diseños experimentales2

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES Y DEL AMBIENTE

PROYECTO DE INVESTIGACION Efecto de cuatro proporciones proporciones de fitohormonas fitohormonas en la propagación y crecimiento de brotes en el cultivos invitro de las especies polylepis incana,  polylepis racemosa racemosa y polylepis micropylla micropylla

CATEDRA: DISEÑOS EXPERIMENTALES ESTUDIANTES: Pacheco Méndez, Luz Denisse Pineda Coronel, Benji Oscar  CATEDRATICO: Ing. Orellana Mendoza, Edith Pilar SEMESTRE: IX HUANCAYOHUANCAYO- PERÚ 2017

I.TITULO Efecto de cuatro proporciones proporciones de fitohormonas en la propagación propagación y crecimiento de brotes en el cultivos invitro de las especies  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla

II.-PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO 2.1.- Planteamiento del problema Los bosques bosques de polylepis sp. Representan uno de los ecosistemas ecosistemas más vulnerables de los Andes peruanos según Servat, Hurtado, Mendoza, Olarte (2002).Jaramillo Palacios (2008) menciona que en los últimos años años los bosques bosques de polylepis sp. como como el de otras especies endémicas han sufrido una alarmante disminución poblacional debido a distintos factores antropogénicos como la tala, extracción de leña, introducción de otras especies, el incremento de las áreas de pastoreo y sembríos en la zona, llevando a las especies a un  proceso de extinción. A raíz de la aparición de una necesidad de conservar estas especies se ha recurrido al uso de la tecnología para propagar y conservar especies forestales forestal es atraves de los cultivos in vitro y la micropropagación. Buscando Buscando el método más efectivo utilizando factores que que puedan ser controlados de de manera que se obtenga obtenga una influencia  positiva en la propagación propagación de especies. especies. (Castillo Alicia ,2004) Actualmente el cultivo in vitro se ha constituido en una vía excelente para incrementar incrementar el número de individuos de especies leñosas, especialmente las que se encuentran bajo estado de conservación. (Uribe Moraga & Cifuentes Luis, 2004) El proceso de propagación propagación natural de especies, especies, tanto que las condiciones condiciones ambientales ambientales como (nutrimentos, temperatura, agua y luz) y algunas sustancias endógenas del crecimiento (comúnmente conocidas conocidas como fitohormonas) son determinantes. Para lo cual “El cultivo in vitro es una herramienta que permite reducir el efecto de estas variables y

 proveer un ambiente ambiente controlado y libre de contaminantes. contaminantes. Identificando las variables variables más influyentes. (Araya, Gómez hidalgo & Valverde, 2000) Uribe moraga moraga &Cifuentes &Cifuentes Luis (2004),señalan que en algunas algunas especies especies el desarrollo desarrollo de yemas en el cultivo invitro invitro se ve favorecido favorecido por por el medios nutritivos nutritivos reducidos en concentraciones concentraci ones de sales , y la adecuada aplicación aplicaci ón de fitohormanas fitohor manas concordando con Jaramillo Palacios (2008) (2008) en su estudio de Evaluación de medios de inducción, inducción, control de la oxidación y contaminación en el cultivo in vitro de Junna ( Polylepis microphylla)

con un 70% de sobrevivencia de brotes y Carranza, Reyes, Mora, Cevallos, Escobar, Cadme,Nieto & Morante (2013)que estudiaron la propagación clonal in vitro de swietenia macrophylla king (caoba).concluyendo que el uso adecuado de fitohormonas durante el  proceso invitro puede favorecer con un porcentaje del 95% de sobrevivencia y una tasa alta de multiplicación. 2.2.-Formulacion del problema 2.2.1.-Problema general 

¿Cómo influyen 4 proporciones de fitohormonas en la propagación y crecimiento de brotes en el cultivos invitro de las especies  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla?

2.2.1.-Problemas específicos 

¿Cómo influye 4 proporciones de fitohormonas en el prendimiento de explamtes en el cultivo invitro de  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla?



¿Cuál es la influencia 4 proporciones de fitohormonas de cultivo in vitro en el crecimiento radicular de brotes de las especies  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla



¿Cuál es la influencia de las proporciones de BPA Y ANA en la multiplicación de brotes en el cultivo invitro de  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla?

3.-MARCO TEORICO 3.1.-Estado del arte Celestino, Hernández, Carneros, López-Vela & Toribio(2005) presentan La embriogénesis somática como elemento central de la biotecnología forestal en la cual nos dicen que Para dar sentido agronómico a diferentes biotecnologías de aplicación, esto es,  para poder transferir las posibilidades que ofrecen a la actividad operativa, es necesario disponer de una técnica fiable de regeneración de plantas. El cultivo de tejidos de genotipos valiosos, de meristemos libres de virus, de células transformadas, etc., no sirve de nada desde un punto de vista aplicado si de ellos no es posible conseguir la multiplicación en masa de dichos genotipos selectos, obtener plantas saneadas o lograr  plantas transgénicas, en condiciones económicamente viables. La embriogénesis somática está ampliamente considerada como la mejor vía de regeneración que utiliza las

