Determinacion del peso molecular de una proteina utilizando cromatografia por Exclusion Molecular

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

M É T O D O S D E A N Á L I S I S 

Práctica (Ciclo 3)

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE UNA PROTEÍNA USANDO C ROMA ROMAT T OGRAF ÍA POR EXCLUSIÓN MOLECULAR. Sección 2

5QM2 Díaz López Mónica/ Equipo: Trejo Solórzano Alejandra

Introduccion La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes presentes en una misma muestra. El método está basado en la circulación de una fase móvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a través de una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos presentes en la mezcla resultará su separación. La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel o de tamiz molecular) es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (partículas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un t amaño de diámetro determinado. Hypothetical partial structure of sephacryl Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular. Mecanismo de la cromatografía de exclusión Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero.

Mecanismo de la cromatografía de exclusión Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las  partículas de menor masa molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero.

Objetivos 

Utilizar el gel apropiado para eluir proteínas de peso molecular conocido y determinará su volumen de elución (Ve)



Realizar una gráfica que relacione los volúmenes de elución relativos (Ve/Vo), y el logaritmo de los pesos moleculares de las proteínas patrón.



Determinar el peso molecular de una proteína problema

Resultádos  A. DETERMINACION DEL VOLUMEN VACIO DE LA COLUMNA. Tabla 1. Determinación de volumen vacío (Vo) de la Columna. No. de fracci ón

 A 615nm

1 2

Volumen de elució n (mL) 3 6

3

9

0,002

4

12

0,002

5

15

0,002

6 7 8 9 10 11 12

18 21 24 27 30 33 36

0,002 0,528 0,843 0,083 0,018 0,007 0,003

0,002 0,002

1. ¿Cuál es el volumen vacío de la columna? - El volumen vacío de la columna es de 21 mL, esto depende de la altura de la misma.

Volumen Vácío de lá columná

Perfil de Elución de Dextrana Azul 2000 0,9 0,8 0,7     )    m0,6    n     ( 0,5    a    i    c    n 0,4    a     b    r 0,3    o    s     b 0,2     A

0,1 0 -0,1 3

6

9

12

15

18

21

24

27

30

33

36

Volumen de Elución (mL)

Fig. 1 Perfil de Elución de Dextrana Azul 2000 para la determinación del volumen vacío en la columna cromatografica. B. DETERMINACION DEL VOLUMEN DE ELUCION (Ve), DE LAS PRTEINAS PATRON Y PROBLEMA. Tabla 2. Determinación de volumen de elución de las proteínas. Volumen de elución (mL) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54

 Albúmina (Problema) 0,03 -0,015 0,114 0,804 0,721 0,202 0,041 0,101 0,026 -0,006 0,039 -0,01 0,089 0,052 -0,023 -0,031 0,008 0,024

 Abso rb anc ia Lisozima Hemoglobina -0,014 -0,039 0,007 0,028 0,039 0,062 0,331 -0,333 0,672 0,995 1,186 1,047 0,87 0,572 0,298 0,167 0,034 0,142

-0,012 -0,013 -0,015 -0,009 0,958 1,378 0,968 0,558 0,27 0,118 0,045 0,013 0,009 -0,002 -0,002 -0,001 -0,001

Tripsina 0,007 0,034 0,013 0,043 -0,015 0,128 0,049 0,164 0,273 0,337 0,368 0,203 0,282 0,368 0,481 0,553 0,251 0,103

0,002 0,075 0,042 0,009 0,034 0,019 0,086

57 60 63 66 69 72 75

0,004 -0,021 -0,003 -0,042 -0,032 0,014 0,08

0,06 0,063 -0,023 -0,023 0,034 0,086

Perfil de Elución de proteínas patrón y proteína problema 1,3 1,2 1,1 1 0,9    m0,8    n 0,7     0     8 0,6     2    a 0,5    a    i 0,4    c    n 0,3    a     b 0,2    r    o    s 0,1     b     A 0 -0,1 3 -0,2 -0,3 -0,4 -0,5

6

9

1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 0,2 0,1 0 -0,1

Volumen de Elución (mL)

Albumina (Problema)

Lizosima

Tripsina

Hemoglobina

Fig. 2 Perfil de Elución de las proteínas patrón utilizadas y la proteína problema.

