Dikt Kuljar Pisang Bener

 

 

 

LEMBAR PENGESAHAN

DIKTAT “ KULTUR JARINGAN PISANG ” UNTUK MATA PELAJARAN PEMBIBITAN DAN KULTUR JARINGAN KELAS XI AGRIBISNIS TANAM TANAMAN AN PANGAN D DAN AN HORTIKUL HORTIKULTURA TURA SEMESTER III SMK-PP NEGERI BANJARBARU Telah disahkan penggunaannya penggunaannya untuk siswa di SMK-PP Negeri Banjarbaru, 7 Agustus 2019

Banjarbaru, 7 Agustus 2019 Kepala SMK - PP Negeri Banjarbaru

Suherman, SP., MP NIP. 19600616 199103 1 001

ii

 

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan anugerah- Nya sehingga DIKTAT DIKTAT   KULTUR JARINGAN PISANG dapat diselesaikan dengan baik. Diktat ini sebagai acuan bagi siswa kelas XI Program Keahlian Keahlian Agribisnis Tanaman Pangan dan Hortikultura pada semester III khususnya mata pelajaran Pembibitan dan Kultur jaringan. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terimakasih yang sedalam  –  dalamnya kepada: 1. Kepala Sekolah SMK PP Negeri Banjarbaru Bapak Suherman, SP., MP, 2. Wakasek Pengajaran Ibu Airin Nurmarita, SP. MP MP 3. Rekan sejawat ( semua guru) guru) di SMK PP Banjarbaru. 4. Siswa/ Siswi SMK – PP N Banjarbaru 5. Serta semua semua pihak pihak yang yang telah telah banyak banyak membantu. membantu.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam diktat ini sehingga kritik dan saran yang membangun membangun sangat penulis harapkan. Semoga Diktat ini ini dapat menjadi media pembelajaran dan acuan bagi siswa khususnya mata pelajaran Pembibitan dan Kultur jaringan.

Banjarbaru, Agustus 2019

Penulis

iii

 

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR DAFTAR ISI BAB I. PENDAHULUAN PENDAHULUAN A. Pengertian Kultur Jaringan dan Pengenalan Pengenalan Beberapa Istilah ..............

1

Pisang .......................................... .................... ............................................ .................................. ............ B. C. Kultur LatihanJaringan Soal ........................................... .................... .............................................. ............................................. .......................... ....

3 5

BAB II. LABORATORIUM DAN PERALATAN PERALATAN KULTUR JARINGAN ..........  A. Ruangan Dalam Dalam Laboratorium Laboratorium Kultur Jaringan Jaringan ...................................... ...................................... B. Peralatan Peralatan Kultur Jaringan ............................................ ................................................................... ........................... .... C. Latihan Soal ........................................... .................................................................. ............................................. .......................... ....

5 5 6 13

BAB III. MEDIA KULTUR JARINGAN ............................................ ........................................................ ............  A. Komponen Media Media ........................................... ................................................................. ......................................... ................... B. Pembuatan Larutan Stok ............................................ ................................................................... ........................... .... C. Pembuatan Media ............................................ ................................................................... ...................................... ............... D. Petunjuk Praktikum ........................................... .................................................................. ...................................... ............... E. Latihan Latihan Soal ........................................... .................................................................. ............................................. .......................... ....

12 12 15 16 17 27

BAB IV. PELAKSANAAN PELAKSANAAN KULTUR JARINGAN ......................................... ......................................... ......................................... ......................................... ................... A. Isolasi Bahan Tanam (Eksplan ) ................... B. Sterilisasi Eksplan ........................................... .................................................................. ...................................... ............... C. Penanaman Eksplan ................... ......................................... ............................................ ...................................... ................ D. Multipikasi Tunas .......................................... ............................................................... ......................................... .................... E. Induksi perakaran .......................................... ............................................................... ......................................... .................... ................................................................... ............................................. .......................... .... F.  Aklimatisasi ............................................ G. Pembesaran Bibit Pisang hingga Siap Tanam ....................................... ....................................... H. Petunjuk Praktikum ........................................... .................................................................. ...................................... ............... I. Latihan Soal ........................................... .................................................................. ............................................. .......................... ....

26 26   26 28 32 33 34 34 35 38 43

DAFTAR PUSTAKA

iv

 

BAB I. PENDAHULUAN A. Pengertian Kultur Jaringan dan Pengenalan Pengenalan Beberapa Beberapa Istilah Istilah Kultur jaringan tanaman adalah suatu teknik untuk menumbuhkan sel,  jaringan ataupun irisan organ tanaman di laboratorium laboratorium pada suatu media buatan yang mengandung nutrisi yang aseptik (steril) untuk menjadi tanaman secara utuh. Kondisi steril merupakan suatu syarat mutlak keberhasilan pelaksanaan kultur jaringan, sehingga kondisi ini harus tetap dijaga selama proses kultur berlangsung. Walaupun hanya satu spora jamur atau hanya satu sel bakteri yang masuk ke media kultur, maka pekerjaan kultur akan gagal dan tidak akan dihasilkan dihasilkan tanaman baru. Kultur jaringan tanaman didasari oleh teori totipotensi sel (cellular totipotency) yang menyebutkan bahwa setiap sel tanaman memiliki kapasitas untuk beregenerasi membentuk tanaman secara utuh.Tanaman baru yang diperoleh dengan cara ini bersifat identik dengan induknya, dan disebut plantlet. plantlet. Jumlah tanaman baru yang dihasilkan tidak hanya satu, tapi bisa puluhan hingga ratusan (dari satu bahan tanam atau eksplan) sehingga teknik kultur  jaringan

digunakan digunakan

sebagai

metode

perbanyakan

tanaman.

Metode

perbanyakan tanaman yang dilakukan dengan teknik kultur jaringan tergolong perbanyakan vegetatif, artinya tidak melibatkan adanya fertilisasi antara sel telur dan sel kelamin jantan seperti halnya pembentukan biji pada tanaman, itu sebabnya plantlet yang dihasilkan identik dengan induknya. Perbanyakan

tanaman

dengan

teknik

kultur

jaringan

disebut

juga

mikropropagasi atau perbanyakan mikro. Kata ‘mikro’ mengacu pada bahan tanam awal yang digunakan yaitu eksplan yang berukuran kecil (micro=kecil),

bahkan dapat mencapai ≤ 1 mm pada kultur mer istem. Dibandingkan dengan perbanyakan vegetatif konvensional seperti dengan stek, cangkok, ‘budding’, ‘layerage’, dan sebagainya, mikropropagasi memiliki kelebihan dan kekurangan seperti terlihat pada Tabel 1. Jika melihat tabel tersebut, jelas terlihat bahwa mikropropagasi mikropropaga si memiliki keunggulan dari segi bahan tanam awal yang sangat kecil namun menghasilkan anakan yang jauh lebih banyak. Dibandingkan dengan

perbanyakan

vegetatif

konvensional,

perbanyakan

dengan

mikropropagasi mikropropaga si akan jauh menjadi m enjadi lebih efi sien untuk tanaman yang memiliki

nilai ekonomi tinggi, karena biaya ‘establishment’ yang mahal akan tertutupi oleh harga jual tanaman yang tinggi.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

1

 

Tabel 1. Perbandingan Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif Konvensional dan Mikropropagasi

Biaya “establishment”   Keahlian / Skill

Ukuran bahan tanam

Jumlah anakan yang dihasilkan dihasil kan persatu bahan tanam per waktu Sifat anakan yang dihasilkan

Perbanyakan konvensional murah

vegetatif

Dibutuhkan keahlian mengenai budding, grafting, okulasi, dll Besar (misalnya untuk stek 10 – 20 cm)

Mikropropagasi mahal

Hanya satu

Dibutuhkan keahlian bekerja secara aseptik di labolatorium Sangat kecil ( misal bisa mencapai < 1 mm untuk kultur meristem) Ratusan hingga ribuan

Identik dengan induknya

Identik dengan induknya

Eksplan , merupakan istilah untuk bahan tanam awal yang digunakan dalam mikropropagasi. Eksplan dapat berupa sel (kultur sel), protoplas (kultur protoplas), mikropropagasi. epidermis, empulur (kultur jaringan), meristem apikal atau lateral (kultur meristem), tunas apikal maupun lateral (kultur tunas), serta irisan batang, daun maupun akar

(kultur organ). Dengan melihat bahan tanam yang digunak digunakan, an, maka istilah ‘kultur in vitro’ lebih tepat digunakan untuk mikropropagasi dibandingkan dibandingkan ‘kultur jaringan’ karena yang dikulturkan sangat beragam, bukan hanya jaringan. In vitro berasal

dari bahasa Latin yang berarti ‘di dalam gelas’ (dalam bahasa Inggris ‘in glass’), untuk menggagambarkan suatu proses biologi yang berlangsung di dalam tabung gelas atau botol kultur, di luar tubuh mahluk hidup. Eksplan tersebut ditanam pada media tanam steril yang mengandung nutrisi.  Adanya senyawa fenol pada jaringan tanaman, seringkali menyebab menyebabkan kan eksplan berubah warna menjadi coklat dan diakhiri dengan kematian jaringan eksplan. Warna coklat disebabkan oleh peran enzim polyfenoloksidase yang mengoksidasi senyawa fenol yang keluar dari irisan eksplan. Senyawa fenol merupakan metabolitt sekunder dan tersimpan dalam vakuola sel tanamn. Ketika eksplan diiris, metaboli vakuola pecah sehingga terjadi eksudasi senyawa fenol dan teroksidasi. Istilah pencoklatan eksplan ini disebut browning. Efek oksidasi senyawa fenol ini juga bisa menyebabkan pencoklatan pada media kultur. Istilah pencoklatan pada media ini pada beberapa literatur disebut dengan istilah staining, namun kebanyakan masih menggunakan istilah browning.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

2

 

Eksplan yang masih hijau pada media yang mengalami browning harus dipindah ke media baru. Pemindahan kultur ke media baru disebut dengan istilah subkultur. Ada beberapa alasan dilakukannya subkultur selain pencoklatan media, diantaranya adalah: media terkontaminasi oleh mikroorganisme, namun eksplan masih sehat; media kultur mengering; populasi kultur sudah terlalu padat;

dilakukannya pengakaran (rooting) sehingga harus disubkultur ke ‘media induksi akar’. Eksplan yang ditanam akan membentuk bentukan baru sebelum menjadi plantlet. plantl et. Bentukan baru yang terbentuk setelah eksplan ditanam pada media kultur disebut propagul. Propagul dapat berupa kalus, organ (tunas, akar) ataupun embrio somatik. Kalus adalah kumpulan sel yang tidak terorganisir. Kalus terbentuk apabila eksplan ditanam pada media yang ditambah dengan zat pengatur tumbuh (ZPT) untuk menginduksi menginduksi kalus, misalny m isalnya a ZPT golongan sitokinin dan auksin dengan konsentrasi yang sama atau ZPT 2,4-Dichloropenoxy acetic acid (2,4-D). Istilah dediferensiasi diberikan untuk eksplan berupa organ tanaman yang sudah terdiferensiasi seperti daun, batang, tunas, akar yang membentuk kalus. Organ tanaman tersebut yang sel-selnya sudah terdiferensiasi dikembalikan lagi menjadi tidak terdiferensiasi. Jika nanti kalus-kalus ini kembali membentuk tunas, disebut mengalami rediferensiasi. rediferensiasi.

