Determinacion de Proteinas en Gelatina Mediante Espectroscopia Uv

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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECURIAS Escuela profesional de Industrias Alimentarias TITULO DEL INFORME: DETERMINACION DE PROTEINAS EN GELATINA MEDIANTE ESPECTROSCOPIA UV CURSO: análisis instrumental GRADO: GRADO: 3ro PROFESOR: ING. ING. Linley Vega ALUMNO: José Cesar Mamani Nina CODIGO: 2011-111085

Año 2017

DETERMINACION DE PROTEINAS EN GELATINA MEDIANTE ESPECTROSCOPIA UV I.

INTRODUCCION:  A continuación estaremos haciendo un experimento con la gelatina comercial con las radiaciones espectrofotómetro en lo cual se analizara la absorbancia y la transmitancia obtenida después de haber hechos los respectivos procesos de la gelatina conforme se procede en el laboratorio. Longitud de onda: se define como la distancia entre los picos adyacentes y puede ser medida en metros, centímetros, o nanómetros (10^(-9) metros).

La radiación de absorción ultravioleta o visible de la excitación de los electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlace que existen en las especies en estudio. La espectroscopia de absorción molecular es por tanto valiosa para la identificación de los grupos funcionales de una molécula. Sin embargo, son más importantes las aplicaciones de la espectroscopia de absorción ultravioleta y visible para la determinación cuantitativa de compuestos que contienen grupos absorbentes o también llamados cromoforos de hecho la aplicación más generalizada de relevancia biológica e la medida de concentraciones de proteínas, NADH y ácidos nucleicos, porque en la mayoría de los casos hay una relación directa y simple entre el número de moléculas presente y la absorción. No obstante en algunos casos, la absorción depende notablemente del entorno molecular, así los cambios en el espectro con cambios de entorno pueden interpretarse en términos de proceso tales como fusión de ácidos nucleicos, interacciones proteínas ligando (ensayos de actividad enzimática, enzimacofactor, activador, inhibidor), etc. El espectro UV/V de un biopolímero es una huella dactilar y como tal puede usarse en ocasiones para identificarlo. La gran utilidad de tales medidas radica en la alta sensibilidad, la sencillez de la medida y el hecho de hacerse en disolución, aunque no es posible estas medidas en sistema biológicos intactos, es decir en vivo, tales como tejidos debido a que esta radiación es fuertemente dispersada.

II.

OBJETIVO: 

III.

Determinar la cantidad de proteínas en una muestra de gelatina comercial, aplicando el método espectrofotométrico en la región ultravioleta.

FUNDAMENTO TEORICO: Las proteínas poseen una banda de absorción en el UV entre 190 y 290 nm debido fundamentalmente a la presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina, triptófano y fenilalanina). El método se basa en la medición de absorbancia a 280nm. Es un método simple, rápido y no destructivo.

CUANTIFICACION DE PROTEINAS: Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:   

La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, Para la formación de derivados químicos La capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

LEY DE LAMBERT - BEER  La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.  Si conocemos l  y A, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida. A = ε·c·l   

Donde: A = absorbencia  = Coeficiente de extinción molar. l = longitud de la celda.

COEFICIENTE DE EXTINCIÓN MOLAR Es una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentración. Un compuesto con un alto valor de coeficiente de extinción molar es muy eficiente en la absorción de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por medidas de absorción cuando se encuentra en disolución a concentraciones muy BAJAS.

MÉTODOS PARA DETERMINAR PROTEÍNAS 



Intervalo del UV: Todas las proteínas pueden ser detectadas, sin embargo solo ciertos residuos de aminoácidos son los que se leen en la región del UV. Por reacciones colorimétricas: Enlaces peptídicos o ciertos aminoácidos reaccionan y los productos coloridos son los que se cuantifican

PROTEÍNAS y la absorción en la región UV 



Las bandas de absorción más significativas se encuentra en el ultravioleta cercano, en el intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm. Concretamente absorben en este rango las cadenas laterales de los aminoáci dos aromáticos , la histidina y la cistina.



La cistina presenta una banda centrada a 250 nm, n-->s* ( Max ~ 300 M1.cm-1), pero apenas se puede considerar, ya que es muy débil y el porcentaje relativo de puentes disulfuro es muy pequeño en una pr oteína.

