizar con ansa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o enprofundidad o en caja de Petri, ya sea en superficie o por homogenización.

Técnica de transferencia en tubos de ensayo. Técnica para medio líquido Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene losmicroorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a lamisma altura. Se sostienen con los dedos índice, medio y anular apoyándolos en el dedomeñique, y se los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir lavisualización de toda la superficie del cultivo. Con los dedos pulgar e índice (como un lápiz) de la otra mano, se toma la pipetaestéril o el mango de Koll con su aguja o ansa en anillo y se esteriliza. Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el ansa, de lasiguiente manera: el tapón del tubo más alejado del operador (que es el quecontiene la muestra) entre el dedo meñique y la palma de la mano; el tapón del tubomás cercano al operador (que contiene el medio de cultivo estéril) entre el meñiquey el anular.

Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inóculo; se siembra; se flameannuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias delos tapones y se quema el ansa. Como el inóculo procede de un medio líquido, antes de realizar la transferencia sedebe agitar el tubo para poner en suspensión a los microorganismos que pudieranestar depositados. Si la

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA siembra se realiza en medio líquido, se agita el tubosembrado para distribuir homogéneamente el inóculo.

Para realizar la agitación se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedosíndice y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo índice dela otra mano con una amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer rotar los tubosentre las palmas de las manos.

Técnicas para medio sólido. Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido, se puede sembrar en superficie, enprofundidad o en profundidad y superficie. En superficie: Por estría: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinadohasta el fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que seacumula en esa parte, luego mover el ansa suavemente sobre la superficie delagar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Por trazo: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado ytrazar una línea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremosuperior, sin ejercer presión para que no se rompa el medio.

En profundidad: Por punción: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo enforma vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con elinóculo rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. Lapunción se realiza en el centro del medio o excéntricamente.

En profundidad y superficie: Por punción y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinadopero con mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, sepunza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta.

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Técnica de transferencia en caja de Petri. La siembra en caja de Petri, puede hacerse: En superficie Por estría central: Se levanta la tapa lo suficiente comopara permitir la introducción del ansa con la carga demicroorganismos, iniciándose la estría en el borde del mediomás alejado del operador y se la extiende hasta llegar alcentro de la placa, luego se gira ésta 180 º y se continúarealizando otra estría de la misma manera. Esta divisiónevita el obstáculo del borde de la placa.

Por estría en cuadrantes: Se divide la caja en cuatrosectores y se siembra en estría cada uno de ellos, partiendodel borde de la caja hacia el centro. El cuadrante a sembrardebe ser el más alejado del operador y el inóculo en cadacaso puede ser el mismo (la misma especie) o distinto(diferente especie) para cada cuadrante. Por diseminación con espátula de Drigalsky: Se depositasobre el medio sólido contenido en la placa, una ansada ouna gota con pipeta del material a sembrar, que luego seextenderá por toda la superficie del medio con una espátulade DRIGALSKY. La espátula se introduce inmediatamente después de suuso en un recipiente para su esterilización en autoclave oen formaldehído al 5 %. Por diseminación con hisopo: Se sumerge en el caldo decultivo, se escurre el exceso de líquido sobre la pared interiordel tubo y se estrían ambas mitades de la placa de Petri,partiendo de los bordes hacia el centro, luego se gira 90º yse estrían nuevamente ambas mitades, finalmente se gira45º y se estrían ambas mitades. Por homogeneización:

Técnica de la siembra en tubo para volcar en placa: Elinóculo se introduce con el ansa o pipeta en un tubo con elmedio de cultivo fundido y enfriado a 45 ºC en cantidadsuficiente para cubrir la placa de Petri. Se homogeneiza porrotación y se vuelca en la placa previo flameado de la boca deltubo.

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Técnica del agar volcado: Se deposita el inóculo con pipeta enel centro de la caja de Petri y luego se vuelca sobre el mismo elmedio de cultivo fundido y enfriado a 45ºC. Se homogeneiza porrotación para lo cual se le imprime a la caja movimientoscirculares, en sentido horario y en sentido anti-horario ymovimientos rectilíneos, horizontales y verticales.

Se debe tener en cuenta que de las cajas de Petri preparadas conmedio de cultivo para sembrar, debe eliminarse el agua desinéresis (condensación) antes de efectuar dicha operación. Paratal fin es aconsejable preparar las placas con 24 hs. Deanticipación y dejarlas invertidas a temperatura ambiente.

AISLAMIENTO. El objeto es obtener cultivos en estado puro, operación imprescindible y previa alestudio e identificación de una especie bacteriana. Se pueden realizar aislamientos por métodos generales y por métodos especiales.

Métodos generales de aislamiento. Estos métodos utilizan medios de cultivos sólidos en caja de Petri. Por diluciones sucesivas: Se homogeneiza la muestra y se cargael ansa por única vez. Luego se pasa el ansa de un tubo a otro. Estos tuboscontienen agar a 45 ºC. De esta manera el primer tubo contendrá mayorconcentración de microorganismos que el último. Luego se pasa el contenidode los tubos a las cajas de Petri y de allí a los tubos con agar en pico de flauta.

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Por agotamiento en superficie en una sola caja: Es el métodomás utilizado. Se prepara una caja de Petri con el medio de cultivo a la que sele elimina el exceso de humedad según se indicó anteriormente. Primero, se marca la parte exterior de la contratapa de acuerdo al esquema. Se cargael ansa con la muestra, se deposita en un punto de la superficie del sector (I)cercano al borde, y se extiende en el mismo con estrías próximas y paralelas. Acontinuación se quema el ansa y se deja enfriar. Se gira la caja 90 º, se pasa el ansa una vez sobre la última estría de la región yainoculada y se arrastra al sector (II) efectuandosobre él la siembra sin superponer las estríascon las realizadas antes. Se quema nuevamente el ansa y de la mismamanera se estría el sector (III). Luego de quemar el ansa, en el sector (IV) serealizan estrías con el material que se arrastrade (III), más amplias y que terminan en elcentro de la caja. Cualquiera sea el método empleado, si se realiza correctamente, podrán obtenersecolonias aisladas. Estas pueden pertenecer a distintas especies bacterianas, las quegeneralmente se diferencian macroscópicamente. En general cada colonia se considera formada a partir de una célula bacteriana, aunque esto no es del todo cierto pues puede darse el caso de que dos o más célulasden origen a una colonia. Si todas pertenecen a una misma especie, la coloniaresultante será pura. Caso contrario, la finalidad del trabajo no se habrá cumplido, nolográndose el aislamiento. Para comprobar la pureza de la colonia aislada se puede realizar una coloración deGram. Para ello se pica la colonia y se la identifica con una marca en el fondo de la caja con un número de identificación. Se hace el extendido con una porción de la coloniay si todas las células observadas coinciden morfológicamente, se repica el resto de lacolonia en un tubo con agar en estría para obtener un cultivo puro.

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A veces la igualdad morfológica en la coloración de Gram resulta engañosa por existirbacterias de diferentes especies (pero iguales morfológicamente) presentes dentro dela colonia seleccionada pero en muy bajo número debido a su imposibilidad dedesarrollar. Por consiguiente es necesario realizar siempre aislamiento para observarla uniformidad de las colonias.

Métodos especiales de aislamiento. Métodos derivados de las propiedades de las bacterias: Consisten en hacer desarrollar la mezcla bacteriana, en un medio de cultivoespecial, donde una especie puede dar lugar a colonias de un color que laidentifiquen (ya sea por cambios de pH o por precipitación de elementos delmedio). Un ejemplo, es el aislamiento en el llamado agarlactosa- verde-brillante- bilis, donde las bacterias coliformes dan colonias color rojo intenso enel centro con un halo rosado que destacan del fondo azul del medio.

Métodos biofísicos: Se basan en el empleo de condiciones físicasdeterminadas que afectan a ciertos microorganismos y no a otros. A) Empleo de temperaturas disgenésicas: La mayoría de las bacterias desarrollan bien a 37ªC. Sin embargo hay especies que lo hacen hasta

40ºC -42ªC y aún más, otras por debajo de 35 ªC. Estas características se pueden usar para la separación de especies.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA B) Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Los esporos de las bacterias son formas de resistencia que toleran temperaturas que resultan letales para las formas vegetativas. Este comportamiento se aprovecha parala separación de las especies que tienen la capacidad de esporular. C) Movilidad del microorganismo: Las bacterias móviles desarrollan en gran parte de la superficie del medio, mientras que las inmóviles lo hacen solo enel punto de siembra. Métodos biológicos: Estos métodos utilizan la propiedad que tienenciertos animales de laboratorio de ser receptivos a algunos microorganismos. Nota: Cuando se realizan aislamientos de bacterias anaerobias, se pueden aplicarlas mismas técnicas, teniendo la precaución de regenerar previamente el medio decultivo e incubar en anaerobiosis.

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PRACTICA #6 LOS COLORANTES OBJETIVOS  Que el estudiante pueda utilizar reconocer y utilizar las técnicas de tinción para una mejor observación e identificación de los microorganismos a observar al microscopio.  Que obtenga la información básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos. INTRODUCCION: Son sustancias de origen químico o biológico, generalmente tintes, pigmentos, reactivos u otros compuestos, empleados en la coloración de tejidos microorganismos para exámenes microscópicos, debiendo tener al menos, un grupo cromóforo que le proporcione la propiedad de teñir. Gracias a estos colorantes se pueden realizar técnicas de tinción y de esta manera poder observar de una mejor manera los objetos de estudio. Estos colorantes se los puede clasificar en:  Colorantes básicos: La acción colorante está a cargo del catión, mientras que el anión no tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+.  Colorante ácido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante está a cargo del anión, mientras que el catión no tiene propiedad, por ejemplo: eosinato- de sodio+  Colorantes neutros: Están formados simultáneamente por soluciones acuosas de colorantes ácido y básicos, donde el precipitado resultante, soluble exclusivamente en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad de teñir sus componentes ácidos y básicos, por ejemplo: La tinción de MG Giemsa. TÉCNICAS DE TINCIÓN: Las distintas técnicas de tinción se las utilizan para poder tener una diferenciación de los microorganismos y reconocer la presencia de determinados constituyentes celulares tales como flagelos, capsulas, esporas, etc. Estas técnicas de tinción son importantes de igual manera al momento de la identificación morfológica de las bacterias, pero debe usarse siempre con precaución, ya que puede conducir a errores.Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no

nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA TINCIÓN SIMPLE En las tinciones simples se llegan a utilizar solo un colorante con el que se tiñe rápidamente el microorganismo específicamente, utilizándose fundamentalmente para observar su morfología y tamaño. Los colorantes empleados con mayor frecuencia para este tipo de tinción son los siguientes: azul de metileno, violeta cristal y fucshina fenicada, entre otros. MATERIALES  Soporte  Placas portaobjetos  Asa de siembra  Mechero de alcohol  Microscopio MEDIOS Y REACTIVOS  Cultivos bacterianos  Solución salina  Colorantes (safranina y cristal violeta)  Aceite de inmersión. PROCEDIMIENTOS  Poner sobre un portaobjetos una gota de solución salina y una pequeña alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.  Hacer el frotis, en el área del mechero de alcohol (esterilizado) formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar.  Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos  Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto.  Lavar el exceso de colorante con agua.  Dejar secar al aire.  Añadir una gota de aceite de inmersión.  Observar con objetivo de inmersión (100 x). GRÁFICOS

*procedimiento al momento de realizar el frotis

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Tinción simple con cristal violeta de Staphylococcus aureus, nos proporciona información sobre la forma y la agrupación en racimos.

TINCIÓN COMPUESTA En las tinciones compuestas a diferencia de las tinciones simples se llegan a utilizar más de un colorante (safranina, violeta de genciana , azul de metileno, etc.), de esta manera tener un mejor estudio de las estructuras bacterianas, y poder tener una mejor diferenciación de estas. Entre estas tinciones están la tinción de gram, que se hablara a continuación. TINCIÓN DIFERENCIALES Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la aplicación de dos o más colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una población. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la tinción de gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia (tinción de Ziehl Neelsen). Tinción de Gram Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las bacterias. La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa. Tinción de ácido-alcohol resistencia Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de

Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistente) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistente).

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacteriumleprae, microorganismos responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente.

CONCLUSIÓN Las diferentes técnicas de tinción son para un mejor estudio de las bacterias a estudiar, en donde permite observar de mejor manera la morfología y características diferenciales de cada grupo de bacterias. Es importante poder realizar las tinciones si errores para así observar correctamente en el microscopio. CUESTIONARIO ¿Dentro de la clasificación de los colorantes encontramos? a) Colorantes ácidos y básicos b) Colorantes neutros c) Colorantes diferenciales d) Ay b son correctos e) Ninguno es correcto. Las tinciones pueden llegar a ser a) Simples b) Estructuradas c) Compuestas, diferenciales, agrupadas. d) Compuestas, simples, diferenciales. Anote cuatro colorantes que se utilizan generalmente para las coloraciones en general. …………………………………………………………. …………………………………………………………. ……………………………………………………….... …………………………………………………………. http://www.ecured.cu/index.php/Colorante http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/viewFile/819/834

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PRACTICA #7 CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS SEGÚN LA TINCIÓN DE GRAM OBJETIVOS  Ejercitar el uso de una técnica de coloración compuesta (Tinción de Gram).  Determinar el tipo de coloración que han tomado las bacterias con la Tinción de Gram.  Aplicar la Tinción de Gram en los frotis de sedimentos de orina, de heces, de secreción nasal, de cera de oído. INTRODUCCIÓN Las Bacterias son células Procariotas Como en todas las células, el citoplasma bacteriano está rodeado por una membrana plasmática. En el interior de esta membrana, sobre cuya superficie interna se encuentran absorbidas numerosas enzimas, hay un citoplasma con un cierto número de ribosomas y de inclusiones granulares, así como una molécula de ADN circular, y de una longitud aproximadamente 1000 veces mayor que la célula contiene. La pared celular está constituida esencialmente de peptidoglucano La pared celular de las bacterias consiste en una matriz de disacáridos enlazados mediante cadenas cortas de aminoácidos (péptidos). La pared celular de las bacterias Gram-positivas tienen un espesor que oscila entre 15 y 30 nm, y consiste en una macromolécula de este tipo, denominada peptidoglucano. La pared celular de las bacterias gram-negativas tienen un espesor de uno 10 nm y posee una capa adicional (la membrana externa) formada, entre otras moléculas, por lipopolisacáridos unida a la capa de peptidoglucano. Las Bacterias Grampositivas y Gramnegativas Tinción de Gram Es una técnica diferencial de característica taxonómica, ideada por el histólogo Hans Cristhian Gram, en la cual el proceso de coloración tiene su base según la estructura de la pared celular de las bacterias. Una característica taxonómica importante de las bacterias es su respuesta a la tinción de Gram. Las propiedades de tinción de Gram parecen ser fundamentales, porque la reacción de Gram se correlaciona con muchas otras propiedades morfológicas en formas con relación filogenética. Un microorganismo que en potencia es positivo para la tinción de Gram puede parecerlo sólo bajo condiciones ambientales particulares y en un cultivo joven. Los procedimientos de tinción de Gram, inician con la

aplicación de un colorante básico, violeta de genciana. A continuación se aplica una solución de yodo; todas las bacterias se tiñen de color azul en este punto del procedimiento. Luego la célula se trata con alcohol. Las células grampositivas que

