Dosage Des Phénols Et Des Flavonoïdes Totaux

Dosage des Phénols et des Flavonoïdes Totaux

I. Dosage des phénols Totaux 1-Principe : Le dosage des phénols totaux se fait à l’aide du Réactif de Folin-Ciocalteu (RFC), qui en présence de polyphénols et en milieu alcalin se réduit en oxyde de tungstène et de molybdène donnant une couleur bleue. Les composés phénoliques réagissent en en milieu basique (pH ~ 10) avec le RFC. En effet, dans ces conditions, la dissociation d'un proton phénolique mène à un anion phénolate, qui est capable de réduire le RFC par des réactions réversibles impliquant le transfert d’un ou de deux électrons. Cette réaction conduit à la formation d’espèces chimiques de couleur bleue, probablement le complexe (PMoW11O40)4-. Le RFC pouvant être réduit par beaucoup de composés non phénoliques (par exemple la vitamine C, le Cu (I), etc.)], ce réactif n’est donc pas spécifique aux composés phénoliques(1). Le composé phénolique standard utilisé dans cette méthode est l'acide gallique. Les teneurs des phénols totaux sont calculés à l’aide de l’équation de la courbe d’étalonnage de l’acide gallique. 2-Réactifs et Matériels :  Une solution de l’échantillon de concentration 1 mg/ml préparée dans un mélange méthanol/eau  Méthanol  l’eau ultra pure  Le réactif Folin-Ciocalteu (dilué à 1/10 dans de l’eau ultra pure)  Le carbonate de sodium Na2CO3 (1M)  L’acide gallique  Micropipettes  Tubes  Béchers  Portoirs

3- Méthode expérimentale : le réactif Folin-Ciocalteu (dilué à 1/10 dans de l’eau ultra pure)

FC

FC + Poly

Jaune

Bleue

Exple : Vt =100ml et FC=1/10 Donc on met 10 ml de réactif de Folin dans un fiole de 100 ml puis on complète jusqu’au trait de jauge.



la solution de carbonate de sodium Na2CO3 (1M) 4ml par tube, comment

calcule la masse(m) ? On a M = 105,99g/mol et m = C*V*M ; avec M : masse molaire Exemple: on a VT=50ml, m = 1M*5010-3ml*105,99g/mol m = 5,30g dans 50ml d’eau ultra pure



Req : une masse de l’extrait de 1 mg est dissoute dans un mélange

méthanol/eau (50:50) pour donner une concentration massique de 1 mg/ml: on doit la dissoudre tout d’abord dans le méthanol ensuite dans l’eau. D’après la méthode décrite par Pourmorad et al. (2), une prise d’essai de 0,5 ml d’une solution mère de concentration 1 mg/ml préparée dans un mélange méthanol/eau (50:50) est mélangée avec 5 ml de réactif Folin-Ciocalteu (dilué à 1/10 dans de l’eau ultra pure) et 4 ml de carbonate de sodium Na2CO3 (1M). Le mélange est agité puis laissé pendant 15 minutes à l’obscurité et à température ambiante. A la fin de la réaction, la solution obtenue présente une coloration bleue foncée dont on mesure l’absorbance à la longueur d’onde 765 nm. La teneur en phénols totaux est exprimée par rapport à un composé référence qui est l’acide gallique, dont la structure est représentée sur la figure suivante. OH O OH HO OH

Figure1. Structure chimique de l’acide Gallique

Pour cela, une gamme étalon de cet acide a été réalisée avec 6 niveaux de concentrations (0 ; 50 ; 100 ; 150 ; 200 ; 250 et 300 µg/ml), puis la courbe d’étalonnage donnant la variation de l’absorbance à 765 nm en fonction de la concentration a été tracée. La lecture de l’absorbance a été réalisée à l’aide d’un spectrophotomètre UV/vis de marque JASCO série V350. Les teneurs en phénols totaux des différents extraits ont été déterminées directement à partir de la courbe d’étalonnage (Figure 2) qui présente un coefficient de régression proche de 1 (r² = 0.9957). [AG]µg/ml Vi µl VMeoh µl

0 0 500

50 25 475

FC Na2CO3

100 * *

150 * *

200 * *

250 * *

300 * **

5ml 4ml

Exemple de calcul: On a : Ci*Vi=Cf*Vf Vi= Cf*Vf/Ci Ci = 1000 µg/ml Cf = 50 µg/ml Vf = 500 µl Donc Vi= 25µl Même démarche pour l’extrait MeOH avec les concentrations [0, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250 et 300 µg/ml]. Les valeurs sont exprimées en mg d’équivalent acide gallique par gramme de matière végétale sèche (mg EAG/g MS) ou en mg d’équivalent acide gallique par gramme d’extrait (mg EAG/g extrait) (3). Exemple : L’extrait méthanolique de la marjolaine présente une teneur des phénols totaux estimée à 215,92 mgGAE/g ou 57,86 mgGAE/gMS.