PROTEÍNAS 





IV.

Los aromáticos absorben de 260-290 nm . La fenilalanina. Es el menos importante cuantitativamente, aunque muestra un espectro complejo con múltiples bandas diferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta también bandas de mayor energía que solapan con el espectro del enlace peptídico en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por encima de 280 nm su contribución al espectro en la zona del ultravioleta cercano de proteínas suele ser pequeña. La tirosina presenta un máximo a 275 nm con un hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores longitudes de onda cuando se produce la desprotonación del OH del anillo aromático. El triptófano agrupa al menos tres bandas diferentes. Bajo el espectro centrado a 280 nm. También presenta bandas en la zona del UV lejano.

MATERIAL Y METODO: MATERIAL: 

Muestra de gelatina comercial  Suero albumina bobina  Tubos de ensayo de 10 ml  Balanza analítica   Espectrofotómetro  Pipetas automáticas  Matraces aforados de 10 ml  Vasos de precipitación  Tubos de ensayo  Pipetas graduadas

REACTIVOS: 

V.

Agua destilada

PROCEDIMIENTO: PREPARACION DE LA MUESTRA: 

Pesar aproximadamente 1 g de muestra de gelatina comercial

   





Disolverlos en un mínimo volumen de agua caliente Dejar enfriar y llevar a 100ml con agua destilada Tomar 1 ml de muestra Agregar 1 ml de agua destilada

Medir la absorbancia de dicha solución a λ:280 nm en un espectrofotómetro UVvisible. Calcular la concentración de proteína en la muestra expresada en ppm a partir de la curva de calibración determinada.

CONSTRUCCION DE LA CURVA DE CALIBRACION:



Preparar un padrón de SAB (1000 mg/L)

   



Tomar 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ml de la solución Colocar cada volumen en distintos matraces aforados de 10 ml Llevar a volumen cada matraz con agua destilada Tomar 2ml de las soluciones finales y medir la absorbancia de dichas soluciones a λ: 280 nm es un espectrofotómetro UV-VISIBLE. Construir una curva de calibración graficando las absorbancias leídas a 280nm vs. La concentración de proteína.

VI.

CALCULOS Y RESULTADOS: Curva de calibración 1000 ppm (1000 mg/L)

Numero tubo

Padrón SAB (ml)

H2O ml

Concentración (mg)

Absorbancia (280 nm)

2 4 6 8 10 blanco

2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 -----

8,0 6,0 4,0 2,0 ----10,0

2,6 5,2 7,8 10,4 13 -----

0.1928 0.2892 0.3622 0.5126 0.6018

DATOS: Peso de la gelatina

0.5

Se afora a 1000 un peso de 1.3 g/l

0.5

500mg

1.3 g

x X = 1300mg

500mg X

1000 ml 2 ml X = 1 mg

1300mg 1300mg 500mg XX XX

1000 1000 1000ml ml ml ml 1000 64 ml 8 10 ml ml ml 7.8 mg XXXX==== 10.4 5.2 5 mg mg mg

HALLAMOS LA CURVA DE CALIBRACION

concentración 2.6 5.2 7.8 10.4 13

absorbancia 0.1928 0.2892 0.3622 0.5126 0.6018

 Abs= 0,6551 a= 0,0095 b= 0,0604 r= 09998

Reemplazando: Y= a +bx 0,6551=0,0095+0,0604

=

  0,6551−0,0095 0,0604

10,6887

 =10,6887

1000 mg

X

100 X= 1,068 porcentaje de

proteína de gelatina

VII.

CONCLUSIONES: Se pudo determinar la cantidad de proteínas en una muestra de gelatina comercial, en la cual se aplicó el método espectrofotométrico en la región ultravioleta utilizando como muestra a la gelatina por lo cual se verifico que tiene un porcentaje de 1,068 de proteínas contenidas en la muestra.

VIII.  

BIBLIOGRAFIA: Bradford, M.M. (1976) Analytical Biochem. 72, 248-254. Gornall, A.G.; Bardawill, C.J.; David, M.M. (1949) J.Biol. Chem. 177, 751-766. Peterson, G.L. (1979) Analytical Biochem. 100, 201-220.