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA conservan el complejo de violeta de genciana- yodo adquieren un color azul y las células gramnegativas se decoloran por completo con la adición de alcohol. Como último paso se aplica otro colorante (como rojo de safranina) de forma que las células gramnegativas decoloradas adquieran un color contrastante; las células grampositivas adquieren un color violáceo. DIFERENCIACIÓN Gram positivas.-Son aquellas que toman una coloración violácea o azul. Esto se debe a que su pared celular es mucho más gruesa por una mayor cantidad de peptidoglucano y por eso el alcohol-cetona no las decolora. Componentes especiales de las paredes celulares de bacterias grampositivas Ácidos teicoico y teicurónico Polisacáridos. Gram negativas.- Son aquellas que toman contrastante, ante la decoloración por el alcohol – cetona, y al colorearlas con safranina toman un color rosado o rojizo. Esto se debe a que la pared celular es menos gruesa, es decir más delgada y por tanto el alcohol-cetona disuelve el contenido lipídico de la pared celular dando la pérdida del colorante violeta de genciana y después ya decoloradas captan la safranina. Componentes especiales de las paredes celulares de bacterias Gram negativas Membrana externa Es una estructura con bicapa cuya hoja interna tiene una composición similar a la de la membrana celular, en tanto que la hoja externa contiene constituyentes diferentes, lipopolisacáridos(LPS, lipopolysaccharide). Lipopolisacáridos (LPS) Los LPS de las paredes celulares de bacterias gramnegativas consisten en un glucolípido complejo, denominado lípido A, el cual está unido a un polisacárido constituido por una porción central y series terminales de unidades repetidas (fi g. 2-19A). El lípido A se encuentra embebido en la hoja externa de la membrana a la cual se unen los LPS.El lípido A consiste en unidades de disacárido de glucosamina fosforilada a la cual se unen varios ácidos grasos de cadena larga. Lipoproteínas Las moléculas poco comunes de lipoproteínas membrana externa con las capas de peptidoglucanos.

unen

la

Espacio periplásmico La capa de peptidoglucano y una solución de proteínas que se comporta como un gel. El espacio periplásmico representa casi 20 a 40% del volumen celular, lo que de ninguna manera es insignificante. Las proteínas periplásmicas incluyen

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA proteínas fijadoras de sustratos específicos (p. ej., aminoácidos, azúcares, vitaminas, y iones), enzimas hidrolíticas (p. ej., fosfatasa alcalina y 5′-nucleotidasa) que se desdoblan en sustratos no transportables hacia fosforilasa de amino glucósidos) que inactivan ciertos antibióticos. Gram variables.- Algunas bacterias pueden no ser identificados correctamente por la tinción de Gram, y sin embargo en su estructura estas bacterias poseen inicialmente una pared de Grampositivas, aunque la capa de peptidoglucano es más delgada que las Grampositivas, estas bacterias luego de ser cultivada y/o tratada se convierten en gramnegativos. Por lo que toman ambas coloraciones tanto azules como rosadas, es un producto de error de tinción. Son poco comunes, Ejemplo: Los géneros actinomicetos, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, y Propionibacterium tienen paredes de célula particularmente sensibles a la fractura durante la división de célula, por lo que suelen mancharse grampositivas y gramnegativas. Tabla 12. Proceso de la tinción de Gram

Pasos Colorante básico

Mordiente

Decoloración

Contraste Observar al microscopios

Etapas en la tinción de Gram Grampositiva Gramnegativa Método s s

Violeta de genciana (luego de 30 seg. se

lava con agua el exceso de colorante) Lugo (Pasado 1 min. se lava con agua el exceso de lugol) Alcohol de 95% o Alcohol-acetona. (durante aprox. 30 seg. y luego lavar con agua para eliminar el resto de disolvente) Fucsina o Safranina (luego de 30 seg. se lava con agua el exceso de colorante) Colocar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión.

Se tiñe de violeta

Se tiñe de violeta

Permanece violeta

Permanece violeta

Se decolora Permanece violeta

Permanece violeta

Se tiñe de rosa

Violeta

Rosa

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. MATERIALES  Tubos de Ensayo.  Guantes.  Portaobjetos.  Laminilla cubre objetos.  Gradilla.  Asa bacteriológica de platino.  Hisopos.  Lámpara de Alcohol.  Vaso de Precipitación.  Pipeta de Pasteur.  Palillos.

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Equipo  Microscopio.  Cronómetro. MEDIOS Y REACTIVOS  Violeta de Metilo 10B o Violeta de Genciana. (C25H30N3+Cl-).  Yodo – Lugo.  Alcohol – Cetona.  Safranina.  Sedimentos de Orina.  Secreciones Nasales.  Heces. PROCEDIMIENTOS 1. Proceder a colocarse los guantes y mascarilla por normas de bioseguridad. Toda preparación de placas cuenta con 3 pasos: la preparación del frotis, la fijación y por último la coloración. 2. Preparación de Frotis: Para la preparación del extendido, se utiliza un portaobjetos limpio, luego se procede a tomar con una pipeta de Pasteur una pequeña muestra de sedimentos de orina del tubo de ensayo, manteniendo la tapa del tubo de ensayo en las manos sin dejarla en el mesón, depositamos al gota de sedimento en un portaobjetos, y extendemos o emulsionamos según sea el caso. Para las muestras de heces, procederemos a disponer de 4 placas limpias, en la primer y segunda placa se colocara una gota de yodo-lugol, y con la ayuda de un palillo emulsionamos en el portaobjetos, cubrimos con una laminilla. Con la tercera placa colocar en el portaobjetos una gota de azul de metileno y con la ayuda de un palillo emulsionar y cubrir con una laminilla cubreobjetos. Con la cuarta muestra agregar una gota de suero

fisiológico, emulsionar cubreobjetos.

con

el

palillo

y

cubrir

con

una

laminilla

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA 3. Fijación: Procedemos a colocar la placa ligeramente rápido a través de la parte más baja de la llama de la lámpara de alcohol encendida, esperando hasta que se evapore, pero sin exponerla mucho a la flama. 4. Tinción de Gram: Necesita del siguiente orden de colorantes y procesos:  Colorante Violeta de Genciana por un 1’ (minuto). Lavar  Solución de Yodo – Lugo (mordiente) por un 1’ (minuto).Lavar. (Si la solución está muy diluida proceder a deja por más tiempo).  Alcohol cetona por 10 - 15’’ (segundos). Lavar.  Colorante Safranina 30 – 45’’ (segundos). Lavar. 5. Enfoque en microscopio.- Siempre al observar una placa es necesario utilizar primero el objetivo de 4x (panorámico), realizando movimientos bruscos con el macrométrico, luego se procede a utilizar el objetivo de 10x , realizando movimientos leves con el micrométrico, luego se cambia al objetivo 40x y se verifica si el haz de luz es muy leve o muy concentrado, así que se procede a mover el condensador de luz, por último se procederá a utilizar el objetivo de 100x si se desea aumentar más la imagen pero siempre haciendo uso del aceite de inmersión. Preparación del Frotis.- Se debe hacer un extendido del material en un portaobjetos, con ayuda de un asa bacteriológica o de un hisopo, a la vez se expande en forma circular hacia fuera o sino en forma de zigzag hacia afuera los 4 sentidos. Si se realiza con un asa bacteriológica ésta tiene un filamento en su punta, existe un círculo pequeño que puede varias de tamaño y permite coger pequeñas cantidades del material a fijar. Existen frotis en fresco, método de observación o in vivo para permitir observar movimiento, ser cultivados o ser sometidos a procesos de tinción, a diferencia del frotis permanente se puede hacer una preparación de materia fecal en fresco fijada. Fijación del Frotis.- Una vez colocada el material en el portaobjeto se deja secar, y luego se procede a aplicar calor, de manera rápida con un movimiento inclinado de arriba abajo se pasa la placa por la parte más baja de la llama encendida de la lámpara de alcohol. Este procedimiento de fijación al calor es uno de los procedimientos más empleado en las tinciones de las bacterias.

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Preparación y fijación de frotis bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos

CONCLUSIÓN  Las células eucariotas carecen de peptidoglucano en su pared celular, y se distinguen de las células procariotas porque ellas si poseen peptidoglucano, haciéndolas resistentes a la acción de antimicrobianos, y protegiendo a la bacteria condiciones adversas al medio.  La Tinción de Gram es un proceso de coloración muy usado en el laboratorio de microbiología ya que permite diferenciar a las bacterias grampositivas de las gramnegativas, debido a que la pared de las grampositivas poseen una pared de peptidoglucano más gruesa y adquiere el color violeta, en cambio las bacterias gramnegativas al tener la pared de peptidoglucano más fina por lo que pierden el colorante en el proceso de coloración.  Las placas o extendidos de muestras biológicas sometidas al proceso de tinción de Gram, nos ha permitido observar una gran variedad de bacterias que van

desde estafilococos, cocos y bacilos Grampositivos de bacilos gramnegativos, por lo tanto nos permite distinguir entre las diferentes morfología cuáles son bacterias grampositivas y gramnegativas.

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CUESTIONARIO. 1. ¿Cuál es la característica principal que diferencia a las células eucariotas de las procariotas en cuanto a su pared celular? 2. ¿Qué es y para qué sirve el proceso de Tinción de Gram? 3. Cite 1 diferencia primordial y básica que distingue a las Bacterias Grampositivas de las Gramnegativas?

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PRACTICA #8 IDENTIFICACIÓN, CLASIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN BACTERIANA OBJETIVOS

 Establecer los conceptos de clasificación, e identificación bacteriana.  Conocer los distintos métodos de clasificación taxonómica, Y las reglas de la nomenclatura bacteriana.  Describir los lineamientos de identificación bacteriana.

INTRODUCCION. 1. VISUALIZACIÓN: Uno de los procedimientos básicos. El microscopio óptico es el más utilizado en los laboratorios de microbiología de forma rutinaria. También pueden emplearse el de campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia o electrónico. El examen microscópico requiere la utilización del microscopio. Puede hacerse una visualización microscópica en 2 momentos: a) directamente de la muestra clínica b) a partir de los microorganismos obtenidos por cultivo como primer escalón en la identificación. Puede realizarse 1-Directamente: examen en fresco. Se estudian las bacterias "al natural", sin teñir. 2-Mediante una técnica denominada gota pendiente que se utiliza para observar la movilidad. 3-Tinciones negativas (Tinta china). Se emplea para ver la cápsula de S. pneumoniae y Cryptococcus neoformans en LCR. 4-Tinciones. Existen muchas y en general se pueden clasificar en:  Simples utilizan un solo colorante). Por ejemplo: azul de metileno para observación de levaduras y protozoos intestinales.  Compuestas (utilizan más de un colorante y permiten la agrupación de las bacterias de acuerdo a su diferente afinidad tintorial). Destacan la tinción de Gram que agrupa a las bacterias en dos grandes bloques, bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas, y la de ZiehlNeelsen utilizada, entre otros, para la tinción de micobacterias.  Especiales: tinciones fluorescentes, tinciones de determinadas estructuras como la tinción del esporo, tinción de flagelos. 5.-Afinidad tintorial

Tinción de Gram: Permite dividir a las bacterias en

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA 1) Gram positivas (Violetas), retienen el colorante principal tras la decoloración con alcohol o alcohol-acetona. 2) Gram negativas (Rojas), pierden el colorante principal tras la decoloración por lo que es necesario aplicar un colorante de contraste para visualizarlas. Esta diferencia de coloración está basada en la diferencia estructural de la pared. En las Gram positivas el colorante se fija fuertemente al peptidoglucano que lo "retiene" e impide que "salga" con el decolorante. En las Gram negativas el colorante es retenido con menos fuerza al ser más delgada la capa de peptidoglucano. Morfología: - Pueden tener diferentes formas: - Esféricas: cocos (Streptococcus spp., Staphylococcus spp., etc.) - Cilíndricas: bacilos (Enterobacterias, Pseudomonasspp., etc...) - Espiroquetas: Treponema pallidum, Borreliaburgdorferi. - Agrupación: Pueden aparecer aisladas o asociarse en PAREJAS [diplococos: (Neisseriagonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae)], cadenas (estreptococcus), tetradas, sarcinas, racimos (estafilococos), "letras chinas" (corinebacterias), etc. - Tamaño: las bacterias se miden en µmetros (1µmetro = 10-3 mm) y, en general y como ejemplo, las bacterias esféricas tienen un diámetro de 1µm y las bacterias alargadas 1.5-8 µm de longitud, aunque este parámetro varía en función de los diferentes géneros bacterianos. 2.-

AISLAMIENTO EN CULTIVO Y POSTERIOR IDENTIFICACIÓN POR SUS CARACTERÍSTICASFENOTÍPICAS (MORFOLOGÍA, CARACTERÍSTICAS METABÓLICAS -PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y ENZIMÁTICAS-, ETC.)

Los medios de cultivo pueden clasificarse atendiendo a varios parámetros: a)Según su origen pueden ser: 1) Naturales: constituidos por sustancias naturales de composición compleja y en ocasiones variable (extracto de carne, extracto de levadura, patata...), 2) Sintéticos o Químicamente definidos en los que se conoce la participación exacta de hidratos de carbono, aminoácidos. 3) Semi-sintéticos.La constitución de los componentes aislados de materia prima compleja y en compuestos obtenidos de sustancias químicas. b) Según su consistencia pueden ser: 1) Líquidos: medios de enriquecimiento. 2) Sólidos: son medios líquidos a los que se les añade para darles consistencia una sustancia gelificante (agar-agar) obtenida de algas marinas. 3) Semisólidos: líquidos a los que se les añade menor concentración de agar que a los sólidos.

