Determinación de Betalactamasas

 

BLOQUE 4  Control bacteriano

antibiótico más adecuado para el tratamiento de la infección y permite instaurar las medidas de aislamiento adecuadas para evitar la transmisión del microorganismo a otros pacientes. p acientes. El estudio de los mecanismos de resistencia se puede realizar mediante la detección del gen que codifica dicho mecanismo (detección genotípica;   v.. capítulo 16)  v 16) o mediante la demostración del efecto que ese gen ocasiona (detección fenotípica). L  Laa

detección genotípica conlleva el empleo de técnicas de biología molecular que, en muchas ocasiones, no están al alcance de los laboratorios clínicos. Por ello, la detección fenotípica resulta muy útil en la práctica clínica y es ampliamente empleada. El objetivo de los siguientes experimentos es mostrar cómo detectar algunos de los mecanismos de resistencia más prevalentes mediante pruebas fenotípicas.

ESTUDIO EXPERIMENTAL 1. DETECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE 󰁢-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO EN ENTEROBACTERIAS

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El principal mecanismo de resistencia a los 󰁢-lactámicos en las enterobacterias es la producción de 󰁢-lactamasas, que son enzimas capaces de hidrolizar el anillo 󰁢-lactámico inactivando estos antibióticos. Destacan las 󰁢-lactamasas de espectro extendido (BLEE), ya que hidrolizan y confieren resistencia a penicilinas, cefalosporinas de tercera y cuarta generación y monobactámicos. Las BLEE se caracterizan por ser sensibles a la acción de los inhibidores clásicos de las 󰁢-lactamasas, como el ácido clavulánico o el tazobactam. Los genes que codifican estas enzimas se encuentran localizados en elementos móviles, lo que facilita su diseminación. El aislamiento de bacterias productoras de BLEE está en auge desde su primera descripción en Alemania en 1983 en una cepa de Klebsiella ozaenae. En ozaenae. En la actualidad se han identificado más de 300 BLEE diferentes, la mayoría pertenecientes a las familias TEM, SHV y CTX-M. Debido al aumento de los aislamientos productores de BLEE durante los últimos años, su detección en el laboratorio se convierte en una tarea necesaria para facilitar su control epidemiológico. Fenotipos que se deben detectar:   Capacidad para hidrolizar cefalosporinas cefalosporinas de tercera y cuarta generación generación y monobactámicos.   Capacidad del ácido clavulánico clavulánico para inhibir la la actividad enzimática de las 󰁢-lactamasas. 󰁬

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TÉCNICAS  Antibiogramas para demostrar demostrar el efecto sinérgico sinérgico producido entre las las cefalosporinas de tercera tercera generación o los monobactámicos y el ácido clavulánico.

MATERIAL NECESARIO 󰁬

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  Tubos con solución salina (SS) estéril.   Agar Mueller-Hinton (MH).   Discos de antibióticos: ceftazidima (30 󰁭g), cefotaxima (30 󰁭g), ceftriaxona (30 󰁭g), aztreonam (30 󰁭g), amoxicilina-ácido clavulánico (20/10 󰁭g).   Estándar de turbidez equivalente a un estándar 0,5 de la escala de McFarland (108 UFC/mL).   Hisopos estériles.   Pinzas metálicas.   Vórtex.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL (TABLA (TABLA 11-1) 11-1) La técnica empleada es el método de difusión con discos. La preparación del inóculo, las placas y los discos se explica en el anexo de técnicas básicas. Dado que la interpretación de la existencia de un efecto sinérgico no siempre es totalmente objetiva, se recomienda el empleo de una cepa control negativo de Escherichia coli  ATCC  ATCC 25922 no productor de BLEE, y de una cepa control positivo de Klebsiella pneumoniae ATCC pneumoniae ATCC 700603 productor de BLEE.

Día 1 󰁬

  Preparación del inóculo. A partir de una placa de cultivo de 18-24 h, tomar una colonia con un asa y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala de MacFarland en SS. Homogeneizar en vórtex durante 15-20 s.

 

CAPÍTULO 11  Resistencia antibiótica

TABLA 11-1  Cronograma del experimento experimento** D ía 1

Día 2

Preparación del inóculo Preparación de medios Dispensación de discos Incubación (24 h)

Lectura de resultados

*Los tres experimentos tienen una cronología similar.

  Inoculación de placas de MH en césped (en tres direcciones) sin dejar ninguna zona libre. Dejar secar durante 3-5 min antes de depositar los discos.   Dispensación de los discos con pinzas estériles. Es necesario asegurarse de que los discos contacten perfectamente con la superficie del agar, por lo que se recomienda presionar ligeramente sobre la superficie del agar. Para la detección de cepas productoras de BLEE, deben colocarse tres discos de cefalosporinas (cefotaxima, ceftacidima y ceftriaxona) y uno de aztreonam alrededor de un disco de amoxicilina-ácido clavulánico, siguiendo el esquema de la figura 11-4. 11-4. Es especialmente importante mantener la distancia entre los discos (20 mm) para poder apreciar el efecto de sinergia que confirmará la producción de BLEE.   Incubación a 35 °C en atmósfera aerobia durante 18-24 h.