técnicas de cultivo de tejidos vegetales en biotecnología forestal. Los avances actuales en  biotecnología-genómica están teniendo un gran impacto en el uso de material selecto en muchos programas de mejora. La embriogénesis somática está contribuyendo a la  producción de plantas transgénicas y a la consecución de la silvicultura clonal de alta  productividad, con calidad de madera mejorada y menor impacto de enfermedades, en  plantaciones forestales. Este artículo revisa la situación actual de la embriogénesis somática aplicada a especies forestales. Vega, Bermejo, Villegas, Quezada, Aguilar & Conde(2007) nos dicen que el Polylepis tomentella ssp. nana es una especie endémica de Bolivia, está considerada En Peligro (EN), por lo cual es necesario el desarrollo de iniciativas que promuevan su conservación, siendo una alternativa el uso de técnicas de cultivo de tejidos vegetales. Se utilizaron yemas apicales que fueron desinfectadas en etanol e hipoclorito de sodio, evaluando el efecto del tiempo de inmersión, adición de carbón activado y aplicación de una solución antioxidante para su establecimiento in vitro. Los explantes que obtuvieron fueron sembrados en medio basal Chu et al. (1975). En la fase de multiplicación, los brotes se subdivididos siendo introducidos en el medio de Tremblay & Lalonde (1984), variando la concentración de los fitorreguladores para incrementar el número de brotes por explante. En la fase de enraizamiento se comparó el efecto de diferentes medios de cultivo sobre el número y la longitud de las raíces generadas in vitro. El tratamiento óptimo para la desinfección de yemas apicales consistió en la inmersión en solución de hipoclorito de sodio al 2% por 10 minutos; por otra parte, la aplicación de una solución de ácido cítrico/ácido ascórbico resultó ser efectiva para el control de la oxidación. La adición de carbón activado al medio de cultivo tuvo un efecto inhibidor en el crecimiento, incluso generando la necrosis de los tejidos. Para la multiplicación in vitro, el mejor medio fue, Tremblay & Lalonde (1984) suplementado con 0.23 mg/l de bencil aminopurina y 0.1 mg/l de acido indol butírico. En la fase de enraizamiento, el tratamiento óptimo tanto para la formación como para el desarrollo radicular de vitroplantas fue el medio de cultivo McCown & LLoyd (1980), al 50%, suplementado con 50 g/l de sacarosa y 0.1 mg/l de acido indol acético. Jaramillo, Jadan & Segovia (2008) presentan la Evaluación de medios de inducción, control de la oxidación y contaminación en el cultivo in vitro de Junna ( Polylepis microphylla) El género Polylepis es la vegetación leñosa dominante del páramo que crece a mayor altura en Sudamérica. Se encuentra ampliamente distribuido a lo largo de los

Andes, cumple una función fundamental para la captación de agua. En la última década el hábitat de este género ha sido dramáticamente fragmentado, Polylepis microphylla actualmente es una especie vulnerable y en peligro de extinción local. Una técnica  biotecnológica como medida de conservación de esta especie es la micropropagación, la finalidad de este estudio es determinar el mejor medio de establecimiento que es una de las primeras fases de la micropropagación. En los primeros intentos por establecer explantes de P. microphylla in vitro se observó una alta contaminación y ennegrecimiento de los tejidos. En el presente trabajo se evaluó el mejor tiempo de inmersión (10, 20 y 30 min.) y tres concentraciones de (10, 20 y 30%) de cloro comercial (5,25% de hipoclorito de sodio) en la desinfección de explantes de P. microphylla. El tratamiento 10 min. en cloro comercial al 30% mostró el menor porcentaje de contaminación y la mayor sobrevivencia de los explantes. El mejor método de control de oxidación fue una modificación de la concentración de nutrientes del medio (K ,N, FeSO4 y sacarosa) minimizando la oxidación fenólica, y permitiendo mayor sobrevivencia de los tejidos. Suárez, Jarma & Avila (2006) evaluaron el desarrollo de un protocolo para propagacion in vitro de roble (tabebuia rosea bertol dc) en el cual nos dice que el desarrollo de un  protocolo de micropropagación para plantas de roble (Tabebuia rosea) ha sido logrado con el fin de producir masivamente clones de esta especie. Para determinar el mejor tratamiento de desinfección superficial el efecto de tres concentraciones (1%, 2% y 3%) de hipoclorito de sodio con tres tiempos (5, 10 y 15 min) de exposición de los explantes consistentes de brotes axilares de 2-3 cm de longitud fueron evaluadas después de establecidos en medio ½ MS con (en mg L-1) mio inositol (100), sacarosa (30,000), tiamina HCl (0.4) y TC agar (8,000) (Sigma Co.). Cinco tratamientos (0.00, 2.22, 4.44, 8.88, 17.76 µM BAP) fueron utilizados para determinar las mejores condiciones para la multiplicación, mientras que usando el mismo medio de establecimiento, el efecto de seis tratamientos (0.00, 1.35, 2.69, 4.03 y 5.37 µM ANA) fueron analizados para evaluar el enraizamiento in vitro de los brotes micropropagados. Los tratamientos fueron repetidos 15 veces y se distribuyeron usando un diseño completamente al azar. Brotes micropropagados con y sin enraizamiento in vitro fueron transferidos ex vitro. Hipoclorito de sodio al 3% durante 10 minutos fue el mejor tratamiento de esterilización superficial. La mejor tasa de multiplicación se obtuvo con 17.76 µM BAP mientras que el mayor enraizamiento ocurrió en presencia de 5.37 µM ANA. El enraizamiento in vitro

