Determinacion de Carbohidratos Estructurales y Lignina en Biomasa (9448)

 

DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS ESTRUCTURALES Y LIGNINA EN BIOMASA

Procedimiento Analítico de Laboratorio (LAP)

NREL/TP-510-42618 (Junio-2010)

1. Introducción. 1.1. Los carbohidratos y la lignina conforman la mayor parte de las muestras de biomasa. Estos constituyentes deben ser medidos como parte de un análisis comprensivo de biomasa, los carbohidratos pueden ser estructurales o no estructurales. Los carbohidratos estructurales están ligados en la matriz de la biomasa, mientras que los carbohidratos no estructurales pueden ser removidos utilizando ya sea extracción o por secuencia de lavado. La lignina es un polímero complejo fenolico. 1.2. Partes de este procedimiento son substancialmente similar a los de ASTM E1758-01 “Método estándar para la determinación de carbohidratos por HPLC”.  1.3. Este procedimiento es adecuado para las muestras que no contengan extractivos. Este procedimiento usa una hidrólisis acida en dos etapas para fraccionar la biomasa en formas que son más fácilmente cuantificables. La lignina se fracciona en el material acido insoluble y en el material acido soluble. EL material acido insoluble puede también incluirá la ceniza y proteína, el cual debe ser tomado en cuanta durante el análisis gravimétrico. La lignina soluble en acido se mide por espectroscopia de UV-Vis. Durante la hidrólisis los carbohidratos poliméricos son hidrolizados en sus formas monomerica, la cuales son solubles en el liquido de hidrólisis. Estas son entonces medidas por HPLC. La proteínas también pueden partirse dentro de la fracción liquida. Una medida del contenido de acetilo es necesaria para biomasa que contiene hemicelulosa con un carácter de xilan, pero no de biomasa que contenga un carácter de manan. El acetato se mide por HPLC. 2. Alcance. 2.1. Este procedimiento es apropiado para extractivos libre de biomasa, la cual incluye biomasa que ha sido extraída utilizando el LAP “Determinación de Extractivos en Biomasa”, así como en sólid os de procesos que no contengan extractivos. Los resultados se reportan sobre una base de peso seco en horno. Los resultados pueden informarse sobre una base de biomasa recibida o en una base libre de extractivos, dependiendo del tipo de biomasa utilizada. El LAP

 

“Preparación de Muestras para el Análisis de Composición de Biomasa” debe utilizarse antes de este procedimiento.

2.2. Este procedimiento es apropiado para biomasa que contiene los componentes listados a través del procedimiento. Cualquier biomasa que contenga otros componentes que podrían interferir deben de ser investigados extensamente. 2.3. Una medida del contenido de acetilo es necesaria para biomasa que contenga hemicelulosa con un carácter de xilan, pero no para biomasa que contenga un carácter manan. 2.4. Todos los análisis deben ser desarrollados de acuerdo con un plan apropiado de seguridad específica de la calidad. 3. Terminología. 3.1. Peso seco en horno (Oven Dry Weight, ODW)   –  el peso de biomasa matemáticamente corregido de la cantidad de humedad presente en la muestra a la hora del pesado. –  biomasa preparada de acuerdo al LAP “Preparación 3.2. Biomasa Preparada  – de Muestras para el Análisis de Composición de Biomasa”:  

3.3. Extractivos libres de biomasa   –  biomasa después de una extracción exhaustica con agua y etanol (refiérase al LAP “Determinación de Extractivos en Biomasa”).  – el residuo remanente en un crisol de porosidad 3.4. Lignina insoluble en acido  – del medio filtrante después de una hidrolisis en dos etapas, con una corrección por la ceniza insoluble en acido y por la proteína insoluble en acido, si es

necesario. 3.5. Carbohidratos estructurales   –  carbohidratos poliméricos, denominados celulosa y hemicelulosa. 3.6. Componentes no estructurales  – – componentes no químicamente enlazados que incluyen pero no están limitados a sacarosa, nitratos/nitritos, proteína, ceniza, clorofila, y ceras. 4. Importancia y uso. 4.1. Este procedimiento puede ser utilizado, en conjunto con otros procedimientos para determinar la cantidad de carbohidratos estructurales y lignina en una muestra solida de biomasa.

