Diagnostico Molecular y Biosensores

 

27 Noviembre de 2015

 ARTÍCULO DE DE REVIS REVISIÓN IÓN

Diagnóstico molecular y biosensores  ANDREA CORREA O.1, HECTOR PARRA F.1, KENIA HOYOS G.1 1. Estudiantes del Programa de Bacteriología, Facultad Ciencias de la Salud, Universidad de Córdoba- Montería.

RESUMEN Los avances de la Biotecnología han permitido la creación de diferentes métodos de diagnósticos moleculares y el empleo de biosensores; permitiendo la detección de marcadores moleculares a partir de proteínas, productos metabólicos, alteraciones genéticas, entre otros, los cuales pueden estar presentes en los organismos vivos que ayudan a ser indicadores del estado fisiológico del cuerpo actuando con gran sensibilidad y especificidad. Esto ha concedido a la medicina una ayuda para el diagnóstico temprano, seguir el curso de la enfermedad y administrar un adecuado tratamiento; para esto se utilizan microarrays, técnicas inmunohistoquímicas, PCR e Hibridación, entre otras.

Palabras claves: Biotecnología, Diagnóstico molecular, Biosensores, Microarrays, técnicas inmunohistoquímicas, PCR, Hibridación. SUMMARY Biotechnology advances have enabled the creation of different molecular diagnostic methods and the use of biosensors, allowing detection of molecular markers fromcanproteins, metabolic alterations, among of other. Which ones be present in aliveproducts, organismsgenetic that help to be indicators the physiological state of the body, acting with a large amount sensibility and specificity. This has given aid to medicine to an early diagnose, following the disease evolution and administer the right treatment; in order to this, microarrays, immunohistochemistry techniques, PCR and hybridization, and among others can be used. Biotechnology, molecular Keywords: immunohistochemistry, PCR, hybridization.

diagnose,

1 Biotecnología: Diagnóstico molecular y biosensores

biosensors,

 

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INTRODUCCION Con la evolución del hombre y el paso de las décadas se han elaborado y potenciado todas aquellas técnicas que abarcan el diagnóstico de las enfermedades basadas en la manipulación de los componentes de la célula, pero para llegar a esto la ciencia debió interrelacionar varias áreas como la física, la química y la biologia1. El proceso de generación de nuevas ideas y conocimientos en cuanto a la biotecnología roja fue dado gracias al desarrollo del modelo estructural del  ADN por Watson y Crick en los años 50, que dio paso a las investigaciones bioquímicas y genéticas, no solo del genoma humano sino de otras especies como los microorganismos y que permitió a la ingeniería genética crear los procesos recombinantes del  ADN que permitiría introducir fracciones de este a otras células o clonar ciertos tipos de células. Esta ciencia y desarrollo tecnológico nuevo conllevó deal desarrollo biotecnológico métodos diagnósticos de enfermedades basadas en la biología molecular y biosensores, los cuales permiten detectar de una forma temprana las aberraciones genéticas hereditarias o adquiridas que transforman la estructura del ADN alterando la producción de proteínas normales creando un proceso patológico.

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 Además todo esto permitió no solo la creación e introducción al mercado tanto de proteínas o enzimas de interés sino de medicamentos que pudieran combatir algunas enfermedades. Las nacientes, pero cada vez más consolidadas técnicas de micro fabricación, incluidas las de fabricación a nanoescala, han abierto un panorama de gran porvenir para el desarrollo y aplicación de los biosensores, dada la reducción de costes que la miniaturización conlleva y la posibilidad de producirlos a gran escala2 de biosensores; además la creación y fabricación de enzimas basadas en el proceso de secuenciación de ADN ha abierto al mundo a la investigación de muchas de las enfermedades teniendo en cuenta la biología molecular. Desde entonces el desarrollo tecnológico a aportando una nueva área de la tecnología de gran interés médico para el diagnóstico, seguimiento y tratamiento oportuno de enfermedades.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR La biología molecular estudia la composición, estructura y función de las moléculas importantes para la vida, manteniendo estrechas relaciones con diversas disciplinas entre las que destacan la bioquímica y la genética, el desarrollo de la biología molecular ha ido íntimamente ligado al desarrollo de las técnicas