fue necesario para la recuperación de plantas ex vitro donde se debe seguir trabajando  para aumentar los porcentajes de recuperación mostrados. Cantos, Liñán, Troncoso, Aparicio & Troncoso (2008) desarrollaron el cultivo in vitro, un método para mejorar la germinación de plantas con interés forestal en Andalucía Se compara la germinación obtenida por métodos convencionales (siembra de semillas en  bandejas), con la lograda por el cultivo in vitro de semillas con cubierta, con cubierta escarificada, sin cubierta o embriones aislados, de especies vegetales elegidas por su carácter endémico, su interés como plantas forestales en Andalucía, su dificultad de germinación y su situación de en peligro de extinción o clara regresión. Los resultados obtenidos con semillas por métodos tradicionales, fueron muy pobres tanto en el  porcentaje de germinación, como en el tiempo prolongado, necesario para ello. Por el contrario, los procedimientos de germinación in vitro, que se utilizaron siempre de mas sencillo (semilla completa) a mas complicado (embrión), dieron tantos por ciento elevados de germinación en tiempos reducidos, como se especifica para cada especie: Atropa baetica Willk., 100% de germinación en 30 días con semilla completa sin escarificar; Echinospartum algibicum Talavera & Aparicio, 100% de germinación en 30 días, con semilla completa escarificada; Juniperus oxycedrus, L. subsp, oxycedrus, y Juniperus oxycedrus, L. subsp, macrocarpa (Sibth. & Reuter) Ball., 50% de germinación en 45 días con embriones aislados; Lavatera maritima Gouan, 76% de germinación a los 21 días, con semillas completas sin escarificar; Olea europaea L. var.sativa, Olea europaea L. var. sylvestris Brot., 100% de germinación en 10 días con embriones aislados; Phillyrea latifolia L., 55% de germinación a los 7 días en embriones aislados y Rhododendron ponticum subsp. baeticum (Boiss. & Reuter) Hand-Mazz. 90 % en 30 días con semillas completas. En todas las especies consideradas, se obtuvieron porcentajes elevados de supervivencia (>85%) al trasplantar las plántulas desde in vitro a condiciones externas.

Carranza et al. (2013) menciona en la propagación clonal in vitro de swietenia macrophylla king (caoba) que la caoba es una especie forestal maderable de múltiples usos, apreciada por su dureza, resistencia, belleza y calidad. La explotación intensiva y un inadecuado sistema de aprovechamiento de la especie han ocasionado la disminución de la variabilidad genética, haciendo imposible la aplicación de programas de mejoramiento genético de caoba en el Ecuador. El cultivo in vitro es una técnica que

ayudaría a disminuir este problema mediante la producción de plantas con alta robustez genética. El objetivo de esta investigación fue establecer un método que facilite la  propagación in vitro de caoba a partir de segmentos nodales, empleados en la fase de establecimiento con diferentes concentraciones de Ca(ClO)2 y tiempos de exposición. La contaminación por microorganismos fue controlada con 15 g de Ca(ClO)2 durante 20 min, alcanzando el 95% de sobrevivencia. Los explantes sanos fueron transferidos a un medio de cultivo MS/2 con distintos niveles de bencilaminopurina (BAP) y ácido indolbutírico (AIB) para su multiplicación in vitro, obteniéndose 70% de brotes con 2 mg L-1 de BAP en combinación con 1 mg L-1 de AIB. Los mejores brotes de la fase de multiplicación se colocaron en medio de cultivo MS/2 con diferentes concentraciones de ANA para facilitar su enraizamiento, ninguno de los tratamientos ensayados permitió generar raíces a los 21 días de su evaluación, aunque el mayor porcentaje de sobrevivencia (65%) se obtuvo al combinar 2 mg L-1 BAP y 1 mg L-1 ANA..