 

5. Interferencias. 5.1. Este procedimiento ha sido optimizado para un intervalo de tamaño de partícula especificado en el LAP “Preparación de Muestras para el Análisis de Composición de Biomasa”. Desviación a un tamaño de partícula menor puede resultar en influir en un bajo contenido de carbohidrato (y una consecuente influencia lignina) debido a una hidrólisis incompleta de azucares poliméricosen en alta azucares monomericos. 5.2. Muestras que contengan extractivos que no son adecuados para el procedimiento. Los extractivos se dividirán irreproduciblemente, resultando en una alta influencia en lignina. 5.3. Muestras con un contenido de cenizas mayor que el 10% en peso podrían no ser adecuados para este procedimiento, ya que la muestras puede contener tierra u otros minerales que podrían interferir con concentraciones de acido apropiadas y podrían catalizar reacciones secundarias. 5.4. Muestras con un contenido de humedad mayor al 10% en peso podrían no ser adecuadas para este procedimiento, ya que el exceso de humedad podría interferir con concentraciones de acido apropiadas. Las muestras deben secarse (secado con aire o secado en horno al menos a 40ºC) antes de este procedimiento. 5.5. Muestras que contengan proteína podría influir en alta lignina insoluble en acido a menos que la proteína se tome en cuenta para las determinación gravimétricas del material insoluble en acido. Un análisis independiente de nitrógeno es requerido para estimar el contenido de proteína en el residuo. El estimado de proteína es entonces sustraído de la medida de lignina insoluble en acido. Separaciones físicas de la proteína insoluble en acido de la lignina insoluble en acido sobrepasa el alcance de este procedimiento. 5.6. Este procedimiento no es adecuado para muestras que contengan acido, bases o catalizadores añadidos. 5.7. Ciertas columnas de guardia para la cuantificación de carbohidratos pueden causar picos del aparato. Los carbohidratos individuales deben de correrse en nuevas columnas y columnas guardia para verificar la ausencia de picos de aparato. 6. Aparatos. 6.1. Balanza analítica, precisión de 0.1 mg.

 

6.2. Horno de convección de secado, con un control de temperatura de 105±3ºC. 6.3. Horno mufla, equipada con un termostato, establecido a 575±25ºC o equipado con un programa opcional de rampa. 6.4. Baño de agua, establecido a 30±3ºC. 6.5. Autoclave, adecuado para líquidos, establecida a 121±3ºC. 6.6. Equipo de filtración, equipado con una fuente de vacío y adaptadores para vacio de crisoles. 6.7. Desecador que contenga material desecante. 6.8. Sistema HPLC equipado con un detector de índice de refracción y las siguientes columnas: 6.8.1. Columna Shodex azúcar SP0810 o Biorad Aminex HPX-87P (o equivalente) con una columna de guardia para el retirado de cenizas con forma iónica H+/CO3-. 6.8.2. Columna Biorad Aminex correspondiente columna guardia.

HPX-87H

(o

equivalente)

con

su

6.9. Espectrofotómetro UV-Vis, arreglo de diodos o una simple longitud de onda, con cubetas de alta pureza de cuarzo con un paso de luz de 1cm. 6.10. Bureta automática, capaz de dispensar 84.00 mL de agua, opcional.

7. Reactivos y materiales. 7.1. Reactivos. 7.1.1. Acido sulfúrico, 72% p/p (gravedad especifica 1.6338 a 20ºC)  –  (también comercialmente disponible como un reactivo para la determinación de fluor, de Fluka #00647). 7.1.2. Carbonato de calcio, grado reactivo ACS. 7.1.3. Agua, purificada, filtrada 0. 2 μm.  7.1.4. Estándares de alta pureza: D-celobiosa, D-(+) glucosa, D-(+) xilosa, D(+) galactosa, L-(+) arabinosa, y D-(+) manosa.

 

7.1.5. Segundo juego de estándares de alta pureza, como se lista arriba, de una fuente diferente (fabricante o lote), para ser usado para preparar los estándares de verificación de calibración (CVS). 7.2. Materiales. 7.2.1. Normas de garantía de calidad, bien caracterizados, como los estándares de biomasa del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST) u otra muestra bien caracterizada de composición similar a las muestras que están siendo analizadas. 7.2.2. Tubos de presión, mínimo con una capacidad de 90 mL, vidrio, con rosca sobre tapas de teflón y sellos o-ring (Tubo de vidrio ace #8648-30 con tapón #5845-47, o equivalente). 7.2.3. Barras para agitación de teflón que encajen en los tubos de presión y aproximadamente 5 cm más largos que los tubos de presión. 7.2.4.