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moleculares, propiciado principalmente por las aportaciones de físicos y químicos3. La biología molecular se han convertido desde los años ochenta, en un instrumentos indispensable para los laboratorios de diagnóstico de medicina veterinaria y medicina humana, basadas no solo en el análisis del genoma bacteriano en los tejidos del animal infectado que haya muerto, o en las secreciones de animales vivos enfermos4, sino en el propio genoma de las especies aquejadas con una enfermedad hereditaria y los productos de este como diversas proteínas.

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por un carácter o gen hereditario, si no que pueden ser debido a la adquisición de un agente extraño en el ambiente que sea capaz de inducir la mutación del ADN como tal. Teniendo en cuenta esto, el principio del diagnóstico de enfermedades con la implementación de técnicas de biología molecular, está basado en la comparación del ADN fluctuante y el  ADN normal, lo que permitirá un adecuado seguimiento y la instauración de un tratamiento que pueda mejorar el estado del paciente.

TECNICAS MOLECULAR

DE

BIOLOGIA

Como se sabe el genoma no es una estructura estática, si no que puede presentar ciertas modificaciones que conllevan al cambio del estado fisiológico del paciente, estas modificaciones o cambios en el genoma pueden ser puntuales, las cuales son mutaciones simples que generaran cierto tipo de delecciones, inserciones y hasta sustituciones de

Las técnicas de biología molecular son aquellas técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en su máxima pureza y así visualizar su estado fraccionándolo, amplificándolo y determinando la ganancia o pérdida de sitios de restricción, se Pueden encontrar técnicas moleculares que varían según el tipo de muestra que se

uno o varios nucleótidos; o también pueden ser a gran escala ocasionando una aberración cromosómica en el ADN, esto generan entonces la codificación de un ARNm variante y la producción de proteínas con características diferentes a la normal o por el contrario la ausencia de producción de esta.

desee analizarPCR, y dentro de ,las cuales encontramos Cloning  Southern blot, Secuenciación, Northern blot,  RT-PCR, Hibridación in situ, Western blot, Inmunohistoquímicas, ELISA, Citometría de flujo5 (Tabla 1).  Además Existen varias técnicas moleculares capaces de detectar varias tipos de moléculas como pueden ser ADN, ARN y proteínas, dentro de las cuales encontramos:

Estos no procesos de modificación de  ADN solo pueden ser generados 3 Biotecnología: Diagnóstico molecular y biosensores

 

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  E lectrofo lectrofores res is en g el: el:  se basa en la separación de ácidos nucleícos o proteínas según su tamaño y carga eléctrica mediante campo eléctrico en medio poroso, su aplicación está dada a la

farmacogenética (identificación de dianas terapéuticas para el desarrollo de fármacos), al diagnóstico de enfermedades, detección de mutaciones y polimorfismos además de análisis

comparación de muestras biológicas que se comporten de una manera distinta (ADN de un individuo sano vs ADN de un individuo enfermo), es una técnica sencilla pero a menudo necesita comparar datos con otros conocidos5.   Hibridación:   Es la unión de sondas especificas marcadas a los ácidos nucleídos o proteínas a

de perfiles de expresión. su ventaja se basa en la posibilidad del estudio de varios elementos simultáneamente en la misma muestra, requiriendo cantidades mínimas de reactivo5.

