UJI ENDOTOKSIN Pengujian endotoksin bakteri adalah uji untuk mendeteksi atau menghitung endotoksin bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel uji. Pengujian dilakukan menggunakan Limulus Amebocyte Lysate (LAL) yang diperoleh dari ekstrak air amebosit dalam kepiting ladam kuda yang dibuat khusus dengan pereaksi LAL. Depirogenasi peralatan gelas dan bahan tahan panas dalam oven udara panas menggunakan proses yang telah divalidasi. Waktu yang diperlukan 30 menit pada 250◦C. Gunakan LAL dengan sensitivitas tidak kurang dari 0,15 UE per mL. Penyiapan larutan uji dengan cara melarutkan atau mengencerkan obat atau dengan mengekstraksi alat kesehatan dengan air pereaksi LAL. Untuk beberapa bahan atau sediaan lebih baik dilarutkan, diencerkan atau diekstraksi dalam larutan mengandung air lainnya. Teknik Pengujian 1. Pembentukan Jendal Gel Prinsip : Cara jendal gel mendeteksi atau menghitung endotoksin berdasarkanpembentukan jendal dari pereaks LAL dengan adanya endotoksin. Prosedur Uji konfirmasi kepekaan pereaksi LAL yaitu dengan pereaksi larutan LAL yang diambil sebanyak 0,1 mL ditambahkan larutan baku sebanyak 0,1 mL. Kemudian diinkubasi selama 60±2 menit dengan suhu 37±1◦C. Kemudiandiambil tabung dari inkubator dan balikkan 180◦C, jika terbentuk gel yang kuatcatat hasil positif, jika gel tidak terbentuk gel catat hasil negatif. Jika hasil pengukuran kepekaantidak kurang dari 0,52 dan tidak lebih dari 2λmaka kepekaan yang tercantum di etiket sesuai dan dapat digunakan dalam pelaksanaan pengujian dengan lysate.
Uji faktor pengganggu untuk cara jendal gel Larutan
Pengenceran
Bb
Konsentrasi endotoksin/larutan yang ditambahkan endotoksin 0/Larutan sampel yang diencerkan 2 λ/larutan sampel
Cc
2 λ/ Air pereaksi LAL
Air pereaksi LAL
Aa
Faktor Pengencer
Kadar Endotoksin Awal
Jumlah replikasi 4
Larutan sampel
1 2 4 8 1 2 4 8
2λ 1λ 0,5 λ 0,25 λ 2λ 1λ 0,5 λ 0,25 λ
Dd 0/Air pereaksi LAL Larutan A : Larutan sampel dari sediaan uji yang bebas endotoksin
4 4 4 4 2 2 2 2 2
Larutan B : Uji Faktor pengganggu Larutan C : Kontrol kepekaan pereaksi LAL sesuai etiket Larutan D : Kontrol negatif air pereaksi LAL Uji dinyatakan absah bila larutan A dan D memberikan hasil negatif dan hasil larutan C sesuai dengan lkepekaan yang tertera pada etiket. Jika kepekaan yang diperoleh dalam larutan uji pada larutan B tidak kurang dari 0,5 λ dan tidak lebih dari 2 λ, maka larutan uji tidak mengandung pengganggu. Gangguan dapat diatasi dengan penyaringan, netralisasi, dialisis atau pemanasan. Konsentrasi endotoksin yang dibutuhkan untuk menyebabkan Lysate menjendal pada kondisi dinyatakan sebagai kepekaan pereksi LAL yang tertera pada etiket. Uji konfirmasi kepekaan pereaksi LAL yang tercantum dalam etiket dan uji faktor pengganggu untuk menjamin presisi dan keabsahan pengujian. Prosedur Uji penyiapan larutan untuk pengujian batas pembentuk jendal gel Latutan A B C D
Kadar Endotoksin 0/Larutan sampel yang diencerkan 2 λ/larutan sampel yang diencerkan 2 λ/Air pereaksi LAL 0/air pereaksi LAL
Jumlah Replikasi 2 2 2 2
Yang merupakan kontrol positif adalah larutan B dan C dengan konsentrasi 2 kali kepekaan pereaksi LAL. Larutan D adalah kontrol negatif. Kedua replikasi larutan B dan C memberikan hasil positif dan kedua kontrol larutan D adalah negatif. Memenuhi syarat hasil jika hasil negatif pada kedua tabung reaksi larutan A, sebaliknya tidak memenuhi syarat jika larutan A memperoleh hasil positif. Maka ulangi pengujian jika hasil positif pada satu tabung larutan A dan hasil negatif pada tabung lain. Sediaan memenuhi syarat jika diperoleh hasil negatif pada kedua tabung reaksi berisi larutan A pada pengujian ulang. Jika pengujian positif untuk sediaan uji dengan pengenceran lebih kecil dari PMA , pengujian dapat diulang dengan pengenceran tidak melebihi PMA.
Penetapan kadar endotoksin bakteri dengan jendal gel Larutan
Aa
Konsentrasi endotoksin/larutan yang ditambahkan endotoksin 0/Larutan sampel yang diencerkan
Bb Cc
2 λ/Larutan sampel 2 λ/Air pereaksi LAL
Dd
0/Air pereaksi LAL
Pengenceran
Faktor Pengencer
Air pereaksi LAL
1 2 4 8 1 1 2 4 8
Kadar Endotoksin Awal
Jumlah replikasi 2
2λ 2λ 1λ 0,5 λ 0,25 λ
2 2 2 2 2 2
2. Fotometrik a. Metode Turbidimetri Didasarkan pada hubungan kuantitatif antara kadar endotoksin dan kekeruhan dan campuran reaksi pada akhir masa inkubasi b. Metode Kromogenik
-Kromogenik titik akhir Didasarkan pada hubungan kuantitatif antara kadar endotoksin dan pelepasan kromofor pada akhir masa inkubasi. -Kromogenik Kinetika Didasarkan pada mengukur waktu yang dibutuhkan untuk mencapai nilai serapan yang telah ditentukan atau kecepatan pembentukan warna.
Thank you for interesting in our services. We are a non-profit group that run this website to share documents. We need your help to maintenance this website.