Crisoles

para

filtración,

25

mL,

porcelana,

media

porosidad,

Coors #60531 o equivalente. 7.2.5. Botellas, boca ancha, 50 mL. 7.2.6. Matraces para filtración, 250 mL. 7.2.7. Matraces erlenmeyer, 50 mL. 7.2.8. Pipeteador ajustable, cubriendo los intervalos de 0.02 a 5.00 mL y 84.00 mL. 7.2.9. Papel pH, intervalo 4-9. 7.2.10. Jeringas desechables, 3 mL, equipadas con filtros para jeringa de 0.2 μm.  7.2.11. Viales para automuestreador con sellos de rosca para adaptarse. 8. Peligros y consideraciones. 8.1. El acido sulfúrico es corrosivo y debe manejarse con el cuidado apropiado. 8.2. Sea precavido cuando maneje tubos de presión calientes después de removerlo de la autoclave, ya que los tubos presurizados tienen peligro de explosión. 8.3. Cuando coloque los crisoles en la mufla y al removerlos, utiliza equipo de seguridad personal, incluyendo guantes resistentes al calor.

 

8.4. Operar todos los equipos de acuerdo al manual y a los procedimientos de operación de seguridad de la NREL. 8.5. Sigue todos los procedimientos aplicables de manejo químico de la NREL. 9. Muestreo, especímenes y unidades de prueba. 9.1. Se debe tener cuidado para asegurar que se tome una muestra representativa para el análisis. 9.2. El LAP “Preparación de Muestras para Análisis de Composición de Biomasa” debe ser realizado antes de este análisis. Muestras deben contener un contenido mínimo de sólidos totales del 85%. 9.3. El LAP “Determinación de Extractivos en Biomasa” debe realizarse antes de este análisis si los extractivos están presentes en la muestra. 9.4. El LAP “Determinación de Sólidos en Biomasa” debe r ealizarse ealizarse al mismo tiempo para las muestras de este análisis son pesadas.

9.5. Este procedimiento es adecuado para muestras que han sido secadas por aire o liofilizadas. Muestras secadas a una temperatura de 45ºC o superiores no son adecuadas para este procedimiento. 9.6. Pasos 9.2 a 9.4 deben de aplicar las normas de garantía de calidad.

10. Procedimiento. 10.1. Prepare la muestra para análisis e hidrolice. 10.1.1. Coloque un numero apropiado de crisoles de filtración en un horno mufla a 575±25ºC por un mínimo de cuatro horas. Retire los crisoles del horno directamente en un desecador y enfrié por un periodo especifico de tiempo, se recomienda una hora. Pese los crisoles con una precisión de 0.1 mg y registre este peso. Es importante mantener los crisoles en un orden específico, si no están marcados con identificaciones. Calcomanías permanentes para marcado están disponibles de Wale Apparatus. No marque el fondo del crisol de filtración con un marcador de porcelana, ya que esto impedirá la filtración. 10.1.2. Coloque los crisoles de vuelta dentro de la mufla a 575±25ºC y cenize a peso constante. El peso constante se define como menos de un cambio de ±0.3 mg en el peso tras una hora de recalentamiento del crisol.

 

10.1.3. Pese 300.0 ±10.0 mg de la muestra o del estándar QA en tubo de presión tarado. Registre el peso con una precisión de 0.1 mg. Etiquete el tubo de presión con un marcador permanente. El LAP “Determinación de Sólidos Totales en Biomasa” debe de realizarse al mismo tiempo, con precisión mida el porcentaje de sólidos para corrección. Cada muestra debe ser analizada en duplicado, como mínimo. El tamaño recomendado de lote es de tres a seis muestras y un estándar QA, todo debe correrse en duplicado. 10.1.4. Adicione 3.00 ± 0.01 mL (o 4.92 ± 0.01 g) de acido sulfúrico al 72% a cada tubo de presión. Utilice una varilla de agitación de teflón para mezclarla durante un minuto, o hasta que la muestra se encuentre bien mezclada. 10.1.5. Coloque el tubo de presión en un baño de agua establecido a 30 ± 3ºC e incube la muestra durante 60 ± 5 minutos. Usando la varilla de agitación, agite la muestra durante cinco a diez minutos sin retirar la muestra del baño. La agitación es esencial para asegurar el nivelado de acido para el contacto de partícula y una hidrólisis uniforme. 10.1.6. Sobre la terminación de la hidrólisis de 60 minutos, retire los tubos del baño de agua. Diluya el acido a una concentración de 4% al adicionar 84.00 ± 0.04 mL de agua desoinizada usando una bureta automática. La dilución también puede hacerse al añadir 84.00 ± 0.04 g de agua purificada usando una balanza con una precisión de 0.01 g. Enrosque los tapones de teflón en forma segura. Mezcle la muestra al invertir los tubos mucha veces para eliminar la fase de separación entre capas de concentración de acido altas y bajas. Nota: El volumen de la solución de 4% será 86.73 mL, como se demuestra en el siguiente calculo. Densidad 72% H2SO4 = d72% H2SO4 = 1.6338 g/mL Densidad H2O = dH2O = 1.00 g/mL Densidad 4% H2SO4 = d4% H2SO4 = 1.025 g/mL 1. El peso de 3.00 mL de 72% H 2SO4 es: 3.00 mL 72% H2SO4 x d72% H2SO4 = 4.90 g 72% H2SO4 2. La composición de 3.00 mL de 72% H 2SO4 es: 4.90 g 72% H2SO4 x 72% (peso acido) = 3.53 g acido 4.90 g 72% H2SO4 x 28% (peso agua) = 1.37 g acido

