Determinación de la Proteína Total

PRÁCTICA 6 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL De todas las moléculas de importancia biológica, las proteínas son de las que más se estudian por ser las más versátiles. Muchas proteínas tienen actividad biológica, como por ejemplo las enzimas y las inmunoglobulinas. Otras son proteínas de transporte que facilitan o controlan el movimiento de sustancias a través de las membranas en las células. Otras actúan como hormonas (ej: insulina) y otras como parte estructural de las células (ej: microtúbulos y microfilamentos del citoesqueleto). El Biólogo molecular puede obtener proteínas a partir de fraccionamiento fraccionamiento celular. celular. Una vez se separa la célula en sus componentes se rocede a aislar las roteínas ara su estudio. Lo más importante a seguir en la purificación es la recuperacion de la proteína que nos interesa. Esto puede hacerse por ensayos enzimáticos si es una enzima, bioactividad si es no-enzimática o algún otro método que sea conveniente, como electroforesis o cromatografía de columna. Lo segundo es conocer la cantidad de proteína presente en la muestra. Existen varios métodos de análisis cuantitativo. El que se use dependerá de la cantidad de proteína esperada, si la muestra analizada debe ser recuperada o si no importa que la muestra sea destruída.

Determinación del Nitrógeno según Kjeldahl Desde hace más de 100 años se está utilizando el método Kjeldahl para la l a determinación del nitrógeno en una amplia gama de muestras. La determinación del nitrógeno Kjeldahl se realiza en alimentos y bebidas, carne, piensos, cereales y forrajes para el cálculo del contenido en proteína. También se utiliza el método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno en aguas residuales, suelos y otras muestras. El método Kjeldahl sirve para determinar el contenido en nitrógeno en muestras orgánicas e inorgánicas. Se basa en la digestión de la muestra en ácido sulfúrico concentrado a ebullición, con la adición de un catalizador. La muestra se digiere hasta disolución y oxidación de la muestra. El nitrógeno contenido en la muestra se convierte en Amonio Sulfato. Añadiendo un exceso de solución de sodio hidróxido, el ion amonio es liberado en forma de amoniaco, destilado y recogido sobre una solución de ácido bórico o sobre una solución valorada de ácido sulfúrico. El amoniaco recogido es determinado con una solución valorada de ácido o se valora por retroceso con solución de sodio hidróxido de concentración conocida, conocida, si se recogió sobre ácido sulfúrico.

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Los resultados se pueden expresar en % N, % NH 3 o proteína (%N x factor).

PROCEDIMIENTO:

Se pesó 0.5 gr. de K 2SO4 y 0.5 gr. de CuSO 4, luego ambas sustancias fueron introducidas en un tubo con el pico largo y angosto cuya finalidad es evitar que los gases se escapen en el proceso de la digestión. La cáscara de piña deshidratada o con un peso neto (de 3.3 gr.), también fue introducida con el objetivo de obtener la proteína total. Luego se echó 3 ml. de H 2SO4

a) Digestión de la muestra En la primera etapa, el hidrógeno y el oxígeno proteico, son oxidados hasta dióxido de carbono y agua, mientras que el nitrógeno es convertido en sulfato de amonio, por la acción de un agente oxidante en medio ácido y con la ayuda de un catalizador. Se han desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador ó el agente oxidante, pero en todos los casos, el objetivo final de la etapa de digestión es el de convertir el nitrógeno proteico en sulfato de amonio. Ocurren dos reacciones:

Mat. Org. +H2SO4 ------------ CO2 + 2SO2+ 2H2O

2NH3 + H2SO4 ---------- SO4(NH4)2

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b) Destilación En la etapa siguiente, se utilizó NaOH, que es una base fuerte y su función es liberar el amoniaco de la sal de amonio. Se agregó 10 ml. de hidróxido de sodio en el tubo grande y luego se añadió la piña digerida. En el erlenmeyer se coloca ácido bórico (de color rosado) que, al actuar con el hidróxido de amonio (resultante del calentamiento de la mezcla del NaOH y la piña digerida) se transforma en borato de amonio, fácilmente reconocible por el cambio de coloración (a verde). Se espera que haya 50 ml. de borato de amonio en el erlenmeyer y se apaga la estufa retirando antes el erlenmeyer para evitar que todo el líquido contenido en este retorne al tubo grande que está siendo calentado.