Cada uno tiene sus finalidades. En la superficie de los medios sólidos es posible ver las colonias resultantes de la multiplicación bacteriana. Los medios líquidos facilitan el crecimiento de las bacterias pero en ellos no se ven colonias, el crecimiento suele detectarse por turbidez. Los medios semisólidos suelen utilizarse para valorar la movilidad de los microorganismos.

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c) De acuerdo a su finalidad y aplicación pueden ser: 1.- Básicos: aquellos que llevan todos los elementos básicos para el desarrollo de los microorganismos no exigentes. 2.-Enriquecidos: incorporan diferentes sustancias para permitir el crecimiento de microorganismos más exigentes. Ej.: agar sangre, agar chocolate. 3.- Selectivos: medios a los que se añaden diferentes sustancias (colorantes, sales biliares, antibióticos...) Que son capaces de inhibir a determinados microorganismos y permitir el crecimiento de otros. En general se utilizan para inhibir el crecimiento de la flora acompañante y permitir el crecimiento del patógeno. 4.- Diferenciales: se les añade un hidrato de carbono y un indicador de pH de forma que si el microorganismo es capaz de utilizar ese hidrato de carbono se produce un cambio de pH que hace que el indicador cambie de color y evidencie la reacción.. 5.- Otros medios: de enriquecimiento (son medios líquidos a los que se les añades sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos acompañantes favoreciendo el crecimiento de otros (los patógenos buscados), de transporte, etc. Siembra de los medios de cultivo Lo primero que hay que hacer es sembrar la muestra en los medios de cultivo reseñados. Una vez cultivada se procede al aislamiento en cultivo y posterior identificación por sus características fenotípicas (morfología, características metabólicas -pruebas bioquímicas y enzimáticas, etc.). Condiciones de cultivo -Temperatura: la mayoría crecen bien a temperaturas entre 35-37ºC aunque hay excepciones -Tiempo de incubación: depende del tiempo de generación (tiempo requerido para que el número de bacterias se duplique) de cada microorganismo. Generalmente 18-24 h. Otros requieren más tiempo de incubación: Brucella spp. , M. tuberculosis. Atmósfera de incubación. Los microorganismos respecto al tipo de respiración pueden ser: 1.- Aerobios: requieren la presencia de oxígeno molecular. 2.- Anaerobios Facultativos: pueden vivir y multiplicarse en presencia o en ausencia de oxígeno. 3.- Anaerobios: el oxígeno libre es tóxico para ellos (algunos son aerotolerantes). 4.- Microaerófila: necesitan la presencia de oxígeno libre pero a una concentración menor que la atmosférica (2-10%).

Este hecho tiene como consecuencia que haya que incubarlos en estas condiciones. Otros hay que incubarlos en una atmósfera con un 5-10% de CO2 (no es tipo de respiración sino un requerimiento): se denominan capnófilos

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Identificación Se valoran entre otros parámetros: 1)Morfología y aspecto de las colonias (masa constituida por bacterias que es visible a simple viste en la superficie de los medios sólidos). 2) Capacidad de crecer a una determinada temperatura. 3) Crecimiento en medios selectivos y diferenciales. 4) Presencia de hemólisis que en los medios con sangre da lugar a la aparición de un halo alrededor de la colonia. Puede ser transparente (hemólisis total o ß-hemólisis), verdoso (hemólisis parcial o α-hemólisis o no aparecer (no hemolíticas o γ– hemólisis) 5) Pruebas bioquímicas y enzimáticas adecuadas para la bacteria que se sospeche por las pruebas preliminares. 6) Movilidad. 7) Detección de productos estructurales: antígenos (reacciones antígeno-anticuerpo), ácidos nucleicos (hibridación, PCR, etc.). 8) Detección de antígenos. 9) Técnicas genéticas de detección de ácidos nucleicos: hibridación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), etc. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): En 1983, KaryMullis dio a conocer la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa que es una técnica para la síntesis in vitro de secuencias específicas de DNA evitando uno de los principales problemas la insuficiente cantidad de ADN para realizar cualquier procedimiento de laboratorio. La técnica se basa en la replicación del ADN inducida por la DNA polimerasa, enzima que es capaz de realizar una síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores. Son una PAREJA de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de ADN que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la PCR se basa en la repetición de ciclos que están formados por tres etapas: 1.- Desnaturalización del ADN doble cadena: la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La re-naturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

2.- Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras: los cebadores, iniciadores se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C). 3.- Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa (elongación): se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxi-nucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas.

Elementos químicos necesarios para realizar la PCR Termociclador Carga de un gel de agarosa. Lectura de un gel de agarosa, teñido con bromuro de estudio, bajo la luz ultravioleta. Hibridación La hibridación o re-naturalización de ácidos nucleicos (ARN o ADN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Se utiliza una cadena sencilla de ADN marcada por un método físicoquímico, bien sea radiactivo o con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida. REACCIONES ANTÍGENO ANTICUERPO Son estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reacción antígeno-anticuerpo producida en el laboratorio ha tenido lugar. Se basan en la especificidad de la reacción, es decir, en que un anticuerpo sólo reaccionará con el antígeno que haya dado lugar a su formación. Pueden utilizarse para realizar tanto diagnóstico directo como indirecto. Si conocemos el anticuerpo ( por ej. anticuerpos monoclonales) podremos identificar el antígeno (en la muestra clínica) que reacciona específicamente con él, diagnóstico directo.

La inmunofluorescencia es una técnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos. Los fluorocromos son moléculas que al ser excitadas con la energía de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energía de una longitud de onda mayor.

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La inmunofluorescencia indirecta permite la detección de anticuerpos circulantes. Si el antígeno es conocido (disponible en el laboratorio), detectaremos los anticuerpos que se encuentran en la muestra clínica y por tanto son desconocidos y que reaccionan específicamente con ellos: diagnóstico indirecto. Otras técnicas que se emplean en el diagnóstico microbiológico directo práctica 5.

La descripción de estas técnicas se verá en la

son: detección de antígeno capsular mediante técnicas de aglutinación con anticuerpos unido a partículas de látex, CIE, RIA y EIA.

Equipo: Microscopio óptico con MATERIALES objetivos Portaobjetos. de 4X, 40X y 100X Cubreobjetos. Mechero de Bunsen o lámpara de Lápiz graso, alcohol.  Asas bacteriológicas graduadas,  Papel secante,  Aceite de inmersión  Cultivo en agar de Escherichiacoli  Cultivo en agar de Staphylococcusssp MEDIOS Y REACTIVOS  Tinción de Gram  Solución desinfectante KOH al 3% PROCEDIMIENTOS Preparaciones Húmedas: 1. Depositar una capa delgada de vaselina alrededor del borde del cubreobjetos o un pedazo pequeño de plastilina en las 4 esquinas del cubreobjetos, sin tocar las caras del cubreobjetos con los dedos. 2. En el centro del cubreobjetos, colocar con el asa microbiológica varias gotas del cultivo bacteriano. 3. Tome una laminilla y colóquela sobre el cubreobjetos, presionando suavemente. 4. Invierta la preparación y obsérvala al microscopio con los objetivos de 40X y 100X si se utilizó vaselina, o con el de 10X en el caso de haberse utilizado plastilina. Preparación de Frotis Fijos para Tinciones: 1. Realizar un frotis fijo de cada uno de los cultivos proporcionados.

2. Utilizar laminillas limpias y marcadas para su identificación, con el lápiz graso marcar el área donde se va a colocar la muestra. 3. La metodología para realizar el frotis bacteriano dependerá si el cultivo se encuentra en medio sólido o líquido.

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Cultivo en líquido: con un asa bacteriológica previamente flameada y fría, se introduce en el cultivo bacteriano se coloca en el portaobjetos y se difunde en el área marcada y se fija al calor. Cultivo en medio sólido: se coloca una gota de agua destilada estéril en el portaobjetos, se recolecta una colonia de medio sólido y se mezcla, realizando un extendido uniforme. 4. Se debe extender la gota sobre el portaobjetos de forma que el resultado sea una capa fina. Debe evitarse preparar un frotis demasiado grueso. 5. Dejar secar las preparaciones (frotis) a temperatura ambiente. 6. Cuando se haya secado el frotis pasar el portaobjetos por la llama del mechero con la capa del frotis hacia arriba, no aplicar calor en forma excesiva ya que estropearía la morfología normal y la estructura de los microorganismos que se van a teñir. Procedimiento para la tinción de Gram: 1. Preparar frotis fijos a partir de cada uno de los cultivos bacterianos. 2. Agregar sobre la preparación cristal violeta durante 30 segundos. 3. Lavar con agua destilada 4. Añadir lugol durante 30 segundos. 5. Lavar con agua destilada 6. Decolorar con alcohol-cetona por 5 a 10 segundos. 7. Lavar con agua destilada 8. Agregar safranina durante 30 segundos. 9. Lavar, secar y observar al microscopio con aceite de inmersión y con el objetivo de 100X. GRÁFICOS

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CONCLUSIÓN.  El aislamiento, identificación y clasificación para el análisis de las bacterias patógenas en el ser humano es imprescindible para la microbiología.  El conocimiento va acompañado de la aplicación del mismo al determinar la estructura, fisiología y metabolismo bacteriano en el laboratorio; es clave el cultivo de microorganismos, su clasificación e identificación y para su posterior interpretación clínica colonizante o contaminante, su fenotipo, mecanismo de acción y resistencia; estableciendo así un diagnóstico diferencial entre el agente causal y el hospedador.

CUESTIONARIO. 1. ¿De qué color se tiñen las bacterias Gram positivas y por qué? 2. ¿De qué color se tiñen las bacterias Gram negativas y por qué? 3. ¿Con que finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta

objetos y por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los Microorganismos?

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PRACTICA # 9 TÉCNICAS DE REALIZACIÓN ANTIBIOGRAMA OBJETIVOS  Realizar un ensayo de sensibilidad de un cultivo bacteriano a los antibióticos, usando el método de Kirby Bauer.  Interpretar los resultados y hacer el informe correspondiente. INTRODUCCION. La resistencia de las bacterias es el principal obstáculo para la eficacia terapéutica de los antibióticos, pues no solo puede anular la acción curativa, sino que tiene consecuencias graves ya que provoca la desaparición de las células susceptibles y la propagación de resistentes. El antibiograma es un método in vitro del comportamiento de los antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos) frente a los agentes infecciosos. Con los resultados obtenidos se clasifican a las bacterias en: sensibles, moderadamente sensibles y resistentes, a un determinado antimicrobiano. No obstante, la correlación exacta entre los resultados in vitro y la respuesta clínica es difícil de predecir, ya existen factores que influencian la interacción de los agentes antimicrobianos y los microorganismos en el paciente.

Entre los factores podemos resaltar:

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Factores del agente antimicrobiano

Factores del huésped

Factores del microorganismo

Farmacocinética Unión a proteínas del plasma Vías de administración Acción bacteriostática o bactericida Concentración en el sitio de la infección Enfermedad Estado inmunológico Formación de absceso Presencia de cuerpos extraños Función renal y hepática Cumplimiento del tratamiento Virulencia Alta concentración de microorganismos Infección mixta Desarrollo de resistencia durante el tratamiento

La metodología usada para realizar el antibiograma y poder determinar la sensibilidad bacteriana a los antibióticos requiere de un medio de cultivo puro que propicie un desarrollo del microorganismo, usualmente se emplea el agar Mueller-Hinton en las pruebas de sensibilidad de microorganismos aeróbicos de rápido crecimiento; cuando se trata de estreptococos u otras bacterias exigentes, se le añade 5% de sangre desfibrinada. De los métodos existentes, el más popular es el del disco de papel. La variante más utilizada de este método es la de Kirby Bauer, la cual consiste en utilizar una sola concentración de antibiótico y medir el tamaño de la zona de inhibición. El método Kirby Bauer, el microorganismo es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre la cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del antibiótico. Las placas se incuban por 1618 horas a35-37º C. Durante la incubación, el antibiótico difunde radialmente desde el disco a través del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco; en un punto determinado, la concentración del antibiótico en el medio es incapaz de inhibir al germen en estudio. El diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías de sensible, intermedio o resistente (S, I, o R). MATERIALES  Cultivo Puro de un microorganismo.  Pinzas metálicas.  Guantes y mascarilla.  Hisopos. MEDIOS Y REACTIVOS  Discos de antibióticos.  Placa con medio de Mueller-Hinton. PROCEDIMIENTOS.