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

identificar, esta técnica de usa en PCR, chips de ADN, Southern blot y Northern blot y presenta una alta especificidad aunque requiere de un método de visualización 5.    Mi  Micc ro roarr arrays ays : permiten analizar  ARNm mediante ensayos de hibridación, estos ARNm son capaces de aparearse con moléculas de DNA inmovilizadas en la superficie del chip por

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complementariedad6, esto la hace una técnica cuantitativa, de alta validez, reproducibilidad y sensibilidad. Se aplica en la monitorización de niveles de biomarcadores, detección de cambios en material genético, evaluación de interacciones entre proteínas   Biochips:   son ensayos bioquímicos miniaturizados que se

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aplican a la farmacogenómica y 4 Biotecnología: Diagnóstico molecular y biosensores

 

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 ART CULO DE REVISI REVISI N

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR MOLECULAR APLICABLES ESPECIFICAMENTE PARA ADN, ARN o PROTE NAS5.  Metodolog ía

PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

PCR cuantitativa o en tiempo real TECNICAS PARA  ADN Cloning

Southern blot

Secuenciación

TECNICAS PARA  ARN

Northern blot

A plicaci ón

Ventajas

Li mitaciones

Método enzimático de amplificación de secuencias específicas de ADN para obtener millones de copias, mediante la ADN polimerasa. Variante de la PCR

 Amplificación de genes, Límite de detección modificación de muy alto. fragmentos de ADN, genotipificacón, detección de mutaciones, marcadores genéticos, expresión de genes. cuantitativa, Cuantificación de Técnica

Requiere de material genético bicatenario y técnicas de visualización, es semicuantitativa, frecuentes falsos positivos por contaminación leve.

en la de que forma se cuantifica absoluta o relativa el producto de la amplificación de  ADN.

expresión génica, valoración de la eficacia de fármacos, detección de agentes infecciosos y polimorfismos, diagnostico tumoral, medición de telómeros. Obtener un fragmento de ADN buscado. Detección de tamaño y cantidad de un fragmento de ADN de interés. Entender la estructura, detectar mutaciones y mecanismos fisiopatológicos generados por interferencia en la secuencia y homología

mayor rapidez, sensibilidad menosy probabilidad e contaminación, no requiere electroforesis para su visualización.

calibrado cuantificación para absoluta lay una alta calidad del material de partida, se aconseja la estandarización.

Posibilidad de ampliar la muestra exacta. Permite cuantificar tamaño y abundancia.

Se obtiene solo una copia. Técnica lenta, requiere grandes cantidades de  ADN.

Duplicar un gen o una porción de este. Electroforesis e hibridación para secuencias específicas de ADN. Conocimiento de la secuencia de bases nitrogenadas mediante un método químico o enzimático. Electroforesis hibridación secuencias específicas  ARNm.

de genes. e Detección de tamaño y para número de transcripciones. de

Requiere de curva de

Permite el No permite conocimiento de la conocimiento de estructura más básica función de las bases. de un nucleótido o gen.

el la

Técnica más sensible Técnica lenta que para detectar niveles requiere grandes de expresión de cantidades de ARN.  ARNm.

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RT-PCR

Hibridación in situ

peso molecular, detección Mediante Ac específicos. Detección de moléculas mediante Inmunohistoquímicas uniones específicas  Antígeno-anticuerpo. Western blot

TECNICAS PARA

 Amplificación de fragmentos de interés para obtener millones de copias, con un paso previo de conversión de  ARNm en ADNc Bicatenario. Visualización de una secuencia de ADN o  ARN en el sitio donde se encuentra mediante hibridación por complementariedad de bases. Electroforesis en gel separa proteínas según

Cuantificación de Requiere cantidades Técnica semicuantitativa. expresión génica, mínimas de ARN. valoración de la eficacia de fármacos, detección de agentes infecciosos, diagnostico tumoral.  Analizar la presencia y/o distribución de una secuencia de ADN o  ARN transcrito de interés en tejidos o células.