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Día 2 Lectura de los resultados. La sinergia entre los discos de las cefalosporinas y el de amoxicilina/ácido clavulánico confirma la presencia de una cepa productora de BLEE (v. fig. 11-4 ).

ESTUDIO EXPERIMENTAL 2. DETECCIÓN DE METALO- 󰁢-LACTAMASAS EN PSEUDOMONAS AERUGINOSA Otro tipo de 󰁢-lactamasas son las denominadas carbapenemasas,  que son enzimas capaces de degradar a los 󰁢-lactámicos de amplio espectro denominados carbapenémicos.

 .   o    t    i    l   e    d     n   u   s   e     n    ó    i   c   a   z    i   r   o    t   u   a     n    i   s   r   a    i   p   o   c    t   o   o    F  .   r   e    i   v   e   s    l    E

FIGURA 11-4  Test de sinergia de doble disco di sco para la detección de enterobacterias productoras de 󰁢-lactamasas

de espectro extendido (BLEE). Se muestra el resultado positivo de una cepa de Escherichia coli  productora  productora de BLEE.  AMC, amoxicilina-ácido  amoxicilina-ácido clavulánico; ATM, clavulánico; ATM, aztreonam;  aztreonam; CAZ, CAZ, ceftacidima;  ceftacidima; CPD, CPD, cefpodoxima;  cefpodoxima; CRO, CRO, ceftriaxona.  ceftriaxona.    © AMC,

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BLOQUE 4  Control bacteriano

Las carbapenemasas del tipo metalo-󰁢-lactamasas (MBL) están aumentando en los últimos años. Se caracterizan por poseer un dominio de unión al cinc, que debe estar ocupado por dos iones de este metal para que la enzima mantenga su actividad hidrolítica. Por lo tanto, todas las MBL tienen en común que son sensibles a la inhibición por agentes quelantes de cationes divalentes, como el ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), pero no por los inhibidores clásicos de las 󰁢-lactamasas, como el ácido clavulánico. Las cepas productoras de MBL suelen presentar resistencia a la práctica totalidad de los 󰁢-lactámicos, incluidos carbapenémicos, con la excepción de aztreonam. Por lo tanto, el hecho de observarse una gran sensibilidad a aztreonam y una sensibilidad reducida o resistencia a ceftazidima y cefepima, además de resistencia a imipenem y meropenem, nos debe hacer sospechar de la presencia de una cepa productora de MBL. Fenotipos que se deben detectar:   Una cepa productora de MBL es resistente a los carbapenémicos. carbapenémicos.   Las MBL requieren unir a su centro activo activo dos iones de cinc. 󰁬

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TÉCNICAS Si quelamos con EDTA los iones presentes en el medio, la enzima no podrá ser activa y se incrementará la sensibilidad a imipenem.   Microdilución en caldo y tiras de E-test®: consiste en calcular el cociente entre los valores de la CMI a imipenem en presencia y ausencia de un quelante.   Difusión en disco (test de los discos combinados y test de sinergia con doble disco): consiste en medir los halos de inhibición generados al enfrentar la cepa en estudio con un disco cargado con un carbapenémico y otro disco cargado con el mismo carbapenémico y un compuesto 󰁬

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inhibidor de las MBL (EDTA). Un aumento de 6 mm del diámetro del halo de inhibición generado en el disco con quelante, respecto al que no contiene quelante, permite inferir la presencia de MBL en el aislamiento. Por su parte, el test de la sinergia de doble disco se fundamenta en la potenciación del halo de inhibición generado alrededor del disco antibiótico cuando este se enfrenta con un disco cargado con un inhibidor de la acción enzimática de las MBL.

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MATERIAL NECESARIO 󰁬

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  Tubos con solución salina (SS) estéril.   Medio de cultivo (dos placas de agar MH).   Discos de antibióticos: tres discos de imipenem (10 󰁭g), un disco de ceftazidima (30 󰁭g) y un disco blanco (sin antibiótico).   EDTA: 0,1 M.   Hisopos estériles.

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Pinzas metálicas. Pipetas automáticas y puntas de pipeta. Incubadora a 37 °C. Nefelómetro o escala MacFarland. Vórtex.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL EXPERI MENTAL (V. (V. TABLA 11-1 11- 1) La técnica empleada es el método de difusión con discos. La preparación del inóculo, las placas y los discos se explica en el anexo de técnicas básicas.