Maldonado, Castillo, Jasso, Jiménez, López & Sánchez (2016) presentaron efecto del medio de cultivo en la propagación in vitro de genotipos de cedrella odorata en la cual nos dice que Para la industria forestal de México Cedrella odorata es la especie de mayor importancia, con amplia demanda para el establecimiento de plantaciones comerciales, las cuales pueden ser cubiertas mediante propagación in vitro de genotipos sobresalientes. Se desarrolló un protocolo para propagación in vitro de Cedrella. odorata, a través de yemas axilares, evaluando efectos de diferentes medios de cultivo en fases de establecimiento, multiplicación y enraizamiento de cinco genotipos seleccionados de Cedrella odorata. Con el medio MS adicionado con antioxidantes, bactericidas y auxinas se obtuvo 55% de establecimiento, mientras que fase de multiplicación el medio MS adicionado con mayor concentración de auxinas favoreció la emisión de brotes (95%) y todos los medios favorecieron la elongación de los mismos. Cedrella odorata presentó  buen nivel de enraizamiento aun sin auxinas pero el medio MS adicionado con 0.1 ml L1 de AIB y 0.1 ml L-1 de ANA fue superior en la generación de raíces (12%), concluyendo que el efecto del medio de cultivo es determinante para el establecimiento, multiplicación y enraizamiento in vitro de C. odorata. Mientras que el genotipo una vez establecido tiene efecto en la sobrevivencia y respuesta al enraizamiento.

3.2.-bases teóricas 3.2.2.-Teoría de la evolución Darwin publica en 1859 El origen de las especies por medio de la selección natural en el que presenta de manera detallada a la selección natural como el mecanismo distintivo que permite explicar la lógica de la vida; es decir, de los sistemas vivos. Esta lógica se caracteriza por un progreso continuo y un proceso de complejidad creciente, anatómica, fisiológica y termodinámica. Pues bien, la selección natural constituye el mecanismo explicativo excelente de la teoría de la evolución. Por su parte, el azar es el factor que determina cómo sucede una extinción y cuáles especies podrían repoblar de nuevo un nicho o un planeta. 3.2.1.-Teoría de la totipotencia celular “El principio de totipotencia, que indica que cualquier célula vegetal contiene una

copia íntegra del material genético de la planta a la que pertenece sin importar su función o posición en ella, y por lo tanto tiene el potencial para regenerar una nueva planta completa” (Calva Calva & Perez Vargaz,2005)

3.3.-Bases conceptuales 3.3.1.-Cultivo In Vitro El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta que puede ser: (el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas. (Jaramillo Palacios, 2008) 3.3.1.1-Fases de cultivo invitro a. Fase 0: Etapa preparativa Consiste en clasificar el material que se encuentre en condiciones fisiológica y fitosanitaria adecuadas (Afanador Pérez, 2005)  b.fase 1: Etapa de establecimiento Las plantas donadoras son sometidas a una desinfección superficial con sustancias toxicas y termoterapia para los microorganismos que puedan generar competencia en el desarrollo del explante. (Afanador Pérez, 2005). Dentro de las sustancias más usadas

está el etanol al 50% por la facilidad que este tiene al humedecer el tejido; de la misma manera la utilización de hipoclorito de sodio (NaCl) y de calcio (CaCl) en una concentración del 2-3.5% debido a que no causa daños en el tejido del explante. (Afanador Pérez, 2005). Lavado

y enjuagado de los explamtes con agua destilada de 3-5 veces para la

eliminación de residuos del desinfectante. (Afanador Pérez, 2005). c.fase 2: Etapa de multiplicación y alongamiento de brotes El objetivo de esta fase es la multiplicación de los brotes de obtenido a partir del meristemo a partir de la estimulación celular y la inhibición de la dominancia apical  para el crecimiento del brote. (Afanador Pérez, 2005). d. fase 3: etapa de enraizamiento invitro Los brotes son sometidos enraizamiento en un medio de cultivo sin reguladores de crecimiento para el trasplante donde los niveles de citoquinina exógena será reducido y de auxinas exógenas será aumentado el tiempo de esta etapa será variable dependiendo de la especie y del regulador de crecimiento (Afanador Pérez, 2005). d. fase 4: Aclimatación del cultivo in vitro En esta etapa se trasplantas los brotes a un ambiente ex vitro de manera gradual  bajando la humedad del ambiente para que se adapten al substrato. (Afanador Pérez, 2005). 3.3.1.2.- Termoterapia Consiste en colocar a las plantas donadoras en una capsula de crecimiento a una temperatura de 35-45 °c para reducir la concentración de virus en la planta en un tiempo  promedio de 8 horas. (Afanador Pérez, 2005). 3.3.1.3.- Cultivo de estructuras organizadas Se pueden distinguir varios tipos, entre ellos: el cultivo de meristemas, cultivo de ápices del vástago, cultivo de raíces, cultivo de anteras, etc. Por lo general se denomina explante a una  porción de tejido u órgano aislada de una planta y para propósitos de micropropagación los más importantes son: cultivo de meristemas, cultivo de ápices caulinares, cultivo de segmentos nodales y cultivo de embriones (Guerra & Nodari, 2016).