1. Funda el medio de cultivo y déjelo enfriar a 45-50°C.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA 2. Vierta asépticamente suficiente cantidad de medio de cultivo en una placa de Petri, para obtener una capa de 4 mm de espesor. Para una placa de 10 cm. de diámetro se requieren 30 ml de medio y para una de 15 cm se requieren 70 ml. 3. Dejar solidificar el medio de cultivo y luego secar las placas durante 30 minutos antes de usarla para la inoculación 4. Inocular la placa mediante un hisopo estéril utilizando una suspensión del germen de 18 a 24 horas de incubación con una turbidez equivalente a 1,5 x 106 bacterias (tubo No. 5 de la escala de Mc Farland). Para la inoculación sumergir un hisopo estéril en el cultivo y eliminar el exceso rotando firme contra la pared interna del tubo. Frotar el hisopo sobre la superficie del medio de cultivo. 5. Repetir tres veces, rotando la placa para obtener una dispersión uniforme del inóculo en toda la superficie. 6. Colocar la tapa a la placa y dejar secar el inóculo durante 3 a 5 minutos. 7. Colocar los discos con los antibióticos sobre el agar mediante pinzas estériles o usando un aplicador de discos. Oprimir los discos suavemente con una pinza para asegurarlo. Los discos deben estar espaciados de manera que su distancia a la pared de la placa sea de 15 mm y entre ellos de 30 mm. 8. Incubar a 35-37º C hasta el siguiente día (aproximadamente 18-19 horas). Si se requieren los resultados con rapidez se pueden leer las zonas de inhibición después de 6-8 horas de incubación, pero estos resultados deben ser confirmados mediante una nueva lectura después de la incubación por 18-19 horas. 9. La medida del diámetro de la zona de inhibición se hace desde el exterior, sin quitar la tapa, con una regla milimetrada, un vernier o un instrumento similar. 10. Interpretar resultados con la tabla 1 o 2 respectivamente. GRÁFICOS Tabla 13.Interpretación del método de Kirby Bauer

Diámetro de la zona de inhibición Resistente Sensible Intermedio o= BETALACTÁMICOS, PENICILINAS Ampicilina Enterobacteriaceae 10 µg 13 14-16 17 Ampicilina Estafilococos 10 µg 28 29 Ampicilina Enterococos 10 µg 16 17 Ampicilina Estreptococos ß 10 µg 18 19-25 26 hemolíticos MezlocilinaPseudomonasaerugin 75 µg 15 16 osa MezlocilinaEnterobacteriaceae 75 µg 17 18-20 21 Oxacilina Estafilococos 1 µg 10 11-12 13 Oxacilina Neumococos para 1 µg 20 evaluar sensibilidad a penicilina Penicilina G Estafilococos 10 U 28 29 Penicilina Enterococos 10 U 14 15 Penicilina Estreptococos ß Agente antimicrobiano

Contenido del disco

hemolíticos

10 U

19

20-27

28

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE ESCUELA LA SALUD. MEDICINA PiperacilinaPseudomonasaerugin 100 µg 17 osa PiperacilinaEnterobacteriaceae 100 µg 17 18-20 COMBIN. CON INHIBIDORES B-LACTAMASA Amoxicilina / Ácido clavulánico 20/10 µg 19 Estafilococos Amoxicilina / Enterobacteriaceae 20/10 µg 13 14-17 Ampicilina / Sulbactama 10/10 µg 11 12-14 Piperacilina / 100/10 µg 17 18-20 TazobactamaEnterobacterias Piperacilina / 100/10 µg 17 Pseudomonasaeruginosa Piperacilina / 100/10 µg 17 Esfafilococosmeticilina S CEFALOSPORINAS Cefaclor 30 µg 14 15-17 Cefazolina 30 µg 14 15-17 Cefepima 30 µg 14 15-17 Cefixima 5 µg 15 16-18 Cefoperazona 75 µg 15 16-20 Cefotaxima 30 µg 14 15-22 Cefoxitina 30 µg 14 15-17 Ceftazidima 30 µg 14 15-17 Ceftixozima 30 µg 14 15-19 Ceftriaxona 30 µg 13 14-20 Cefuroxima sódica parenteral 30 µg 14 15-17 Cefalotina 30 µg 14 15-17 CARBAPENS Imipenem 10 µg 13 14-15 Meropenem 10 µg 13 14-15 MONOBACTAMAS Aztreonam 30 µg 15 16-21 GLICOPÉPTIDOS Teicoplanina 30 µg 10 11-13 Vancomicina Enterococos 30 µg 14 15-16 Vancomicina Estafilococos 30 µg AMINOGLUCÓSIDOS Amicacina 30 µg 14 15-16 Gentamicina 10 µg 12 13-14 Kanamicina 30 µg 13 14-17 Netilmicina 30 µg 12 13-14 MACRÓLIDOS Azitromicina 15 µg 13 14-17 Claritromicina 15 µg 13 14-17 Eritromicina 15 µg 13 14-22 TETRACICLINAS Minociclina 30 µg 14 15-18

18 21 20 18 15 21 18 18 18 18 18 19 21 23 18 18 20 21 18 18 16 16 22 14 17 15 17 15 18 15 18 18 23 19

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE ESCUELA LA SALUD. MEDICINA Tetraciclina

30 µg 14 QUINOLONAS Ciprofloxacina 5 µg 15 Fleroxacina 5 µg 15 Nalidíxico Ácido 30 µg 13 Norfloxacina 10 µg 12 Ofloxacina 5 µg 12 Trovafloxacina 10 µg 13 OTROS ANTIMICROBIANOS Cloranfenicol 30 µg 12 Clindamicina 2 µg 14 Nitrofurantoína 300 µg 14 Polimixina B 300 U 8 Rifampicina 5 µg 16 Sulfonamidas 300 µg 12 1.25/23.75 Trimetoprima - Sulfametoxazol 10 µg

15-18

19

16-20 16-18 14-18 13-16 13-15 14-16

21 19 19 17 16 17

13-17 15-20 15-16 9-11 17-19 13-16

18 21 17 12 20 17

11-15

16

Tabla 14.Controles del método de Kirby Bauer

Antibióticos Ampicilina Bacitracina Cefalotina Cloramfenicol Colistina Eritromicina Gentamicina Kanamicina Meticilina Neomicina Novobiocina Oleandomicina Penicilina G Polimixina B Estreptomicina Tetraciclina Vancomicina

Concentración del disco 10 µg 10 U 30 µg 30 µg 10 µg 15 µg 10 µg 30 µg 5 µg 30 µg 30 µg 15 µg 10 U 300 U 10 µg 30 µg 30 µg

GRAFICOS: Prueba de Antibiograma

Diámetro de la zona de inhibición (en mm) Con S. aureus Con E. coli ATCC 25923 ATCC 25922 24-35 15-20 17-22 25-37 18-23 19-26 21-27 11-15 22-30 8-14 19-27 19-26 19-26 17-25 17-22 18-26 17-23 22-31 19-28 26-37 7-13 12-16 14-22 12-20 19-28 18-25 15-19 -

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CONCLUSIÓN  El conocimiento de la sensibilidad a los antibióticos del microorganismo causante de la enfermedad, permite determinar la selección inicial del agente terapéutico correspondiente, sino que además en aquellos casos en los cuales el paciente presente intolerancia a determinado fármaco, permite seleccionar el más adecuado para el paciente. CUESTIONARIO 1. Subrayar lo correcto Los factores del huésped que influyen en la interacción de los agentes microbianos y los microorganismos en el paciente son: a) Vías de administración, estado inmunológico, farmacocinética. b) Enfermedad, estado inmunológico, formación de absceso, función renal y hepática, cumplimiento del tratamiento. c) Virulencia y antibiograma. d) Enfermedad, estado inmunológico, formación de absceso, función renal y hepática, infección mixta. 2. Verdadero o falso Los antibiogramas son métodos in vivo que determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio específica y estandarizada. ( )

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3. Subrayar lo correcto En el método Kirby Bauer, el microorganismo es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre la cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del antibiótico. Las placas se incuban por: a) 16-18 horas a 35-37º C. b) 26-28 horas a 35-37º C. c) 12 horas a 38º C. d) 16-19 horas a 34-37º C.

PRACTICA #10 PRUEBAS BIOQUÍMICAS OBJETIVOS El alumno aprenderá:  A reconocer bacterias por sus propiedades metabólicas.  A reconocer cada pruebas bioquímicas que se realiza a cada bacteria para su diferenciación e identificación. INTRODUCCION Las bacterias no muestran una gran variedad de aspectos morfológicos y por tanto su identificación requiere además de la información obtenida en el estudio morfológico, realizar otras determinaciones (fisiología, comportamiento bioquímico, etc.). A continuación se describe una selección de pruebas bioquímicas. Se han de realizar con cultivos bacterianos puros. Recomendaciones 1. No aplicar a cultivos mixtos 2. Se han de usar cultivos jóvenes, en fase exponencial de crecimiento. 3. La identificación de cualquier bacteria ha de comenzar por los aspectos morfológicos: forma, tinción de Gram, movilidad, etc. 4. Rotular todo el material que se vaya a sembrar.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA 5. Comprobar la esterilidad de los medios de cultivo antes de su siembra HEMÓLISIS Es el fenómeno de la desintegración de lo eritrocitos que se produce en el agar sangre respectivamente, esta es producida por la acción de una enzima llamada hemolisina (alfa, beta, gamma). MATERIALES  Mechero de alcohol  Asa  Incubadora MEDIOS Y REACTIVOS  Agar sangre  Muestra bacteriana PROCEDIMIENTOS Realice un aislamiento en una placa de agar sangre tomando una muestra bacteriana con el asa esterilizado previamente, e incúbela a 37°C por 24-48 horas. GRÁFICOS

*se observa como resultado A: hemolisis beta, B: hemolisis alfa, C: hemolisis gamma.

CATALASA Es la enzima de la mayoría de las bacterias aerobias, descomponen el peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva.

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MATERIALES  Porta objeto  Pipeta  Mechero de alcohol. MEDIOS Y REACTIVOS  Peróxido de hidrogeno  Muestra de un cultivo bacteriano PROCEDIMIENTO En un porta objeto colocar una gota de peróxido de hidrogeno y colocar una muestra de cultivo bacteriano, luego de 5 minutos observar si existen burbujas en la solución siendo esta positiva, si en la solución no se observa burbujas esta es negativa.

GRAFICOS

*prueba de catalasa

COAGULASA. Es una proteína producida por varios microorganismos que permiten la conversión del fibrinógeno en fibrina. Si la prueba resulta positiva el suero coagulara, dando como resultado un coagulo. MATERIALES.

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 Tubo de ensayo  Gradilla  Asa  Incubadora MEDIOS Y REACTIVOS.  Plasma  Microorganismo de un cultivo bacteriano PROCEDIMIENTO Mezcle un asa cargada con el microorganismo obtenido de un cultivo en medio sólido, o 0,1 ml de un cultivo en un medio líquido, con 0,5 ml de plasma, contenido en un tubo pequeño incube a 37ºC y examine periódicamente. Se considera que la prueba es positiva si el plasma es coagulado en 6 a 18 horas.

GRAFICO

*En esta imagen se observa como resultado la prueba positiva y negativa

BACITRACINA Esta prueba se la realiza para identificación de streptococcos. MATERIALES  Hisopo estéril  Tubo de ensayo  Asa

MEDIOS Y REACTIVOS

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD.  Agar sangre  Solución salina  Disco de bacitracina  Muestra de cultivo

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PROCEDIMIENTO Realizar una suspensión densa del microorganismo en estudio (de turbidez igual a la del estándar 0.5 de la escala de Mac Farland). Utilizando un hisopo estéril, hisopar una placa de agar sangre. Aplicar un disco de Bacitracina de 0.04 U sobre la superficie de la placa. Incubar durante 24 horas, a 35-37 ºC. Examinar la placa para observar cualquier zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco de bacitracina. Sensible: presencia de halo de inhibición del desarrollo alrededor del disco. Resistente: ausencia de halo de inhibición del desarrollo alrededor del disco.

GRAFICO

*Prueba de Bacitracina OXIDASA. Es una prueba utilizada para determinar si una bacteria produce alguna de las citocromo c oxidasas. El sistema citocromo esta normalmente presente solo en los organismos aerobios capaces de usar oxigeno como aceptor final del hidrogeno. MATERIALES.

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 Caja Petri  papel filtro cortado en trozos MEDIOS Y REACTIVOS.  agua destilada  reactivos de oxidasa (toxico)  muestra de cultivo bacteriano PROCEDIMIENTO. Poner un trozo de papel de filtro sobre una de las tapaderas de una placa de Petri. Añadir una gota del reactivo de oxidasa. Depositar sobre el reactivo masa bacteriana (actuar de forma rápida y con un asa de platino nueva o con un palillo de dientes) Resultado. La reacción positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de 10 segundos.

GRAFICO

*prueba de oxidasa; se observa el color azul violeta en el resultado positivo

LACTOSA. Esta prueba se la utiliza para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismos en agar MacConkey, ya que este medio contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). MATERIALES. asa

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD.  mechero de alcohol  caja Petri

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MEDIOS Y REACTIVOS.  Agar McConkey  Muestra bacteriana. PROCEDIMIENTO. Tomando el asa, se obtiene una muestra bacteriana y se siembra el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta contrastando con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).

GRAFICO

*prueba de lactosa positiva; muestra un color rojizo a diferencia de la reacción negativa, que no obtiene ningún color.

CONCLUSIONES  Las pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma uno.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA  Es importante reconocer la importancia de cada una de estas pruebas bioquímicas, para así tener la especificidad de los objetos a estudiar.

CUESTIONARIO. Verdadero o falso. La prueba de hemolisis se la utiliza solo para el reconocimiento de enzimas y proteínas para la diferenciación de bacterias Gram negativas. ( ) Identifique que prueba es la que se muestra en los gráficos y su reacción.

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¿ Que prueba se realiza para la identificación de enterobacterias y escriba como se reconoce si la prueba es positiva?.

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PRÁCTICA #11 TOMA DE MUESTRA Objetivos:  Que los estudiantes puedan reconocer el método que se debe realizar al momento de la toma de muestra.  Reconocer específicamente las muestras que se necesita para el estudio de cada grupo bacteriano. Introducción: La toma de muestra consiste en la obtención de muestras biológicas con el fin de determinar y aislar el o los agentes etiológicos de una infección a fin de obtener resultados concretos que ayuden a la obtención de un diagnóstico exacto. Es preferible que la toma de muestra sea obtenida antes de comenzar un tratamiento antibiótico, ya que este inhibe el crecimiento bacteriano. EXUDADO BUCOFARINGEO

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. Conocido también como frotis faríngeo.

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Materiales  Hisopo esterilizado.  Baja lengua (paleta)  Incubadora. Medios y reactivos  Agar sangre. Procedimiento. Este se realiza utilizando un hisopo (recordando las normas de bioseguridad) y el baja lengua, este hisopo es introducido hasta la pared posterior de la garganta rosándolo por esta pared. Una vez tomada esta muestra se hace una siembra por agotamiento en el agar sangre y colocarlo en la incubadora a 36º o 37ºC, esperar el resultado por 24 horas. GRAFICOS

*toma de muestra bucofaríngea

*siembra de la muestra

UROCULTIVO Es el cultivo de orina necesario para el diagnóstico de infecciones urinarias producidas generalmente por bacterias. Materiales

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA  Un frasco con tapa ancha estéril en donde se colocara la muestra de orina.  Asa  Incubadora Medios y reactivos  agar cromógeno de orina o agar MacConkey  muestra de orina tomada previamente. Procedimiento Con el asa esterilizada previamente se introduce en la muestra de orina y se procederá a sembrar por agotamiento en el agar. Incubar a 35º-37ºC en aerobiosis durante 24-48 horas. GRAFICO

*siembra de muestra por agotamiento con el asa

*Urocultivo en agar MacConkey, presencia de escherichiacoli Se realiza una dilución en un tubo de ensayo con una pequeña cantidad de heces recogida con la ayuda de un asa de siembra desechable y se le añade un poco de agua destilada, se agita un poco y se obtiene una gota de esta dilución. Dicha gota la colocamos en un portaobjetos y añadimos una gota de Lugol donde colocaremos un cubreobjetos encima para su posterior observación al microscopio.

Otro método de observación es realizando el mismo procedimiento pero sustituyendo el lugol por el negro sudan. Esta tinción está indicada para la observación de grasa.

