Determi Nacion Debi Omasa

LABORATORIO N° 03.

DETERMINACIÓN DE BIOMASA PESO HÚMEDO, PESO SECO, TURBIDIMETRÍA

“

I. 

”

OBJETIVOS Determinar la concentración en Peso húmedo (g mH/mL) y Peso Seco (g mS/mL) de una solución celular y ver que método es más efectivo.



Calcular el coeficiente de variabilidad de las tres repeticiones en Peso Húmedo y Peso Seco de la levadura de pan.



Determinar la biomasa de una solución celular desconocida mediante el método de turbidimetría



Determinar la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la aplicación de diferentes métodos.



Hallar el factor de conversión para cada caso, mediante la Curva de Calibración.



Determinar el Porcentaje de Error de los factores de Conversión, relacionando los datos.

II.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Biomasa es un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez también se puede referir como la cantidad de células, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproducción de células. La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes de un bioproceso ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clave para establecer las tasas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances de masa de cualquier proceso biológico. Los métodos clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que se basan en el número de células o en el peso celular. Para determinar la biomasa es necesario calcular el número de células en una determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo, para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar los microorganismos en esos productos. Los métodos para estimar el número de microorganismos pueden medir la cantidad de células, la masa celular o la actividad celular. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales.

A. Medida de biomasa La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad metabólica, o de un constituyente metabólico o químico. Algunos de los métodos para cuantificar la biomas son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca exactitud. 1. Peso húmedo Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. 2. Peso seco La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Se expresan en g.m.s/mL. La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no sólo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica adsorbida.  Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los métodos gravimétricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. A la vez este método este método los componentes volátiles de las células pueden perderse en el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca pude recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene humedad relativa alta. 3. Absorción Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz

transmitida a través de la solución. Con relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión. Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular). 

Turbidimetría

La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.

Figura 1. Absorbancia en función del Peso Seco 

K:  constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W 0).



Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml).

La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.

Figura 2. Absorbancia en función del Peso Seco III. MATERIALES Y MÉTODOS A. Materiales e instrumentos Materiales 

Levadura de panificación “Fleishmann”

Agua destilada  Tubos de ensayo  Láminas cubreobjetos  Vaso de precipitación   Pipeta   Jeringa 

Equipos   Centrifugadora   Microscopio  Estufa (105°ºC por 3 horas)  Balanza electrónica  Cámara de Neubauer   Espectrofotómetro 

Figura 3.  Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales

B. Metodología a) Para determinación de Peso Húmedo Se tomaron muestras de 5 mL de la solución inicial y se colocaron en tres tubos de ensayos previamente pesados.  Luego los tubos son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un tiempo de 10 minutos.  Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analítica, anotamos los pesos y luego promediamos. En Seco la solución no tiene que estar muy diluida, con este método se mide la levadura b) Para determinación de Peso Seco 

“Fleischmann” 









Se tomaron muestras de 5 mL de la solución inicial y se colocaron en tres tubos de ensayos previamente pesados. Los tubos de ensayo son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un tiempo de 10 minutos. Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analítica y anotamos los pesos. Posteriormente, se llevan los tubos a estufa, a una temperatura de 105 ºC por un tiempo promedio de 3 horas. Pasado el tiempo anotaremos, los pesos y luego pasamos a sacaremos un promedio.

Figura 4. Metodología de Peso Húmedo y Peso Seco.



Las ecuaciones que se determinarán son:

 +  ú −     ú(  ) =     = 5  +  −     (  ) =     = 5  Hallaremos el coeficiente de Variabilidad de las 3 repeticiones.



c) Para determinación de turbidimetría 











Método Indirecto

Se preparó una solución acuosa con levadura, a partir de la cual se procedió a preparar diluciones ( 4/5, 3/5, 2/5, 1/10, 1/30, 1/50, 1/100) De la muestra original se tomó 5 ml en dos tubos para determinar la concentración en peso seco y peso húmedo. Para determinar la concentración por conteo celular se tomó una muestra de la dilución 1/100. Con todas las diluciones y muestra original se procedió a colocarlas uno por uno en celdas para leer la absorbancia en el espectrofotómetro. Con estos datos se pasó a realizar las siguientes graficas absorbancia vs peso seco, absorbancia vs peso húmedo y absorbancia vs conteo celular. Se preparó una solución desconocida con la finalidad de determinar el porcentaje de error (%Error), en la realización de la práctica, utilizando los diferentes métodos empleados.