Sondas más sensibles y específicas que las de ADN, la visualización del tejido permite correlacionar el resultado con muestras histológicas e inmunológicas. Examinar cambios en Técnica con gran niveles sensibilidad, permite Proteicos. detectar el peso molecular proteínas.

de

Las sondas de ARN son más lábiles que las de  ADN.

Técnica semicuantitativa poco específica, laboriosa, requiere

las técnicas de visualización.

Localización de Posibles a partir de proteínas muestras congeladas o Específicas en tejidos o en formol. células.

Técnica semicuantitativa.

PROTEINAS ELISA (Enzyme linked inmuno sorbent assay)

Citometría de flujo

Ensayo inmunoenzimático que puede ser directo/ indirecto, Cualitativo/ cuantitativo. Paso de células por un fluido bajo una fuente de luz que permite su visualización.

Cuantificación moléculas.

de Sencilla, rápida, Requiere técnicas económica, visualización de automatizable, análisis reacción enzimática. simultaneo de varias muestras.

Recuento celular, Técnica rápida, permite evaluación de valorar el contenido marcadores fenotípicos, total de ADN de una ciclos celulares población celular. apoptosis.

Requiere células suspensión.

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Entonces como se ha mostrado anteriormente en cada análisis de diagnóstico molecular hay un sin número de técnicas que se pueden

de una especie el cual es de gran interés pecuario.

utilizar y que están disponibles en el mercado, pero es importante destacar que la elección de la técnica apropiada para un determinado examen de diagnóstico debe ser muy cuidadosa y a demás estar basada en el conocimiento de las ventajas y desventajas esta7.

biología el estudio y manejo molecular de las en enfermedades podemos encontrar:

APLICACIONES DE LA BIOLOGIA MOLECULAR las aplicaciones diagnósticas de la biología molecular son extremadamente variadas y básicamente son aplicables a cualquier problema diagnóstico asociado a procesos biológicos8, estas técnicas han permitido la búsqueda de ADN en muchos campos uno de ellos la medicina, permitiendo así con la genética molecular humana el diagnóstico de mutaciones genéticas que contribuyen al desarrollo de 9 enfermedades , búsqueda de alelos asociados a una característica de interés, diagnostico bacteriano y viral, test de paternidad, diagnóstico de identidad forense, así como detección de marcadores celulares de interés.

En cuanto a las aplicaciones de la

  Identificación de la etiología Corresponde al  g énica: éni ca: descubrimiento de genes que contribuyen al desarrollo de enfermedades, una vez identificado el o los genes responsables se abren amplias perspectivas para la comprensión de sus mecanismo patogénicos, diagnósticos, tratamiento y 8 prevención . 

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  Estudio de la patogenia de las enfermedades :  El poder de la medicina molecular también se manifiesta en el estudio de los mecanismos, que permiten que el genotipo se traduzca en el fenotipo anormal de una enfermedad. Esta aplicación de la medicina molecular se ha denominado genética funcional o patogenética y tiene importancia no sólo para entender los mecanismos de una enfermedad sino también para el desarrollo de nuevos tratamientos9. 

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de la

en

También se puede utilizar estas técnicas en el campo control de

  Diagnóstico

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molecular de ag en enttes i nfe nfeccios ccios os: se basa en

la detección de genes o partículas calidad que pueden determinar contaminación microbiana de del agente infeccioso que está alimentos y agua, además selección ocasionando la enfermedad en el de marcadores para el mejoramiento 7 Biotecnología: Diagnóstico molecular y biosensores

 

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paciente, llevando a la ventaja de ser más rápida que otros métodos diagnósticos y con la posibilidad de un número menor de muestra (tabla 2).  TECNICAS TECNI CAS DE B IOLO IOLOGIA GIA MO MOLECULAR LECULAR APLICADA AL DIAGNOSTI DIAGNOSTICO CO DE 7   A G E NT NTE E S IN F E C C IOS IO S OS .