C. DETERMINACION DE LA RELACION Ve/Vo. Tabla 3. Relación de Ve/Vo y el logaritmo del peso molecular de las proteínas  patrón y problema. Prot eínas

Vo (mL)

Ve (mL)

PM

Log PM

Ve/Vo

Lisozima Tripsina Hemoglobina  Al bu mi na

15 24 24 15

33 51 21 15

14400 24000 64500 67000

4,16 4,38 4,81 4,83

2,20 2,13 0,88 1,00

   m    n     5     0     4    a    a    i    c    n    a     b    r    o    s     b     A

Cálculos.   = / 

Relación de volúmenes= (24 )(21)= 0.88 

Curva tipo 2,50

   o     V     /    e     V2,00    o    v    i    t    a     l    e 1,50     R    n    o    i    c    u1,00     l     E    e     d    n0,50    e    m    u     l    o     V0,00

4,10

y = -2,1535x + 11,315 R² = 0,9175

4,20

4,30

4,40

4,50

4,60

4,70

4,80

4,90

Log PM

Fig. 3. Curva tipo empleando el método de Andrews y Whitaker del volumen e elución relativo respecto al logaritmo del peso molecular. Calculo del PM con la ecuación de la recta. Y=mx+b Ve/Vo= m (logPM) + b Utilizando el valor de que obtuvimos en la relación Ve/Vo de nuestra proteína problema: 1= -2.16 (logPM) +11.33  1−11.33 −2.16

= 4.78

 Antilog PM (4.78)= 60200

Daltones

a) ¿Cuál es el peso molecular Según los cálculos realizados, de acuerdo a la curva tipo, el peso molecular es de 60200 daltones, por lo tanto el valor obtenido experimentalmente para nuestra proteína problema (albúmina), no esta tan alejado del valor calculado, es similar. b) Mencionar 5 métodos para determinar peso molecular. Electroforesis: La electroforesis en gel de SDS se usa comúnmente para obtener estimaciones de peso molecular fiables para polipéptidos desnaturalizados. Las

proteínas migran a través del gel hacia el electrodo positivo a una velocidad que es inversamente proporcional a su peso molecular. Método de Kjeldah mediante la determinación del nitrógeno orgánico: Primero reaccionan las proteínas en una mezcla con H2SO4 en presencia de catalizadores, donde el nitrógeno orgánico pasa a sulfato de amonio. La mezcla se neutraliza con una base y se destila recogiendo en ácido bórico. Luego se titula, el contenido de nitrógeno es proporcional a las proteínas de la muestra Espectrometría de masas: Por un método de tinción con plata superficial compatible con la digestión proteica. c) Mencionar ventajas y limitaciones del método empleado. Ventajas -Utiliza materiales comunes para el montaje del sistema cromatografico. -No utiliza mucha cantidad de muestra. Desventajas -No es posible observar el desarrollo cuando la muestra es incolora. -Para una buena resolución es necesario mantener todos los parámetros controlados. -El tiempo de separación delas moléculas pequeñas es mucho mas prolongado.

Discusion En esta práctica se llevó a cabo un método cromatográfico para determinar el peso molecular de una proteína problema, que en este caso fue Albúmina. Primero se llevó a cabo el empaquetamiento de la columna con el gel Sephadex G75, que es un gel de dextrana con un intervalo de fraccionamiento de 3000-80000 daltones, luego se realizó la determinación del volumen vacío para conocer el volumen intersticial que existe entre las esferas del gel de la fase estacionaria (Sephadex G-75), esta determinación se realizó con dextrana azul 2000 con un peso molecular de 2000 kDa, asegurando que no entrara en los poros del gel y solo pase entre las esferas del mismo, el volumen vacío resulto de la f racción de volumen a la que se presentó mayor absorbancia (Tabla 1.), para observar la representación gráfica de los resultados obtenidos durante la cromatografía se realizó el perfil de elución (Fig 1) esperándose un único pico a 615 nm, este volumen vacío dependerá de la velocidad de elución y de la altura de la columna utilizada para el experimento. Para la determinación de la curva tipo se trataron diferentes muestras patrón: Lisozima, Tripsina y Hemoglobina, en nuestro caso se trabajó con Hemoglobina, siendo esta una proteína colorida se leyó a 405 nm. En la Fig 2 Se puede observar que en las diferentes proteínas patrón se presentan diferentes picos de absorción máxima la razón es que la integración de la muestra se llevó a cabo en diferentes bloques; la proteína no está integra y hubo cierta degradación de la misma por lo cual alguno de los picos pueda ser por fragmentos de péptidos.

El peso molecular de la proteína problema fue determinado con la ecuación de la recta de la Fig. 3, que representa la relación del volumen de elución relativa de cada una de las proteínas patrón respecto al logaritmo del peso molecular, se encontró que el valor obtenido experimentalmente es muy similar al calculado.

Conclusiones 

Se determinó el peso molecular de una proteína problema mediante la ecuación de la recta de la curva tipo.



Se determinaron algunas de las ventajas y desventajas del método de separación empleado.



Se realizó el perfil de elución de la dextrana azul para determianr volumen vacío.



El volumen de elución es la cantidad de tiempo que se invierte para que la fase móvil salga sin interferencia del analito y depende relativamente de la altura de la columna cromatografica.

Bibliográfíá. 

“TÉCNICAS DE SEPARACIÓN. CROMATOGRAFÍA” URL: http://ocw.uc3m.es/ciencia-e-oin/caracterizacion-de-materiales/materialde-clase-1/Tecnicas_de_separacion_cromatografica.pdf (Consulta 25/10/16)



“SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR” URL: http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/6.pdf (Consulta 24/10/16)