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Prueba de COPRO-PARASITOLOGIA: Este tipo de pruebas se realiza cuando se sospecha de la presencia en heces de parásitos. En nuestro caso, la prueba no es necesaria, ya que el paciente no presenta una sintomatología como diarrea aguda, gases intestinales excesivos, dolores cólicos, elevación de eosinófilos en sangre u otros síntomas. En el examen de parasitología se coloca un poco de muestra en el portaobjetos y se agrega una gota de lugol. Con un bote de muestra colocar una gasa y añadir 50 ml de suero fisiológico para poder filtrar dicha muestra. Al líquido resultante del filtrado de le coloca en un tubo de centrifuga y se centrifuga 5 min. a 3000 r.p.m. se desecha el sobrenadante y obtenemos el sedimento que observaremos con una gota de lugol añadida para poder observar mejor.

Gráficos.

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*resultados de la siembra.

HEMOCULTIVO

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA También llamado cultivo de sangre, este en un análisis para verificar si hay bacterias u otros microorganismos en una muestra de suero. Específicamente para verificar si hay presencia de bacterias. Materiales  Jeringa  Algodón  Incubadora  Hisopo  Incubadora. Medios y reactivos  Botella BACTEC  Agar MacConkey  Agar chocolate  Agar sangre. Procedimiento Primero proceder a tomar la muestra con la jeringa esterilizada, recordando las normas de bioseguridad, por lo menos 10ml de sangre, una vez obtenida la sangre se inocula en dos frascos o botellas de BACTEC, es necesario que los frascos no se contaminen ( es preferible realizar dos hemocultivos tomados de lugares diferentes o con 15 minutos de diferencia). Incubar la botella inoculada con sangre a 35ºC Procesar las botellas que le aparato automatizado detecte como positivas. Sembrar dos gotas de sangre en cada uno de los agares ya mencionados (sangre, chocolate, MacConkey). Incubar los cultivos por 24 horas a una temperatura de 36-37ºC. GRÁFICOS

*botellas BACTEC para la realización de hemocultivo

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 Es importante poder realizar una buena toma de muestra para obtener resultados esperados para la identificación de los microorganismos que deseamos estudiar.  El recordar tener presente las normas de bioseguridad al momento de maniobrar con las sustancias biológicas de las que se desea estudiar.  Se recomienda evitar en lo absoluto la contaminación de los materiales e incluso de los reactivos que se utilicen la obtención de la muestra ya que esto evitara el desarrollo correcto de las bacterias que se desea estudiar teniendo como resultado una práctica incorrecta. Cuestionario Coloque el nombre de la prueba correspondiente Cultivo de sangre ………………………………………………. Cultivo de heces ……………………………………………… Cultivo de orina …………………………………………….. Escoja el literal correcto Exudado bucofaríngeo a) Se toma la muestra de la pared posterior de la garganta b) Se realiza una siembra por agotamiento en agar sangre c) Se lo coloca en la incubadora a 27ºC por 24 horas d) A y b son correctas e) A y c son incorrectas f) Todas son incorrectas. Describa la imagen que está a continuación y cite el procedimiento.

……………………………………………………………………………………………………… ………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………… ………………………………………… ………………………………………………………………………………………………..

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PRACTICA #12 MICOBACTERIAS TINCIÓN ZIEHL NEELSEN OBJETIVOS  Localizar e identificar la morfología y agrupación de las micobacterias especialmente el Mycobacterium tuberculosis en un frotis realizado con muestra de esputo tiñéndolo por medio de la Tinción Ziehl Neelsen. INTRODUCCIÓN MICOBACTERIAS Bacterias aerobias, patógenas oportunistas intracelulares, de contornos cilíndricos, no esporulados inmóviles sin flagelos sin cápsulas. No captan fácilmente los colorantes, pero una vez teñidas resisten la decoloración por ácido-alcohol, particularidad de ser acido-alcohol-resistentes. BAAR. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS También llamado Bacilo de Koch, descubierta por Robert Koch en 1882, causante de la Gran plaga blanca. Morfología Bacilos rectos cilíndricos, imposibles clasificarlos por la Tinción de Gram. Se emplea la Tinción de Ziehl-Neelsen. Crecimiento  Aerobios obligados (parásito intracelular).  Obtienen energía de la oxidación de carbono.  CO2 - > Proliferación lenta.  Cada 18h (duplican)- 22 a 33°C.  Superficie celular hidrófoba.  Sensible al calor, sobrevive en esputos secos, resistente al frío.

    

Estructura antigénica Lípidos: bicapa lipídica Ácidos micólicos: Lesionan las membranas mitocondriales, confieren la acido resistencia. Ceras y fosfolípidos: necrosis caseosa, inhiben la fusión del fagosoma con el lisosoma. Dipéptido muramilo: granulomas, inhibe la diapédesis leucocitaria Factor Cord: o cordones serpentinos, formado por un complejo de tres macromoléculas: peptidoglicano (PG), arabinogalactano (AG) y micolatos. Estimulan la enzima que hidroliza al dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADasa), disminuyendo la enzima NAD en el hospedero, la cual interrumpe la respiración mitocondrial e inhibe la diapédesis leucocitaria, causando granulomas crónicos.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA  Polisacáridos: induce la Hipersensibilidad : Antígeno Grupo I (todas), Grupo II y LLL (cepas de crecimiento lento), Grupo IV (específico)  Proteínas: Reacción de la tuberculina (PPD), formación de anticuerpos. MATERIALES Hisopo (sin el algodón). Recipiente de desechos. Lámina portaobjeto. Muestra de esputo. Servilleta y pinza. Suero fisiológico.

Equipo: Mechero o lámpara de alcohol Microscopio óptico Guantes Mascarilla

MEDIOS Y REACTIVOS Tabla 15.Proceso de Coloración de Ziehl – Neelsen

Tinción de ZiehlNeelsen 1. Carbol fucsina: solución de fucsina fenicada: 0.3 g

2. Alcohol ácido: Alcohol etílico 98% 97 ml Ácido clorhídrico2% 3 ml Azul de 3. Metileno : 0.3 g

Proceso de Coloración de Ziehl-Neelsen Tiempo de Acción: aplicación Como no captan fácilmente los colorantes, 5 minutos una vez teñidas resisten la decoloración con alcohol cetona, particularidad de ser acido-alcoholresistentes. BAAR. La fucsina fenicada penetra sus paredes de ácidos micólicos a través del calor y las tiñe de rojo Decolorante ácido-alcohol. Permite decolorar 2-3 minutos el medio de contraste

30 segundos Colorante básico de contraste.

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La muestra debe extenderse y diseminarse sobre la superficie de portaobjetos esterilizados y nuevos, desengrasados, la existencia de grietas en el portaobjetos presenta un riesgo y causa de confusión. 1. Preparación del extendido: Examen directo y homogeneizado, para la homogenización se añade un volumen equivalente de Nao al 4% (hidróxido de sodio) o suero fisiológico a la muestra. Se coloca en la estufa a 370C durante 15 a 30 minutos y se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 20 minutos. 2. Secado del extendido: Colocar el portaobjetos en posición horizontal sobre la llama de un mechero de Bunsen. 3. Fijado del extendido: Mediante el calentamiento suave, flameándolo sobre la llama. Esto se efectúa pasando 3 veces el lado del portaobjeto que no tiene la preparación sobre la llama para que adquiera una temperatura de 800C Coloración: Colocar un pequeño trozo de papel de filtro un poco más largo que el tamaño del preparado sobre el portaobjeto. Importante: el papel de filtro tiene que estar por encima del extendido. i. Cubrir el extendido con carbolfucsina. Flamear por debajo del portaobjeto hasta el desprendimiento de vapores blancos (evitar que se produzca la ebullición por exceso de calor). Dejar enfriar 3 minutos y repetir el flameado hasta nuevo desprendimiento de vapores blancos. Dejar enfriar 2 minutos. Cuando esté frio, mediante el uso de pinzas, quitar y descartar el papel filtro. ii. Lavar. iii. Cubrir la muestra con decolorante (alcohol-ácido). Dejar 2 minutos, en el caso de muestras más gruesas, se deja 3 minutos. iv. Lavar. v. Cubrir con Azul de Metileno. Dejar 30 segundos. vi. Secar el extendido. vii.Cubrir el extendido con una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio, con objetivo de 100X. viii. Observar al microscopio no menos de 100 campos.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. GRÁFICOS 1. 2. 3. 4.

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Porta lámina para la preparación del frotis. Porta placa (secador). Muestra de esputo. Hisopos

Tabla 16. Preparación del Extendido del Esputo

5. Mechero de Bunsen o lámpara de alcohol. 6 . Pinza. 7 . Recipiente de desechos 8 . Láminas porta objeto.

Preparación del extendido Ordenar las muestras. Marcar las láminas portaobjetos. Partir el hisopo (aplicador). Tomar la muestra más purulenta. Depositar en el portaobjetos. Extender la muestra uniformemente de 2 cm (longitud) por 1 cm de (ancho).

Fijar el extendido cuando este seco.

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Tabla 17. Ejemplos de Muestras de Frotis

CONCLUSIÓN  Los bacilos ácido-resistentes, comparten una característica pared celular, más gruesa que la de muchas otras bacterias, hidrofóbica, cerosa, y rica en ácidos micólicos/micolatos. La pared celular es rica en lípidos, lo que hace que su superficie sea hidrófoba y confiere resistencia frente a muchos desinfectantes y las tinciones de laboratorio. Los “bacilos ácido-alcohol resistentes” (BAAR) aparecen de color rojo sobre un fondo de azul claro, otras bacterias toman distintas tonalidades de azul. CUESTIONARIO 1. Subraye lo correcto: En relación a la morfología del Mycobacterium tuberculosis: ¿Cómo se presenta?: a) Cocos. b) Bacilo, cocobacilo, spirilum, Vibrio. c) Bacilos alargados. d) Cocobacilo, bacilo, diplo-bacilo, estreptococo. 2. Subraye lo correcto: En relación a la Tinción de Ziehl Neelsen: ¿Cuál es la composición del alcohol ácido?: a) Alcohol etílico 10%. b) Alcohol etílico 98% (97 ml) y ácido clorhídrico 5% (3 ml). c) Alcohol etílico 98% (97 ml) y ácido clorhídrico 2% (3 ml). d) HCl 6% y etanol. 3. Subraye lo correcto: Cómo se lo conoce al Mycobacterium tuberculosis? a) Bacilo de Koch. b) Bacilo de JohneFrothingham.

c) Bacilo de Hansen. d) Bacilo pulmonar.

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PRACTICA #13 PARASITOLOGIA INTRODUCCION Y GENERALIDADES IDENTIFICACION DE PARASITOS EXAMEN MICROSCOPIO EXAMEN MACROSCÓPICO OBJETIVOS  Recordar las reglas que se deben respetar y observar en el laboratorio de parasitología.  Conocer e identificar la clasificación parasitaria a través de los métodos microscópicos y macroscópicos. INTRODUCCION El laboratorio de parasitología, es una herramienta útil para la realización y confirmación de la posible presencia de parásitos, en muestras obtenidas adecuadamente. El laboratorio de parasitología cuenta con material de cristalería, así como soluciones, colorantes y equipo esencial para llevar a cabo las técnicas diagnósticas más comunes. El reconocimiento de material y equipo de laboratorio permitirá llevar a cabo las técnicas parasitoscópicas de mayor utilidad.

Identificación Asociaciones biológicas • Seres de la misma especie. – Sociedades, el individuo conserva su individualidad. – Colonias, el organismo no conserva su individualidad. • Seres de distinta especie – Parasitismo: el individuo vive a expensas del otro y le produce daño – Comensalismo: el individuo vive a expensas del otro y no le produce daño. – Mutualismo o simbiosis: dualidad, beneficio mutuo, sin causar daño. Triada ecológica • Agente y reservorio contagiante (humano, animal, inanimado) • Huésped o mesonero y su variación individual – estructura genética – inmunidad. • Edad, nutrición, protección por vacunas. • Ambiente: – mecanismos de transmisión, vía de infección fuente infectante

– probabilidad de contagio: hacinamiento, nivel de vida, hábitos y costumbres , terapia y asistencia médica.

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Parásitos: definición.• • • •

Seres eucariontes que viven a expensas de otro de distinta especie y le produce daño. Desarrollan ciclos evolutivos simples o complejos Se define el ciclo evolutivo o biológico a las etapas secuenciales del desarrollo de un parásito. Relevancia social.

Importancia de la parasitología. • •

•

Magnitud epidemiológica ( prevalencia, letalidad), impacto económico, aspectos éticos Complejidad biológica - reproducción, patogenicidad, adaptación evolutiva, ausencia de vacunas asociación a factores antropológicos culturales y bio-demográficos

Factores asociados a las parasitosis: • Socio antropológicos – Desarrollo de los pueblos: Calidad de vida: salud, alimentación, educación, vivienda, seguridad social. recreación, trabajo, vestimenta, libertades humanas, desarrollo y transporte. • Factores – biológicos : existencia de todos los eslabones del ciclo (reservorio, huéspedes) – geográficos y climáticos :humedad, latitud, altura

Clasificación de los parásitos y los huéspedes. De acuerdo a su localización en el huésped: • Ectoparásitos: viven sobre la superficie externa o cavidades que comunican al exterior. Ej.: ácaros, garrapatas, piojos. • Endoparásitos: viven dentro del cuerpo de los huéspedes. Ej. Cestodos, nematodos, protozoarios. De acuerdo a los huéspedes no habituales: • Parásitos erráticos: aparecen en órganos no habituales. Ej. Fasciola hepática en el riñón o pulmón. • Parásitos accidentales: aparecen ocasionalmente en un huésped no habitual. Ej. Diplidiumcaninum en niños.

•

Parásitos facultativos: microorganismo de vida libre (no parásitos) y pueden volverse parásitos en determinados huéspedes. Ej. Pelotera strongyloides, nematodo de vida libre que afecta a animales domésticos.

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De acuerdo al tipo de huésped y los órganos de localización: • • •

Hiperparásito: parásito que afecta a otro parásito. Ej. Diplidiumcaninum Parásito estenoxeno: afecta a la misma especie animal y a un mismo órgano. Ej. Eimeriatenella. Parásito eurixeno: puede afectar a varios huéspedes y varios órganos. Ej. Toxoplasma gondii, Tripanosoma cruzi, Crypstosporidium spp.