 

3. La concentración de H 2SO4 después de la dilución es: 3.53 g acido / (84.00 g H2O + 4.90 g 72% H 2SO4) = 3.97 % H2SO4 (p/p) 4. El volumen total de la solución presente después de la dilución es: (4.90 g H2SO4 + 84.00 g H2O) x (d 4% H2SO4)-1 = 86.73 mL 10.1.7. Prepare una serie de estándares de recuperación de azúcar (SRS) que se tomaran a través de la hidrólisis remanente y usados para corregir las pérdidas debido a la destrucción de azucares durante la hidrólisis acida diluida. SRS debe incluir D(+)glucosa, D(+)xilosa, D(+)galactosa, L(+)arabinosa, y D(+)manosa. Las concentraciones de azucares SRS deben de ser escogidas para parecerse lo más posible a las concentraciones de azucares en la muestra de prueba. Pese las cantidades requeridas de cada azúcar, a una precisión de 0.1 mg, t añada 10.0 mL de μ L de d e acido ac ido sulfúrico su lfúrico al a l 72%. Transfiera el agua desionizada.  Adicione 348 μL SRS a un tubo de presión y tápelo con fuerza. 10.1.7.1. Un nuevo SRS no es requerido para cada análisis. Un gran lote de estándares de recuperación de azucares puede producirse, filtrado a través de filtros de 0.2 μm, dispensado en alícuotas de 10.0 mL en contenedores sellados, y etiquetados. Estos podrán ser almacenados en un congelador y retirados cuando se necesiten. Descongele y agite el SRS congelado antes de su uso. Si se va a usar un SRS congelado, la cantidad apropiada de acido debe añadirse a la muestra descongelada y agitada antes de su uso y transferida a un tubo de presión. 10.1.8. Coloque los tubos en una rejilla de seguridad para autoclave, y coloque la rejilla en la autoclave. Autoclave las muestras selladas y los estándares de recuperación de azúcar durante una hora a 121ºC, usualmente el líquido se asienta. Después de completar el ciclo de autoclave, permita a los hidrolizados enfriarse lentamente a temperatura ambiente antes de remover las tapas. (Si el paso 10.2. no es desarrollado, retire una alícuota de 10 mL del licor para usarlo en el paso 10.5.) 10.2. Analice la muestra para lignina insoluble en acido como sigue: 10.2.1. Filtre al vacio la solución de hidrólisis de autoclave a través de uno de los previamente pesados crisoles de filtración. Capture el filtrado en un matraz para filtración.

 

10.2.2. Transfiera una alícuota, aproximadamente 50 mL, dentro de un recipiente para almacenamiento de muestra. Esta muestra se utilizara para determinar la lignina insoluble en acido así como para carbohidratos, y acetilo su es necesario. La determinación de lignina soluble en acido debe hacerse dentro de las seis horas después de la hidrólisis. Si el licor de hidrólisis debe ser almacenado, debe ser almacenado en un refrigerador por un máximo de dos semanas. Es importante recoger una alícuota del licor antes de proceder con el paso 10.2.3. 10.2.3. Utilice aguas Desionizada para transferir cuantitativamente todos los sólidos remanentes fuera del tubo de presión dentro del crisol para filtración. Enjuague los sólidos con un mínimo 50 mL de agua desionizada fresca. Agua desionizada caliente puede ser usada en lugar de agua a temperatura ambiente para disminuir el tiempo de filtración. 10.2.4. Seque el crisol y el residuo de acido insoluble a 105±3ºC hasta que se alcance un peso constante, usualmente un mínimo de cuatro horas. 10.2.5. Retire las muestras del horno y enfrié en un desecador. Registre el peso del crisol y de la muestra seca con una precisión de 0.1 mg. 10.2.6. Coloque los crisoles y el residuo en un horno mufla a 575 ± 25ºC durante 24 ± 6 horas. 10.2.6.1. Un horno con rampa de temperatura también puede usarse: Programa de rampa de temperatura para horno. Rampa de temperatura ambiente a 105ºC Mantenga a 105ºC durante 12 minutos Rampa a 250ºC a 10ºC / minuto Mantenga a 250ºC durante 30 minutos Rampa a 575ºC a 20ºC / minuto Mantenga a 575ºC durante 180 minutos Permita que la temperatura caiga a 105ºC Mantenga a 105ºC hasta que las muestras sean retiradas 10.2.7. Cuidadosamente remueva el crisol del horno directamente a un desecado y enfrié por una cantidad específica de tiempo, igual al tiempo

