Determinación de Proteínas en Lácteos. Método de Formalina/Formol

PRÁCTICA DE BROMATOLOGIA #14 Gabriela Cabrera, Juan Andrés Machado, Jorge Saquicela, Martin Yauri, Andrea Viznay. Dra. Jessica León Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Químicas, Carrera de Bioquímica y Farmacia Asignatura: Bromatología, Cuenca – Ecuador, Fecha de entrega: 29-11-2016 1. TÍTULO: Determinación de proteína en leche mediante el uso de formalina 2.- OBJETIVOS:   

Determinar la concentración de proteínas en distintos tipos de leche (mediante el uso de formol). Comparar la muestra respecto a su origen y a su tratamiento tecnológico (o falta de). Relacionar los resultados obtenidos con la bibliografía y normas de calidad en leche en cuanto a proteínas.

3.- FUNDAMENTO: La leche es una sustancia líquida y blanca que segregan las mamas de las hembras de los mamíferos para alimentar a sus crías y que está constituida por caseína, lactosa, sales inorgánicas, glóbulos de grasa suspendidos y otras sustancias. Sirve como alimento y de la cual se obtiene, además, queso, yogur, mantequilla y otros derivados. (Artica, 2014) El contenido promedio de proteínas totales en la leche es de 3,3%. En esta fracción se incluyen las caseínas, las cuales por si solas representan un 80% del contenido proteico total (2,7 %), el resto está integrado por las proteínas séricas, (β- lactoglobulina, α-lactoalbúmina), inmunoglobulinas y una fracción de proteínas menores, entre las cuales se incluyen la lactotransferrina, la lactolina y otras. (Kukovics & Németh, 2013) La composición de la leche está interaccionada por diversos factores lo que hace variar significativamente de acuerdo con el estado de lactación y otros parámetros como son alimentación, clima, raza, salud de la vaca, etcétera. La calidad y composición de la leche también están relacionadas con el tratamiento que se le da luego de la extracción: refrigeración, calentamiento y otros tratamientos. (Artica, 2014) Para el análisis de las proteínas de alimentos concretos se han perfeccionado varios métodos directos, basados en reacciones en las que intervienen grupos funcionales específicos de los aminoácidos presentes; así pues, no son aplicables a la medición de las proteínas en general. Entre dichos métodos figuran la titulación con formol o de Sorensen. (Artica, 2014; McKenzie, 1971; Southgate, 2006) El método de Sorensen, también llamado índice proteico; sirve para determinar nitrógeno amínico en muestras líquidas o extractos. La finalidad es poder determinar la concentración de amoníaco o grupos aminos libres de aminoácidos, péptidos y proteínas. Es útil para medir aminoácidos libres,

el grado de hidrólisis de una proteína, o amonio después de la destrucción de materia orgánica. (Southgate, 2006) Se basa en la reacción del grupo amino (NH2) de los aminoácidos con formaldehído (CH2O) formando imina (metilen amino N=CH2). Así, se bloquea el grupo amino y es posible valorar la acidez de la solución (protón titulable COOH) con una solución alcalina (NaOH) utilizando fenolftaleína como indicador. A partir de la cantidad de NaOH consumido, se determina la cantidad de nitrógeno amino libre. (Pyne, 1932; Southgate, 2006). Los requisitos de la leche cruda en la INEN indican un mínimo de 2,9% de contenido proteico total. De igual manera, se indica un mínimo de 2,9% para la leche pasteurizada y la de larga vida UHT. (INEN, 2008) (INEN, 2012) El procedimiento de determinación de estas proteínas (tanto en leche cruda como pausterizada), según la norma INEN, se la hace mediante el método de Kjeldahl para obtener contenido de nitrógeno total, y se multiplica el resultado por el factor 6,38 para expresarlo como proteína. El porcentaje de proteínas, por el Método Formol según Sorensen, es equivalente a la cantidad de nitrógeno por 6,38 obtenido por el método de Kjeldahl. (INEN, 1984)(Artica, 2014)

4.- Materiales, Equipos y Reactivos: MATERIALES Vasos de precipitación Soporte metálico Bureta Pipeta Pera de succión 5.- Procedimiento:

REACTIVOS NaOH 0,1N Fenolftaleína Formaldehído 37% neutralizado K2C2O4 35% CoSO4 5%

MUESTRAS Leche recién ordeñada Leche de mercado

A 50ml de muestra de leche, agregar 23 gotas de Fenolftaleína. Homogenizar

Agragar 2ml de Oxalato de Potasio 35%. Esperar 2 min.

Titular con NaOH 0,1N de incoloro a rosa.

Agregar 10ml de formaldehído 37% neutralizado

Volver a titular con NaOH 0,1N hasta el mismo color

Comparar con solución patrón: 25ml leche + 1ml K2C2O4 (35%)+ 0,5ml CoSO4 5%

Anotar resultados (segundo volumen) y realizar cálculos (V2x 0,348)

6.- Datos y cálculos: Datos Fenolftaleína Formaldehído 37% Oxalato de Potasio 35% Sulfato de Cobalto 5% Hidróxido de Sodio 0,1N Vol de muestra1 (recién ordeñada)= 50ml Vol de titulación 2: 8,2 Vol de titulación 2 (duplicado): 8,4 Vol de muestra2 (mercado)= 50ml Vol de titulación 2: 9,3 Vol de titulación 2 (duplicado): 9,2