De acuerdo al tiempo que pasan dentro del huésped: • •

Parásito temporal: visitan al huésped en busca de su alimento. Ej. Mosquitos hematófagos, pulgas. Parásito estacionario: parásito obligado, requieren del huésped casi en la mayoría de su vida o pasan un período de su desarrollo sobre o dentro del huésped y se dividen: – Parásito periódico: permanecen parte de su ciclo de desarrollo y luego lo abandonan para completarlo y continuar un tipo de vida no parasitaria. Ej. Gasterophilusspp. – Parásitos permanentes: pasan su existencia completa en los huéspedes, excepto en las épocas en que pasan de un huésped a otro. Ej. Toxocaracanis, Trichinellaspiralis, Haemonchuscontortus.

Tipos de huéspedes: • • • • • • •

Huésped definitivo: el parásito alcanza su madurez sexual o se reproduce. Ej. Fasciola hepática (metazoario), Babesiabigemina (protozoario) Huésped intermedario: el parásito lleva a cabo alguna fase inmadura de su ciclo de vida. Huésped de transporte: el parásito pasa parte de su vida inmadura, pero no sufre desarrollo en su interior y es expulsado al final. Huésped paraténico: organismo que aloja una fase evolutiva de un parásito, pero no puede expulsarla debido a que se encuentra enquistada o encapsulada en los tejidos. Huésped reservorio: organismo vertebrado en donde se alberga un parásito o una enfermedad, es una fuente de infección. Huésped principal: organismo en el que es más frecuente la infección. Huésped suplementario: organismo en donde un parásito se encuentra en menor frecuencia.

•

Huésped accidental o vicariante: organismo en el cual un parásito puede desarrollarse pero no es habitual.

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Tipos de ciclos biológicos: • • • • •

Ciclo directo: el parásito requiere de un solo huésped para su desarrollo. Ej. Haemonchuscontortus Ciclo indirecto: el parásito necesita dos o más huéspedes para su desarrollo. Ej. Fasciola hepática. Ciclo diheteromonógeno: el parásito puede desarrollar su ciclo en forma directa o indirecta. Ej. Hymenolepis nana. Ciclo monogenético: parásito que tiene un tipo de reproducción sexual o asexual en su ciclo biológico. Ej. Ascarissuum, Tricomonasfoetus. Ciclo Heterogenético: parásito con ciclo sexual y asexual. Ej. Eimeriaspp, Babesiaspp.

Clasificación morfológica: • •

Protozoos – seres unicelulares Metazoos – seres pluricelulares Helmint os Artrópo dos

Protozoos: formas evolutivas • •

• • •

Trofozoito. – forma vegetativa, el parásito se alimenta y se reproduce Quiste. – forma de resistencia, vive en condiciones ambientales adversas. Hay quistes (simples), que provienen de un zoìto recubierto, y ooquistes, producto de un cigoto que está en fases de reproducción.

– Rizópodos: desarrollan seudópodos para su locomoción Flagelados: tienen diferente número de flagelos Ciliados: poseen cilios en su superficie

• •

Coccidios: forma de banano, poseen un cono apical, y reproducción compleja. Microsporidios: poseen esporas.

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•

Reproducción en protozoos • •

Asexuada. – binaria, esquizogonia, endodiogenia. Sexuada. – Conjugación, singamia

Helmintos: •

Nematelmintos:Gusanos redondos al corte, de diferentes tamaños, se reproducen por huevos o larvas, para crecer desarrollan mudas (ecdisis), autóctonos. Ej. Ascarislumbricoides, Enterobiusvermicularis, Trichuristrichiura, Trichinellaspiralis, Toxocaraspp.

•

Platelmintos:gusanos planos a la sección horizontal • Céstodos, gusanos en forma de cinta, de diferentes tamaños, hermafroditas, se reproducen por huevos, tienen ciclos evolutivos complejos, desarrollan estados intermediarios denominados larvas (plerocerocides, cisticercoides, etc), autóctonos. Ej. Taeniasolium, Taeniasaginata, Hymenolepis nana, D. Latum, Equinococcusgranulosus. • Tremátodos, forma de hoja, reproducción sexuada por huevos, reproducción asexuada pasando por diferentes estados larvales, autóctono. Ej. Fasciola hepática (Distoma hepático).

•

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Artrópodos: Seres de patas articuladas, simetría bilateral, cientos de especies, metamorfosis (completa, incompleta). • insectos, arácnidos, crustáceos, autóctonos: – Pediculusspp, Sarcoptesscabiei, Loxosceleslaeta, Latrodectusmacta. UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE ESCUELA LA SALUD. MEDICINA •

Tabla 18.Clasificación de Protozoarios

1. Protozoarios Seudópodos y 1) Sarcomastigophora Flagelos 2) Ciliophora Cilios 3) Apicomplexa Complejo Apical EntamoebaHistolyti 4a) Amebas intestinales ca patógenas 4b) Amebas intestinales EntamoebaHartma no nni patógenas EntamoebaColi IodamoebaButschlii Endolimax Nana DientamoebaFragili s EntamoebaGingivali s NaegleriaAcantham 4c) Amebas de vida libre oeba 5) Flagelados EnteromonasHomin intestinales y is genitales RetortamonasIntestinalis ChilomastixMesnili GiardiaLamblia TrichomonasVaginal is TrichomonasHomini s TrichomonasTenax 6) Patógenas para el Donovani

hombre Leishmania 7) Hemoflagelados

8) BALANTIDIUM COLI 9) PARÁSITOS DEL PALUDISMO

10) TOXOPLASMA GONDII 11) SARCOCYSTIS E ISOSPORA 12) PNEUMOCYSTlS CARINII

Trypanosoma

Braziliensis Trópica Rhodesiense Gambiense Cruzi Rangeli

PlasmodiumMalaria e PlasmodiumVivax (Terciano Benigno) Plasmodium (Laverania) Facilparum (Terciano Maligno) Plasmodium Ovale (Terciano)

Belli Hominis

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA ESCUELA SALUD. MEDICINA Tabla 19.Clasisificación de Helmintos

2. Helmintos D. Latum

Céstodos pseudofilideos Taeniidae Céstodos ciclofidelios

Taenia

Himenolepidida e Echinococus Dilepidida e

Dipyladium

Saginata Solium Granulosus Mutiloculares Caninum

Tabla 20.Clasificación de Tremátodos

3. Tremátodos Phylum Clase Subclase Orden Suborden SUBORDEN

Platelmintos Tremátodos Digeneos Prosostomas Strigeata Amphistoma Distoma FAMILIA

GENERO

Strigeata

Schitosomatidae

Schitosoma

Amphistoma

Paramphistomatidae

Gasrtodiscoides Watsonius

Fasciolidae

Fasciola Fasciolopsis

Distoma

Opisthorchidae Heterophyidae Troglotrematidae

Clonorchis Opisthorchis Heterophyes Metagonimus Paragonimus

ESPECIE S.haematobium S.mansoni S.japonicum S.intercatalum G. hominis W. watsoni F. hepática F. gigantica F. buski C.sinesis O.felineus O. viverrini H.heterophyes M. yokogawai P. westermani

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE ESCUELA LA SALUD. MEDICINA Tabla 21. Clasificación de Nemátodos

SUBCLASE Adenophorea (anteriormente afasmídeos)

4. Nemátodos ORDEN SUPERFAMILIA Enóplidos

Trichinelloidea

Rabdíticos Estrogilinos

Rhabditoidea Ancylotosmatoidea Metastrongyloidea Trichostrongyloidea

Secernentea (anteriormente fasmídeos)

Ascaridos

Ascaridoidea

Oxiuroideos Espirúridos

Oxyuroidea Spiruroidea Thelazoidea Gnathostomatoidea Filarioidea

Dracunculoidea

GENERO Trichinella Trichuris Capillaria Strongyloides Ancylostoma Necator Ternidens Angiostrongylus Metastrongylus Tricostrongylus Ascaris Toxocara Anisakis Lagochilascaris Enterobius Gongylonema Thelazia Gnathostoma Wuchereria Brugia Onchocerca Dipetalonema Mansonella Dirofilaria Dracunculus

EXAMEN DIRECTO MACRÓSCOPICO Fundamento Permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros o fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las heces eliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.). MATERIALES  Aplicador (baja lengua).  Pinza de metal.  Coladera de plástico o malla metálica.  Muestra de heces fecales. MEDIOS Y REACTIVOS  Suero fisiológico.

 Solución yodada de Lugol.

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PROCEDIMIENTOS  Agregar suero fisiológico/Lugol en cantidad suficiente para homogeneizar la muestra.  En caso de presencia de parásitos adultos, tamizar o colar la muestra.  Observar las características organolépticas de las heces, útiles para la ayuda diagnóstica (consistencia, color, presencia de moco, sangre, alimento sin digerir), así como la presencia de gusanos cilíndricos, anillados o aplanados (enteros o parte de ellos).

EXAMEN DIRECTO MICRÓSCOPICO Fundamento Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas móviles de parásitos de tamaño microscópico: (trofozoítos, quistes de protozoos: Entamoebahistolytica, Giardialamblia, Balantidiumcoli, etc.; así como larvas o huevos de helmintos: Strongyloidesstercoralis, Ancylostomaduodenalis, Necatoramericanus, Trichostrongylusspp., Paragonimus, Fasciola, etc.). MATERIALES Láminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos.  Aplicador de vidrio o madera.  Marcador de vidrio.  Muestra de heces fecales.

Equipo: Microscopio óptico Mascarilla Guantes

MEDIOS Y REACTIVOS  Suero fisiológico.  Solución de lugol.  Verde brillante.  Rojo neutro. PROCEDIMIENTO 1. Colocar en un extremo de la lámina portaobjeto una gota de suero fisiológico y, con ayuda de un aplicador, agregar 1 a 2 mg de materia fecal, emulsionarla y cubrirla con una laminilla cubreobjetos. 2. Colocar en el otro extremo de la lámina portaobjeto, una gota de lugol y proceder a la aplicación de la muestra fecal. 3. Con el suero fisiológico, los trofozoítos y quistes de los protozoarios se observan en forma natural, y con lugol, las estructuras internas, núcleos y vacuolas. 4. En algunos casos, se recomienda el uso de colorantes vitales, debido a que no alteran la actividad del trofozoíto. Los más usados son verde brillante 0,2% y rojo neutro 0,01%.

5. Observar al microscopio a 10X ó 40X. No es aconsejable usar objetivo de inmersión (100X), pues se puede ensuciar el microscopio.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA GRÁFICOS

Quiste de Giardialamblia con solución lugol

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CONCLUSIÓN  El estudio de la parasitología es fundamental para la identificación diferencial en el laboratorio de prácticas, aplicando el método directo macroscópico y microscópico de extendido coprológico parasitario, permite realizar determinar el diagnóstico de los protozoarios intestinales. Se ha demostrado su eficacia cuando se utiliza lugol, para la búsqueda e identificación de quistes, huevos y larvas. CUESTIONARIO 1. Subraye lo correcto Entre las características de los Nematelmintos están: a) Seres de patas articuladas, simetría bilateral, cientos de especies, metamorfosis (completa, incompleta) b) Son, gusanos redondos al corte, de diferentes tamaños, se reproducen por quistes, para crecer desarrollan mudas (ecdisis), autóctonos. Ej. Ascarislumbricoides, Enterobiusvermicularis, Plasmodium ovale. c) Son gusanos redondos al corte, de diferentes tamaños, se reproducen por huevos o larvas, para crecer desarrollan mudas (ecdisis), autóctonos. Ej. Ascarislumbricoides, Enterobiusvermicularis, Trichuristrichiura, Trichinellaspiralis, Toxocaraspp. d) Son gusanos en forma de cinta, de diferentes tamaños, hermafroditas, se reproducen por huevos, tienen ciclos evolutivos complejos, desarrollan estados intermediarios denominados larvas (plerocerocides, cisticercoides, etc), autóctonos. 2. Verdadero o Falso De acuerdo a las asociaciones biológicas: a) Parasitismo, el individuo vive a expensas del otro y no produce daño (Falso) b) Mutualismo o simbiosis: dualidad, beneficio mutuo, sin causar daño (Verdadero) c) Comensalismo, el individuo vive a expensas del otro y produce daño (Falso) 3. Subraye lo incorrecto. De acuerdo a los platelmintos a) Se dividen en céstodos y tremátodos. b) Songusanos planos a la sección horizontal c) Pertenecen a la clasificación de los helmintos. d) Forma infectante:ooquistes.

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PRÁCTICA #14 ESTUDIO MORFOLOGICO DE LOS PARASITOS Objetivos  Los estudiantes puedan identificar las características taxonómicas, morfológicas de los diferentes parasitos a estudiar. Introducción Los parásitos son organismos eucariotas que viven de otro sin necesariamente provocarles la muerte directamente, pero si afectando su condición corporal. Asociaciones biológicas  Seres de la misma especie Sociedades, el individuo conserva su individualidad Colonias, el organismo no conserva su individualidad  Seres de distinta especie Parasitismo, el individuo vive a expensas del otro y le produce daño Comensalismo, el individuo vive a expensas del otro y no le produce daño. Mutualismo, ambos obtienen beneficios.

Parasitismo Relación íntima y OBLIGATORIA entre dos individuos de distinta especie en la que uno de los simbiontes (PARASITO) depende metabólicamente del otro (hospedador) y existe respuesta inmunitaria por parte del hospedador. Tipos de parásitos: Por su tiempo de permanencia en el hospedador

Parásitos

Por su localización en el

Por su

Por su tipo de ciclo

especificidad

biológico

Por su adaptación a la vida parasita

hospedador

hacia el hospedador

Parasitosmonoxe

Parasitos

Ectoparasito Parásitos

s permanent es Parásitos temporale s

nos estenoxenos

Endoparásit os

Parásitos eurixenos

obligados Parasitosheterox enos

Parasitos facultativos

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Clasificación morfológica de los parásitos: Protozoos: seres unicelulares Metazoos: seres pluricelulares Protozoos: Son organismos microscópicos, unicelulares que viven en ambientes húmedos o directamente en medios acuáticos, la reproducción puede ser asexual (binaria, esquizogonia, endodiogenia) por bipartición y también sexual (conjugación, singamia) por isogametos o por conjugación intercambiando material genético.

En este grupo de protozoos encontramos:  Sarcodina (Amebas)  Sporozoa ( Esporozoos)  Mastigophora (Flagelados)  Ciliata (Ciliados)

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Amebas Las amebas se caracterizan por su forma cambiante, pues carece de pared celular, y por su movimiento a base de seudópodos, también usados para capturar alimentos a través de la fagocitosis. En su ciclo de vida se los encuentra en quistes y trofozoitos.