 

inicial de enfriado para los crisoles. Pese los crisoles y las cenizas con un precisión de 0.1 mg y registre el peso. Coloque los crisoles de vuelta en el horno y cenize hasta un peso constante. (La cantidad de ceniza insoluble en acido no es igual a la cantidad total de ceniza en la muestra de biomasa. Refiérase al LAP “Determinación de Ceniza en Biomasa” si el total de ceniza se determinara.) 10.3. Analice la muestra para lignina soluble en acido como sigue 10.3.1. En un espectrofotómetro UV-Visible, corra un blanco con agua desionizada o con acido sulfúrico al 4%. 10.3.2. Usando la alícuota del licor de hidrólisis en el paso 10.2.2., mida la absorbancia de la muestra en una longitud de onda apropiada en un espectrofotómetro UV-Visible. Refiérase a la sección 11.3 para valores sugeridos de longitud de onda. Diluya la muestra como sea necesario para llevar la absorbancia al intervalo de 0.7  – 1.0, registrando la dilución. Agua desionizada o acido sulfúrico al 4% puede ser utilizado para diluir la muestra, pero el mismo solvente debe ser utilizado como blanco. Registre la absorbancia hasta tres decimales. La reproducibilidad debe estar en ±0.05 unidades de absorbancia. Analice la muestra en duplicado, como mínimo. (Este paso debe ser hecho en las seis horas después de la hidrólisis). 10.3.3. Calcule la cantidad presente de lignina soluble en acido usando el cálculo en 11.3. 10.4. Analice la muestra para carbohidratos estructurales. 10.4.1. Prepare unas series de estándares de calibración que contengan los componentes que se van a cuantificar, refiriéndose a la Tabla 1 para un intervalo de concentración sugerido. Use una calibración de cuatro puntos. Si los estándares se preparan fuera del intervalo sugerido, el nuevo intervalo para estas curvas de calibración deberá ser validado. 10.4.1.1. Tabla 1  –  Intervalo de concentración sugerido para los estándares de calibración 10.4.1. Componente D-cellobiose D(+)glucosa D(+)xilosa D(+)galactosa L(+)arabinosa

Intervalo sugerido de concentración (mg/mL) 0.1 – 4.0 0.1 – 4.0  0.1 – 4.0  0.1 – 4.0  0.1 – 4.0 

 

0.1 – 4.0  Media del rango lineal, concentración no igual a la del punto de calibración (se sugiere 2.5) 10.4.1.2. Un nuevo lote de estándares no es requerido para cada análisis. Un largo lote de estándares se puede producir, filtrado a través de filtros de 0.2 μm  en viales para automuestreador, sellados y etiquetados. Las muestras de estándares y de CVS pueden almacenarse en un congelador y removidos cuando se necesite. Descongelar y agitar los estándares antes de su uso. Durante cada uso, las muestras de estándar y CVS se deben observar por un comportamiento de concentración inusual. Las concentraciones inusuales pueden significar que las muestras se encuentran comprometidas o que componentes volátiles se han perdido.  Asumiendo  Asumiend o volumen suficiente, suficiente, las muestras de estándares estándares y CVS no deben de tener más de 12 arrastres de inyección de un solo vial. En una para automuestreador enfriada, el tiempo de vida de las muestras de estándares y CVS es aproximadamente de tres a cuatro días. D(+)manosa CVS