Figura 5. Metodología de Turbidimetría.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES A. Para Peso Seco y Peso Húmedo Tabla1. Peso Seco y Peso Húmedo de las muestras conocidas de 5ml Muestra Original

W Tubo vacío(g)

W tubo + muestra húmeda (g)

W tubo + muestra seca (g)

Peso en húmedo (g/mL)

Peso en seco (g/mL)

A

7,4625

7,9003

7,5198

0,0876

0,01146

B

6,4196

6,8065

6,4859

0,0774

0,01326

C

9,7336

10,1598

9,80321

0,0852

0,0139

PROMEDIO

-

-

-

0,0834

0,0129

S

-

-

-

0,0053

0,00128

CV

-

-

-

0,0730

0,0357

Tabla 2. Peso húmedo y peso seco de las muestras desconocida de 5 ml

W Tubo vacío(g)

W tubo + muestra húmeda (g)

W tubo + muestra seca (g)

6,5821

6,7484

6,5989

B. Para Turbidimetría

Peso en Peso en seco húmedo (g/mL) (g/mL)

0,03326

0,00336

En la Cámara Neubauer se escogió 5 celdas al azar para tener una muestra representativa de la cual se obtuvo una muestra ori inal de 1210000000 cel. /ml.

Tabla 3. Peso Húmedo, peso Seco, Absorbancia y Conteo Celular de la muestra original y de cada dilución. Conteo celular (cel/ml) Absorbancia

Peso húmedo (g/ml)

Peso húmedo (g/ml)

Diluciones

Concentración

Muestra original

-

1210000000

2,499

0,083393333

0,012880667

4/5

0,80

968000000

2,413

0,066714667

0,010304533

3/5

0,60

726000000

2,268

0,050036

0,008243627

2/5

0,40

484000000

2,065

0,033357333

0,006594901

1/10

0,10

121000000

1,265

0,008339333

0,005275921

1/30

0,03

40333333,33

0,603

0,002779778

0,004220737

1/50

0,02

24200000

0,428

0,001667867

0,003376589

1/100

0,01

12100000

0,482

0,000833933

0,002701272

ABSORBANCIA vs. PESO HÚMEDO 3.5 3      a       i 2.5      c      n      a 2       b      r      o 1.5      s       b       A 1 0.5 0

y = 25.934x + 0.7018 R² = 0.8682

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

Peso húmedo (g/ml)

Figura 6. Relación absorbancia vs peso húmedo. De la Muestra problema se obtuvo una absorbancia de 1.671 y 179000000 cel. /ml. Esto se obtuvo igual que para muestra original, escogiendo 5 cuadrados al azar en la cámara de Neubauer.

Tabla 4. Porcentaje de error Ecuación y de la muestra en peso húmedo.

ECUACIÓN

25,93x + 0,701

ABSORBANCIA

1,671

PESO HÚMEDO REAL

0,03326

PESO HÚMEDO TEÓRICO

0,037408407

ERROR (%)

-12,47266161

ABSORBANCIA vs. PESO SECO 3.5 3

y = 234.06x - 0.0653 R² = 0.8408

2.5      a       i      c      n 2      a       b      r      o      s 1.5       b       A

1 0.5 0 0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

Peso seco (g/ml)

Figura 7. Relación absorbancia vs peso seco Tabla 5. Ecuación y porcentaje de error de la muestra en peso seco ECUACIÓN ABSORBANCIA PESO SECO REAL

234,0x - 0,065 1,671 0,00336

PESO SECO TEÓRICO

0,007418803

ERROR (%)

-120,7977208

0.012

0.014

ABSORBANCIA vs. CONTEO DE CÉLULAS 3.5 y = 2E-09x + 0.7018 R² = 0.8682

3      a 2.5       i      c      n      a 2       b      r      o 1.5      s       b       A

1

0.5 0 0

500000000

1E+09

1.5E+09

Conteo de células (cel/ml)