ENTAMOEBA E histolitica S dispar P

E C I E S

coli hartmanii gingivalis polecki

Graficos

GENERO ENDOLIMAX nana

IODAMOEBA butschlii

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Esporozoos Los esporozoos son paracitos obligados de diversos grupos animales. Viven dentro de las células de su huésped y pueden llegar a ser patógenos. Presentan generalmente alternancia entre fases de reproducción sexual y otras multiplicaciones asexuales. Como característica, son formadores de esporas, carecen de cilios y flagelos al menos en faces adultas. Los esporozoos atacan a todo tipo de animales causando enfermedades muy graves. Son capaces de formar esporas muy resistentes. Los más representativos son: ESPOROZOOS

ISOSPORA

CRYPTOSPORIDIUM

Son estructuras ovaladas que poseen una cubierta transparente, y en el interior se observa, uno o dos esporoblastos o la presencia de trofozoitos. Es un parasito apicomplexo intracelular obligado. El ooquiste es esférico, mide de 4-6 µm de diámetro y posee 4 esporozoitos en su interior.

Ligeramente rosados con punteados citoplasmáticos. El parásito internalizado tiene una forma irregular, descrito como ameboide. PLASMODIUM

TOXOPLASMA

Es un protozoo que mide 4 a 8 µm de largo por 2 a 4 µm de ancho, tiene forma de media luna con un extremo aguzado y el otro romo, durante su ciclo biológico el protozoo adopta esta forma de medialuna, puede tres fases que son de ooquiste, bradizoito y traquizoito

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FLAGELADOS Son organismos unicelulares móviles, algunos son autótrofos, realizan la fotosíntesis, y otros son heterótrofos, se alimentan por absorción. Viven en ambientes húmedos o en medios acuáticos, tanto en agua salada como en agua dulce. Según en hábitat se dividen:  Flagelados intestinales: (giardialamblia)  Flagelados atriales: parásitos de la boca, uretra y vagina (trichomonasvaginalis)  Hemoflagelados: se desarrolla en secreciones de la boca, flagelados de la sangre (leishmaniabrasilienzis y tripanosoma cruzi) Flagelos intestinales Giardialamblia Causa enteritis por parasitación de los primeros tramos del intestino delgado. El trofozoito presenta 8 flagelos y dos los dispuestos en simetría bilateral. En la parte anterior presenta dos discos suctorios o ventosas. Tiene una hendidura ventral de la cual salen flagelos ventrales.

Observación en el microscopio Grafico

*trofosoito de giardia

*quiste de giardia

Flagelados atriales Trichomonasvag inalis Produce una patología denominada trichomoniasis urogenital. El trofozoito presenta una morfología piriforme, posee 5 flagelos: 4 son anteriores y libres, el quinto se dirige hacia la parte posterior del cuerpo celular. Su reproducción es binaria.

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Hemoflagelados Leishmania y Tripanosoma cruzi Leishmania

Tripanosoma cruzi

Es el responsable de la enfermedad conocida como leishmaniosis. Promastigote; alargada con un cilio o flagelo anterior, en el intestino del invertebrado vector. Amastigote; esférico y con un cilio muy corto que no sobresale de la bolsa flagelar de modo que solo es apreciable en el

Parasito intracelular, es el agente etiológico del mal de chagas. Amastigote; esférico, es la forma reproductiva en el interior de las células mamíferas. Epimastigote; alargado, es la forma reproductiva en el tracto digestivo de los invertebrados y en medios de cultivo. Tripomastigote; también alargado, se encuentra en la sangre de los mamíferos y es la forma infectante de ellos.

microscopio electrónico.

Tripomastigote Promastigote

Epimastigote Amastigote

Amastigote

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Ciliados Estos paracitos presentan cilios en almenos una etapa de vida, su reproducción es asexual, la mayoría son de vida libre, aunque la mayoría son comensales de vertebrados e invertebrados. Entre estos parásitos tenemos.  Paramecium  Balantidium

Paramecium Su habitad, aguas dulces estancadas con abundantes materia orgánica, los cilios que presentan recubren todo la superficie. Puede presentar reproducción asexual, sexual.

Balantidium Se encuentra en el intestino de crustáceos, insectos, peces, mamíferos. La única especie que infecta al humano es el Balantidiumcoli. Trofozoito; son esféricos, son la etapa parasítica, están rodeado por cilios y muestran un movimiento constante. Quiste; son ovoides, son la etapa de trasmisión, pueden sobrevivir en el medio ambiente, carecen de cilios.

Quiste

Trofozoito

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Metazoos Son un grupo de organismos pluricelulares, son heterótrofos es decir necesitan ingerir materia orgánica y oxígeno para vivir. Su reproducción puede ser sexual como asexual en el caso de algunos parásitos. Se los puede clasificar en:

Platelmintos Helmintos

(planos)

Trematodos Cestodos

Nematelminto s (redondos)

Platelmintos: Conocidos también como gusanos planos son después de las esporas los metazoos más simples, presentan tejidos aunque no tienen aparato circulatorio ni respiratorio y el aparato excretor está formado por una red de conductos que permiten al animal expulsar al exterior los productos generados en su organismo. Los platelmintos son hemafróditas, es decir, el mismo individuo presenta aparato reproductor masculino y femenino. Entre los platelmintos encontramos:  Los trematodos.  Los cestodos.

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Trematodos Son parásitos que se caracterizan por tener un cuerpo único, no segmentado, en forma de hoja y revestido por un sincitio denominado tegumento. Internamente contiene aparato digestivo y sensitivo, entre otros. Presentan formas variadas según las especies. En este caso estudiaremos las de mayor relevancia para el ser humano. Schistosoma: Son el agente causal del proceso infecciosoconocido como esquitosomiasis, presentan un molusco como hospedador intermediario. Los adultos llegan a medir 10-12 mm(macho) y 1216mm (hembras), presentan ventosas, su tubo digestivo es incompleto, tiene reproducción sexual. Fasciola; caracterizado por su forma lanceolada, con dos ventosas, una bucal y otra ventral. Es parasito de los canales biliares y la vesícula biliar. Es un gusano plano, sin segmentos, carnoso, mide de 2 a 3 cm de largo por 1 a 1,5 cm de ancho. En la porción anterior presenta una ventosa bucal y otra de mayor tamaño en la zona ventral, que mide aproximadamente1,6mm. Es hermafrodita, el huevo se presenta en el extremo proximal del útero.

Microscopia electrónica del parasito Schistosoma, huevo del parasito.

Fasciola hepática adulta; huevo de la fasciola.

Huevos de P.Westermani

Parasito adulto.

Los huevos son depositados en el conducto biliar, son de color amarillento. ParagonimusWestermani:ca usan la paragonimiasis, estos parásitos se localizan preferentemente en los pulmones de los mamíferos causando inflamación interna, dolores, tos seca y fiebre. Los parásitos adultos miden 7 a 12 mm de largo por 4 a 6 mm de ancho.

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Cestodos Son parásitos obligados que a diferencia de la clase anterior no tienen aparato digestivo. Se alimentan a través de la piel de su cuerpo (osmosis). Presentan un cuerpo alargado, adaptado a la forma tubular del intestino, dividido en tres regiones: escólex (órgano de fijación), cuello (da origen a la cadena de proglotides) , estróbilo ( es el conjunto deproglotides). Taeniasolium; vive en el intestinodelgado, normalmente mide de 3 a 4 m. junto con la taeniasaginata, son conocidas como lombriz solitaria. Es un gusano en forma de cinta dividido en segmentos T a o proglótides, de color e n amarillo. i a s o l i u m a d u l t a , h u e v o s d e

Cada proglótides es una unidad de reproducción autofecundante e independiente, que produce huevos que contienen embriones infestantes; cada

t a e n i a s o l i u m .

uno contiene un promedio de 50.000 a 60.000 huevos y habitualmente se desprenden del estróbilo en cadenas cortas que se eliminan con las heces. Otros tipos de cestodos:  Taeniasaginata  Hymenolepis nana

Huevo H. Nana

 Echinococcusgranulosus  Diphylobothriumlatum.

Nematelmintos También conocidos como nemátodos, nematode.Son un filo de vermes pseudocelomados con más de 25.000 especies registradas. Se conocen vulgarmente como gusanos redondos debido a la forma de su cuerpo en un corte transversal.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Presentan aparato reproductor: Masculino: Testículos del cual parte un vaso deferente, que desemboca en la vesícula seminal y se continúa con el conducto eyaculador; expele su contenido a través de la cloaca. Femenino:Ovario del cual parte un oviducto, desemboca en el receptáculo seminal y continúa por el útero y vagina para terminar en la vulva, ubicada en la línea media ventral de la mitad anterior del cuerpo. Entre los nematelmintos encontramos: Intestinales Áscaris lumbricoides

Trichuristrichiura

Enterobiusvermicularis

Strongyloidesstercoralis

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Cuestionario Describa la siguiente imagen:

………………………………………………………………………………………… ………………………………………… Colocar en el índice correcto: a) Esporozoos b) Flagelados c) Ciliados d) Amebas

Parameciu m( ) Isospora ( ) GiardiaLambl ia( ) Entamoebahistolitic a( )

Identifique los siguientes parásitos:

………………………………… …………………………………. ………………………………..

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PRÁCTICA #15 ESTUDIO SEROLOGICO E INMUNOLOGICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS. Objetivos  Cada uno de los alumnos recibirán la capacitación metodológica práctica para el diagnóstico de infecciones por microorganismos que no se pueden cultivar.  Conocimiento del estado inmunitario de un individuo previo a una vacunación.  El diagnóstico de la enfermedad actual.  El conocimiento y diagnóstico de enfermedades infecciosas en pacientes con tratamiento antibiótico.  Capacitación y conocimiento en el diagnóstico retrospectivo (seroconversión), evaluando en el laboratorio las alteraciones inmunitarias.  Capacitación en aspectos de investigación básica seroinmunológica.

Introducción. La palabra inmunología deriva del latín immunis que significa “sin carga”, sin enfermedad, contándose que todo individuo que no tiene enfermedad es INMUNE y en el estado de la resistencia específica a una enfermedad se denomina INMUNIDAD. EL CONOCIMIENTO científico - académico y el desarrollo de la inmuno-serología durante este siglo, hace más aplicable en la práctica evidencias en la prevención, desarrollo, evolución y en el tratamiento de un gran número enfermedades infecciosas.

Cada una de las REACCIONES entre ANTIGENOS y ANTICUERPOS son respuestas de defensa a estímulos exógenos o endógenos y sus derivaciones patológicas.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Algunas de la reacciones serológicas pueden ser CUALITATIVAS y otras absolutamente CUANTITATIVAS. EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO es un proceso analítico que mide el número de anticuerpos que se producen ante la presencia de un microorganismo patógeno sea este un VIRUS, BACTERIAS, PARASITOS, HONGOS en el suero sanguíneo. Las reacciones serológicas se emplean además para IDENTIFICAR ANTIGENOS O ANTICUERPOS y estimar la cantidad relativa de cada uno de ellos. Se obtiene información definitiva de los microorganismos aislados de un individuo durante una infección. En muchas enfermedades infecciosas, el paciente desarrolla ANTICUERPOS ESPECIFICOS en el suero sanguíneo, los cuales ejercen actúan contra el agente infeccioso que se pueden identificar mediante pruebas de laboratorio in vitro, todos estos procesos son OBSERVABLES como REACCIONES SEROLOGICAS.

FLUJOGRAMA EN LA PRACTICA DEL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTOS DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS.

METODOLOGIA: I- MICROSCOPIA DIRECTA. Demostración del agente etiológico. IICULTIVO. Identificación del agente etiológico aislado III- PRUEBA DE SUSCEPTILIBILIDAD Antibiograma

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA IV- PRUEBAS SEROLOGICAS Suero del paciente. Demostración indirecta de anticuerpos asociados con el agente etiológico. VEVIDENCIA SEROLOGICA. Tipificación

VALIDACION DEL INFORME DE LA PRUEBA DE LABORATORIO. VI- INTERPRETACION CLINICA DE LA PRUEBA. En relación con: 1- Examen clínico del paciente Signos y síntomas en el paciente “cuadro de la enfermedad” 2- Historia clínica del paciente Exposición a la infección Evolución de la enfermedad Inmunizaciones previas Tratamiento recibido, etc. 3- Estudio epidemiológico del paciente VII- DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD VIII- TRATAMIENTO TERAPEUTICO. TECNICAS DE DIAGNOSTICO SERO-INMUNOLOGICO Entre las principales técnicas que se emplean para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas y sus reacciones serológicas específicas encontramos:  REACCIÓN DE PRECIPITACION.  REACCION DE AGLUTINACION.  FIJACION DE COMPLEMENTO.  INMUNOFLUORESCENCIA.  ENZIMAINMUNOANALISIS E.L.I.S.A.

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Fundamento Cada uno de los procedimientos permite observar directamente los procesos y características de la reacción ANTIGENO-ANTICUERPO de los principales microorganismos y entender cada uno de los ciclos y estadios. La especificidad en la detección de anticuerpos contra parásitos, hongos y virus. Determinar la distribución, la incidencia y prevalencia de una enfermedad. La elección de la mejor conducta terapéutica. Establecer una verdadera políticas sanitarias de salud. Mantener un estudio permanente epidemiológico.

Las enfermedades infecciosas DIAGNOSTICADAS POR EXAMENES SEROLOGICOS PUEDEN SER: SIFILIS

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA  TOXOPLASMOSIS.  LEPTOSPIROSIS  RUBEOLA  MONONUCLEOSIS INFECCIOSA  HELICOBACTER PILORY  SALMONELOSIS  RICKETTSIOSIS  TRIPANOSOMIASIS  LEISHMANIASIS  ASO  FACTOR REUMATOIDEO  PROTEINA C REACTIVA – PCR.  MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS – MICOBACTERIUM LEPRAE.

MATERIALES  Jeringas desechables 3 – 5 ml.  Algodón.  Torniquetes  Tubos de ensayos 5 – 10 cc  Gradillas porta tubos. SOLUCIONES Y REACTIVOS  Alcohol antiséptico, Suero fisiológico.  Solución yodada de Lugol. PARASITOLOGIA INTRODUCCION Y GENERALIDADES IDENTIFICACION DE PARASITOS EXAMEN MICROSCOPIO EXAMEN MACROSCÓPICO OBJETIVOS  Recordar las reglas que se deben respetar y observar en el laboratorio de parasitología.  Conocer e identificar la clasificación parasitaria a través de los métodos microscópicos y macroscópicos. INTRODUCCION El laboratorio de parasitología, es una herramienta útil para la realización y confirmación de la posible presencia de parásitos, en muestras obtenidas adecuadamente.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA El laboratorio de parasitología cuenta con material de cristalería, así como soluciones, colorantes y equipo esencial para llevar a cabo las técnicas diagnósticas más comunes. El reconocimiento de material y equipo de laboratorio permitirá llevar a cabo las técnicas parasitoscópicas de mayor utilidad.