Proteínas enleche=VolTit 2 x 0,348 Proteínas enleche MUESTRA 1=8,3 x 0,348=2,89

Prote í nas enlec h e MUESTRA 2=9,25 x 0,348=3,22

7.- Resultados: Leche Recién ordenada Del mercado

% Proteínas 2,82 3,22

8.- Conclusiones/Interpretación: Los análisis físico-químicos de la leche permitirá determinar su calidad para el consumo humano, basándose tanto en límites de normas nacionales e internacionales. Se analizaron 2 muestras de leche por duplicado. Una extraída el mismo día de la determinación y otra de venta en un mercado local, ambas sin tratamiento de calentamiento post-extracción. Para la muestra recién ordeñada se obtuvo un porcentaje de proteína de 2,89% según el método de la formalina. Y para la muestra de mercado se obtuvo un valor de 3,22%. Ambas muestras analizadas presentan un valor ≥2,9%, indicado como requerimiento mínimo de proteínas para la leche cruda según la INEN. Es decir, estas muestras cumplen los requerimientos de calidad en cuanto a porcentaje de proteínas según normas nacionales. Según regulaciones ecuatorianas, puede ser destinadas a: la pasterización, a un tratamiento UHT, o a un tratamiento de calentamiento casero para su consumo. Vale recalcar que la INEN sugiere el método de Kjeldahl como el estándar para la determinación proteica en leche. Sin embargo, como la bibliografía lo sugiere, el método de la formalina presenta un método equivalente de determinación, además de ser mucho más conveniente en cuanto al tiempo y recursos. El sulfato en la reacción de la formalina es para favorecer la solubilidad de las proteínas y el oxalato es para evitar interferencias con el calcio. La cantidad de proteínas en la leche dependerán de muchos factores: método de ordeño, clima, época del año, características del animal (estado de lactación, alimentación, raza, salud) y los métodos de refrigeración y calentamiento, entre otras variables. Hay que tomar en cuenta factores para una correcta titulación, pues ésta es el punto clave para la determinación.

9.- Bibliografía: 

Artica, L. (2014). Métodos para el análisis fisicoquímico de la leche y derivados lácteos (2da ed.). Perú: Libros y editoriales, TEIA. Recuperado a

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partir de https://luisartica.files.wordpress.com/2011/11/metodos-de-analisisde-leche-2014.pdf INEN. (1984). NTE INEN 0016: Leche. Determinación de proteínas (Norma Técnica Ecuatoriana No. 16). Quito: Instituto Ecuatoriano de Normalización. Recuperado a partir de https://law.resource.org/pub/ec/ibr/ec.nte.0016.1984.pdf INEN. (2008). NTE INEN 0009: Leche cruda. Requisitos. (Norma Técnica Ecuatoriana No. 9:2012). Quito: Instituto Ecuatoriano de Normalización. Recuperado a partir de https://law.resource.org/pub/ec/ibr/ec.nte.0009.2008.pdf INEN. (2012). NTE INEN 0010: Leche pasteurizada. Requisitos (Norma Técnica Ecuatoriana No. 10:2012). Quito: Instituto Ecuatoriano de Normalización. Recuperado a partir de https://law.resource.org/pub/ec/ibr/ec.nte.0010.2012.pdf Kukovics, S., & Németh, T. (2013). Milk Major and Minor Proteins, Polymorphisms and Non-protein Nitrogen. En Young W. Park & George F.W. Haenlein (Eds.), Milk and Dairy Products in Human Nutrition: Production, Composition and Health. Wiley-Blackwell. Recuperado a partir de http://gen.lib.rus.ec/book/index.php? md5=8f9ddef8f03f80cb16dd69e3fa671584 McKenzie, H. A. (1971). Milk Proteins: Vol. 1: Chemistry and Molecular Biology. Academic Press. Recuperado a partir de http://gen.lib.rus.ec/book/index.php? md5=9ac5105e8b3714718a2d27f2cd7f605f Pyne, G. T. (1932). The determination of milk-proteins by formaldehyde titration. Biochemical Journal, 26(4), 1006-1014. Southgate, D. A. T. (2006). Datos de composición de alimentos: obtención, gestión y utilización. Food & Agriculture Org.

10. Anexos:

Anexo 1: Terminología de lácteos según el Instituto Ecuatoriano de Normalización.

Leche cruda. Leche que no ha sido sometida a ningún tipo de calentamiento, es decir su temperatura no ha superado la de la leche, inmediatamente después de ser extraída de la ubre (no más de 40°C). Leche pasteurizada. Es la leche cruda homogenizada o no, que ha sido sometida a un proceso térmico que garantice la destrucción total de los microorganismos patógenos y la casi totalidad de los microorganismos banales (saprofitos) sin alterar sensiblemente las características fisicoquímicas, nutricionales y organolépticas de la misma. Las condiciones mínimas de pasteurización son aquellas que producen efectos bactericidas equivalentes a las producidas por las combinaciones de tiempo-temperatura siguientes: 72 oC durante 15 segundos (pasteurización de flujo continuo) o 62 °C - 65 oC durante 30 minutos (pasteurización en lotes). Leche modificada larga vida. Es la leche que ha sido reducida total o parcialmente de alguno de sus componentes naturales o modificada en cualquiera de sus elementos constitutivos, sometida posteriormente a los procesos de esterilización o UHT. Tratamiento UHT (Temperatura ultra elevada). Procedimiento mediante el cual se somete la leche a elevada temperatura durante corto tiempo con el objeto de elaborar un producto comercialmente estéril que puede ser almacenado a temperatura ambiente. El tratamiento UHT es de flujo continuo, seguido de un llenado aséptico en envases esterilizados y cerrados herméticamente. Tratamiento de esterilización. Procedimiento mediante el cual se somete la leche a elevada temperatura durante corto tiempo con el objeto de elaborar un producto comercialmente estéril que puede ser almacenado a temperatura ambiente. La esterilización es un procedimiento térmico que se aplica dentro del envase herméticamente cerrado o por lotes.