B. Kultur Jaringan Pisang Kultur jaringan adalah suatu usaha untuk menumbuhkan sel, jaringan, dan organ tanaman pada medium buatan secara aseptik dalam lingkungan yang terkendali. Pengadaan bibit dengan cara ini, sangat sesuai untuk usaha pisang dalam skala besar (industri). Pada umumnya media yang digunakan dalam kultur  jaringan pisang pisang ini adalah adalah MS (Roedyarto, (Roedyarto, 1999 dan Gunawan, Gunawan, 1995). Pisang umumnya diperbanyak dengan anakan. Anakan yang berdaun pedang lebih disenangi petani, sebab pohon pisang yang berasal dari anakan demikian akan menghasilkan tandan yang lebih besar pada panen pertamanya (tanaman induk). Bonggol atau potongan bonggol juga digunakan sebagai s ebagai bahan perbanyakan.

Tetapi

jantung

pisang

juga

merupakan

eksplan

yang

menguntungkan karena mudah mendapatkannya dan resiko kontaminasi lebih kecil karena bukan berasal dari tanah dan tertutup rapat oleh kelopak bunga (Nisa dan Rodinah, 2005). Kini telah t elah dikembangkan kultur jaringan untuk perbanyakan perbanyakan secara cepat, melalui ujung pucuk yang bebas-penyakit. Cara ini telah

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

3

 

dilaksanakan dilaksanak an dalam skala komersial, tetapi adanya mutasi yang tidak dikehendaki menimbulkan kekhawatiran. Dalam perbanyakan bibit pisang secara kultur  jaringan, ada empat tahap yang harus dilalui yaitu, pertama, tahap inisiasi. Pada tahap ini eksplan membentuk kalus dan bertunas banyak. Kedua, tahap pelipatan tunas (multiplikasi) yaitu tunas yang sudah terbentuk dipisahkan kemudian ditumbuhkan dalam medium agar tumbuh tunas baru (perbanyakan sub kultur). Ketiga, tahap perakaran tunas (regenerasi planlet) dan tahap terakhir yaitu tahap aklimatisasi lingkungan (Sunarjono, 2002 dalam Wahyudi,2004). Pada mata pelajaran pembibitan pembibitan dan kultur jaringan di semester III progr program am studi budidaya tanaman pangan dan hortikultura hortikultu ra di SMK PP N Banjarbaru fokus utama

adalah kultur jaringan

pisang.

Kompetensi

yang

harus dikuasai

berdasarkan kompetensi dasar dan dan kompetensi kompetensi inti disajikan pada Tabel 2.

KOMPETENSII DASAR KOMPETENS 3.13. Menganalisis Menganalisi s teknik penyiapan laboratorium kultur jaringan tanaman hortikultura

KOMPETE KOMPETENSI NSI DASAR 4.13 Menunjukkan teknik penyiapan laboratorium kultur jaringan tanaman hortikultura

3.14

Menganalisis Menganalisi s teknik penyiapan peralatan kultur jaringan tanaman hortikultura 3.15. Menganalisis Menganalisis teknik sterilisasi sterilisasi ruang, ruang, alat, dan bahan kultur jaringan tanaman hortikultura 3.16 Menganalisis teknik pembuatan larutan stok

4.14 Menunjukkan teknik penyiapan peralatan kultur jaringan tanaman hortikultura 4.15 Menunjukkan Menunjukkan teknik teknik sterilisasi sterilisasi ruang, alat, dan bahan kultur  jaringan tanama tanaman n hortikultura 4.16 Menunjukkan teknik pembuatan larutan stok

3.17 Menganalisis teknik pembuatan media kultur jaringan tanaman hortikultura

4.17 Menunjukkan teknik pembuatan media kultur jaringan tanaman

3.18 Menganalisis teknik penyiapan bahan tanam/eksplan tanaman hortikultura

4.18 Menunjukkan teknik penyiapan bahan tanam/eksplan tanaman

3.19 Menganalisis teknik inokulasi bahan bahan tanam/eksplan tanaman hortikutura

4.19 Menunjukkan teknik inokulasi bahan tanam/eksplan tanaman hortikultura

3.20 Menganalisis teknik penumbuhan bibit kultur jaringan tanaman hortikultura

4.20 Menunjukkan teknik penumbuhan bibit kultur jaringan tanaman

3.21 Menganalisis teknik pengendalian ruang pertumbuhan kultur

4.21 Menunjukkan teknik pengendalian ruang pertumbuhan kultur

3.22 Menganalisis Menganalisis teknik aklimatisasi plantlet tanaman hortikultura

4.22 Merumuskan Merumuskan teknik teknik aklimatisasi aklimatisasi plantlet tanaman hortikultura

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

4

 

C. LATIHAN SOAL Untuk mengukur tingkat pemahaman kalian terhadap materi diatas  jawablah soal berikut berikut dengan benar! benar! 1. Jelaskan pengertian pengertian Kultur Jaringan! 2. Dalam perbanyakan bibit pisang pisang secara kultur kultur jaringan, ada empat tahap yang harus dilalui, sebutkan keempat tahap tersebut! 3. Sebutkan lima perbedaan perbanyakan perbanyakan tanaman secara konvensi konvensial al dan kulturjaringan! 4. Jelaskan upaya yang dapat dilakukan untuk menangani menangan i senyawa fenol pada eksplan! 5. Jelaskan pengertian pengertian eksplan dalam dalam pelaksanaan pelaksanaan kultur kultur jaringan! jaringan!

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

5

 

BAB II. LABORA L ABORATORIUM TORIUM DAN PERALATAN KULTUR JARI J ARINGAN NGAN

B. Ruangan Dalam Dalam Laboratorium Laboratorium Kultur Jaringan Jaringan

Laboratorium Laboratori um kultur jaringan minimal m inimal memili memiliki ki empat em pat ruang, yakni dapur, ruang preparasi,, ruang tanam dan ruang kultur (ruang inkubasi). preparasi 1. Dapur Merupakan tempat pencucian alat-alat sebelum disterilisasi. Di dapur terdapat tempat pencucian (shink) dengan kran, bak sampah serta rak tempat menaruh alat-alat setelah dicuci. 2. Ruang preparasi Merupakan tempat pembuatan media. Pada ruangan ini diletakkan rak yang berisi zat kimia, timbangan, magnetic stirrer, kulkas (tempat zat kimia yang harus disimpan pada suhu dingin, seperti zat pengatur tumbuh, media kemasan, vitamin, dan lain-lain) serta meja untuk melakukan pekerjaan pembuatan media. Jika autoklaf yang digunakan untuk sterilisasi memakai daya listrik, maka alat ini juga diletakkan di ruang preparasi. Namun jika autoklaf yang digunakan adalah jenis yang memakai kompor, maka sebaiknya diletakkan di dapur dan tidak di ruangan preparasi. Ruangan preparasi harus dijauhkan dari nyala api karena terdapat banyak bahan kimia. Selain menghindarkan bahaya kebakaran karena adanya bahan kimia yang mudah terbakar, tetapi juga agar terhindar dari suhu tinggi yang mungkin dapat merusak bahan kimia yang ada di ruangan tersebut. Meja yang ada di ruang preparasi juga digunakan untuk melakukan preparasi eksplan sebelum dibawa ke ruang tanam 3. Ruang tanam Ruang tanam merupakan ruang untuk menanam kultur. Ruangan ini harus dijaga sterilitasnya agar pekerjaan kultur dapat terhindar dari kontaminasi dan berjalan dengan sukses. Untuk alasan sterilitas ini, ruang tanam juga dilengkapi dengan lampu pembunuh mikroorganisme. Lampu ini dinyalakan 30 menit sebelum pekerjaan dimulai dan dimatikan ketika sudah mulai menanam. Pada laboratorium kultur yang lebih modern, sebelum memasuki ruang tanam, setiap orang harus disterilisasi dengan memasuki ruang

pembersih

yang

dilengkapi

dengan

sprayer

automatis

yang

menyemprotkan safety disinfectant ke tubuh orang. Di dalam ruang kultur

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

6

 

terdapat meja kerja steril. Meja kerja steril ini dapat berupa enkas yaitu meja kerja yang sangat sederhana dan tidak menggunakan daya listrik atau yang lebih modern dan menggunakan daya listrik yaitu laminar air fl ow cabinet. Laminar ini banyak ragamnya dan akan dibahas secara lebih detail pada sub bab peralatan. Ruang tanam sebaiknya dilengkapi dengan pendingin (AC) untuk memberikan kenyamanan pada pekerja kultur. 4. Ruang kultur (inkubasi ( inkubasi)) Ruang kultur merupakan ruang untuk meletakkan dan menumbuhkan menumbuhkan hasil kultur yang kita tanam. Ruangan ini dilengkapi dengan pendingin yang bisa diatur suhunya. Umumnya suhu yang dibutuhkan berkisar 20-24o C karena morfogenesis dalam kultur umumnya terjadi pada kisaran suhu tersebut. Di dalam ruang kultur diletakkan rak-rak kultur yang digunakan untuk menaruh kultur. Ruang ini juga harus dijaga sterilitasnya untuk menghindar menghindarkan kan kultur dari kontaminan. Sterilitas dijaga dengan jalan j alan menyemprotkan desinfectan secara berkala serta membersihkan ruangan serta menyingkirkan kultur yang sudah terkontaminasi. Kultur yang sudah terkontaminasi ini akan menjadi sumber kontaminan untuk kultur yang sehat.

B. Peralatan Kultur Jaringan Berikut akan dibahas berapa peralatan penting yang umumnya digunakan dalam kultur jaringan. Peralatan ini meliputi: 1. Timbangan digital Timbangan (balance) digital beragam jenisnya, gunanya secara umum adalah untuk menghitung satuan massa suatu benda dengan teknik digital. Dalam lab kultur, alat ini digunakan untuk menimbang bahan/zat yang digunakan dalam kultur, misalnya zat pengatur tumbuh, bahan untuk media, gula, agar, agar, dan lain lain sebagainya. sebagainya.

Sebelum menimbang menimbang bahan, bahan, kita harus

mengetahui kapasitas timbang dari suatu timbangan. Pilihan jenis timbangan yang akan digunakan disesuaikan dengan berat bahan yang akan ditimbang dan kapasitas timbangan. Secara umum, cara penggunaan penggunaan timbangan adalah sebagai berikut: a. Timbangan dihubungkan dengan stop kontak listrik (plugin), kemudian

tekan tombol “on/off” untuk mengaktifkan. m engaktifkan.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

7

 

b. Sebelum digunakan timbangan dinolkan terlebih dahulu. Setelah alas timbang (untuk menaruh bahan yang akan ditimbang) diletakkan pada timbangan, timbangan kembali dinolkan. c. Kemudian bahan yang akan akan ditimbang ditimbang ditaruh pada alas alas timbang yang yang sudah disiapkan. Selanjutnya, berat benda yang ditimbang akan terbaca pada layar. d. Setelah pekerjaan pekerjaan penimbangan selesai, selesai, timbangan harus harus dibersihkan, dinolkan dan stop kontak harus dicabut.

2. Magnetic stirrer Magnetic stirrer digunakan untuk proses pembuatan media serta pembuatan larutan dari senyawa yang berbentuk padat. Magnetic stirrer memiliki dua fungsi yaitu untuk pemanasan (heating) dan pengadukan (stirring).

3. Autoklaf  Autoklaf adalah alat untuk sterilisasi dengan metode uap panas (steam (steam heating). Ada dua jenis jika dilihat dari daya yang digunakan. Yang pertama adalah autoklaf yang menggunakan kompor dan yang kedua adalah autoklaf yang menggunakan daya listrik. Keduanya memiliki cara kerja yang sama dalam proses sterilisasi.