3.3.2.-Explanto (explamtes) Tejido vivo separado de su órgano

propio y transferido a un medio artificial de

crecimiento. El nombre “explante” es una versión castellanizada del vocablo inglés “explant”; acuñado especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in

vitro. (Castillo Alicia ,2004)

3.3.3.-La micropropagación La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en cultivos de importancia económica. Permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. “Los cultivos son realizados por personal especializado en medios específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz)”. (Castillo Alicia ,2004) 3.3.4.-Asepcia El prefijo "a" significa negación, falta o ausencia; y "sepsis" infección o contaminación; por lo tanto el término asepsia se define como la ausencia de materia séptica, es decir la ausencia de microorganismos patógenos. La asepsia es la condición de "libre de microorganismos que producen enfermedades o infecciones". (Sánchez Nazario, 2010) 3.3.5.- Medio de cultivo Un medio de cultivo es un conjunto de componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. (Alves Menéndez, s.f) 3.3.5.1.-Composición del medio de cultivo A.- Composición nutricional del medio de cultivo - Macronutrientes, micronutrientes, sales minerales, vitaminas, compuestos orgánicos. (Alves Menéndez,s.f) B.- Composición hormonal del medio de cultivo -Auxinas, Giberelinas, ácido abscisico, etileno.etc (Alves Menéndez,s.f) C.- Composición física del medio de cultivo - pH, temperatura, humedad relativa, exposición a la luz (Alves Menéndez,s.f) 3.3.6.- componentes del cultvio 3.3.6.1.- Hormonas naturales reguladoras de crecimiento A.-Auxinas Las auxinas son un grupo de hormonas vegetales naturales que regulan muchos aspectos del desarrollo y crecimiento de plantas. La forma predominante en las plantas es el ácido indolacético (IAA). (Jordán & Casareto, 2006)

B.-Efectos fisiológicos “Las auxinas

influyen crecimiento y formación de raíces. Debido a que las auxinas

influencian tanto la división, como el crecimiento y diferenciación celular, están involucradas en muchos procesos del desarrollo, en algunos de ellos interactuando con otras fitohormonas.” (Jordán & Casareto, 2006) C.- Giberelinas “Las giberelinas (GAs) son hormonas de crecimiento diterpenoides tetracíclicos

involucrados en varios procesos de desarrollo en vegetales. A pesar de ser más de 100 el número hallado en plantas, sól o son unas pocas las que demuestran actividad biológica.” (Jordán & Casareto, 2006) D.- Citocininas “Las citocininas DMAPP

son hormonas esenciales en el accionar de varios procesos

vinculados al crecimiento y desarrollo de las plantas y relacionados a la acción de varios genes.” (Jordán & Casareto, 2006)

E.- Citoquinina “Las citoquinina son un grupo de fitorreguladores que gobiernan la división celular

y la diferenciación en tejidos vegetales, participan en el control del desarrollo y la senescencia.” (García Brejo, 2014)

3.3.6.1.- Hormonas artificiales reguladoras de crecimiento A.-6-N-Bencilaminopurina: 

Es un regulador de crecimiento de las plantas de la clase de las citoquinina(García Brejo,2014)

B.-Acido giberélico (AG3) 

Fitorregulador del crecimiento caracterizado por sus efectos fisiológicos y morfológicos. Actúa a concentraciones extremadamente  bajas; es traslocado en el interior de la planta y, generalmente, sólo afecta a las partes aéreas(García Brejo,2014)

C.- Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 

es un herbicida sistémico hormonal auxínico muy común, usado en el control de malezas de hoja ancha. Es el tercer herbicida más ampliamente utilizado en Norteamérica, y el más usado en el mundo. (García Brejo,2014)

C.- 1-ANA El ácido α -Naftalén acético (tiene un uso muy amplio en la agricultura,



hortalizas, flores, árboles frutales, invernaderos y en todo tipo de siembra  para estimular la formación de raíces, aumenta la longitud de los ramales de las raíces haciéndolas más frondosas y fuertes; previene caídas precosecha. (FERTICHEN,s.f.) 3.3.6.2.-Sustancias vitamínicas: De todas las que comúnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la única realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos. (Mroginski, Sansberro & Flaschland,s.f) A.-Fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos (comparativamente unos  pocos son autótrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azúcar más utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. También myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos. (Mroginski, Sansberro & Flaschland,s.f)

B.-Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los mismos macro y micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente El nitrógeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. También se pueden utilizar urea, glutamina y caseína hidrolizada. Es fundamental que el hierro sea incorporado juntamente con un agente quelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible es un amplio rango de pH. (Mroginski, Sansberro & Flaschland,s.f)

3.3.5.3.- Medio de cultivo común (Murashige & Skoog (MS)) El número después de las letras MS, sirve para indicar la concentración de sucrosa en el medio, por ejemplo, MS0 no contiene sucrosa, mientras que el MS20 contiene 20 g/L de sucrosa. Esta formulación del medio Murashige & Skoog (MS ) no contiene fuente de carbono (sucrosa), hormonas vegetales (auxinas y citosinas) o vitaminas. Aprobado para su uso en el cultivo de tejidos vegetales. Concentración de trabajo: 4.3 g/L. (Murashige & Skoog,1962) 3.3.7.-propagacion vegetal