10.4.2. Prepare una calibración de verificación de estándares independiente (CVS) para cada lote de estándares de calibración. Use reactivos de otra fuente o lote del que se está utilizando en la preparación de los estándares de calibración. Prepare los CVS a una concentración que caiga en el medio de un rango valido de la curva de calibración. Los CVS deben de analizarse en el HPLC después de cada lote de calibración y a intervalos regulares a través de la secuencia, agrupando grupos de muestras. Los CVS se usan para verificar la calidad y estabilidad de la curva(s) de calibración a través de la corrida. 10.4.3. Usando el licor de hidrólisis obtenido en el paso 10.2.2., transfiera una alícuota de aproximadamente 20 mL de cada licor en un matraz Erlenmeyer de 50 mL. 10.4.4. Use carbonato de calcio para neutralizar cada muestra a un pH de 5 – 6. Evite neutralizar a un pH mayor de 6 al monitorearlo con papel de pH.  Añada el carbonato carbonato de calcio lentamente lentamente hasta que el pH sea de 4. Agite la muestra frecuentemente, Después de llegar a un pH 5  – 6, permita que la muestra sedimente y decante el líquido claro. El pH del líquido después del sedimentado será aproximadamente de 7. (Las muestras nunca deberán permitirse exceder a un pH de 9, ya que esto resultara en una pérdida de azucares).

 

10.4.5. Prepare la muestra para análisis por HPLC al pasar el liquido decantado a través de un filtro de 0.2 μm dentro de un vial para automuestreador. Selle y etiquete el vial. Prepare cada muestra en duplicado si lo desea. Si es necesario, las muestras neutralizadas pueden ser guardadas en un refrigerador por tres o cuatro días. Después de este tiempo, las muestras deberán ser consideradas como comprometidas debido al crecimiento potencial microbiano. Después del almacenado en frio, revise las muestras por la presencia de un precipitado. Las muestras que contengan un precipitado deberán ser refiltradas, mientras permanezcan frías, a través de filtros de 0.2 μm.   10.4.6. Analice los estándares de calibración, CVS y las muestras por HPLC usando una columna Shodex sugar SP0810 o Biorad Aminex HPX-87P equipada con su apropiada columna guardia. Condiciones HPLC: Volumen de inyección: 10  –  50 μL, dependiendo de la concentración y los límites del detector. Fase móvil: Agua grado HPLC, filtrada 0.2 μL y desgasificada.  

Caudal: 0.6 mL / minuto. Temperatura de columna: 80 – 85ºC. Temperatura del detector: tan cercana a la temperatura de la columna como sea posible. Detector: índice de refracción. Tiempo de corrida: 35 minutos. Nota: La columna guardia retirado de cenizas deberá ser colocada fuera de la unidad de calentamiento y mantenida a temperatura ambiente. Esto prevendrá picos del aparato en el cromatograma. 10.4.7. Revise los cromatogramas de la muestra de prueba por la presencia de celobiosa y azucares oligomericos. Niveles de celobiosa mayores que 3 mg/mL indican una hidrólisis incompleta. Muestra frescas deberán hidrolizarse y analizarse. 10.5. Analice la muestra por el contenido de lignina soluble en acido si es necesario.

 

10.5.1. Prepare 0.005 M (0.01 N) de acido sulfúrico para usarlo como fase móvil para HPLC. En un matraz volumétrico de 2L, añada 2.00 mL de acido sulfúrico estandarizado 10N y afore al volumen con agua grado HPLC. Filtre a través de un filtro de 0.2 μm y desgasifique antes de usar. Si acido sulfúrico 10N no se encuentra disponible, se puede utilizar acido sulfúrico concentrado. 278 μL de acido sulfúrico concentrado traído a un volumen en un matraz volumétrico de 1 L con agua grado HPLC también producirá 0.005 M de acido sulfúrico. 10.5.2. Prepare una serie de estándares de calibración que contengan los componentes que se van a cuantificar. Se recomienda el acido acético, son opcionales el acido fórmico y el acido levulinico. Se sugiere un intervalo de 0.02 a 0.5 mg/mL. Se sugiere un espaciado uniforme de cuatro puntos de calibración. Si los estándares se preparan fuera de los intervalos sugeridos, el nuevo intervalo para estas curvas de calibración debe ser validado. 10.5.3. Prepare un independiente estándar de verificación de calibración (CVS) para cada lote de estándares de calibración, usando los componentes obtenidos de otra fuente que los usados en la preparación de los estándares de calibración. Los CVS deben contener con precisión cantidades conocidas de cada componente contenido en los estándares de calibración, en una concentración que caiga en el medio del intervalo validado de la curva de calibración. El CVS debe ser analizado mediante HPLC después de cada lote de calibración y a intervalos regulares a través de la secuencia, entre espacios de grupos de muestras. El CVS se utiliza para verificar la calidad y estabilidad de la curva(s) de calibración a través de la corrida. 10.5.4. Prepare la muestra para análisis de HPLC al pasar una pequeña alícuota del licor recolectado en el paso 10.2.2. a través de un filtro de 0.2 μm dentro de un vial para automuestreador. Selle y etiquete el vial. Si se sospecha que la concentración de la muestra pueda exceder el intervalo de la curva de calibración, diluya las muestras como se necesiten, registrando la dilución. Las concentraciones deberán ser corregidas por la dilución después de la corrida. 10.5.5. Analice los estándares de calibración, CVS y las muestras por HPLC usando una columna Biorad Aminex HPX-87H equipada con su apropiada columna guardia. Condiciones HPLC: Volumen de inyección: 50 μL  