absorbance à 765 nm 1,4 1,2 1,0

y = 0,0052x + 0,0258 R2 = 0,9957

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0

50

100

150

200

250

300

concentration Ac.gallique(µg/ml)

Figure 2. Courbe d’étalonnage de l’acide gallique

II. Dosage des flavonoïdes totaux 1-Principe : Le dosage des flavonoïdes totaux est basé sur un test colorimétrique utilisant le trichlorure d’aluminium AlCl3. En effet, il a été démontré que ce réactif forme des complexes acides stables soit avec le carbonyle (C=O) en position C-4, soit avec le groupe hydroxyle en C3 ou C-5 des flavones et des flavonols. Par ailleurs, AlCl3 peut également former des complexes acides labiles avec les groupements orthodihydroxyles éventuellement présents sur le noyau A et/ou B des flavonoïdes. Chang et al (4) ont montré que les complexes formés par l’AlCl3 avec 15 composés flavonoliques références présentent une absorption maximale à des longueurs d’onde variant entre 415 et 440 nm. La teneur des flavonoïdes totaux peut être calculée à partir de l’équation de la courbe d’étalonnage d’un flavonoïde pris comme référence. Nous avons choisi de réaliser le dosage à l’aide d’un composé standard, à savoir la quercétine. Ce dernier appartient à la classe des flavonols, son structure chimique est présentée dans la Figure 3.

Figure3. Structure chimique de la Quercétine

2-Réactifs et Matériels :

 Une solution de l’échantillon de concentration 1 mg/ml (préparée dans le méthanol)  Méthanol  l’eau ultra pure  le trichlorure d’aluminium (AlCl3, 6H2O)  L’acétate de sodium (1M)  Quercétine  Micropipettes  Tubes  Béchers 3-Méthode expérimentale : 

(AlCl3, 6H2O) (10%)

1mg dans 10ml d’eau ultra pure



l’acétate de sodium (1M) comment calculer la masse(m) ?

Exple : pour V= 20ml on a m = M*V*C = 82,03 g/mol *20 10-3 ml* 1M = 1.64g dans 20ml Les flavonoïdes totaux ont été déterminés suivant la méthode décrite par Pourmorad et al (2) avec quelques modifications. Ainsi à 0,5 ml d’une solution de concentration 1 mg/ml de l’extrait on ajoute 1,5 ml de méthanol, 0,1 ml d’ (AlCl3, 6H2O) à 10%, 0,1 ml d’acétate de sodium (1M) et 2,8 ml d’eau ultra pure. Le mélange est agité vigoureusement puis laissé pendant 30 minutes à l’obscurité. La lecture de l’absorbance a été réalisée à 430 nm. La courbe d’étalonnage de la quercétine a été réalisée dans les mêmes conditions avec 6 niveaux de concentration (0, 20, 40, 60, 80,100 et 120µg/ml). La courbe d’étalonnage (figure 4) présente un coefficient de régression proche de 1 (r² = 0.9967). Ce tableau présente les étapes de préparation de la gamme étalon de la quercétine. (Quercétine µg/ml) Vi de la sol° mère (µl) VMeOH (µl) méthanol AlCl3 Acétate de sodium

0 0

20 10

40 20

80 40

100 50

120 60

500

490

480

460 1 .5 ml 0.1ml 0.1ml

450

440

Eau ultra pure

2.8ml

Les teneurs en flavonoïdes totaux sont exprimées en mg d’équivalent quercétine par gramme de matière végétale sèche (mg EQ/g MS) ou en mg d’équivalent quercétine par gramme d’extrait (mg EQ/g extrait) Exemple : La teneur des flavonoïdes totaux est exprimée en équivalent quercétine, et a été estimée à 23,70 mg EQ /g ou 6,35 mg EQ/g MS dans la Marjolaine. absorbance à 430nm 1,2 1,0 0,8 y = 0,010x R² = 0,996

0,6 0,4 0,2 0,0 0

20

40

60

80 100 120 concentration de la quercétine (µg/ml)

Figure4. Courbe d’étalonnage de la Quercétine

Mesure de l’activité antioxydante I-Activité antiradicalaire contre le DPPH 1-Principe L’activité antiradicalaire est mesurée par la dégradation du DPPH, ou le 2,2diphényle-1-picrylhydrazyl, qui est un radical synthétique qui peut être solubilisé et stabilisé dans le méthanol, donnant une coloration violette en solution et absorbant ainsi dans le domaine visible à la longueur d’onde 515 nm (5).