Día 1* 1* 󰁬

  Preparación del inóculo. A partir de una placa de cultivo de 18-24 h, tomar una colonia con un asa y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala de MacFarland en SS. Homogeneizar en vórtex durante 15-20 s.

*Empléense como controles positivos positivos cepas de laboratorio conocidas productoras de MBL de tipos VIM-2 e IMP-13,  y como control negativo negativo la cepa salvaje PAO1. PAO1.

 

CAPÍTULO 11  Resistencia antibiótica

  Inoculación de las placas MH  en césped (en tres direcciones), sin dejar ninguna zona libre. Dejar secar 3-5 min antes de depositar los discos.   Dispensación de los discos. Para llevar a cabo el test de los discos combinados, y siguiendo las indicaciones de la figura 11-5 A, depositar dos discos de imipenem en una de las placas placas de MH. Para llevar a cabo el test de sinergia con doble disco, d isco, y siguiendo las instrucciones de la figura 11-5B, 11-5B, depositar en el centro de la otra placa de MH el disco de filtro blanco.  A un lado, y a una distancia de borde a borde de los discos de 10 mm, colocar colocar el disco de imipenem y, al otro lado y a la misma distancia, el disco d isco de ceftazidima.

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  Inoculación del quelante. Siguiendo las indicaciones de la figura 11-5, 11-5, inocular 10 󰁭L de la solución de EDTA 0,1 M sobre uno de los dos discos de imipenem, colocándolo sobre la primera placa, y 10 󰁭L de esta misma solución sobre el disco de filtro blanco. Mantener las placas a temperatura ambiente y no moverlas durante 5 min, para permitir que los discos absorban la solución.   Incubación a 35 °C en atmósfera aerobia durante 18-24 h.

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Día 2 Lectura de los resultados.

ANÁLISIS Y RESULTADOS ESPERADOS   Test de los discos combinados: considerar como resultado positivo para la producción de MBL un aumento del diámetro del halo de inhibición del disco suplementado con EDTA de al menos 6 mm más que el disco que únicamente contiene imipenem (v. fig. 11-5 A).   Test de sinergia de doble disco: considerar como resultado positivo para la producción

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de MBL la potenciación del halo de inhibición generado entre los discos de antibiótico (imipenem y/o ceftazidima) y el quelante (v. fig. 11-5B). 11-5B).

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 .   o    t    i    l   e    d     n   u   s   e     n    ó    i   c   a   z    i   r   o    t   u   a     n    i   s   r   a    i   p   o   c    t   o   o    F  .   r   e    i   v   e   s    l    E

FIGURA 11-5  Pruebas fenotípicas para la detección de cepas de Pseudomonas aeruginosa  productoras

de metalo-󰁢-lactamasas. En la imagen inferior, se muestra un resultado positivo. A. Disposición de los discos para    © realizar el test de los discos combinados. B. Disposición de los discos para realizar el test de sinergia de doble disco.

 

BLOQUE 4  Control bacteriano

ESTUDIO EXPERIMENTAL 3. DETECCIÓN DE CEPAS DE STAPHYLOC OCCUS AUREUS AUR EUS  RESISTENTES A METICILINA S. aureus es aureus es uno de los principales causantes de infecciones, tanto nosocomiales como comunitarias. Es el agente etiológico de múltiples patologías, entre las que destacan las infecciones de la piel y los tejidos blandos, la bacteriemia, la endocarditis, las infecciones del sistema nervioso central y las infecciones del aparato genitourinario. Las penicilinas antiestafilocócicas, como meticilina, nafcilina, cloxacilina u oxacilina, son los antibióticos de primera elección para su tratamiento. Sin embargo, están apareciendo numerosos casos producidos por S. aureus resistentes aureus resistentes a la meticilina (MRSA o SARM, según el acrónimo en inglés o en castellano, respectivamente) y S. aureus  aureus  resistentes a la oxacilina. Ambos antibióticos pertenecen a la misma familia y presentan resistencia cruzada, por lo que la detección de resistencia a uno de ellos implica resistencia al otro. Desde su primera aparición en el Reino Unido en 1961, los SARM se han distribuido por todo el mundo y su prevalencia ha incrementado significativamente, oscilando entre el 25-50% en los diferentes países europeos. Su detección rápida es imprescindible para aplicar el tratamiento adecuado. Pero, ¿a qué se debe su resistencia? Y, por lo tanto, ¿cómo se pueden detectar? Las penicilinas antiestafilocócicas son antibióticos 󰁢-lactámicos estables a la acción de las 󰁢-lactamasas, que actúan fijándose y bloqueando a las proteínas fijadoras de la penicilina (conocidas como PBP por su afinidad con los 󰁢-lactámicos). Estas proteínas se encuentran en la membrana citoplásmica y son responsables de la síntesis del peptidoglucano. Las cepas de S. aureus contienen aureus contienen normalmente cuatro PBP. La resistencia a este grupo antibiótico antibiótic o se debe a la síntesis de una PBP de baja afinidad por estos