 Autoklaf dilengkapi dengan “sarangan” seperti pada dandang  untuk mengukus. Pada sarangan ini diletakkan benda yang akan disteril. Sementara pada dandang (dibawah sarangan) diisi dengan air untuk menghasilkan uap, mirip seperti dandang pengukus. Setelah benda yang akan disterilisasi dimasukkan, autoklaf ditutup dengan jalan memutar m emutar ‘skrup’ hingga benar -benar -benar kencang, sementara itu katup uap dibiarkan tetap terbuka. Setelah itu autoklaf diletakkan di atas kompor (untuk yang menggunakan daya kompor) dan dihubungkan stop kontak (yang menggunakan daya listrik). Katup uap ditutup  jika sudah mengeluarkan mengeluarkan uap agar suhu dan tekanan nai naik. k. Perlahan suhu dan tekanan akan naik. Jika sudah mencapai tekanan 17,5 Psi atau suhu 121 o  C, kompor harus segera dikecilkan. Kemudian suhu ini dijaga selama waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi. Misalnya untuk sterilisasi media selama 20-30 menit, peralatan kecil dan glasswares selama 1 jam. Untuk jenis autoklaf listrik, naiknya suhu sangat lambat dan tekanan 17,5 Psi dicapai dalam waktu yang lebih lama. Namun kemudian stabil dalam tekanan ini tanpa harus mencabut

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

8

 

stop kontak seperti halnya mengecilkan kompor pada autoklaf kompor. Pada autokalf daya listrik, besaran suhu akan berjalan secara automatis sesuai pengaturan suhu yang kita lakukan. Autoklaf Autoklaf kompor k ompor lebih murah harganya dan lebih umum digunakan. 4. Oven Sterilisasi juga bisa dilakukan dengan oven, namun hanya bias untuk alatalat kecil dan glasswares dan tidak bisa untuk sterilisasi media. Di dalam laboratorium, oven diletakkan di ruang preparasi. Metode sterilisasi dengan oven dikenal dengan dry heating, karena proses sterilisasi sterilisasi menggunaka m enggunakan n udara kering yang panas. Ada banyak ragam oven, namun satu diantaranya dapat dilihat pada Gambar. Oven ini mengguna m enggunakan kan daya listrik, dilengkapi dengan pengatur suhu dan waktu, sehingga proses sterilisasi bisa dilakukan dengan menekan tombol sesuai dengan kebutuhan. Angka yang menunjukkan suhu dan waktu pengovenan akan terbaca secara digital.

5. Meja Kerja (laminar) Meja kerja dalam kultur jaringan disebut juga meja tanam, adalah tempat yang digunakan untuk menanam. Laminar air flow cabinet

(LAFC)

menggunakan daya listrik dan dilengkapi dengan lampu ultra violet (UV) yang berguna untuk membunuh mikroorganisme serta lampu neon sebagai penerang. Lampu UV ini dinyalakan 30 menit sebelum LAFC digunakan dan dimatikan segera saat LAFC mulai m ulai digunakan. Prinsip kerja LAFC adalah dengan hembusan udara (air flow) yang steril. Pertama udara dari luar disaring oleh filter pertama yang letaknya umumnya di bagian atas laminar. Udara ini selanjutnya s elanjutnya memasuki memasuki sistem filter yang kedua dalam laminar dan menjadi steril. Udara steril ini akhirnya dihembuska d ihembuskan n pada areal meja kerja ke arah luar laminar, laminar, sehingga sehingga jika ada mikroorganisme mikroorganisme yang masuk dari arah luar secara automatis akan terhembus ke luar.

6. Glasswares dan Peralatan kecil lainnya Glasswares adalah semua peralatan kecil yang terbuat dari bahan gelas seperti gelas ukur, gelas dan labu Erlenmeyer, serta botol kultur. Alatalat ini dapat disterilisasi dengan oven maupun dengan autoklaf. Alat-alat ini harus dibungkus dengan kertas saat sterilisasi agar kondisi steril tetap terjaga

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

9

 

sampai alat tersebut digunakan. Botol-botol bekas seperti botol selai, botol minuman dan botol infus yang terbuat dari bahan gelas dapat digunakan untuk botol kultur. Peralatan kecil lainnya terdiri dari dissecting kit (perataan untuk memotong/mengiris), memotong/mengi ris), pinset, spatula dan lain-lain yang umumnya terbuat dari bahan logam (stainlessteel). Spatula merupakan pengaduk atau digunakan untuk mengambil bahan berupa serbuk. Pinset digunakan untuk memegang / menjepit benda, umumnya digunakan pada saat penanaman eksplan. Scalpel adalah gagang pisau yang dalam penggunaannya berpasangan dengan blade (pisau). Gunanya adalah untuk mengiris/memotong, dalam hal ini bahan eksplan yang akan akan ditanam. Bagian pisau pisau dijual secara terpisah dari scalpel (gagang) nya dan sudah dalam keadaan steril dan bersifat sekali pakai. Peralatan kecil dari bahan logam ini juga harus dibungkus deng dengan an kertas saat sterilisasi.. Sterilisasi dapat dilakukan dengan oven maupun dengan autoklaf. sterilisasi

7. Rak kultur Rak kultur merupakan tempat untuk meletakkan eksplan setelah ditanam pada media steril dan menumbuhahkan menumbuhahkannya nya hingga hingga menjadi plantlet. Rak kultur diletakkan dalam ruang kultur atau ruang inkubasi inkubasi..

Semua proses

morfogenesis hingga terbentuknya plantlet berlangsung di ruang kultur pada rak kultur.

a. Autoclave

b. Neraca analitik analitik

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

10

 

c. Laminar Air Flow (LAF)

d. Rak Kultur

e. Hot plate stirer

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

11

 

Glasware yang digunakan dalam kultur jaringan pisang

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

12

 

D. LATIHAN SOAL Untuk mengukur tingkat pemahaman kalian terhadap materi diatas  jawablah soal berikut berikut dengan benar! benar! 1. Mengapa perlu dilakukan penataan ruangan kultur jaringan dengan tepat? 2. Jelaskan persyaratan ruang tanam dan dan ruang ruang inkubasi! inkubasi! 3. Jelaskan prosedur penggunaan aotoclaf untuk sterilisasi

alat, media dan

pembuatan air steril! 4. Jelaskan standar penyimpanan penyimpanan bahan bahan kima yang tepat dalam dalam kultur jaringan! jaringan! 5. Jelaskan prosedur prosedur penggunaan penggunaan Laminar Air Flow Flow dengan benar!

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

13

 

BAB III. MEDIA KULTUR JARING JARINGAN AN

A. Komponen Media Komponen Media Eksplan (berupa sel, jaringan atau irisan organ) yang ditumbuhkan secara in vitro pada media buatan, juga membutuhkan hara untuk terjadinya morfogenesis morfogenesis dan pertumbuhan. pertumbuhan. Secara umum media buatan tersebut mengandung komponen sebagai berikut: 1. Hara makro (macro nutrient).  nutrient).  Hara makro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah banyak oleh tanaman, yaitu nitrogen (N), posfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium magnesiu m (Mg), dan sulfur s ulfur (S). N merupakan komponen dalam pembentukan protein dan asam amino dalam tubuh tanaman, juga merupakan elemen pada beberapa koenzim. P merupakan komponen pembentukan asam nukleat (DNA dan RNA) serta dibutuhkan sebagai sumber energi transfer. K dibutuhkan untuk mengatur potensial osmotik sel tanaman. Ca untuk sintesis dinding sel, fungsi membran dan berperan dalam aktifnya signal sel. Mg merupakan kofaktor enzim dan komponen klorofi l. S adalah komponen beberapa asam amino dan beberapa kofaktor enzim 2. Hara mikro (micro nutrient).  nutrient).   Hara mikro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit oleh tanaman, yaitu ferum/zat besi(Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), cobalt (Co), copper (Cu) dan molybdenum (Mo). Fe merupakan komponen cytochrome yang berperan dalam Kultur Jaringan Tanaman 22 transfer electron. Mn adalah kofaktor enzim, Zn berperan dalam sintesis klorofi l dan  juga merupakan kofaktor enzim. enzim. Co adalah komponen bebera beberapa pa vitamin. Cu merupakan kofaktor enzim dan berperan dalam reaksi transfer elektron. Mo  juga merupakan kofaktor enzim enzim dan komponen dari enzim nitrate reductase. Baik hara makro maupun hara mikro, keduanya diberikan dalam bentuk garam inorganik. 3. Gula Gula.. Jenis gula yang umum digunakan digunakan dalam kultur in vitro adalah sukrosa,  jumlahnya berkisar 2-3 % atau 20-30 gram/liter media. Selain sukrosa, beberapa jenis gula lainnya adalah laktosa, galaktosa, maltosa , glukosa dan fruktosa. Gula diberikan pada media kultur sebagai sumber karbohidrat karbohidrat untuk

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

14

 

respirasi karena tanaman kultur bersifat heterotroph, tidak dapat melakukan fotosintesis untuk menghasilkan karbohidrat. Respirasi menghasilkan energi yang digunakan oleh sel tanaman untuk melakukan pembelahan sel. Dengan demikian gula ditambahkan pada media kultur sebagai sumber energi. 4. Vitamin Vitamin   Vitamin dibutuhkan tanaman sebagai katalisator dalam berbagai proses metabolisme. Vitamin digunakan untuk pertumbuhan sel serta proses diferensiasi sel dan jaringan yang ditanam secara in vitro. Beberapa jenis vitamin yang digunakan dalam kultur in vitro v itro adalah thiamin, nicotinic acid dan pyridoxine. Diantara ketiganya, yang bersifat esensial adalah thiamin (vitamin B1) yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel tanaman. Nicotinic acid dan pyridoxine (vitamin B6) dibutuhkan hanya oleh spesies tanaman tertentu. Ada beberapa jenis vitamin lainnya yang digunakan dalam kultur in vitro namun bersifat tidak umum atau spesifi k hanya untuk kultur tertentu, yakni biotin, folic acid, ascorbic acid, pantothenic acid, tocopherol (vitamin E), ribofl avin, dan p-aminobenzoic acid 5. Myo-inositol Myo-inositol   Myo-inositol adalah senyawa golongan karbohidrat yang ditambahkan pada media kultur dalam jumlah sedikit untuk menstimulasi pertumbuhan sel pada banyak spesies tanaman. Meskipun bukan tergolong vitamin, namun senyawa ini akan terpecah menjadi vitamin C dan pectin. Myo-inositol memiliki peran dalam pembelahan sel, digunakan dalam konsentrasi kons entrasi berkisar 50-5000 ppm. Pada kultur kalus tembakau, dibuktikan bahwa hanya thiamin (dari kelompok vitamin) dan myo-inositol yang dibutuhkan untuk pertumbuhan pertumbuhan optimal kalus tembakau. 6. Zat pengatur tumbuh. tumbuh . Umumnya ada dua golongan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan dalam kultur in-vitro, yakni golongan auksin dan sitokinin. ZPT golongan auksin yang biasa digunakan dalam kultur in-vitro in-v itro adalah: indole-3acetic acid (IAA), indole-3- butricacide (IBA), 2,4-dichlorophenoxy-acetic 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid (2,4-D) dan naphthalene- acetic acid (NAA). ZPT dari golongan sitokinin adalah: BA (Benzyladenine), (Benzyladenine), BAP (6-benzyloaminopurine), (6-benzyloaminopurine), 2- iP (isopentenyl adenine), kinetin (6-furfurylaminopurine), (6-furfurylaminopurine), Zeatin (6-4-hydroxy-3-methyl-trans(6-4-hydroxy-3-methyl-trans2-butenylaminopurine) 2-butenylami nopurine) dan TDZ (thidiazuron). Rasio kedua golongan ZPT ini akan mempengaruhi arah morfogenesis yang terjadi pada kultur.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

15

 