Microorganismo

Metodología

Virus

CMV Enterovirus VEB VHC VHS I Y VHS II VIH VPH

PCR, Branched DNA RT-PCR PCR, hibridación in situ de  ARN6   Branched DNA, Hibridacion in situ6  

PCR Branched DNA Secuenciacion, PCR, hibridacion in situ6  

Bacterias Bartonella hensalae Bordetella pertussis Chlamydia pneumonia Legionella pneumophila Mycoplasma pneumonia Mycobacterium sp

PCR PCR PCR PCR PCR

S. aureus MR

PCR, PFGE PCR, hibridación in situ PCR

Hongos

 Aspergillus sp/ Candida sp Pneumocystis carinii

BIOSENSORES Los biosensores iniciaron su desarrollo y comercialización, fundamentalmente, alrededor de los

 

través de la reacción catalizada por la glucosa oxidasa; éste biosensor fue diseñado en 1962, acoplando la glucosa oxidasa a un electrodo selectivo de oxígeno10.

años 60, orientados a aplicaciones clínicas y de impacto bioquímico. El

Durante la última década se han

primero desarrollado fue un sensor enzimático para determinar la concentración de glucosa en sangre a

producido notables avances en lo que respecta a las tecnologías que soportan el desarrollo de nuevos

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procedimientos de análisis. En este sentido, la capacidad catalítica y de reconocimiento de los sistemas biológicos y químicos11.

generando un cambio particular que otro componente del sensor, el elemento transductor, convierte en una señal fácilmente medible.

¿Qué es un biosensor?

Clasificación de los biosensores 

Un biosensor es un dispositivo que usa reacciones bioquímicas específicas mediadas por enzimas, anticuerpos, organelos, tejidos o células completas para detectar compuestos químicos usualmente por señales eléctricas, térmicas u ópticas12.

Los biosensores pueden clasificarse atendiendo a diferentes criterios.

Según la IUPAC, un biosensor está constituido por dos partes integradas: un elemento de reconocimiento biológico o biorreceptor y un transductor fisicoquímico13. La interacción entre el biorreceptor y el analito ocasiona cambios físicos o químicos (de tipo eléctrico, óptico, térmico o másico) que son detectados y transformados en una señal eléctrica por el transductor 14. La utilización del biorreceptor permite aportar selectividad y pueden emplearse proteínas, ácidos nucleicos, microorganismos, organelas, o tejidos. La elección del material biológico depende de las características del analito. Los

elementos

biológicos

Clasificación de según su estructura

biosensores

Se puede definir un biosensor como un dispositivo analítico que consta básicamente de dos partes:   Una “fase sensible” (elemento de reconocimiento): capaz de interaccionar selectivamente con la especie de interés, con el resultado de un cambio físico o químico del sistema cuya intensidad estará relacionada con la concentración de la especie a analizar.   Un “transductor” de tipo

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mencionados funcionan como elementos de reconocimiento, es decir, entran en contacto directo con el compuesto químico que nos interesa detectar (llamado analito),

óptico, eléctrico, térmico, másico, acústico o magnético, el cual transforma la interacción bioquímica en una

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señal analítica susceptible de ser medida11.

catalítica producto).

(Enzima-

sustrato-

de

-Sensores biocatalíticos: Utilizan

acoplamiento elemento de reconocimiento del y el transductor.

catalizadores biológicos en quelos median la reacción química, que pueden intervenir diferentes sustratos para generar uno o varios productos, al finalizar el proceso el biocatalizador es capaz de regenerarse para ser nuevamente utilizada. Entre estos se pueden encontrar enzimas, células, tejidos y organelas subcelulares.

Clasificación

según

forma

Se establecen dos categorías en función de la forma de acoplamiento del elemento de reconocimiento y el transductor. Estos dos elementos esenciales pueden estar conectados ópticamente (mediante el empleo de una fibra óptica) o eléctricamente; o bien el transductor (detector) y la “fase

sensible”

pueden

estar

integrados en un único elemento.