La propagación vegetal corresponde a un conjunto de procedimientos para incrementar la cantidad de plantas con el objeto de perpetuar individuos o grupos de ellos que tienen cierto valor. (Sisaro & Higawuara, 2016) A.-Crecimiento vegetal Sus células se dividen y multiplican y luego se alargan; el efecto, por supuesto, es que la planta aumenta en tamaño y peso. Sin embargo, el crecimiento no es uniforme en toda la planta. Se encuentra localizado en las zonas meristemáticas, las que producen células que formarán nuevos tejidos y órganos. (Kamara Keita, 2001) B.-Porcentaje de mortalidad La tasa bruta de mortalidad, que resulta de dividir las defunciones entre la población total. 3.3.9.- descripción botánica El género Polylepis pertenece a la familia Rosaceae, subfamilia Rosoidea, tribu Sanguisorbeae (Simpson, 1979). Las especies de este género son principalmente árboles o arbustos, con troncos torcidos, corteza delgada y exfoliante (ritidoma); hojas alternas, imparipinnadas, inflorescencia simple, raramente ramificada. Flores generalmente con 4  brácteas simples; hipantio más o menos urceolado con espinas o alas; episépalo ausente; sépalos más o menos valvados persistentes; pétalos ausentes; estambres 6-36, anteras  pubescentes; un carpelo; un óvulo pendular; estilo villoso o híspido en la base, estigma fimbriado. Fruto aquenio, con 1 semilla dentro del hipantio. Semillas más o menos fusiformes, con testa delgada o subcoreacea (Simpson, 1979; Mendoza & Cano 2011; Mendoza, 2005). La especie de  Polylepis microphylla comprende árboles o arbustos hasta de 4 m. Hojas imparipinadas, con 3-5 pares de foliolos; vaina estipular vilosa o glabrescente, pelos blanquecinos o cremas, proyecciones obtusas;  pecíolo de 1-5 mm, viloso; lámina de 20-27 x 6-12 mm; raquis con una capa resinosa de pelos anaranjado, bajo la cubierta de pelos lanosos crema,  punto de incisión de los foliolos con un anillo panoso-resino anaranjado  bajo la cubierta lanosa; folíolos 3-6 x 2,5-5 mm, oblóngos, obovados, ápice emarginado, margen revoluto y entero, haz esparcidamente viloso o glabro, envés densamente lanoso pelos blancos cremosos a grisáceos(Simpson, 1979). La especie de  Polylepis incana Árboles de 5-8 m de altura. Hojas congestionadas en los ápices de las ramas, trifolioladas, folíolos obovados,

subcoriáceos, glabros por la haz, cubiertos de tricomas cortos por el envés, tricomas enrollados, irregulares y multicelulares, mezclados con exudado resinoso; margen crenado, ápice ligeramente emarginado, base atenuada, raquis con tricomas cortos, multicelulares y glandulares, algunas veces mezclados con exudado resinoso; el punto de unión de la hoja en el tallo  presenta un pequeño manojo de tricomas largos y rizados, vainas estipulares superpuestas, la superficie externa cubierta con tricomas glandulares. Inflorescencia de 2-7 cm de largo, con tres a diez flores,  brácteas estrechamente lanceoladas, glabras o pilosas; flores perfectas, cuatro sépalos, ovados; ocho a veinticuatro estambres, anteras orbiculares,  barbadas; estilo con la base vellosa. Fruto en aquenio turbinado o fusiforme, irregularmente piloso y/o alado (Barclay & Juajibo,s.f) La especie de  Polylepis racemosa Arboles de 4 a 15 cm. de altura. Hojas compuestas, agrupadas en los extremos de las ramas, con 1 a 3 pares de foliolos; de 3.5 a 8.8 cm. de longitud por 2.3 a 5.0 cm. De ancho; y con raquis viloso. Inflorescencia: En racimos pendulares, de 4.0 a 11 cm. de longitud, llevando de 3 a 11 flores. Flores: Perfectas, de 0.9 a 1.0 cm. de diámetro, con 4 sépalos ovados. Frutos: Turbinado, cubierto con tricomas  blancos, con 4 a 5 apéndices foliáceos (Lao Maguin, Zevallos Pollito & De La Cruz Silva, s.f ;Leon Araujo,2009; Kessler & Schmidt,2005). 3.3.9.1.-Distribución de  Polylepis sp en el Perú Tabla 1: Distribución de polylepis sp

Fuente (Mendoza & Cano, 2011)

3.4.-MARCO LEGAL En el artículo N° 3 del decreto supremo 034-2006-AG promueve la investigación científica sobre las especies en peligro crítico (CR) y en peligro (EN).dentro de las cuales se encuentra el género polylepis incana.; polylepis racemosa; polylepis microphylla;  polylepis tormentella 4.- OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN 4.1.-Problema general 

Analizar el efecto 4 proporciones de ANA y BAP en la propagación y crecimiento de brotes en el cultivos invitro de las especies  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla.