Rasio auksin yang lebih tinggi dari sitokinin akan menstimulasi terbentuknya akar, sedangkan rasio sitokinin yang lebih tinggi dari auksin akan menginduksi terbentuknya tunas. Jika auksin dan sitokinin pada konsentrasi yang sama (rasio 1) maka akan terbentuk kalus. Untuk pembentukan kalus juga dapat digunakan 2,4-D. Ada beberapa jenis ZPT lainnya yang digunakan dalam kultur in vitro. ZPT tersebut yaitu gibberellin (GA3) untuk pembentukan tunas pada spesies tertentu, dan asam absisik (ABA) untuk pematangan pematangan embrio pada proses embriogenesis embriogenesis somatik. s omatik. Dalam proses pembuatan larutan stok ZPT, untuk IAA, 2,4-D dan NAA dapat dilarutkan awal dengan beberapa tetes alkohol 95% atau NaOH. 1N, sedangkan untuk golongan sitokinin umumnya digunakan beberapa tetes HCL 1N atau dimethylsulfoxide (DMSO). Jika bahan sudah terlarut oleh pelarut awal, maka baru kemudian ditambah DD water (Double distilled water) untuk mencapai volume yang diinginkan. Penggunaan pelarut awal ini diperlukan untuk menghindari terjadinya penggumpalan akibat tidak larutnya ZPT tersebut. 7. Pemadat media  media  Penambahan senyawa pemadat bertujuan untuk membuat media menjadi padat maupun semi padat. Pemadat tersebut dapat berupa agar, agarose atau gellan gum. Agar dan agarose digunakan dalam konsentrasi 0.7-1.0% (7-10 gram per-liter media), sedangkan gellan gum 0.2-0.6% (2-6 gram per-liter media). Gellan gum dijual dengan nama dagang Gellrite, Phytagel dan Kelcogel. Media kultur sebaiknya tidak terlalu padat agar penyerapan nutrisi dapat berjalan baik. Demikian pula pada perkecambahan biji secara in-vitro, diperlukan media semi padat untuk mempermudah terjadinya perkecambahan. perkecambahan. 8. Asam amino  amino   Asam amino tidak selalu selalu harus ditambahkan pada pada media kultur, kultur, namun diperlukan untuk kultur sel dan kultur protoplas. Penggunaannya secara tunggal atau campuran dari beberapa asam amino. Asam amino menyediakan sumber nitrogen untuk pertumbuhan sel. Senyawa nitrogen ini lebih mudah diserap oleh sel tanaman dibandingkan sumber nitrogen dari garam inorganik. Asam amino yang biasa digunakan adalah casein hydrolysate,

Lglutamine,

L-asparagine,

adenine,

glycine,

glutamine,

asparagine, L-arginine, L-arginine, cysteine dan L-tyrosine.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

16

 

9. Senyawa organik alami  alami  Senyawa organik alami seperti air kelapa, santan kelapa, jus/ekstrak tomat, ekstrak pisang, ekstrak kentang dan lain 25 Kultur Jar Jaringan ingan Tanaman sebagainya seringkali ditambahkan pada media kultur untuk menstimulasi pertumbuhan sel/jaringan kultur. Kebutuhan akan jenis dan jumlahnya tergantung

spesies

tanamannya.

Misalnya,

untuk

menstimulasi

perkecambahan perkecamba han biji anggrek Vanda tricolor dari Bali dibutuhkan 100-200 gram ekstrak tomat per-liter media, sedangkan anggrek Phalaenopsis amabilis membutuhkan 100 gram ekstrak tomat yang dicampur dengan 150 ml air kelapa (perliter media) untuk menstimulasi perkecambahan perkecambahan bijinya. Selain itu, penambahan arang aktif/active charcoal kadang-kadang juga digunakan dalam kultur in vitro v itro untuk tujuan tertentu, misalnya untuk mengatasi browning (pencoklatan) pada kultur organ tanaman yang banyak mengandung senyawa senyawa fenol. Arang aktif juga ditambahkan pada media kultur untuk merangsang perakaran, karena perakaran tumbuh lebih baik pada media yang berwarna gelap.

B. Pembuatan Larutan Stok Media yang digunakan dalam pembuatan media pisang adalah media MS. Komposisi Komposisi bahan kimia kimia media MS adalah sebagai berikut: Nama Bahan Kimia

Stok

Konsentrasii (g/l) Konsentras

Penggunaan (ml/l)

Stok A

NH4NO3

82,5

20

Stok B

KNO3

95,0

20

KH2PO4

34,0

H3BO3 Na2MoO4

1,24 0,05

CoCl2.6H2O

0,005

KI

0,66

CaCl2.2H2O

88,0

MgSO4.7H2O

74,0

MgSO4.4H2O

4,4

ZnSO4.7H2O

1,72

CuSO4.5H2O

0,005

Na Edta

7,45

FeSO4.7H2O

5,57

Stok C

Stok D

Stok E

Stok F

5

5

5

5

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

17

 

Vitamin

Thiamin HCl

0,02

 Asam Nicotin

0,1

Prydoksin HCl

0,1

Myo Inositol

10

5

10

Cara pembuatan media dengan menggunakan magnetic stirrer   adalah sebagai berikut. Magnetic stirrer  dihubungkan   dihubungkan dengan listrik. listrik. Gelas erlenmeyer erlenmeyer yang akan digunakan sebagai wadah pem buatan media diletakkan diatas magnetic stirrer . Ukuran erlenmeyer biasanya lebih besar dari volume media yang dibuat untuk menghindari menghindari tumpahnya media media pada saat media mendidih. mendidih. Misalnya untuk pembuatan volume media satu liter, digunakan gelas erlenmeyer 2 liter. Pembuatan satu liter media MS dari larutan stok dilakukan dengan jalan menambahkan larutan stok A, B, C, D dan E secara berurutan pada erlenmeyer/gelas beker yang sudah berisi kurang lebih 400 ml air destilasi. Volume larutan stok yang dipipet tergantung dari konsentrasi stok yang dibuat dan volume larutan larutan stok. Yang pertama harus harus dicari adalah adalah konsentrasi larutan larutan stok sesungguhnya. sesungguhny a. Misalny Misalnya a diberikan contoh disini untuk volume 500 ml stok dengan

“50 x konsentrasi konsentrasi”. ”. Karena volume larutan stok adalah 500 ml, sementara yang ditimbang adalah 50 x konsentrasi (dari komponen untuk pembuatan 1000 ml media), berarti konsentrasi konsentrasi larutan stok adalah adalah (1000/500) x 50 = 100 kali. Untuk membuat 1000 ml media, maka yang dipipet didapat dengan rumus sebagai berikut: V1N1 = V2N2  V1=1000 ml (media yang akan dibuat), N1=konsentrasi N1=konsentra si media yang akan dibuat (dalam hal ini 1 kali), V2= volume larutan stok yang harus dipipet, N2=konsentrasi larutan stok (dalam hal ini 100 kali). Maka akan didapat V2=(1000x1)/100=10 V2=(1000x1)/100=10 ml.

C. Pembuatan Media Media tumbuh digolongkan dalam dua bagian yaitu media padat dan media cair. Media padat pada umumnya umumnya berupa padatan gel, seperti seperti agar , dimana nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan diair. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan. Komposisi media yang digunakan dalam kultur jaringan dapat berbeda komposisinya. Perbedaan komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

18

 

pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditumbuhkan secara in vitro. vitro. Dari sekian banyak jenis media dasar yang digunakan dalam teknik kultur jaringan, tampaknya media MS (Murashige dan Skoog) mengandung jumlah hara organik yang layak untuk memenuhi kebutuhan banyak jenis sel tanaman dalam kultur (Gunawan, 1990).  1990).  Dalam kultur jaringan jaringan pisang pada u umunya munya menggunakan menggunakan 2  jenis media selama proses kultur yaitu 1) media pembelahan pembelahan ms dasar + BAP 5 ppm dan dan 2) media perakaran. Perakaran dengan kualitas yang baik sangat menentukan keberhasilan dalam tahap aklimatisasi. Untuk itu formulasi media yang tepat sangat menentukan kualitas kualitas akar. Namun pada tanaman tanaman tertentu pembentukan pembentukan akarnya sangat sulit sehingga diperlukan media tumbuh baru yang mengandung auksin. Pada tunas in vitro pule vitro pule pandak, lada, vanili, dan lain-lain dapat menghasilkan akar dengan menggunakan IBA atau IAA. Pada Pada tanaman tanaman inggu, inggu, penggunaan IAA 1 mg/l menghasilkan akar terbanyak dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Pada tanaman tangguh tangguh menggunakan menggunakan media MS + NAA 1 mg/l dapat di dihasilkan hasilkan akar (Lestari et al., 1999).

D. Petunjuk Praktikum 1) Pembuatan larutan stok a) Stok A:NH₄NO  82,5g /L 1) Timbang NH₄NO₃ pada neraca analitik sebanyak 82,5 g 2) Pindahkan hasil timbangan pada gelas piala 600-mL yang bersih dan telah dibilas dengan akuades. 3) Tambahkan akuades secukupnya secukupnya kemudian aduk sampai larut. 4) Pindahkan larutan tersebut ke labu takar 1000-mL yang sudah di bilas dengan akuades. 5) Tambahkan akuades akuades sampai hampir ke tanda tera. 6) Keringkan bagian bagian atas tanda tera dengan kertas tisu. 7) Penambahan dilanjutkan dengan pipet sampai meniskus bawah sampai mencapai tanda tera. 8) Larutan dicampur sampai sampai merata dengan hot plate, 9) Berilah label pada botol dengan keterangan sebagai berikut; Nama stok(A), nama zat (volume pipet untuk 1 L medium 20 ml ).

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

19

 

b) Stok B :KNO  95 g /L 1) Timbang KNO₃ pada neraca anaitik sebanyak 95 g. 2) Tahap selanjutnya selanjutnya sama dengan stok stok A . 3) Beri label: nama stok, nama zat, volume pipet untu untuk k 1 L medium(20 mL).

c) Stok C: KH₂PO₄ 

34 g/ L

H₃BO₃ 

1,24 g/ L

KI

0,166 g/ L

Na₂MoO₄.2H₂O

0,05 g/ L

CoCI₂.6H₂O

0,005 g/ L

1) Timbang zat-zat di atas secara secara terpisah. 2) Campurkan semua komponen komponen dalam gelas gelas piala yang sama. 3) Tahap selanjutnya selanjutnya sama dengan stok stok A. 4) Berilah label: label: nama stok, nama zat, volume pipet untuk 1 L medium (5 mL)

d) Stok D: CaCI .2H O 88 g/L 1) Timbang CaCI₂.2H₂O pada neraca analitik sebanyak 88 g. 2) Tahap selanjutnya selanjutnya sama dengan stok stok A. 3) Beri label: nama label, label, nama zat, volume untuk 1 L m medium edium (5 mL)

e) Stok E: MgSO₄.7H₂O

74 g/ L

MnSO₄.H₂O

3,38 g/ L

ZnSO₄.7H₂O

1,72 g /L

CuSO₄.5H₂O

0,05 g /L

1) Timbang zat-zat di atas secara secara terpisah. 2) Campurkan semua zat-zat tersebut dalam gelas piala 600-ml sampai 500 ml. 3) Tahap selanjutnya selanjutnya sama dengan stok stok A. 4) Berilah label: label: nama stok, nama zat,volume pipet unuk 1 L medium (5 mL).

