Determinación de Riboflavina por fluorometria

ENCB-IPN 5QV1, Sección 3 Práctica: Determinación de Riboflavina por fluorometria Fundamento: La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una técnica complementaria es la espectrometría de absorción. Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros. Su fundamento es la fluorescencia que es la emisión de radiación por electrones excitados. En el fenómeno de fluorescencia, una molécula absorbe radiación electromagnética y debido a ello los electrones pasan de un estado basal a otra fase de excitación. Objetivos:  

Determinar el efecto del pH sobre el disolvente Elegir el mejor disolvente para la riboflavina

Resultados: Tabla 1. Resultados de Curva de Calibración de riboflavina en diferentes medios Intensidad de Emisión

Riboflavina (ppm)

Agua

HCl 0.1M

CH3COOH 0.9M

NaOH 0.1M

0

5

4.98

5

4.98

1

5.91

5.08

5.65

4.99

2

6.74

4.96

6.27

5

3

7.53

5.26

6.88

5.01

4

8.27

5.44

7.4

5.02

5

8.83

5.13

8.01

5.04

10

11.86

5.74

10.16

5.05

50

17.52

6.63

14.09

5.1

pH

5.5

1

4

13

Curva Tipo de los diferentes disolventes 10

9

f(x) = 0.77x + 5.12 Linear (Agua ) R² = 0.99

Agua 8

Intensidad de Emisión

HCl

Linear (HCl)

NaOH

Linear (NaOH)

f(x) = 0.6x + 5.04 R² = 1

7

6 Ácido Acético

Linear (Ácido Acético) f(x) = 0.06x + 4.99 f(x) 0.01x + 4.98 R² ==0.39 R² = 0.98

5

4

0

1

2

3

4

5

6

Figura 1. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes Concentración (ppm) contra la concentración de 0 a 5 ppm.

Curva Tipo de los diferentes disolventes 20 18 16 14

Intensidad de Emisión

12 10 8 6 4

0

10

20

30

40

50

concentración (ppm) Agua

HCl

Ácido Acético

NaOH

Figura 2. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes contra la concentración de 0 a 50 ppm.

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Discusión La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. En la figura 1 se observa la intensidad de emisión de la riboflavina con diferentes disolventes. La riboflavina posee un grupo aromático, por lo que la estructura de la molécula se verá afectada con el pH, siendo el pH alcalino el que afecta más a la estructura y lo podemos observar en la figura 1, donde el valor de la pendiente para recta para NaOH es la más baja, esto nos indica que es menos exacto. El agua presenta el valor más alto de m, nos indica que es el mejor disolvente y que es más exacto. En la figura 2 se graficaron todas las concentraciones de riboflavina (0-50 ppm). A concentraciones altas la energía emitida es absorbida por otras molecular por eso se observa ese comportamiento en la diferentes rectas.

Conclusiones:  

El pH ácido y fuerte no es buen disolvente para la riboflavina El mejor disolvente es el agua

Preguntas: 1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima exitación y de máxima emisión? Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único. Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y emisión. 2. Diga cuáles son las formas coenzimáticas de la riboflavina y cuál es su papel en el metabolismo molecular. Dinucleótido de flavina y adenina (FAD), coenzima que transfiere átomos de hidrógeno; interviene en las oxidorreducciones, para la producción de energía. Flavina Mononucleótido (FMN): Requerida en reacciones de óxidoreducción catalizadas por las deshidrogenasas ligadas a la flavina. Bibliografía:

Espectroscopia de fluorescencia molecular. [En Línea] [Disponible en: http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan %201997/temarios/671111d-archivos/fundamentos/SEMINARIO %203.PDF] Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia. Universidad de Alicante. [En Línea] [Disponible en: http://ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursosprogramados/2011/especifica/microscopia-optica/microscopia-optica-y-laserconfocal-2a-ed/tema-5.pdf]