Se puede apreciar como gracias al hidróxido de amonio el ácido bórico reacciona con con este para convertirse en borato de amonio. amonio. La reacción es fácilmente identificada por el cambio de coloración.

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c) Titulación Al final, se hace la titulación con ácido sulfúrico 0.0025 N (aunque también puede utilizarse ácido clorhídrico clorhídrico a 0.05N). 0.05N). Se echa H2SO4 hasta que que la solución vuelva a adquirir un color rosado, luego se anota el volumen gastado de la titulación y se hacen los cálculos respectivos. r espectivos.

Erlenmeyer con la solución titulada

CALCULOS:

→

%N = 0. 583

RESULTADOS: a. Porcentaje de nitrógeno en la muestra: 0.583 % b. Porcentaje de proteína bruta en la muestra: 0.583 x 6.25 = 3.644 %

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CUESTIONARIO: a. ¿Cómo se obtiene el factor 6.25? Explique El factor 6.25 se deriva del hecho de que la mayoría de las proteínas contiene 16 % de Nitrógeno. De este modo, 100 entre 16 dará como resultado 6.25.

b. ¿Qué se entiende por proteína bruta o total? Se entiende por proteína bruta o total al nitrógeno total de la muestra expresada como proteína. El método empleado no es apto para aquellas sustancias que contienen enlaces N-N, NO u NO 2

c. ¿Qué críticas se le pueden hacer al método utilizado? Existen otros tipos de mezclas catalíticas (siendo las más empleadas hechas a base de selenio o mercurio). Estas mezclas catalíticas tienen como objetivo acelerar el proceso de digestión, que se puede prolongar durante varias v arias horas. En síntesis, aunque el método m étodo utilizado es seguro, podemos utilizar otras mezclas catalíticas para acelerar la digestión. Claro que debe tenerse en consideración, que la mayoría de estas mezclas catalíticas son tóxicas y es necesario el uso de la campana extractora para evitar ser contaminados.

APLICACIÓN: Se tomó dos muestras de pasto y se determinó la cantidad de proteína por el método de Kjeldahl

MUESTRA 1 Gasto de HCl Normalidad de HCl Peso de la muestra Meq. Nitrógeno

MUESTRA 2

: 4.6 ml : 0.0544 N : 0.300 gr. : 0.014

Gasto de HCl Normalidad de HCl Peso de la muestra Meq. Nitrógeno

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: 4.4 ml : 0.0505 N : 0.300 gr. : 0.014

Entonces:

Hallando la proteína total en Muestra 1: %N=

4.6 x 0.0544 x 0.014 x 100 0.300

% N = 1.17 % de proteína bruta: 6.31

Hallando la proteína total en Muestra 2: %N=

4.4 x 0.0505 x 0.014 x 100 0.300

% N = 1.03 % de proteína bruta: 6.44

BIBLIOGRAFÍA http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biom http://www.biorom.uma.es /contenido/av_biomo/FigT4/tema4.pdf  o/FigT4/tema4.pdf  http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/laboratorio2.htm http://www.panreac.com/new/esp/produ http://www.panreac .com/new/esp/productos/docs/re_es ctos/docs/re_esp.pdf  p.pdf  http://64.233.169.104/search?q=cache:ujNsG1 http://64.233.169.104/search?q=c ache:ujNsG1vU784J:www.monog vU784J:www.monografias.com/trabajos1 rafias.com/trabajos1 0/acig/acig.shtml+factor+6.25&hl=es 0/acig/acig.shtml+ factor+6.25&hl=es&ct=clnk&cd=1&g &ct=clnk&cd=1&gl=pe l=pe http://xtec.es/~ffernan5/castellano/05001.htm

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