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

20

 

f) Stok F: Na₂EDTA.2H₂O

3,72 g/ L

FeSO₄.7H₂O

2,78 g/ L

1) Timbang zat-zat di atas secara secara terpisah. 2) Masukan Na₂EDTA.2H₂O tersebut ke dalam piala gelas 600-mL,lalu tambahkan sedikit sedikit air.volume nya sampai 500 ml. 3) Panaskan sampai hampir hampir mendidih. mendidih. 4) Tambahkan FeSO₄.7H₂O secara perlahan-lahan sambil diaduk sampai larut dan larutan menjadi menguning. 5) Biarkan larut menjadi dingin dengan sendirinya. sendirinya. 6) Tahap selanjutnya selanjutnya sama dengan stok stok A . 7) Beri label:nama stoknama stoknama zat, volume pipet untuk 1 L medium (5 mL)

Cara pengambilan larutan stok dalam medium 1 liter. li ter. stok A ket: V₁ = volume larutan stok yang dicari M₁ = dosis larutan stok yang tersedi V₂= volume medium Yang akan dibuat M₂=dosis medium Yang akan dibuat pertanyaan: V₁=....? M₁=82,5 g = 82.500 mg V₂= 1.650 ml M₂= 1000 ml V₁.M₁=V₂.M₂  V₁.82.500= 1.650 .1000 V₁= 

1.650 . 1000 82.500

 = 20 ml

Untuk pengambilan stok selanjutnya B-F dihitung dengan cara yang sama.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

21

 

g) Vitamin Bahan

  Thiamin 0,01 g/ L   Pyridoxine 0,05 g/ L   Glycine 0,2 g /L Nocotinic c acid 0,05 g/ L   Nocotini 1) Timbang zat-zat diatas diatas secara terpisah. 2) Campurkan semua zat tersebut dan larutkan larutkan dalam akuades 100 mL. 3) Berikut labelnya: nama stok, nama zat,volume pipet untuk 1 medium (1 mL).

h) Myo-imositol 10 g / L 1) Timbang 1 g myo-imositol myo-imositol 2) Larutkan dalam 1000 mL akuades akuades 3) Beri label: nama stok, nama nama zat, volume pipet untuk 1 L medium (10 mL).

i) Zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh terdiri dari golongan sitokinin dan auksin.  Auksin mempunyai peran ganda tergantung pada struktur kimia, konsentrasi,, dan jaringan tanaman yang diberi perlakuan. Pada umumnya konsentrasi auksin digunakan untuk menginduksi pembentukan kalus, kultur suspensi,

dan

akar,

yaitu

dengan

memacu

pemanjangan

dan

pembelahan sel di dalam jaringan kambium (Pierik, 1987). Untuk m memacu emacu pembentukan kalus embriogenik dan struktur embrio somatik seringkali auksin diperlukan dalam konsentrasi yang relatif tinggi. 1) Timbang 2,4-D,BAP(benzyladeni 2,4-D,BAP(benzyladenine), ne), IAA(idole-3-acetic IAA(idole-3-acetic acid/asam indol

asetat),

kinetin,

IBA(indole-3-butyric

acid/asam

indol

butirat),dan NAA (naphthaleneacetic acid)masing-masing 50 mg secara terpisah 2) Larutkan 2,4-D, IAA, dan NAA dengan sedikit sedikit KOH 1 N secara terpisah 3) Larutkan BAP BAP dan kinetin kinetin HCI 1 N secara terpisah

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

22

 

4)

Pindahkan masing-masing masing-masing zat zat pengatur pengatur tumbuh tersebut ke dalam labu takar 100-mL.

5)

Tambahkan akuade ke dalam dalam masing-masing masing-masing labu takar hingga volumenya mencapai 100-ml.

6)

Simpan semua zat pengantur tumbuh ini dalam w wadah adah erlenmeyer 100-ml dan tutup dengan aluminium foil serta di beri label.

7)  

Simpan semua stok zat pengatur tumbuh dalam lemari pendingin. Cara mencari berapa ml stok yang di butuhkan. Sisa dari larutan stok dapat disimpan dan dapat digunakan lagi apabila membuat medium yang lain. Jika larutan stok yang tersedia tadi dalam dosis 1000 ppm, dan diumpamakan pembuatan medium yang baru memerlukan larutan stok dengan dosis 2 ppm sebanyak 500 ml, maka larutan stok yang akan kita ambil dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :

  V₁.M₁=V₂.M₂    Vl

= volume larutan larutan stok yang dicari dicari

  Ml

= dosis larutan larutan stok yang tersedi tersedi

  V2=  

volume medium Yang akan akan dibuat

M2=dosis medium Yang akan dibuat

Maka perhitungannya adalah sebagai berikut berikut :   V₁.M₁=V₂.M₂   

V₁.1000=500.2

  V₁= 

500.2

 = 1 ml.

 1000

Berarti untuk membuat medium dengan volume 500 ml, kita mengambil larutan larutan stok sebanyak 1 ml. m l. 2) Persiapan botol 1. Sebelum digunakan digunakan botol di cuci dan direndam dalam ai airr bayclin dalam sehari semalam. 2. Keringkan sampai benar-benar botol dalam ke adan kering kering 3. Botol diletakan diletakan ke tempat bagian bagian alat .

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

23

 

3) Media pembelahan pembelahan ms dasar + BAP 5 ppm. ppm. a. Definisi Kegiatan yang dilakukan untuk memuat media subkultur pembelahan agar bertambah banyak.

b. Tujuan

  Dapat mengetahui prosedur kerja kerja yang yang dilakukan. dilakukan.   Adanya media untuk sub kultur. c. Alat

d.

Bahan

  Otoclaf

Stok A

20 mL

  Erlenmeyer

Stok B

20 mL

  Botol media

Stok C

5 mL

  Meja dorong

Stok D

5 mL

  Gelas ukur plastik

Stok E

5 mL

  Kerts Ph

Stok F

5 mL

  Hot plate stirer

Vitamin

1 ML

  Sendok

Myo-inositol Myo-inosit ol 10 mL

  Panci

Gula

30 g

  Kompor

 Agar

7g

BAP 5

5 mL

e. Prosedur kerja 1) Siapkan bahan dan dan alat. 2) Masukan semua bahan kedalam kedalam erlenmeyer erlenmeyer kecuali agar. 3) Berikan air air akuades kedalam kedalam erlenmeyer sampai batas mi minikus nikus 1000 mL. 4) Homogenkan menggunakan hot plate plate stirer

sampai larutan

menjadi larut. 5) Cek pH hingga 5,8-6.jika ph kurang dari 5,8 tambahkan larutan NaOH jika lebih dari 6 tambahkan HCl beberapa tetes. 6) Nyalakan kompor. 7) Setelah larutan sudah homogen, masukan kedalam panci. Tunggu sampai sedikit menddih lalu masukan agar , aduk hingga merata.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

24

 

8) Setelah mendidih, matikan kompor. Pindahkan ke botol media, dengan ukuran yang cukup untuk 40 botol/1L. 9) Tutup botol hingga rapat, lalu masukan kedalam otoclaf untuk disterilisasi disterili sasi sampai 25 menit. menit. Dalam keadaan 17,5 Psi, Psi, dengan suhu 121˚6 1aiap sC˚6  10) Setelah selesai simpan simpan didalam ruangan ruangan inkubasi inkubasi..

f. Keterangan Pertama BAP5 itu pada pembelahan 1-5 Mendekati perakaran 5 ke atas BAP di turunkan menjadi BAP2.

BAP 2 di

butuhkan 2 ppm, BAP4 di butuhkan 4 ppm, BAP 5 di butuhkan. Untuk tambahan bisa gunakan

larutan NaOH dan HCl sebagai

penetral pH .

3). Pembuatan Media perakaran a. Definisi Perakaran dengan kualitas yang baik sangat menentukan keberhasilan dalam tahap aklimatisasi. Untuk itu formulasi media yang tepat sangat menentukan kualitas akar.

b. Tujuan membuat media media dengan dengan benar.   Megetahui prosedur kerja membuat

  Adanya media untuk sub sub kultur kultur perakaran. perakaran. c. Alat

  Otoclaf   Botol media   Panci   Sendok   Erlenmeyer   Hot plate stirer   Kertas ph   Meja dorong   Kompor

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

25

 

d. Bahan

  Stok A

20 ml

  Stok B

20 ml

  Stok C

5 ml

  Stok D

5 ml

  Stok E

5ml

  Stok F

5 ml

  Vitamin

1 ml

  Gula

30 g

  Agar

7g

  Arang

1g

  Myo-inosit Myo-inositol ol

10 ml

  IBA

2 ml

e. Prosedur kerja 1) Siapkan bahan dan dan alat. 2) Masukan semua bahan kedalam erlenmeyer kecuali arang dan agar. 3) Berikan air akuades kedalam erlenmeyer ampai batas minikus 1000 mL. 4) Homogenkan menggunakan hot plate sampai larutan menjadi larut. 5) Cek pH hingga 5,8-6.jika ph kurang dari 5,8 tambahkan larutan NaOH jika lebih dari 6 tambahkan HCl beberapa tetes. 6) Nyalakan kompor. 7) Setelah larutan sudah

homogen, masukan kedalam panci.

Tunggu sampai sedikit menddih lalu masukan agar dan arang, aduk hingga merata. 8) Setelah mendidih, matikan kompor. Pindahkan ke botol media, dengan ukuran yang cukup untuk 40 botol/1L. 9) Tutup botol hingga rapat, lalu masukan kedalam otoclaf untuk disterilisasi disterili sasi sampai 25 menit. menit. Dalam keadaan 17,5 Pci, Pci, dengan

suhu 121˚C sampai 126˚C.  10) Setelah selesai, selesai, simpaan di ruang inkubasi. inkubasi.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001

26

 

 

E. Latihan Soal Untuk mengukur tingkat pemahaman kalian terhadap materi diatas  jawablah soal berikut berikut dengan benar! benar! 1. Sebutkan 9 komponen komponen media yang yang digunakan digunakan dalam kultur jaringan pisang! 2. Mengapa perlu perlu dilakukan dilakukan pembuatan pembuatan larutan stok sebelum pembuatan media! 3. Sebutkan jenis media yang digunakan digunakan dalam dalam kultur jaringan pisang! 4. Media yang telah terinkubasi terinkubasi terkadang terkadang terkontaminasi terkontaminasi oleh oleh mikroba, Jelaskan Jelaskan upaya yang dapat dilakukan untuk mencegah kerusakan media akibat kontaminasi! 5. Jelaskan fungsi pemberian hormon BAP dalam kultur jaringan pisang!

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

27

 

BAB IV. PELAKSA PEL AKSANAAN NAAN KULTUR JARINGA J ARINGAN N

Pada dasarnya pekerjaan kultur jaringan meliputi tiga tahap sampai penanaman kultur (culture (culture establishment ) dan tiga tahap setelah setelah itu sebelum dipindah ke lapang, yaitu: a. Isolasi bahan tanam tanam (eksplan) (eksplan) dari tanaman induk induk b. Sterilisasi eksplan c. Penanaman eksplan pada media steril yang sesuai (culture establishme es tablishment  nt ). ). Setelah eksplan ditanam, ada empat fase lagi yang diperlukan sampai tanaman siap ditanam di lapang, yaitu: a. Perbanyak Perbanyakan an propagul b. Pengakaran c. Aklimatisasi d. Pemindahan tanaman ke lapang

 A. Isolasi Bahan Tanam (Eksplan )  Isolasi bahan tanam dimulai dari pemilihan dan pemeliharaan tanaman induk. Tanaman induk induk yang dipilih dipilih harus sehat, sehat, bebas penyakit penyakit dan memiliki memiliki pertumbuhan yang baik. Hal ini diperlukan agar bahan eksplan yang digunakan dalam kultur jaringan tidak menjadi sumber kontaminan sehingga kondisi aseptik kultur tetap terjaga.