Figure5. Structure chimique de la DPPH

En contact d’antioxydants, la couche électronique de ce radical est saturée, (il s’agit d’une réduction, qui se traduit par un transfert d’un atome d’hydrogène sur l’atome d’azote du radical DPPH∙) ce qui a pour résultat sa décoloration (la solution qui vire vers le jaune). Cette propriété permet de suivre la capacité de l’extrait de la plante à piéger ce radical. Expérimentalement, la réaction consiste à mettre la solution de DPPH∙ en présence de différentes concentrations d’un extrait susceptible d’avoir un effet antiradicalaire et de mesurer la capacité de ce dernier à réduire le radical DPPH∙ en DPPH-H selon la réaction suivante : DPPH ∙ + AH Avec (AH) un composé antioxydant (5).

DPPH-H +A∙

L’importance de la décoloration, qui provoque la diminution de l’absorbance à 515 nm, est proportionnelle au pouvoir antiradicalaire de l’extrait testé. 2-Réactifs et Matériels : DPPH (0,1 mM) Extrait méthanolique du Marjolaine TROLOX BHT Méthanol Tubes Micropipettes Portoirs 3-Méthode expérimentale : Comment calculer la masse de DPPH ? Le DPPH est une poudre C= 10-4M M= 394.32g/mol La masse de DPPH : m = nombre de mole*masse molaire= n*M= C*V*M V : volume total de DPPH qui sera utilisé Req : la solution de DPPH est préparée fraichement dans le MeOH dans le même jour de la réalisation du test. Comment calculer la concentration de TROLOX (800 µmol/l)? Masse de trolox= nombre de mole* masse molaire 800 µmol est équivalent à 800.106 mol m trolox= 800.106 * 250.29=0.200 g dans un litre pour avoir concentration molaire 800 µmol/l Exemple : pour une concentration [Trolox]= 800µmol/l on prend 1mg dans 5ml MeOH. L’activité antiradicalaire de DPPH∙ a été déterminée en se basant sur les essais décrits par W. Binsan et al. (2008) (6), avec quelques modifications. Ainsi à 1 ml de l’extrait à tester, on ajoute 2 ml de la solution méthanolique de DPPH∙ de concentration 0,1 mM. Après agitation vigoureuse, le mélange est incubé pendant 1 heure à l’obscurité et à température ambiante, puis l’absorbance est mesuré à 515 nm par un spectrophotomètre UV vis (JASCO-V530). Une

solution contenant 1 ml de méthanol et 2 ml de DPPH∙ considérée comme blanc analytique est préparée en parallèle. L’estimation de l’activité antiradicalaire est exprimée par la valeur du pourcentage d’inhibition (%I) calculé à l’aide de la formule suivante (7): %I = [(Abs0 – Abs1)/Abs0)] x100 Avec Abs0 : absorbance du blanc analytique. Abs1 : absorbance de la solution en présence d’extrait. La courbe donnant la variation du (%I) en fonction des différentes concentrations de l’extrait (0, 10, 20, 40, 60,80 et 100 µg/ml), permet de déterminer l’activité antiradicalaire ou EC50 (Efficient Concentration 50%), défini comme étant la quantité d’extrait nécessaire pour diminuer de moitié la concentration initiale de DPPH (7). Les résultats peuvent également être exprimés par rapport aux molécules références, le Trolox et la BHT, avec les gammes de concentrations respectives de (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 et 25 µg/ml) et (0, 15, 25, 40, 60, 80 et 100 µg/ml). Ce tableau présente les différentes dilutions pour l’extrait MeOH et on adopte la même démarche pour le Trolox et le BHT. (Ext MeOH)µg/ml Vi (µl) VMeoh (µl) VDPPH (ml)

0

10

20

0 1000

10 990

20 980

40

60

80

100

40 60 960 940 2(pour chaque tube)

80 920

100 900

absorbance (515nm) 0,8 0,7 0,6

y = -0,029x + 0,749 R² = 0,988

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0

5

10

15

20

25 Concentration(ug/ml) 30

Figure6. Variation de la densité optique de DPPH en fonction des concentrations

massiques de Trolox

absorbance(51 5nm)

0,8 0,7

0,6 0,5

y = -0,007x + 0,749 R² = 0,988

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0

20

40

60

80

100 120 Concentration(Umol/l)

Figure7. Variation de la densité optique de DPPH en fonction des concentrations molaires de Trolox

% d'inihibition de DPPH 100 90 80 marjolai ne

70 60

BHT

50 40 30 20 10 0 0

20

40

60

80

100 120 concentrations des extraits (µg/ml)

Figure 8. Pourcentage d’inhibition (%) de DPPH en fonction des différentes

concentrations de l’extrait brut de la marjolaine comparée avec le BHT