Figura 8. Relación absorbancia vs conteo celular Tabla 6. Ecuación y porcentaje de error de la muestra en conteo celular  ECUACIÓN ABSORBANCIA CONTEO DE CÉLULAS REAL CONTEO DE CÉLULAS TEÓRICO ERROR (%)

Según Arnáiz,

et al   (1992),

2E-09x + 0,701 1,671 179000000

4,85E-10 100

el peso húmedo se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es

pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Demostrando una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. Esto se puede contrastar en la Tabla 1, hay una diferencia entre el peso húmedo y el peso seco debido a que el primero contiene agua del diluyente de la solución. Este peso húmedo tiene una masa de 0,0834 gramos lo cual representa a 1210000000 células. De modo que las células estarán hidratadas y gran parte de ellas podrían ser visibles. Según Gil (2003), el recuento de células por área presentes en una solución, su coeficiente de variación se encuentra dentro de lo aceptable si no hay mucha diferencia significativa, ya que dentro de la determinación de biomasa, su variación podía ser significativamente cuando es menor (CV= 12,3 %),

indicando que la exactitud de la determinación varía con los laboratorios y el personal. Esto se comprueba con las muestras de peso seco y húmedo calculadas donde se obtienen valores menores al mencionado: 7.304% en cuanto a peso húmedo y 3.57% en peso seco; de lo que hay un mínimo error significativo esto se puede atribuir por el pesado y una buena maniobrabilidad con los objetos de laboratorio. Según Rodríguez, et al ( 2005), nos señala que para que sean visibles las trazas de turbidez es necesario más de un millón de células por ml., como para ser medida por un espectrofotómetro. Por lo que la turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias y o levaduras. Se comprobó en la práctica con éxito en el experimento ya que tanto la muestra original analizada como la muestra problema sobrepasaban dicha cantidad,; además, todas las muestras de concentraciones diferentes se leyeron 550nm de longitud de onda, cercano a 540 nm, (longitud de onda comúnmente utilizada para la determinación de crecimiento por el método de turbidimetría en las investigaciones). Según Toro (2005), la relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Sus absorbancias no deben ser mayores a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones. Esto se comprobó con el peso Seco de la muestra problema, su peso real y su peso teórico, presentando estos un % de error mayores y donde su absorbancia resultó 1.671. V. 

CONCLUSIONES Se determinó la biomasa de la levadura Fleischamn mediante el método de peso húmedo, peso seco y por turbidimetría, encontrando su Absorbancia y su variabilidad.



La determinación de biomasa mediante peso seco y peso húmedo es un método fácil y rápido de realizar pero que también es un método impreciso debido a diversos factores que se presentan en laboratorio.



Encontramos el factor de conversión para cada caso, logrando construir la curva de calibración y hallar el factor de conversión en los tres métodos para determinar sus resultados teóricos comparándolos con los reales, obtenidos en laboratorio.



Determinamos el porcentaje de error. VI. RECOMENDACIONES 

Para obtener una muestra homogénea se debe agitar la muestra antes de colocarlas en las celdas y de esta manera evitar errores en las lecturas del espectrofotómetro.



El llenado en las celdas de la cámara de Neubauer se debe hacer correctamente para evitar que se pierda parte de la muestra.



Calibrar el espectofómetro antes de tomar las medidas, ya que este pudo haber sido utilizado con otras sustancias en experimentos anteriores. Del mismo modo calibrar la balanza analítica par que nuestro porcentaje de error sea mínimo.



El llenado correcto de la muestra en la cámara, se debe realizar de modo que no se derrame en la lámina cubre objeto la solución. De esta manera haremos el conteo.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS  ARNÁIZ,C., ISAC,L. Y LEBRATO, J. (2000).Determinación de la biomasa en procesos biológicos. Sevilla. GIL, E. (2003).

Elementos clave en la uniformidad de distribución de abonos. Escuela superior de

agricultura de Barcelona. RODRÍGUEZ, E., GAMBOA, M., HERNÁNDEZ, F Y GARCÍA, J. (2005). Bacteriología General: Principios y prácticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. TORO R. (2005), Manual de Introducción al Laboratorio De Microbiología, editorial universidad de caldas, 2005. ANEXOS