Sebelum Sebelu m eksplan diambil, diambil, tanaman tanaman induk dapat dapat diberi diberi

perlakuan, misalnya penyemprotan dengan pestisida untuk menjaga kesehatan tanaman serta diberi diberi pupuk agar pertumbuhan pertumbuhan vigor. Penyemprota Penyemprotan n ZPT jenis sitokinin sitokini n dan/atau pemangkas pemangkasan an tunas apical dapat dilakukan pada tanaman induk  jenis dikotil untuk merangsang merangsang pertumbuh pertumbuhan an tunas tunas lateral. lateral. Tunas lateral yang yang baru tumbuh ini baik digunakan sebagai bahan eksplan, karena bahan eksplan dengan sel-sel yang masih aktif membelah (tunas yang baru tumbuh) memiliki daya regenerasi yang tinggi. 1) Eksplan anakan

Permudaan sumber eksplan perlu dilakukan pada tanaman induk pisang. Ukuran tunas pisang yang akan dijadikan eksplan sangat menentukan keberhasilan. Ukuran tunas yang terlalu besar dapat menyebabkan banyak hambatan dalam inisiasi tunas pisang, seperti tingginya tingkat kontaminasi, timbulnya browning, lambatnya respons tumbuhnya tunas in vitro pertama, serta

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

28

 

rendahnya tingkat multiplikasi tunas. Oleh karena itu, sebaiknya kultur jaringan pisang dimulai dengan eksplan yang muda dengan ukuran yang lebih kecil. Cara permudaan eksplan pada induk tanaman pisang bias dilakukan sebagai berikut: a.  Tahap pertama dalam kultur jaringan pisang adalah pemilihan induk tanaman. Pilihlah tanaman induk yang mempunyai karakter buah unggul dan bebas penyakit. b.  Bonggol anakan pisang dewasa diambil dari tanaman induk, ukuran diameter bonggol tersebut antara 15-25 cm. c.  Pelepah pisang dikupas hingga mencapai pelepah yang dalam. Kemudian pucuk tunas di bagian paling dalam pelepah dibuang dengancara memotong memakai pisau. d.  Bonggol kemudian ditanam di media tanah dalam polibag besar, tetapi bagian bekas pucuk tunas muncul di permukaan tanah (Gambar 6.). e.  Bonggol disemprot dengan fungisida dan bakterisida 2 kali seminggu untuk menghindari pembusukan bonggol terlalu cepat. f.  Pupuk urea diberikan untuk mempercepat pertumbuhan tunas baru pada bonggol pisang. g.  Setelah dia minggu, anakan-anakan baru akan muncul pada bonggol pisang. Eksplan yang paling baik adalah adalah anakan dengan tinggi ± 20 cm (Gambar 6.1). 6.1). h.  Bonggol indukan pisang ini akan menghasilkan anakan-anakan baru selama dua bulan, setelah itu biasanya bonggol akan membusuk. Oleh karena itu harus dibuat bonggol indukan yang baru. 2)

Eksplan Jantung Pisang Selain menggunakan anakan sebagai sumber eksplant pisang, aksis jatung

pisang juga dapat digunakan sebagai sumber eksplan yang minim resiko kontaminasi. Induksi paling

tunas in vitro yang ber asal dari anakan (suc ke ker )

umum diter apkan pada mikr opr  opr opagasi

pisang,

sepe pert rti yang

dilakukan oleh B hosale et al . (2011). Namun demikian, cara

ber isiko tinggi

terhadap

terjadinya

kontaminasi,

maupun bakter i yang ber asal dari tanah.

 

baik

tersebut

oleh  jamur

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

29

 

Krikorian Banana

et

al.

(1999)

bahkan

melapor kan bahwa infeksi virus

streak virus (BSV) lebih banyak dijumpai pada tanaman pisang

yang ber asal dari anakan (32%) dibanding dengan yang ber asal dari aksis  jantung (5%) dan benih yang dihasilkan  da dar  r i aksis  jantung memiliki memiliki keseragaman f enotipe yang tinggi dibanding dengan yang ber as al dari anakan. Hal ini mengi ndikasikan bahwa aksis  jantung ber pe peluang besar

diaplikasikan pada perbanyakan kepe per  r luan,

i n

vitro

pisang

untuk

ber bagai

sepe pert rti produksi benih secara massal dan

untuk

pen yed yediaan sumber eksplan yang bebas kontaminasi dalam kegiatan

kriopreservasi khususnya. Regen gene er asi aksis  jantung pisang Barangan dipengar uhi uhi oleh taraf BA. BA 25 μM merupakan pe per  r lakuan yang ter baik

karena

menghasil kan

 ju  jumlah total tunas dan

tunas nor ma mal  yang

terbanyak, yaitu 9,2 tunas/eksplan dan 6 tunas/eksplan masing-masing.

Semua

tunas

in

vitro

(100%)

yang

dihasil kan

dar  da r i eksplan aksis

 jantung terbukti bebas dari kontaminasi bakteri, sedangkan semua yang

ber asal dari anakan terkontaminasi  bakteri, wa laupun upun   pada awa lnya  tida dak k ter deteksi secara visual, sebelum dil akukan skr ining. Potongan

aksis

 jantung

dapat

men jadi

su mber eksplan pisang yang bebas

bakter i.

B. Sterilisasi Eksplan Sterilisasi adalah proses untuk mematikan atau menonaktifkan spora dan mikroorganisme mikroorganism e sampai ke tingkat yang tidak memungkinkan lagi berkembang biak atau menjadi sumber

kontaminan

selama proses

perkembangan

berlangsung. Proses sterilisasi sterilisasi yang yang tidak sempurna sempurna akan menimbulkan menimbulkan adanya kontaminasi.. Kontaminasi yang umum terjadi adalah kontaminasi adalah kontaminasi oleh cendawan dan bakteri. Komposisi Komposisi medium kultur kultur jaringan yang mengandun mengandung g gula, vitamin, asam asam amino, garam-garam anorganik, air, zat pengatur tumbuh, dan bahan pemadat sangat menguntungkan untuk pertumbuhan cendawan dan bakteri. Bila diberi kesempatan maka organisme tersebut akan tumbuh dengan cepat, dan dalam waktu singkat akan menutupi permukaan medium dan eksplan yang ditanam. Selanjutnya organisme ini menyerang eksplan melalui bekas luka pemotongan pada saat perlakuan sterilisasi. Beberapa jenis mikroorganisme

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

30

 

melepaskan senyawa beracun ke dalam medium kultur yang dapat menyebabkan kematian eksplan (Zulkarnain, 2009). Beberapa sumber kontaminasi mikroorganisme pada sistem kultur jaringan, adalah: (1) media, (2) lingkungan kerja yang kurang steril dan pelaksanaan penanaman yang kurang hati-hati dan kurang teliti, (3) eksplan, secara internal (kontaminan terbawa di dalam jaringan tanaman), (4) eksplan, secara eksternal (kontaminan berada di permukaan eksplan akibat prosedur sterilisasi yang kurang sempurna, (5) serangga atau hewan kecil yang masuk ke botol kultur setelah diletakkan pada ruang kultur. Dari semua sumber kontaminasi, yang paling sulit diatasi ialah yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu, dalam memilih suatu metode sterilisasi dan bahan sterilisasi sterilisas i semaksimal mungkin menghilangkan

haruslah selektif, dengan prinsip

mikroorganisme mikroorg anisme kontaminan yang tidak

diinginkan diingi nkan dengan gangguan sekecil mungkin pada jaringan eksplan. Sterilisasi eksplan dapat dilaksanakan dengan dua cara, yaitu secara mekanik dan secara kimia. Sterilisasi eksplan secara mekanik digunakan untuk eksplan yang keras (misalnya tebu, biji salak, dan sebagainya) atau berdaging (misalnya wortel, umbi, dan sebagainya), yaitu dengan membakar eksplan tersebut di atas lampu spiritus sebanyak tiga kali. Sedangkan sterilisasi eksplan secara kimia digunakan untuk eksplan yang lunak (jaringan muda) seperti daun, tangkai daun, anther, dan sebagainya. Bahan-bahan kimia yang sering digunakan untuk sterilisasi permukaan eksplan antara lain:

i. Natrium hipoklorit hipoklorit Nama dagangnya adalah clorox dan bayclin. bayclin. Konsentrasi untuk sterilisasi tergantung dari kelunakan eksplan, dapat 5%-20% dan waktunya antara 510 menit. ii. Mercuri klorit Nama dagangnya adalah sublimat 0.05%. Penggunaan bahan kimia ini harus hati-hati karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasinya sama dengan clorox, hanya waktunya lebih pendek karena sublimat sublimat bersifat keras. k eras. 3. Alkohol 70%  Alkohol lebih banyak diperdagangkan diperdagangkan dalam bentuk alkohol 95%. Jamur biasanya mati dengan alkohol 70%, sedangkan dengan alkohol 95% masi h  tetap hidup.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

31

 

Prinsip dasar sterilisasi sterilisasi eksplan adalah adalah mensterilkan mensterilkan eksplan dari berbagai mikroorganisme, mikroorgani sme, tetapi eksplannya eksplannya tidak ikut mati. Setiap tanaman tanaman memerlukan memerlukan perlakuan

khusus sehingga

sebelum mengulturkan

tanaman

baru

perlu

melakukan percobaan sterilisasi. Sebagai patokan, konsentrasi bahan dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi eksplan sebagai berikut : 1. Sterilisasi Ringan Eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan cairan pemutih pakaian 10% 10% selama 10 menit, lalu bilas dengan dengan air steril tiga kali. 2. Sterilisasi Sedang Eksplan direndam dalam HgCl2 0.1-0.5 mg/l selama 7 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali. 3. Sterilisasi Keras Eksplan direndam dalam HgCl2 0.1-0.5 mg/l selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril tiga kali. Menurut Gunawan (1987) ada sekitar sepuluh sepuluh jenis bahan yang digunakan dalam dalam sterilisasi permukaan, yaitu kalsium hipoklorit, natrium hipoklorit, hidrogen peroksida, gas klorin, perak nitrat, merkuri klorid, betadin, fungisida, antibiotik, dan alkohol.

Masalah yang sering mengganggu dalam pekerjaan in vitro adalah membuat m embuat dan menjaga kondisi aseptik, baik kondisi lingkungan maupun kondisi eksplannya. Oleh karena itu bila memindah-tanamkan bagian tanaman dari satu wadah ke wadah yang lain, jangan menyentuh permukaan bagian dalam dari wadah dengan tangan atau bagian alat yang tidak steril. Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang berbeda, tergantung dari : a. Jenis tanamannya. b. Bagian tanaman yang dipergunakan. dipergunakan. c. Morfologi permukaan (misalnya berbulu atau tidak).

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

32

 

d. Lingkungan tumbuhnya (Green (Green house atau lapang). e. Musim waktu mengambil (musim hujan atau kemarau). f. Umur tanaman (seedling (seedling atau tanaman dewasa). g. Kondisi tanamannya (sehat atau sakit).

Tahapan sterilisasi eksplan anakan pisang: a. Tunas muda pisang pisang dipilih dipilih yang sehat sehat dan bebas penyakit. penyakit. Potong tunas tunas pisang beserta bonggolnya. bonggolnya. b. Cuci di air mengalir, sambil mengupas kulit bonggol dengan pisau hingga putih bersih. c. Kupas pelapah pelapah daun, hingga tertinggal 3-4 lapisan d. Masukan tunas tunas dalam larutan larutan sabun tween, tween, rendam rendam sambil sesekali dikocok. dikocok. e. Kemudian, tunas dibilas dibilas dengan dengan akuades steril. f.

Eksplan direndam direndam larutan larutan fungisida fungisida Benlate Benlate (2 g/L) g/L) selama selama 1 jam, kemudian kemudian bilas 3 kali dengan akuads steril.

g. Eksplan direndam direndam larutan bakterisida bakterisida Agrept (2 g/L) selama 1 jam, kemudian kemudian bilas dengan akuades steril. h. Eksplan direndam direndam dalam larutan alcohol alcohol 70% selama selama 1 menit, menit, kemudian bilas 1 kali dengan akuades steril. i.