 

Fase móvil: Acido sulfúrico 0.005 M, filtrada 0.2 μm y desgasificada  

Caudal: 0.6 mL / minuto. Temperatura de columna: 55 – 65ºC. Temperatura del detector: tan cercana a la temperatura de la columna como sea posible. Detector: índice de refracción. Tiempo de corrida: 50 minutos. 11. Cálculos. 11.1. Calcule el peso seco de horno (ODW) de la muestra libre de extractivos, usando el promedio del contenido de sólidos totales como se determino por el LAP “Método Estándar para la Determinación de Sólidos Totales en Biomasa”.    

 = =   100 ∗%    −      % = +    ∗100

11.2. Calcule y registre el porcentaje en peso del residuo de acido insoluble (AIR) y lignina insoluble en acido (AIL) en una base libre de extractivos.  

+ −  ) − ∗100 % = (+ − ) − ( 

 

Donde: Peso proteína = Cantidad de proteína presente en el residuo de acido insoluble, como se determina en el LAP “Determinación del Contenido de Proteína en Biomasa”. Esta medición solo es necesario  para biomasas que contengan altas cantidades de proteína. 11.3. Calcule la cantidad de lignina soluble en acido (ASL) en una base libre de extractivos:

∗          ∗    % =  ∗  ∗∗  ∗100

 

Donde: UVabs = promedio de la absorbancia UV-Vis para la muestra en una apropiada longitud de onda (ver tabla abajo).

 

Volumen

licor hidrólisis =

volumen del filtrado, 86.73 mL

     =  

 

ε = Absortividad de la biomasa a una longitud de onda especifica (ver tabla abajo)

Constantes de absortividad para mediciones de lignina soluble en acido para tipo de biomasa seleccionados Tipo de Biomasa

Lamda max (nm)

 Absortividad en la lambda max (L/ g cm)

Longitud de onda recomendada (nm)

Pinus RadiataNIST SRM 8493 Bagasse – Bagasse  – NIST  NIST SRM 8491 Corn Stover – Stover –  

198

25

240

 Absortividad en la longitud de onda recomendada (L/g cm) 12

198

40

240

25

198

55

320

30

197

60

240

25

NREL materia prima suministrada Popolus deltiodes – deltiodes  – NIST  NIST SRM 8492

Nota: Valores máximos de lambda con frecuencia contienen picos inoportunos de los productos de degradación de carbohidratos. Los valores de longitud de onda recomendados han sido escogidos para minimizar estas interferencias. 11.4. Calcule la cantidad total de lignina en una base libre de extractivos.  

%  = %  %% ) %  = (% ) ∗ (100−% 100

11.5. Calcule el valor total de lignina en una base así como se recibió, si es necesario  

Donde:

% Extractivos = porcentaje de extractivos en la muestra de biomasa  preparada, como se determino en el LAP “Determinación de Extractivos en Biomasa”  

 

11.6. Cree una curva de calibración para cada analito que será cuantificado utilizando regresión lineal. De estas cuervas, determine la concentración en mg/mL de cada componente presente en la muestras analizadas por HPLC, corrigiendo por dilución si se requiere. 11.7. Calcule y registre la cantidad de cada estándar recuperado de verificación

..     ,  ,/ /  %  =  .   ,/ ∗ 100

de calibración (CVS) seguido por análisis por HPLC.

 

11.8. Para los estándares de recuperación de azúcar (SRS), calcule la cantidad de cada componente recuperado de azúcar después de la hidrólisis acida diluida, contando para cada dilución hechas antes del análisis por HPLC. Promedie cualquier calor de replica (%Razucar ) obtenido para cada azúcar individual y repórtelo %R azúcar prom. 

  . .   , / / % = .    ℎ,/  / ∗ 100

 

11.9. Use los valores de porcentaje de azucares recuperados hidrolizados calculados en el paso 11.8 para corregir los valores correspondientes de concentración de azúcar obtenidos por HPLC para cada una de las muestras hidrolizadas (C muestra cor.), contando para cada dilución hecha antes del análisis por HPLC.

/100    = % ∗ .