Sensores biológicos reconocimiento más comunes

de

Las moléculas de reconocimiento en los biosensores deben cumplir con diferentes criterios para que puedan ser utilizadas; entre estos debe poseer afinidad hacia el elemento objeto de reconocimiento, ser selectiva para escoger a este elemento en presencia de otras sustancias y además que tenga la capacidad de permanecer estable por un tiempo determinado2. Existen dos tipos de sensores biológicos, que dependen del enlace

-Sensores de bioafinidad: consisten en la interacción del analito con el elemento de reconocimiento, sin que exista una transformación catalítica. La interacción conlleva a la modificación de un equilibrio en el que se forma un complejo analitoreceptor. Entre estos podemos encontrar anticuerpos, lectinas, receptores, ácidos nucleicos y canales iónicos2.

que se forme, puede conllevar simplemente el enlace entre el elemento receptor anticuerpo) y la molécula conocida (antígenoo que la interacción sea de naturaleza

Ilustración 1. Representación esquemática de un biosensor. Disponible en:

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http://www.revista.unam.mx/vol.15/num12/art 97 /

Aplicaciones biosensores

clínicas

de

los

Las aplicaciones de estos dispositivos son múltiples: agricultura, alimentación o defensa. Sin embargo, el 92% de las aplicaciones se encuentran en el campo de la medicina. Entre estas aplicaciones podemos encontrar:   Biosensores para medir la

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glucosa en personas diabéticas:  este dispositivo trata se simular la acción biológica al incluir dentro de este medio enzimas que degradan la glucosa junto con un electrodo encargado de traducir la degradación en un valor de la concentración de la glucosa en la sangre. Fue ideado en el año 1962 por los médicos estadounidenses Clark y Lyons, en vista de la incomodidad y sufrimiento que suponía para los diabéticos someterse a continuos análisis de sangre15. A adicionalmente, el biosensor desarrollado muestra una respuesta rápida en el tiempo y también una

  Biosensor para la detección de anticuerpos anti-VIH: basado en la utilización combinada de una enzima alostérica, modificada genéticamente, y una matriz con redes de microelectrodos. Una de las ventajas de este biosensor es su alta sensibilidad, su sencillez en la detección y su portabilidad 16. Un equipo de investigadores del Instituto de Microelectrónica de Barcelona (IMB), adscrito a esta



universidad, desarrolló en el pasado año 2009, un biosensor que permite la detección del virus de inmunodeficiencia humana 15 (VIH) en una hora .   Detección de cancerígenas. 

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células

Otras aplicaciones   Los biosensores se utilizan para la detección e identificación de microorganismos patógenos y toxinas que contaminan el ambiente.    Uso de biosensores aplicado al control de calidad los

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buena selectividad y reproducibilidad a temperatura ambiente, además de 16 permitir una buena reusabilidad . 

alimentos.    Para la detección de toxinas producidas por hongos, enterotoxinas, entre otras.    Los biosensores se utilizan para determinar las

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características organolépticas de los alimentos. En el caso de frutas se puede analizar el contenido de algunos ácidos orgánicos y azúcares que son indicadores de la madurez de las mismas17.   Detección de mercurio en suelos.    Biosensores utilizados para determinar alérgenos.    Detección de agentes químicos y biológicos potencialmente contaminantes: pesticidas10.

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CONCLUSIÓN Las utilidades ofrecidas por el diagnóstico molecular y el uso de biosensores junto con las aplicaciones y conocimientos en genética y biología molecular en el ámbito clínico son de gran ayuda en el diagnóstico certero y temprano de enfermedades humanas así como también en otros aspectos importantes entre los que se incluye la industria, pero la mayor parte de los usos y aplicaciones son desarrollados en el campo de la medicina por lo que es probable que un futuro el diagnóstico de muchas enfermedades en las que actualmente el diagnostico se realiza

recibir un tratamiento especializado y eficaz.

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