4.2.-objetivos específicos 

Evaluar el prendimiento de explamtes sometidos a diferentes proporciones de ANA y BAP en el cultivo invitro de  polylepis incana, polylepis racemosa y  polylepis micropylla



Evaluar el crecimiento de brotes en el cultivo in vitro de las especies  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla

Sometidos a 4 proporciones

distintas de DAP y ANA 

Analizar la influencia de las proporciones de BPA Y ANA en el la multiplicación de brotes en el cultivo invitro de  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla?

5.-FORMULACIONDE HIPOTESIS 5.1.- Hipótesis 

Ha : Las 4 proporciones de fitohormonas influyen de manera diferente y significativa en la propagación y crecimiento de brotes en el cultivos invitro de las especies  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla



Ha: El prendimiento de explamtes en el cultivo invitro de  polylepis incana,  polylepis racemosa y polylepis micropylla es

influido de manera distinta por las

cuatro proporciones de fitohormonas. 

Ha: El crecimiento de brotes de las especies  polylepis incana, polylepis racemosa  y polylepis micropylla: en el cultivo in vitro

es influenciado de manera distinta y

significativa por la aplicación de 4 proporciones diferentes de fitohormonas.

Ha: Las diferentes proporciones de fitohormonas BPA Y ANA tienen un efecto



diferente y significativo en la multiplicación de brotes en el cultivo invitro de  polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla

6.-OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES Tabla Tabla n ° 2 :Operacionalizacion de Variables

VARIABLES

DIMENSIONES

INDICADORES

INSTRUMENTO

FUENTE

TRATAMIETO

T1: Medio de cultivo MS+BAP & ANA 2 (1;2) T2: Medio de cultivo

Variable

MS+BAP & ANA 1

independiente:

Proporción de Fito hormonas de

mg/L(1;1) T3: Medio de cultivo MS+BAP & ANA

fitohormonas

Cantidad de fitohormonas

Balanza

y vaso de

aplicada en mg/L

 precipitación

Medio

de

cultivo

(2;1) T4: Medio de cultivo MS+BAP

&

ANA(1;3)



Variable dependiente:

Crecimiento  propagación

y

Propagación

Crecimiento



% de prendimiento



Cantidad de multiplicación



Vernier.



Ficha

 Brotes

de

evaluación 

Ficha de evaluación

 Numero

de

Explamtes  prendidos  Numero

 brotes

de

7.-METODOLOGÍA DE INVESTIGACIÓN Metodología de Investigación 7.1.

Lugar de ejecución a) Fase de campo

Las muestras fueron colectadas en la ciudad del cuzco Ubicado en la región sur oriental del Perú, comprende zonas andinas y parte de la selva alta. Limita al norte con Ucayali, al sur con Arequipa y Puno, al este con Madre de Dios y Puno y al oeste con Arequipa, Apurímac, Ayacucho y Junín.



Superficie: 20000,891 km².



Latitud Sur: 13º 30´45"



Longitud oeste: entre meridianos 73º 59´52" y 73º 57´ 45"



Densidad demográfica: 16,3 hab./km².



Población: Total: 1 171.403 habitantes (Censo 2007).



Capital del Departamento: Cuzco (3.399 msnm)



Clima: Su clima es frío y seco de mayo a diciembre y lluvioso en los meses de enero hasta abril. La temperatura media en la capital es de 12 °C siendo la máxima de 18 °C y la mínima alrededor de 4 °C más o menos. En la selva amazónica es tropical.

 b) Fase de Laboratorio 7.2. Método de la investigación



Inductivo-cuantitativo: es un método científico que obtiene conclusiones generales a partir de premisas particulares y se compararan resultados con otros estudios

7.3. Tipo de investigación 

Aplicada: porque analiza los efectos de las proporciones de fitohormonas en la propagación in vitro de brotes de Polylepis sp.

7.4.- Nivel de investigación 

Explicativa o causal: trata de explicar

cómo los niveles influye las

 proporciones de ANA Y BAP en la propagación in vitro de brotes de  Polylepis sp.

7.5. Diseño de la investigación



experimental: debido a que existe manipulación de variables



diseño en bloques completamente al azar: debido a la evaluación se realizaran v tratamiento y en diferentes especies.

El experimento se realizara en el laboratorio de la facultad de ciencias forestales y del ambiente de la universidad nacional del centro del peru, el tambo, Huancayo, junin - peru, el cual consiste en averiguar ¿Cómo influyen 4 proporciones de fitohormonas en la propagación y crecimiento de brotes en el cultivos invitro de las especies polylepis incana, polylepis racemosa y polylepis micropylla? TRATAMIENTOS: T1: Medio de cultivo MS+BAP 1mg/l & ANA 2 mg/L (1; 2) T2: Medio de cultivo MS+BAP 1mg/L & ANA 1 mg/L (1; 1) T3: Medio de cultivo MS+BAP 2mg/L & ANA 1 mg /L (2; 1) T4: Medio de cultivo MS+BAP 1mg/L & ANA 3 mg/L (1; 3 ) BLOQUES:  I: Polylepis incana  II: Polylepis racemosa  III: Polylepis macrophylla