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antibióticos, denominada PBP2a o PBP2’. Debido a esta baja afinidad, los antibióticos 󰁢-lactámicos son incapaces de unirse a esta proteína y, por lo tanto, de realizar su acción. La bacteria se convierte en resistente. Esta alteración puede adquirirse gracias a la adquisición de ADN exógeno, en concreto la adquisición del gen  mecA, que codifica dicha proteína con baja afinidad por estos 󰁢-lactámicos. Para la detección de cepas resistentes a la meticilina en los laboratorios clínicos, se emplea la determinación de la sensibilidad a los antibióticos oxacilina y cefoxitina. ¿Por qué? Razones:   Las cepas de S. aureus resistentes aureus resistentes a oxacilina (SARM) presentan resistencia cruzada con todos los 󰁢-lactámicos, incluidas penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y monobactámicos.   La cefoxitina es un marcador alternativo de la presencia de mecA, de  mecA, ya  ya que es un inductor más potente del sistema regulatorio de mecA de  mecA en  en comparación con las penicilinas y, por ello, mejora la expresión de dicho gen facilitando la detección de la resistencia. Para facilitar la expresión y posterior detección de este mecanismo de resistencia, se recomienda 󰁬

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realizar el antibiograma convencional, pero empleando una placa de MH suplementada con un 4% de NaCl. Esta recomendación se basa en que, en ocasiones, la expresión fenotípica de la resistencia no tiene lugar bajo las condiciones estándar de cultivo utilizadas para realizar el antibiograma.

MATERIAL NECESARIO   Tubos con solución salina (SS) estéril.   Medio de cultivo: agar MH con un 4% de NaCl.   Discos de antibióticos: oxacilina (1 󰁭g) y cefoxitina (30 󰁭g).   Hisopos estériles.   Pinzas metálicas.   Vórtex.   Estufa 37 °C.   Nefelómetro o escala MacFarland.   Protocolo experimental (v. tabla 11-1 ) La técnica empleada es el método de difusión con discos. La preparación del inóculo, las placas y los discos se explica en el anexo de técnicas básicas (v. anexo 2; técnica 12). Se recomienda el empleo de cepas control: S. aureus ATCC aureus ATCC 29213 oxacilinaS y S. aureus ATCC aureus ATCC 4330 R oxacilina . 󰁬

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CAPÍTULO 11  Resistencia antibiótica

Día 1   Preparación del inóculo. A partir de una placa de cultivo de 18-24 h, tomar una colonia con un asa y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala de MacFarland en SS. Homogeneizar en vórtex durante 15-20 s.   Inoculación de las placas. Mueller-Hinton en césped (en tres direcciones), sin dejar ninguna zona libre. Dejar secar durante 3-5 min antes de depositar los discos.   Dispensación de los discos de cefoxitina y oxacilina con pinzas estériles. Es necesario asegurarse de que los discos contacten perfectamente con la superficie del agar,

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por lo que se recomienda presionar ligeramente sobre ella ( fig. fig. 11-6 ).   Incubación a 35 °C en atmósfera aerobia durante 18-24 h.

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Día 2 Lectura de los resultados.  Aquellas cepas de S. aureus  aureus  resistentes a oxacilina (diámetro del halo de inhibición ≤10 mm) y a cefoxitina (diámetro del halo de inhibición ≤21 mm) se consideran resistentes a meticilina (SARM) (v. fig. 11-6 ).

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FIGURA 11-6  Estudio de la susceptibilidad a cefoxitina y oxacilina para la detección de cepas de Staphylococcus aureus  resistentes a meticilina (SARM). El medio empleado está suplementado suplementado con un 4% de NaCl. Se muestra un ejemplo de cepa resistente a meticilina. A. No sensible a cefoxitina. B. No sensible a oxacilina. Un diámetro de halo menor o igual a 21 mm se considera resistente. FOX, FOX, cefoxitina;  cefoxitina; OXA, OXA, oxacilina.  oxacilina.  .   o    t    i    l   e    d     n   u   s   e     n    ó    i   c   a   z    i   r   o    t   u   a     n    i   s   r   a    i   p   o   c    t   o   o    F  .   r   e    i   v   e   s    l    E

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Etimologías  antí-, «frente  Antibiótico: del gr. antí-,  «frente a», «contra», y bio-, «vida». bio-,  «vida».

-cida: del lat, -c  ī da, «que da, «que mata». Penicilina:  del lat. p ēnicill(um), nicill(um),   «forma estrecha y alargada», «pincel», y -  ī n(a), «sustancia»; n(a), «sustancia»; referente al antibiótico producido por el hongo Penicillium. -statico: del gr, sta-t(o)-, sta-t(o)-, «en  «en equilibrio», «detenido».