 

Donde: HPLC  = conc. de un azúcar como se determina por HPLC, mg/mL C HPLC 

%R   prom. azúcar   = promedio de recuperación de un componente especifico de SRS. C   = C cor.  x  = cor. muestra, concentración en mg/mL de un azúcar en la muestra hidrolizada después de corregir por perdida en la hidrólisis al 4%.

11.10. Calcule la concentración de azucares poliméricos de la concentración de los correspondientes azucares monomericos, usando una corrección anhidra de 0.88 (o 132/150) de azucares C-5 (xilosa y arabinosa) y una corrección de 0.90 (o 162/180) de azucares C-6 (glucosa, galactosa, y manosa).

 =  ∗ ℎ

 

 

11.11. Calcula el porcentaje de cada azúcar en una base libre de extractivos.

 1000 1      ∗    ∗   %  =    ∗100

Donde:

 

Vfiltrado = volumen del filtrado, 86.73 mL.

11.12. Calcula el porcentaje de cada azúcar en una base como fue recibida, si es necesario.

) %   = (% ) ∗ (100−% 100

 

Donde: % Extractivos = porcentaje de extractivos en la muestra de biomasa pretratada, como se determino en el LAP “Determinación de Extractivos en Biomasa”.  11.13. Calcula el porcentaje de acetato en una base libre de extractivos.

%  = , ∗   ∗      ∗100

 

Donde:

C AA,HPLC = concentración en mg/mL de acido acético como se determino por HPLC. Volumen

licor de hidrólisis =

volumen del filtrado, generalmente 86.73 mL

Factor de conversión = 0.683, la conversión de acido acético a acetato en biomasa. 11.14. Calcula el porcentaje de acetilo en una base como se recibió, si es necesario.

) %   = (% ) ∗ (100−%  100

 

11.15. Para reportar o calcular el porciento relativo de diferencia (RPD) entre dos muestras, use el siguiente cálculo:

)  − 2 ∗100  = (  

Donde:

X1 y X2 = valores medidos

 

 

 

XMedia = la media de X1 y X2.

11.16. Para reportar o calcular la desviación cuadrada de la raíz media (RMS desviación) o la desviación estándar (st dev) de las muestras, utilice los siguientes cálculos. Primero encuentre la raíz cuadrada de la media (RMS), de la muestras usando

 =  =  = √ ∑    2

 

Después encuentre la desviación cuadrada de la raíz media, usando

 2 ∑ ( )    −       √    =  =  =  Donde:

 

xm = la raíz media cuadrada de todos los valores de x en el conjunto n = numero de muestras en el conjunto xi = un valor medido del conjunto

12. Formato del reporte. 12.1. Reporte el porcentaje en peso de lignina, de cada azúcar, y del acetato. Reportado en una base como fue recibido corrigiendo por los extractivos, si es necesario. 12.2. Para análisis de replicas, reporte el promedio y la diferencia en porcentaje relativo. 13. Precisión y parcialidad. 13.1. Rondas de pruebas complejas  –  Para un reporte documentando una prueba internacional de rondas de prueba complejas de métodos de análisis de biomasa, incluyendo este procedimiento, ver Milne et al., 1992. 14. Control de la calidad. 14.1. Reporte figuras significativas o decimales: Determinado por los objetivos de adquisición de datos y un plan apropiado de seguridad específica de la calidad. 14.2. Replicas: Corra todas las muestras en duplicado. 14.3. Blanco: Ninguno.

 

14.4. Criterio relativo de diferencia porcentual: Determinado por los objetivos de adquisición de datos y un plan apropiado de seguridad específica de la calidad. 14.5. Método de verificación de estándar: Estándares de verificación de calibración deben de prepararse independientemente y analizados como se describe en la sección del procedimiento. 14.6. Tamaño de la muestra: 4g, como mínimo, de la muestra, extraer si es necesario (incluyendo la cantidad necesaria para la determinación del porcentaje de sólidos). 14.7. Almacenamiento de muestras: Los licores de hidrólisis pueden ser almacenados en un refrigerados por hasta dos semanas. 14.8. Almacenamiento de estándares: Los estándares deberán ser almacenados en un congelador y retirados cuando se necesiten. Descongele y agite los estándares congelados antes de su uso. 14.9. Preparación de estándares: Los estándares deberán ser preparados como se describe en el procedimiento, incluyendo los estándares de calidad. 14.11. Definición de un lote: Cualquier numero de muestras que se van a analizar y registrar juntos. El tamaño recomendado es de tres a seis muestras con un estándar de calidad, todas corridas en duplicado. 14.11. Tablas de control: Todos los recuperados de CVS, SRS y NIST o los estándares QA deberán tener una tabla de control. 15. Apéndices. 15.1. Ninguno.