Polylepis incana

T2

T1

T4

T3

BLOQUE I

Polylepis racemosa

T4

T3

T2

T1

BLOQUE II

Polylepis my

T3

T2

T4

T1

BLOQUE III

CARACTERISTICAS DEL EXPERIMENTO

 N° de tratamientos: 4  N° de bloques: 3  N° de unidades experimentales: 12(c/UE compuesto por 24 plantas)  N° de explantes por tratamiento: 72  N° total de explantes: 288

7.6.-Prueba de hipótesis estadísticas



Análisis univariable

La Contrastación estadística de significación mediante las pruebas de hipótesis estadísticas se utilizará 

Hipótesis para medias de los tratamientos Ho: µ0 = µ1= µ2 Ha: µi ≠ µj

Si Fc ˃ Ft, se rechaza la Ho o Si P˂= 0,05 se rechaza la H o (SPSS)



Hipótesis para medias de los bloques Ho: µ1 = µ2 Ha: µi ≠ µ j

Si Fc ˃ Ft, se rechaza la Ho o Si P˂= 0,05 se rechaza la H o (SPSS)

7.7.- Técnicas e instrumentos de recolección de datos 

Técnica: medición directa

(toma de datos con vernier y

conteo directo). 

Instrumento de medición: vernier

Procesamiento de datos: se tomara los datos

recolectado de experimento realizado

; luego se procederá al análisis de los datos en SPSS donde proveerá los resultados de la prueba F al igual que la pruebas de normalidad, levene ,Duncan y tukey . Materiales 

Material vegetal



Medio de cultivo



Jabón anti-bacterial



Cepillo dental de cerdas medianas



Cloro comercial (cloralex)



Fungicidas (benomil, captan)



Agitador magnético con control de temperatura



Bisturí



 Navajas para bisturíes estériles del número 11 y 22



Campana de aire de -ujo laminar (limpia y funcional)



Lámpara de alcohol



Pinzas de disección



Cinta de papel klen- pack de 1” de ancho



Alcohol contenido en frasco de boca ancha para -amear bisturíes y pinzas.



7.2.

Procedimiento metodológico de colecta de datos EN CAMPO

Recolección de muestras:

Se procedió a escoger las plántulas de las 3 especies

escogidas (polylepis incana, polylepis rasemosa y polylepis micropylla) de un vivero. a. RECOLECCIÓN Y ANALISIS DE LAS MUESTRAS Sometemos a las platulas a Termoterapia Consiste en colocar a las plantas donadoras en una capsula de crecimiento a una temperatura de 35-45 °c para reducir la concentración de virus en la planta en un tiempo  promedio de 8 horas. Fase 0: Etapa preparativa Consiste en clasificar el material que se encuentre en condiciones fisiológica y fitosanitaria adecuadas (Afanador Pérez, 2005) fase 1: Etapa de establecimiento Las plantas donadoras son sometidas a una desinfección superficial con sustancias toxicas y termoterapia para los microorganismos que puedan generar competencia en el desarrollo del explante. (Afanador Pérez, 2005). Dentro de las sustancias más usadas está el etanol al 50% por la facilidad que este tiene al humedecer el tejido; de la misma manera la utilización de hipoclorito de sodio (NaCl) y de calcio (CaCl) en una concentración del 2-3.5% debido a que no causa daños en el tejido del explante. (Afanador Pérez, 2005). Lavado

y enjuagado de los explamtes con agua destilada de 3-5 veces para la

eliminación de residuos del desinfectante. (Afanador Pérez, 2005). fase 2: Etapa de multiplicación y alongamiento de brotes El objetivo de esta fase es la multiplicación de los brotes de obtenido a partir del meristemo a partir de la estimulación celular y la inhibición de la dominancia apical  para el crecimiento del brote. (Afanador Pérez, 2005).

fase 3: etapa de enraizamiento invitro Los brotes son sometidos enraizamiento en un medio de cultivo sin reguladores de crecimiento para el trasplante donde los niveles de citoquinina exógena será reducido y de auxinas exógenas será aumentado el tiempo de esta etapa será variable dependiendo de la especie y del regulador de crecimiento (Afanador Pérez, 2005). fase 4: Aclimatación del cultivo in vitro En esta etapa se trasplantas los brotes a un ambiente ex vitro de manera gradual  bajando la humedad del ambiente para que se adapten al substrato. (Afanador Pérez, 2005). 8.-ASPECTOS ADMINISTRATIVOS 8.1.-Cronograma de actividades Tabla n°3: cronograma de actividades. ACTIVIDADES

2016 Enero

Compra de plantas donante Aclimatación Selección de especies donantes Desinfección y termoterapia

1

2

x

x

3

febrero 4

1

2

3

marzo 4

1

x x x

Fase de establecimiento

x

Fase de multiplicación conteo de explamtes prendidos

x

Trasplante y replante de brotes

x

Medición de crecimiento radicular y longitudinal

x

Conteo de plantas sobrevivientes. conclusión del informe del proyecto

3

x

Obtención de explamtes

Trasplante al medio ex vitro

2

x x

ANEXOS