Detección de patógenos en alimentos Consuelo Vanegas / Johanna Rojas
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Detección de patógenos en alimentos Consuelo Vanegas / Johanna Rojas
Los grupos de mayor riesgo son los niños, ancianos, mujeres embarazadas y pacientes inmunosuprimidos, aunque se presenten casos en población sana entre quince y cuarenta y cuatro años. Según reportes de la Secretaria Distrital de Salud de Bogotá, los lugares en los cuales se ha presentado la mayoría de casos son en casas, colegios, escuelas, hogares infantiles, restaurantes escolares y sitios turísticos.
Los síntomas típicos de la gastroenteritis causada por estos microorganismos son dolor de cabeza, náuseas, diarrea, vómito, dolor abdominal y, en algunos casos, escalofrío o fiebre. El período de incubación A diario consumimos diferentes ali- depende del agente etiológico implicado y puede ser muy corto, o hasta de mentos que son la principal fuente setenta y dos horas después de ingerido el alimento contaminado. Las ETAs, de energía para realizar las activida- además de causar la gastroenteritis, ameritan especial atención porque puedes de nuestra vida, pero estos ali- den generar complicaciones y secuelas como meningitis, artritis, desórdementos pueden causar enfermedades nes auto inmunes, enfermedades cardiovasculares, neoplasias, y abortos. si no han sido elaborados bajo nor- Por otra parte los gastos económicos causados por i ncapacidades laborales mas de higiene adecuadas. Este tipo y por pérdidas industriales debido al rechazo de productos contaminados de enfermedades se conocen con el con estos patógenos son bastante altos. Por estas razones, es necesario que nombre ETAs –Enfermedades Transmitidas por Alimentos–. A nivel mundial las ETAs son una de las causas más preocupantes en salud pública ya que ocurren de 24 a 81 millones de casos y más de diez mil muertes por consumo de alimentos contaminados. Los alimentos y el agua pueden ser la vía de transmisión de bacterias, parásitos, virus, priones –causantes del mal de las vacas locas–, toxinas de bacterias y hongos. En Colombia se ha reportado que los alimentos potencialmente dañinos son aquellos con alto contenido proteico, baja acidez y alta humedad tales como la carne, mariscos, lácteos, huevos, arroz y pastas. Entre los factores de riesgo asociados con la presentación de estas enfermedades tenemos deficientes hábitos higiénicos, el manejo inapropiado de temperaturas –enfriamiento, calentamiento, descongelamiento– y almacenamiento inadecuado.
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Figura 1.
Casos de ETAs en Colombia de 1998 a 2001. Datos tomados de SIVIGILA, consultados en http://www.col.ops-oms.org/sivigila/2002/BOLE06_02.htm el 8 de noviembre de 2004
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Figura 2.
Placa de electroforesis de productos de amplificación del gen para la identificación de cepas de Salmonella spp. Los números de las columnas corresponden a: 0 y 11-escala DNA Ladder ; 1- Salmonella typhi ATCC 6539. 2-9. Cepas de Salmonella sp. aisladas de alimentos. 10. Control
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Figura 3.
Placa de electroforesis de productos de 235 pares de bases que identifican a las cepas de Listeria monocytogenes . Los números de las columnas corresponden a: 0 y 13-escala DNA Ladder ; 1-L. monocytogenes ATCC 7644. 2-10 Cepas de Listeria sp., –las columnas 6 y 7 no fueron identificadas como L. monocytogenes –; 11-Control Negativo: S .aureus ATCC 25923. 12. En blanco
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se preste la atención adecuada a esta problemática y se optimicen los métodos de detección de estos microorganismos en los laboratorios de microbiología. En Colombia, como en otros países del mundo, han aumentado las ETAs bacterianas debido a que no se ha logrado controlar efectivamente la contaminación de los alimentos (figura 1). Estos reportes no muestran la dimensión real del problema, las estadísticas pueden ser mayores debido a que falta mejorar el registro de la información ante las entidades pertinentes, ya que el consumidor se automedica y desconoce la magnitud de la enfermedad. Además, los médicos no siempre ordenan los exámenes adecuados para determinar el agente causante de la sintomatología. Por lo tanto, es necesario desarrollar la investigación en esta área e implementar métodos de microbiología más sensibles y específicos para detectar los patógenos en los alimentos. Para una explicación de las técnicas de PCR y de electroforesis, se recomienda el artículo “Detectives del Mal de Chagas” en Hipótesis No. 1 1
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Detección de los microorganismos
Para aislar e identificar bacterias de alimentos en el laboratorio se han utilizado, tradicionalmente, métodos de microbiología clásica en los cuales los protocolos tardan mucho tiempo en generar resultados y son poco sensibles, permitiendo el crecimiento de otras bacterias, lo que dificulta la detección del patógeno. Por esta razón y teniendo en cuenta la necesidad de detectar con rapidez los microorganismos en los alimentos, para evitar que estos salgan a la venta contaminados, se está implementando el uso de la reacción en cadena de la polimerasa, PCR, que permite identificar de manera más rápida y específica los microorganismos productores de ETAs en alimentos destinados al consumo humano. Esta técnica permite multiplicar el fragmento de un gen específico de la bacteria patógena, para que se evidencie su presencia al observarlo por el método de electroforesis. Este método permite identificar el gen al compararlo con un patrón de escala ( DNA-Ladder ) que indica el número de pares de bases del gen 1. (Figuras 1 y 2).