Eksplan direndam dalam dalam larutan selama 30 30 menit, menit, mudian bilas 3 kali dengan dengan akuades steril.

 j.

k. Eksplan direndam dalam larutan Bayclin 20% selama 20 menit, kemudian bilas 3 kali dengan akuades sreril.

k. Eksplan yang telah bersih dibilas dengan akuades steril, kemudian kupas pelepah daun hingga tersisa 2-3 pelepah. Bagian bonggol juga dikupas hingga bagian yang rusak akibat perlakuan Bayclin terpisah. l.

Eksplan dibelah dua secara vartikal.

m. Eksplan ditanam di media MS padat tanpa ZPT. Eksplan ditanam miring, posisinya hampir horizontal. n. Tambahkan media MS MS Cair + BAP 2-5 mg/L kira-kira kira-kira sebanyak sebanyak 5 mL. o. Tutup botol kultur, kemudian kemudian simpan simpan di rak rak kultur.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

33

 

Tahapan sterilisasi sterilisasi eksplan jantung jantung pisang: a. 

 jantung pisang dipotong dan dikupas br akteanya hingga panjangnya berukuran sekitar 15 cm lalu di cuci dengan detergen dan dir endam dalam f u un ngi sida dan bakter isida selama 3 jam.

 b. 

Sterilisasi bertur ut-tur ut dilakukan  dengan menggunakan alkohol 70%, N aOCl 1,58% dan 1,05% masing-masing sel ama 5 menit.

c. 

Selanjutnya, jantung pisang dicuci dengan akuades steril sebanyak

tiga kali. Helaian braktea dibuang satu per satu hingga ter sisa aksis atau tangkai  jantun ung. g. d. 

 Aksis  jantung kemudian diiris tipis-tipis secara me- lintang dengan ukuran sekitar 2 mm.

e. 

Selan ju  jutnya, irisan-irisan tipis tersebut dibelah men jadi dua bagi an atau

men jadi setengah

keping.

Kepingan

ter sebut digunakan 

sebagai ekspla plan.

C.  Penanaman Eksplan

Media yang paling baik untuk inisiasi in vitro pisang adalah media MS padat tanpa ZPT ditambahkan media MS cair mengandung BAP/kinetin 2-5 mg/L. Penambahan media cair dimaksudkan untuk mencegah terjadinya browning pada ekspain yang diakibatkan keluarnya senyawa fenolik. Besarnya konsentrasi sitokinin pada media inisiasi tunas setiap jenis tanaman pisang berbeda-beda. Misalnya pada pisang ambon konsentrasi BAP yang digunakan cukup 2mg/L, sedangkan pada pisang tanduk atau kapok diperlukan BAP hingga 5mg/L. Lamanya inisiasi tunas in vitro pertama untuk tanaman pisang biasanya dilakukan selama 2 bulan. Setelah satu bulan penanaman, biasanya pelepah tunas akan tumbuh terangkat ke atas pada saat tersebut biasanya sudah mulai tumbuh tunas aksiler. Kemudian eksplan tunas disubkultur ke media yang sama. Pelepah tunas yang sudah terbuka ke atas dipngkas atau dikupas untuk merangsang pertumbuhan calon tunas-tunas aksiler yang ada di antara pelepah tersebut. Pada akhir bulan kedua, pada eksplan sudah dapat tumbuh 2-4 2 -4 tunas aksiler. Setelah itu eksplan disubkultur

ke media MS padat tanpa ZPT untuk merangsang

pertumbuhan tinggi tunas.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

34

 

D.  Multipikasi Tunas

Berbeda dengan system kultur nodus pada tanaman jati, multiplikasi tunas pisang dilakukan dengan cara merangsang peningkatan poliferasi tunas aksiler dari bagian bonggol tunas. Biasanya tahap multiplikasi tanaman pisang menggunakan ZPT yang optimal pada setiap jenis pisang sering sering kali berbeda  –  beda . kombinasi konsentrasi yang optimal dapat diperoleh melalui percobaan secara empiris Multiplikasi tunas pisang ambon dilakukan melalui tahapan berikut ini 1. Gerombol tunas pisang {terdiri dari 2-3 tunas } yang di hasil hasilkan kan Dari tahap inisiasi tunas {satu bulan di media ms npl } disubkultur Ke media induksi tunas, yaitu media media MS ditambah bap 2-5mg/l Dan NAA 0,1-0,5 mg/l . setelah 1-2 bulan ,pada gerombol tunas ini akan tumbuh tunas tunas aksiler baru sehingga jumlah tunas Dalam gerombol tersebut terse but akan bertambah (GAMBAR 6,3), MISALNYA MISALNYA Dari dua tunas akan akan menjadi 4-8 tunas. 2. Gerombol tunas yang diberikan diberikan yang di hasilkan hasilkan pada tahap 1 disubkultur disubkultur ke Media elongasi elongasi tunas, yaitu yaitu media MS MS nol (tanpa ZPT) . gerombol Tunas dipotong dan dipisahkan menjadi gerombol tunas kecil yang terdiri dari 2-3 tunas. Dipangkas . satu bulan dimedia ini ,tunas tunas tersebut akan mengalami pertumbuhan tinggi dan tidak mengalami pertambahan jumlah tunas (Gambar 6,3) 3. Setelah satu bulan di media MS MS nol , gerombol tunas disubkulkul disubkulkultur tur ke media induksi tunas kembali . setelah 1-2 bulan bulan ,jumlah tunas dalam setiap gerombol tunas akan bertambah 3-4 kali lipat 4. Proses selanjutnya selanjutnya kembali ke tahap 2, gerombol gerombol tunas yang yang Dihasilkan Dihasilkan di media induksi tunas disubkultur disubkultur ke media elongasi elongasi Tunas . gerombol tunas di potong dan dipisahkan menjadi gerombol tunas kecil. Setelah itu bulan di media ini ,tunas-tunas ,tunas-tunas tersebut Disubkultur ke media media induksi tunas kembali kembali untuk multiplikasi multiplikasi Tunas .

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

35

 

E. Induksi Perakaran Setelah kultur pisang mencapai target yang diinginkan ,sebagian kultur tunas yang berasal Dari media multiplikasi multiplikas i tunas disubkultur ke media induksi akar , sedangkan sebagian sebagian kultur Lagi terus diulakukan moltiplikasi moltiplikasi tunas . Media induksi akar untuk tanaman tanaman pisang pisang adalah Media MS tanpa tanpa ZPT dengan kandungan kandungan hara makro setengah dari ionsentrasi normal,ditambah normal,ditambah arang aktif 2 g/L. Tunas pisang yang tumbuh bergerombol di media multiplikasi tunas dipisahkan satu sama lain .Kemudian ,tunas-tunas tersebut ditanam di media induksi perakaran .Setelah satu bulan di media, ini,tunas pisang mengalami pertumbuhan tinggi dan sudah mempunyai akar yang cukup banyak, sehingga siap untuk diaklimitasi diakli mitasi di media m edia tanah.

F. Aklimatisasi  Aklimatisasi dan Pemindahan Tanaman ke Lapang Tanaman hasil kultur  jaringan tidak dapat ditanam langsung di lapang, namun memerlukan proses adaptasi bertahap terhadap lingkungan barunya yang disebut dengan aklimatisasi. Hal ini diperlukan karena kondisi tanaman hasil kultur jaringan berbeda dengan tanaman normal di lapang. Kondisi lingkungan mikro botol kultur menyebabkan tanaman hasil kultur jaringan tidak memiliki lapisan lilin dan stomata tidak berfungsi sehingga sangat riskan jika langsung ditanam di lapang. Aklimatisasi dalam kultur in-vitro adalah suatu proses adaptasi dari tanaman hasil kultur in-vitro (plantlet) terhadap cekaman lingkungan baru sebelum ditanam di lapang. Kondisi lingkungan baru tersebut meliputi suhu, cahaya dan kelembaban. Tahap aklimatisasi ini juga merupakan tahap yang krusial dalam kultur jaringan. Kematian plantlet setelah aklimatisasi seringkali terjadi sehingga tahap ini perlu dilakukan secara hati-hati.  hati-hati.  Proses aklimatisasi plantlet pisang dilakukan melalui tahapan berikut ini : a. Siapkan plantlet plantlet dalam dalam botol kultur yang akan di aklimatisasi. aklimatisasi. b. Siapkan bubuk hormone penumbuh akar dalam wadah,tambahkan air secukupnya.sehingga secukupnya.se hingga terbentuk larutan hormone penumbuh akar yang cair. c. Siapkan bak aklim aklim yang sudah berisi berisi media.Aduk media media sambil disemprot dengan air hingga media lembab basah merata. d. Plantlet di keluarkan dari botol kultur,kemudian kultur,kemudian cuci di bawah air mengalir mengalir untuk membuang media agar yang menempel m enempel,terutama ,terutama pada bagian akarnya.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

36

 

e. Plantlet yang yang bergerombol bergerombol dipisahkan dipisahkan dengan menggunakan gunting. f.

Kemudian,plantlet Kemudian,plantlet direndam dalam larutan fungisida selama 1 enit. enit.

g. Setelah itu,bagian akar plantelet dicelupkan pada larutan hormone yang telah di sisipkan,kemudian plantlet plantlet ditanam di media aklim. h. Penanaman di ke lompokkan berdasarkan tinggi plantlet,plante plant let,plantelet let yang tinggi di tanam dalam bak yang terpisah dengan plantelet plantelet yang kecil. k ecil. i.

Bak plastik plastik yang sdh di tanami plantelet di semprot air hingga menjadi lembab basah,setelah itu bak di tutup dengan plastic transparan dan diikat dengan karet.

 j.

Pada bak aklim di beri label jenis tanaman,tanggal aklimatisasi,dan jumlah plantelet dalam bak aklim tersebut.

k. Bak plastik plastik di simpan dirumah kaca atau di dalam sungkup plastic bsar yang di naungi paranet 65-75% selama 4 minggu.

G.  Pembesaran Bibit Pisang hingga Siap Tanam

Cara menyiapkan media polibeg,penanaman ke polibek,dan pembesaran plantlet pisang pasca-aklimatisasi hingga menjadi siap jual atau siap tanam dilapangan hampir sama dengan pembesaran bibit jati.Yang berbeda hanya pada ukuran polibeg,ukuran polibeg yang optimal untuk bibit pisang adalah ukuran 15x15. Setelah ditanam di polibeg,bibit di pelihara di bawah sungkukan plastic selama 2 minggu dan di bawah paranet 2 minggu.Setelah itu,bibit di pindahkan ke lahan terbuka.Bibit di siram dua kali sehari:pagi sehari :pagi dan sore hari.Pupuk hari.Pu puk y yang ang di gunakan untuk bibit pisang adalah pupuk kompos yang diberikan setelah satu minggu dipindahke lahan terbuka.Pada minggu berikutnya,bibit pisang di pupukdengan pupuk urea setiap dua minggu sekali.Pembesaran bibit pisang hingga menjadi siap tanam di lapangan memerlukan pemeliharaan di lahan terbuka selama 2-3 bulan dengan tinggi bibit 15-20 cm. Pemeliharaan tahap pembesaran bibit pisang: a) Pemupukan. Menggunakan pupuk organik misalnya pupuk greentonic. b) Diwiwil.

Minimal

seminggu semingg u

sekali

dilakukan

pewiwilan

dengan

memisahkan/membuang daun yang kuning. c) Penyiraman. Dilakukan 1 kali sehari apabila tidak tidak hujan. d) Pencegahan hama. terawat dari gulma .