Identificación Asociaciones biológicas • Seres de la misma especie. – Sociedades, el individuo conserva su individualidad. – Colonias, el organismo no conserva su individualidad. • Seres de distinta especie – Parasitismo: el individuo vive a expensas del otro y le produce daño – Comensalismo: el individuo vive a expensas del otro y no le produce daño. – Mutualismo o simbiosis: dualidad, beneficio mutuo, sin causar daño. Triada ecológica • Agente y reservorio contagiante (humano, animal, inanimado) • Huésped o mesonero y su variación individual – estructura genética – inmunidad. • Edad, nutrición, protección por vacunas. • Ambiente: – mecanismos de transmisión, vía de infección fuente infectante – probabilidad de contagio: hacinamiento, nivel de vida, hábitos y costumbres , terapia y asistencia médica.

Parásitos: definición.• • • •

Seres eucariontes que viven a expensas de otro de distinta especie y le produce daño. Desarrollan ciclos evolutivos simples o complejos Se define el ciclo evolutivo o biológico a las etapas secuenciales del desarrollo de un parásito. Relevancia social.

Importancia de la parasitología. •

Magnitud epidemiológica ( prevalencia, letalidad), impacto económico, aspectos éticos

•

•

Complejidad biológica - reproducción, patogenicidad, adaptación evolutiva, ausencia de vacunas asociación a factores antropológicos culturales y bio-demográficos

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Factores asociados a las parasitosis: • Socio antropológicos – Desarrollo de los pueblos: Calidad de vida: salud, alimentación, educación, vivienda, seguridad social. recreación, trabajo, vestimenta, libertades humanas, desarrollo y transporte. • Factores – biológicos : existencia de todos los eslabones del ciclo (reservorio, huéspedes) – geográficos y climáticos :humedad, latitud, altura

Clasificación de los parásitos y los huéspedes. De acuerdo a su localización en el huésped: • Ectoparásitos: viven sobre la superficie externa o cavidades que comunican al exterior. Ej.: ácaros, garrapatas, piojos. • Endoparásitos: viven dentro del cuerpo de los huéspedes. Ej. Cestodos, nematodos, protozoarios. De acuerdo a los huéspedes no habituales: • Parásitos erráticos: aparecen en órganos no habituales. Ej. Fasciola hepática en el riñón o pulmón. • Parásitos accidentales: aparecen ocasionalmente en un huésped no habitual. Ej. Diplidiumcaninum en niños. • Parásitos facultativos: microorganismo de vida libre (no parásitos) y pueden volverse parásitos en determinados huéspedes. Ej. Pelotera strongyloides, nematodo de vida libre que afecta a animales domésticos.

De acuerdo al tipo de huésped y los órganos de localización: • • •

Hiperparásito: parásito que afecta a otro parásito. Ej. Diplidiumcaninum Parásito estenoxeno: afecta a la misma especie animal y a un mismo órgano. Ej. Eimeriatenella. Parásito eurixeno: puede afectar a varios huéspedes y varios órganos. Ej. Toxoplasma gondii, Tripanosoma cruzi, Crypstosporidiumspp.

De acuerdo al tiempo que pasan dentro del huésped:

•

Parásito temporal: visitan al huésped en busca de su alimento. Ej. Mosquitos hematófagos, pulgas.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA • Parásito estacionario: parásito obligado, requieren del huésped casi en la mayoría de su vida o pasan un período de su desarrollo sobre o dentro del huésped y se dividen: – Parásito periódico: permanecen parte de su ciclo de desarrollo y luego lo abandonan para completarlo y continuar un tipo de vida no parasitaria. Ej. Gasterophilusspp. – Parásitos permanentes: pasan su existencia completa en los huéspedes, excepto en las épocas en que pasan de un huésped a otro. Ej. Toxocaracanis, Trichinellaspiralis, Haemonchuscontortus.

Tipos de huéspedes: • • • • • • • •

Huésped definitivo: el parásito alcanza su madurez sexual o se reproduce. Ej. Fasciola hepática (metazoario), Babesiabigemina (protozoario) Huésped intermedario: el parásito lleva a cabo alguna fase inmadura de su ciclo de vida. Huésped de transporte: el parásito pasa parte de su vida inmadura, pero no sufre desarrollo en su interior y es expulsado al final. Huésped paraténico: organismo que aloja una fase evolutiva de un parásito, pero no puede expulsarla debido a que se encuentra enquistada o encapsulada en los tejidos. Huésped reservorio: organismo vertebrado en donde se alberga un parásito o una enfermedad, es una fuente de infección. Huésped principal: organismo en el que es más frecuente la infección. Huésped suplementario: organismo en donde un parásito se encuentra en menor frecuencia. Huésped accidental o vicariante: organismo en el cual un parásito puede desarrollarse pero no es habitual.

Tipos de ciclos biológicos: • • • • •

Ciclo directo: el parásito requiere de un solo huésped para su desarrollo. Ej. Haemonchuscontortus Ciclo indirecto: el parásito necesita dos o más huéspedes para su desarrollo. Ej. Fasciola hepática. Ciclo diheteromonógeno: el parásito puede desarrollar su ciclo en forma directa o indirecta. Ej. Hymenolepis nana. Ciclo monogenético: parásito que tiene un tipo de reproducción sexual o asexual en su ciclo biológico. Ej. Ascarissuum, Tricomonasfoetus. Ciclo Heterogenético: parásito con ciclo sexual y asexual. Ej. Eimeriaspp, Babesiaspp.

Clasificación morfológica: Protozoos – seres unicelulares UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA • Metazoos – seres pluricelulares Helmintos Artrópodos •

Protozoos: formas evolutivas •

•

Trofozoito. – forma vegetativa, el parásito se alimenta y se reproduce Quist e. – forma de resistencia, vive en condiciones ambientales adversas. Hay quistes (simples), que provienen de un zoìto recubierto, y ooquistes, producto de un cigoto que está en fases de reproducción.

– • Rizópodos: desarrollan seudópodos para su locomoción • Flagelados: tienen diferente número de flagelos • Ciliados: poseen cilios en su superficie • Coccidios: forma de banano, poseen un cono apical, y reproducción compleja. • Microsporidios: poseen esporas.

•

Reproducción en protozoos • •

Asexuada. – binaria, esquizogonia, endodiogenia. Sexuada.

–

Conjugación, singamia

Helmintos: Nematelmintos:Gusanos redondos al corte, de diferentes tamaños, se reproducen por huevos o larvas, para crecer desarrollanmudas (ecdisis),autóctonos. Ej. •

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Ascarislumbricoides, Enterobiusvermicularis, Trichuristrichiura, Trichinellaspiralis, Toxocaraspp.

•

Platelmintos:gusanos planos a la sección horizontal • Céstodos, gusanos en forma de cinta, de diferentes tamaños, hermafroditas, se reproducen por huevos, tienen ciclos evolutivos complejos, desarrollan estados intermediarios denominados larvas (plerocerocides, cisticercoides, etc), autóctonos. Ej. Taeniasolium, Taeniasaginata, Hymenolepis nana, D. Latum, Equinococcusgranulosus. • Tremátodos, forma de hoja, reproducción sexuada por huevos, reproducción asexuada pasando por diferentes estados larvales, autóctono. Ej. Fasciola hepática (Distoma hepático).

•

Artrópodos: • •

Seres de patas articuladas, simetría bilateral, cientos de especies, metamorfosis (completa, incompleta). insectos, arácnidos, crustáceos, autóctonos: – Pediculusspp, Sarcoptesscabiei, Loxosceleslaeta, Latrodectusmacta.

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Tabla 22.Clasificación de Protozoarios

1) Sarcomastigophora 2) Ciliophora 3) Apicomplexa 4a) Amebas intestinales patógenas 4b) Amebas

1. Protozoarios Seudópodos y Flagelos Cilios Complejo Apical EntamoebaHistolytica EntamoebaHartmanni

intestinales no

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA ESCUELA SALUD. MEDICINA patógenas EntamoebaColi IodamoebaButschlii Endolimax Nana DientamoebaFragili s EntamoebaGingivali s NaegleriaAcantham 4c) Amebas de vida libre oeba 5) Flagelados intestinales EnteromonasHomin y is genitales RetortamonasIntestinalis ChilomastixMesnili GiardiaLamblia TrichomonasVaginal is TrichomonasHomini s TrichomonasTenax 6) Patógenas para el hombre Donovani Leishmania Braziliensis Trópica 7) Hemoflagelados Trypanosoma Rhodesiense Gambiense Cruzi Rangeli 8) BALANTIDIUM COLI 9) PARÁSITOS DEL PlasmodiumMalaria PALUDISMO e PlasmodiumVivax (Terciano Benigno) Plasmodium (Laverania) Facilparum (Terciano Maligno) Plasmodium Ovale (Terciano) 10) TOXOPLASMA GONDII 11) SARCOCYSTIS E ISOSPORA Belli Hominis 12) PNEUMOCYSTlS CARINII

Tabla 23.Clasisificación de Helmintos

2. Helmintos D. Latum

Céstodos pseudofilideos Taeniidae Céstodos ciclofidelios

Taenia

Himenolepidida e Echinococus

Saginata Solium Granulosus Mutiloculares

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA ESCUELA SALUD. MEDICINA Dilepididae Dipyladium

Caninum

Tabla 24.Clasificación de Tremátodos

3. Tremátodos Phylum Clase Subclase Orden Suborden SUBORDEN

Platelmintos Tremátodos Digeneos Prosostomas Strigeata Amphistoma Distoma FAMILIA

GENERO

Strigeata

Schitosomatidae

Schitosoma

Amphistoma

Paramphistomatidae

Gasrtodiscoides Watsonius

Fasciolidae

Fasciola Fasciolopsis

Distoma

Clonorchis Opisthorchis

Opisthorchidae Heterophyidae

Heterophyes Metagonimus Paragonimus

Troglotrematidae

ESPECIE S.haematobium S.mansoni S.japonicum S.intercatalum G. hominis W. watsoni F. hepática F. gigantica F. buski C.sinesis O.felineus O. viverrini H.heterophyes M. yokogawai P. westermani

Tabla 25. Clasificación de Nemátodos

SUBCLASE Adenophorea (anteriormente afasmídeos) Secernentea (anteriormente

ORDEN

4. Nemátodos SUPERFAMILIA

Enóplidos

Trichinelloidea

Rabdíticos

Rhabditoidea

GENERO Trichinella Trichuris Capillaria Strongyloides Ancylostoma

fasmídeos)

Estrogilinos

Ancylotosmatoidea

Necator

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA ESCUELA SALUD. MEDICINA Metastrongyloidea Trichostrongyloidea Ascaridos

Ascaridoidea

Oxiuroideos Espirúridos

Oxyuroidea Spiruroidea Thelazoidea Gnathostomatoidea Filarioidea

Dracunculoidea

Ternidens Angiostrongylus Metastrongylus Tricostrongylus Ascaris Toxocara Anisakis Lagochilascaris Enterobius Gongylonema Thelazia Gnathostoma Wuchereria Brugia Onchocerca Dipetalonema Mansonella Dirofilaria Dracunculus

EXAMEN DIRECTO MACRÓSCOPICO Fundamento Permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros o fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las heces eliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.). MATERIALES  Aplicador (baja lengua).  Pinza de metal.  Coladera de plástico o malla metálica.  Muestra de heces fecales. MEDIOS Y REACTIVOS  Suero fisiológico.  Solución yodada de Lugol.

PROCEDIMIENTOS  Agregar suero fisiológico/Lugol en cantidad suficiente para homogeneizar la muestra.  En caso de presencia de parásitos adultos, tamizar o colar la muestra.

 Observar las características organolépticas de las heces, útiles para la ayuda diagnóstica (consistencia, color, presencia de moco, sangre, alimento sin digerir), así como la presencia de gusanos cilíndricos, anillados o aplanados (enteros o parte de ellos).

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EXAMEN DIRECTO MICRÓSCOPICO Fundamento Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas móviles de parásitos de tamaño microscópico: (trofozoítos, quistes de protozoos: Entamoebahistolytica, Giardialamblia, Balantidiumcoli, etc.; así como larvas o huevos de helmintos: Strongyloidesstercoralis, Ancylostomaduodenalis, Necatoramericanus, Trichostrongylusspp., Paragonimus, Fasciola, etc.). MATERIALES Láminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos.  Aplicador de vidrio o madera.  Marcador de vidrio.  Muestra de heces fecales.

Equipo: Microscopio óptico Mascarilla Guantes

MEDIOS Y REACTIVOS  Suero fisiológico.  Solución de lugol.  Verde brillante.  Rojo neutro. PROCEDIMIENTO 6. Colocar en un extremo de la lámina portaobjeto una gota de suero fisiológico y, con ayuda de un aplicador, agregar 1 a 2 mg de materia fecal, emulsionarla y cubrirla con una laminilla cubreobjetos. 7. Colocar en el otro extremo de la lámina portaobjeto, una gota de lugol y proceder a la aplicación de la muestra fecal. 8. Con el suero fisiológico, los trofozoítos y quistes de los protozoarios se observan en forma natural, y con lugol, las estructuras internas, núcleos y vacuolas. 9. En algunos casos, se recomienda el uso de colorantes vitales, debido a que no alteran la actividad del trofozoíto. Los más usados son verde brillante 0,2% y rojo neutro 0,01%. 10. Observar al microscopio a 10X ó 40X. No es aconsejable usar objetivo de inmersión (100X), pues se puede ensuciar el microscopio. GRÁFICOS

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Quiste de Giardialamblia con solución lugol

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PROCEDIMIENTOS  Agregar suero fisiológico/Lugol homogeneizar la muestra.

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en

cantidad

suficiente

para

 En caso de presencia de parásitos adultos, tamizar o colar la muestra.

UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA  Observar las características organolépticas de las heces, útiles para la ayuda diagnóstica (consistencia, color, presencia de moco, sangre, alimento sin digerir), así como la presencia de gusanos cilíndricos, anillados o aplanados (enteros o parte de ellos).

GRÁFICOS

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