Figura 4.
Curvas generadas por la PCR en tiempo real de la detección de Salmonella enteritidis
El Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos, LEMA, de la Universidad de los Andes, ha realizado estudios para identificar dos de las bacterias más importantes dentro del grupo de productoras de ETAs: Salmonella spp., causante de gastroenteritis y fiebre tifoidea y Listeria monocytogenes causante de abortos y meningitis . Para Salmonella se estandarizó la técnica de PCR mediante identificación de un fragmento del gen invA, que permite la invasividad de la bacteria en las células epi teliales del intestino. Mediante esta técnica se han confirmado cincuenta cepas de Salmonella spp. aisladas de
diferentes tipos de alimentos como pollo, tocineta y jamón de cerdo, entre otros. (Figura 2). Para Listeria monocytogenes se amplificó el gen que codifica para la Listeriolisina O , que es el factor de virulencia que inicia la infección. Se trabajaron sesenta cepas de L. monocytogenes, provenientes de derivados lácteos, las cuales fueron identificadas por la banda de amplificación de 235 pares de bases (figura 3). Los alimentos estaban disponibles para su venta en plazas de mercado de Bogotá.
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A pesar de que la PCR es una técnica rápida, se ha desarrollado una modificación a ésta, en la cual no se realiza electroforesis, de tal forma que los resultados se obtienen simultáneamente con la amplificación del gen. Esta técnica se conoce con el nombre de “PCR en tiempo real” y se realiza utilizando un marcador, como SYBR GREEN-I, que produce fluorescencia al unirse al ADN de cadena doble, con un equipo que la detecta y genera una curva de la intensidad de fluorescencia contra temperatura. El pico de la curva indica la temperatura de fusión – melting peak –, en la cual el 50 por ciento del ADN se encuentra en doble cadena. De esta manera, cada cepa bacteriana genera una temperatura de fusión específica que indica su presencia. En la figura 4 se observan los picos de amplificación obtenidos para la detección de Salmonella enteritidis . Esta bacteria genera una temperatura de fusión de 86.47 C mientras las otras cepas evaluadas, utilizadas como controles negativos (véase la tabla de la figura 4), expresan temperaturas de fusión diferentes, indicando que no son Salmonella enteritidis . Esto demuestra la alta especificidad de la prueba.
> Referencias [1]
D. De Medici, L. Croci, E. Delibato, D. Pasquale, E. Filetici & L. Toti. Evaluation of DNA extraction methods for use in combination with SYBR Green I real-time PCT to detect Salmonella enterica serotype Enteritidis in poultry. Applied Environmental Microbiology 69(6), 3456–3461 (2003).
[2]
C. Jaramillo, A. Diaz. Detectives del mal de Chagas. Revista Hipótesis No. 1, 42–49 (2003).
[3]
A. D. Sails, A. J. Fox, D. R. Wareing & D.L. Greenway. A real-time PCR assay for the detection of Campylobacter jejuni in foods after enrichment culture. Applied Environmental Microbiology 69(3): 1383–1390 (2003).
[4]
J. S. Way, K. L. Josephson, S. D. Pillai, M. Abbaszadegan, C. P. Gerba & L. I. Pepper. Specific Detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction. Applied Environmental Microbiology 59(5), 1473–1479 (1993).
[5]
Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Pública. Enfermedades transmitidas por alimentos en Santa Marta durante la temporada de vacaciones. Boletín epidemiológico Semanal . Semana Epidemiológica No. 6. febrero 03 a 09 de 2002. Consultado en http://www.col.ops-oms.org/ sivigila/2002/BOLE06_02.htm el 8 de noviembre de 2004.
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En el Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos, LEMA, de la Universidad de los Andes, se está utilizando la técnica de PCR en tiempo real para la detección de Salmonella enteritidis en muestras de pollo a la venta en supermercados de Bogotá, Listeria monocytogenes en leches crudas distribuidas en Boyacá, y Campylobacter, utilizando menudencias de pollo distribuidas en Bogotá. El uso de estos métodos permite obtener resultados más rápidos y seguros, por lo cual deberían utilizarse en la industria para tener un control de calidad más estricto y reducir el riesgo de distribución y venta de alimentos contaminados. De esta forma se podría disminuir la circulación de bacterias patógenas en los alimentos y reducir la generación de infecciones e intoxicaciones.
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> Reseña de los autores María Consuelo Vanegas López.
[email protected] Profesora asistente, Microbiología. Directora del Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos, LEMA, Universidad de los Andes. Johanna Rojas. Microbióloga.
[email protected] Asistente graduada, Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos, LEMA. Estudiante de Maestría en Ciencias Biológicas con énfasis en Microbiología de Alimentos en la Universidad de los Andes.
> Agradecimientos A la Facultad de Ciencias y a Roche-Diagnóstica por el apoyo financiero prestado para la realización de estas investigaciones.