 

Lingkungan disekitar pembesaran pisang harus tetap

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

37

 

Persiapan eksplan

Pertumbuhan awal eksplan

Hasil Penanaman eksplan

Sub kultur media perakaran

Hasil Pertumbuhan pada media perakaran

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001    

Persiapan Aklimatisasi Pisang

Penanaman pada media aklimatisasi sekam bakar dan pasir

Pembesaran bibit pisang

 

38

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

39

 

H. Petunjuk Praktikum 1. Sub kultur Media pembelahan a. Definisi Kegiatan ini dilakukan untuk membelah bonggol pisang agar dapat diperbanyak. b. Tujuan Siswa dapat melaksanakan subkultur sesuai prosedur.

c. Alat

  LAF   Cawan petri   Pembakar spritus   pinset+skapel   korek   lap steril d. Bahan

  Media ms pembelahan   Bonggol pisang   Alkohol e. Prosedur kerja 1)

Siapkan alat dan bahan yang akan di gunakan.

2) 3)

Nyalakan UV, Blower, tunggusampai 30 menit. Lalu matikan dan nyalakan ligh.

4)

Sterilisasi Sterilisas i ruang LAV dengan alkohol 75% menggunakan lap lap tanagn.

5)

Alat dan bahan yang akan akan digunakan,sebel digunakan,sebelum um dimasukan dimasukan ke dalam ruangan LAV semprot menggunakan alkohol 75% dan keringkan dengan lap tangan.

6)

Letakan pembakar api bunsen di tengah (belakang),media perakaran sebelah kiri, botol alkohol 95% di belakang sebelah kanan, media yang berisi eksplan sebelah kanan depan botol alkohol, serta taruh petridis di depan api bunsen.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

40

 

7)

Matikan blower, tutup LAV, nyalakan UV tunggu 5-10 menit lalu buka dan matikan UV kembali dan nyalakan blower dan ligh.

8)

Nyalakan api bunsen dan sterilisasi terlebih dahulu cawan petri.

9)

Lepas plastik plastik cling cling wrep wrep yang terikat pada media media yang berisi eksplan

bonggol

pisang

lalu

sterilisasi

media

dengan

membakar di area tutup sampai keseluruhan botol dengan api bunsen. 10) Ambil eksplan bonggol pingsan dengan pinset yang sudah di sterilisasi dengan api bunsen , lalu letakan di cawan petri. 11) Strerilisasi kembali kembali pinset dengan api bunsen serta skapel. 12) Bersihkan Bersihka n bonggol pisang dari bonggol kering yang menempel di sekitar bonggol bawahnya, jika bonggol besar yang sudah bersih bisa di belah menjadi dua atau tiga. 13) Sterilisasi botol

media yang akan di gunakan dengan api

bunsen. Janagan lupa lupa untuk mensterilisasikan mensterilis asikan kembali pinset yang akan di pakai. 14) Isi botol 4-5 bonggol pisang baru dengan pinset. Lalu tekan dengan hati-hati agar bonggol pisang bisa menyatu dengan media agar. 15) Jika sudah, sterilisasi bagian tutup dengan api bunsen, tutup dengan rapat, lalu sterilisasi kembali hingga merata ke seluuruh bagian botol. 16) Lakukan prosedur 9-15 ke media yang selanjutnya. selanjutnya. 17) Jika sudah selesai subkultur,

matikan api bunsen dengan dengan

langsung menutup bagian yang terbakar.

Keluarkan semua

alat dan benda, lalu semprot kembali ruang LAV dengan alkohol. 18) Matikan blower, ligh.

f. Keterangan Sesuaikan dengan media ms pembelahan dengan BAP yang akan dilaksanakan.

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

41

 

2.

Aklimatisasi a. Pengertian  Aklimatisasi adalah suatu upaya mengadaptasikan mengadaptasikan tanaman pisang hasil perbanyakan perbanya kan melalui kultur in vitro ke lingkungan lingkungan in vivo  vivo  yang septik.

b. Tujuan Mengetahui dan dapat menjelaskan proses pengakaran dan aklmatisasi planlet hasil kultur jaringan, beserta faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan aklimatisasi tersebut. c. Alat

  Ember yang kecil   Pinset   Wadah / boks   polibag d. Bahan

  Fungisida   planlet yang akan di aklimatisasi   Air bersih   Media tanam yang terdiri dari tanah, tanah, pasir, pasir, sekam sekam bakar. Dengan perbandingan perbandinga n 2:1:1

  Pupuk kandang   Sekam biasa

e. Prosedur aklimatisasi aklimatisasi 1) Siapkan terlebih dahulu media tanam yang terdiri dari campuran tanah, pasir, dan sekam bakar. 2) Diamkan 2-3 hari media yang berada di boks, jangan lupa untuk disiram agar lembab 3) Planlet pisang yang akan di aklimatisasi di keluarkan keluarkan dari dari dalam dalam wadah/motol wadah/mot ol media.

Lalu rendam pada larutan fungisida dan

bakterisida 2 g/ L selama 5-10 5 -10 menit. 4) Agar-agar yang masih menempel di cuci bersih untuk membuang sumber kontaminasi k ontaminasi.. 5) Setelah itu itu planlet yang yang telah bersih, kering kering anginkan .

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

42

 

6) Selanjutnya, planlet planlet tersebut di tanam pada boks yang berisi medium tanah, pasir, pasir, dan sekam bakar. Tutup boks dengan rapat, kurang lebih 10-15 hari baru tutup boks tersebut dibuka. 7) Setelah selesai selesai di letakan letakan di green house house dan rawat rawat hingga tumbuh tumbuh daun baru.

f. Keterangan Ketika tanaman sudah berumur ± 1 bulan di dalam bos, pindah ke dalam polibag dengan media tanah, sekam, dan pupuk kandang dengan perbandingan 3:2:1.

I.

Latihan Soal Untuk mengukur tingkat pemahaman kalian terhadap materi diatas

 jawablah soal berikut berikut dengan benar! benar!

1. Jelaskan isolasi isolasi bahan tanam pada kultur jaringan pisang pisang dengan eksplan berasal dari anakan dan jantung pisang! 2. Sebutkan

bahan sterilisasi sterilisasi yang tepat tepat untuk eksplan pisang berasal berasal dari

anakan dan jantung pisang! 3. Jelaskan fungsi penambahan media dan BAP cair dalam inisiasi eksplan pisang! 4. Sebutkan komposisi media yang sesuai untuk multiplikasi multiplikasi tunas pada kultur kultur  jaringan pisang! pisang! 5. Kapan waktu yang tepat untuk untuk melakukan induksi perakaran perakaran dalam kultur kultur  jaringan pisang? pisang? Jelaskan alasanmu! alasanmu! 6. Jelaskan proses proses aklimatisasi aklimatisasi planlet pisang pisang hasil kultur jaringan jaringan 7. Jelaskan bagaimana pemeliharaan bibit pisang sampai siap tanam

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

43

 

DAFTAR PUSTAKA  Abidin, Z. 1982. Dasar-Dasar Pengetahuan tentang Zat Pengatur Tumbuh.  Angkasa:: Bandung. 85 hal.  Angkasa  Abidin,Z.  Abidin, Z. 1985. Dasar-dasar Pengetahuan tentang Zat Pengatur Tumbuh,  Angkasa, Bandung.  Angkasa,  Avivi,S dan Ikrarwati, 2004, Mikropagasi Pisang Abaca (Musa textilis Nee) Melalui Teknik Kultur Jaringan, Jurnal Ilmu Tanah Vol.11 Tanah Vol.11 No.2 Chawla, H. S. 2002. Introducti Introduction on to Plant Biotechnology. Science Publishers Inc. New Hemsphire. Hemsphire. 23-26. Gunawan, L.W. 1990. Teknik Kultur Jaringan Jaringan Tumbuhan. Tumbuhan. Laboratorium Laboratorium Kultur Jaringan. Pusat Jaringan.  Pusat Antar Universitas (PAU) Bioteknologi. IPB. Bogor. P. 304. Gunawan, L. N. 1987. Teknik Kultur Jaringan. Jaringan. Bogor: PAN ITB. Hendaryono, D. P. S dan Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif Modern. Modern . Yogyakarta: Kanisius Lestari, E.G., R. Purnamaningsih, dan S. Hutami. 1999.Perbanyakan 1999. Perbanyakan mikro tanaman tangguh melalui kultur in vitro. Prosiding Ekspose Hasil Penelitian Bioteknologi Pertanian. Bogor, Pertanian. Bogor, 31 Agustus-1 September 1999. Nisa,C dan Rodinah, 2005, Kultur Jaringan Beberapa Kultivar Buah Pisang (Musa  paradisiaca  paradisia ca L.) dengan Pemberian Campuran NAA dan Kinetin, Kinetin, Jurnal Bioscientiae, Bioscienti ae, Vol 2, No.2. Pierik, R.L.M. l987. In Vitro Culture of Higher Plants.Martinus Nijhoff Publisher.  Publisher.  London. 344 p. Priyono, D. Suhandi, Suhandi, dan Matsaleh. Matsaleh. 2000. Pengaruh Zat Pengatur Tumbuh IAA dan 2-IP pada Kultur Jaringan Bakal Buah Pisang . Jurnal Hortikultura. Hortikultur a. 10 (3) : 183 – 190. Priyono. 2000. Perbanyakan Abaka (Musa textillis Nee) melalui Kiltur Mata Tunas Secara In vitro. vitro. Pelita Perkebunan 9(2): 129-133. Purwanto, D.1991.  pengaruh ukuran bahan tanam terhadap keberhasilan keberhasilan  perbanyakan beberapa varietas pisang (Musa paradisiacal paradisiacal L.) dengan metode kultur jaringan. jaringan. Skripsi fakultas pertanian UNIBRAW. Malang. Salisbury, F.B. dan C.W. Ross. 1995. Fisiologi Tumbuhan. Tumbuhan. Jilid 3. Edisi Bahasa Indonesia. Penerbit Penerbit ITB, Bandung.

Satuhu, S., dan A. Supriyadi, 1999. “ Pisang” Budidaya, Pengolahan dan Prospek Pasar . Penebar Swadaya, Jakarta. Steenis JV. 2003. Flora Untuk Sekolah Indonesia. Indonesia . Cetakan IX. Jakarta (ID): Pradnya Paramita

 

FOFA AROFI, SST. MP NIP 198712022009122001  

44

 

Sitohang,N, 2004, “Kultur Meristem” Pisang Barangan(Musa paradisiaca L.) pada Media MS dengan Beberapa Komposisi Zat Pengatur Tumbuh naa, iba, Dan Kinetin,, Unika Santo Thomas Medan. Kinetin Taji, A., P. Kumar dan P. Lakshmanan. 2002. In Vitro Plant Breeding. Haworth Press, Inc., Press,  Inc., New York. Umami, N. 2012. Efficient Nursery Production and Multiple Formation from Shoot Tiller Derived Shoot Apices of DwarfShoot NapierClumps Grass (Pennisetum purpureum Schumach). Schumach). JWARAS 55 (2) : 121-127. Warda dan Hutagalung, L. 1994.Pisang 1994.Pisang barangan kultivar Sulawesi Selatan. Selatan . Informasi Hortikultura Hortikultura 2(1) Wibowo, A. 1998. Abaca 1998.  Abaca (Musa textillis Nee) Penghasil Penghasil Serat . Duta Rimba XXIV (222): 31-37. Yusnita. 2003. 2003. Kultur Jaringan Jaringan Cara Memperbanyak Memperbanyak Tanaman Secara Efisien. Efisien. Jakarta: PT. Agromedia Pustaka. Zulkarnain.2009. Kultur Jaringan Tanaman Solusi Perbanyak Tanaman Budidaya.. Jakarta: PT. Bumi Aksara Budidaya