Desenvolvimento de Métodos por HPLC Fundamentos, Estratégias e Validação

Série

 Apo  Apontamen mentos

Queria Qu eria B. B. Cass  Ana  A na lju ljui^ i^a a Gu Gusmão Degani

Desenvolvimento de Métodos por HPLC Fundamentos, Estr atégias e Valid Validação ação

Edição revista em dezembro de 2001

Universidade Federal de São Carlos

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 Editora da UFSCar

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

Oswaldo Baptista Duarte Filho  Reito  R eito r

Romeu Cardozo Rocha filho Vice-Reitor

Oswaldo Mário Serra Truzzi  Dire  D iretor tor da Ed itora da UFSCar

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São Carlos ^

Edi Editor tora da UFSCar UFSCar 2001

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© 2001 Quezia B. Cass e Ana L uiza Gusmão Degani

Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária da UFSCar

C343d

Cass, Quezia B. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação / Quezia B. Cass, Ana Luiza Gusmão Degani - São Carlos: EdU FSCar, 2001. 77p. - (Série Apontamentos)

ISBN = 85-85173-61-0 1. Cromatografia líquida. 2. Análise quantitativa. 3. Parâmetros cromatográficos. 4. Cromatografia quiral. 5. Cromatografia preparativa. I. Título. CDD - 543.0894 (20*) CDU - 543.544.44

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 Art es e Textos

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SUMÁRIO 1. In t r o d u ç ã o

  ..... . ....   .........  .............

2. T e o r i a .........................

...................

.. 5 .. 7

3. P a r â m e t r o s  C r o m a t o g r á f ic o s

.11

4. I n s t r u m e n t a ç ã o

.17

  _____    _______ 

5. Síl ic a G e l .....................................

.23

6. F a s e s Q u im ic a m e n t e L i g a d a s  ..

.25

7. M o d o s d e  S e p a r a ç ã o

.27

8. O t im iz a ç ã o

 . ...............

..................................

9. E l u i ç â o G r a d i e n t e .................... 10. C r o m a t o g r a f i a  Q u ir a l

11. C r o m a t o g r a f i a

  ............

P r e pa r a t iv a ...

12. T r a t a m e n t o d e  Am o s t r a s

  .......

13. V a l i d a ç ã o d e  M é t o d o s  An a l ít ic o s

.35 .41 .49 .57 63 71

Desenvolvimento de Métodos por HPLC: Fundamentos, Estratégias e Validação

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1. INTRODUÇÃO A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias torna-a uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é atribuída a um botânico russo, ao descrever suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas. Neste estudo, a passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna de vidro  preeenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicion ou o extrato, levou à separação dos componentes em faixas coloridas. Este é provavelmente o motivo pelo qual esta técnica é conhecida como cromatografia (“chrom” - cor e “graphie” - escrever), podend o levar à errônea idéia de que este processo seja dependente da cor. Apesar deste estudo e de outros anteriores, os quais também poderiam ser considerados  precursores do uso desta técnica, a cromatografia foi praticamente ignorada até a década de 30, quando foi redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na área possibilitaram seu aperfeiçoamento e, em conjunto com os avanços tecnológicos, a levaram a um elevado grau de sofisticação, o qual resultou no seu grande potencial de aplicação em muitas áreas. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE/HPLC) surgiu como a aplicação de cromatografia líquida às teorias e instrumentações desenvolvidas originalmente para a cromatografia gasosa. Baseando-se na teoria da cromatografia gasosa, de que a eficiência de uma separação aumenta com a diminuição do tamanho da partícula da fase estacionária, surgiu, na década de 60, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Em 1952, Martin e Synge ganharam o prêmio Nobel pelo desenvolvimento do primeiro tratamento matemático da teoria cromatográfica e, com o avanço da tecnologia, foi possível aplicar esta teoria ao desenvolvimento da cromatografia líquida. A principal diferença entre a cromatografia líquida clássica e a cromatografia líquida de alta eficiência é a utilização de fases estacionárias com micropartículas (10, 5 ou 3 m) esféricas, de  preferência. Estas fases,' por serem muito menos permeáveis, tornaram necessária a utilização de  bombas para a eluição da fase móvel. A utilização destas novas fases estacionárias, associada ao desenvolvimento da instrumentação, levou esta técnica a uma melhor performance em termos de resolução, quantificação e detecção em um menor tempo de análise.

Referências DEGANI, A.L.G.; CASS, Q.B.; VIEIRA, P.C. (1997). Cromatografia: Um breve ensaio. Química  Nova na Escola, v.7, p.21-25. LOUGH, W.J.; WAINER, I.W. (1995).  High Perform ance L iq uid Chromatography, Fund amental   Prin cipies an d P ractice. Glasgow, Blackie Academic & Professional. p. 1-276.

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2. TEORIA A separação cromatográfica baseia-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido às diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária, e no alargamento de bandas, que é dependente de processos físicos e não da diferença de equilíbrio. A migração diferencial resulta da diferença de equilíbrio dos analitos entre as duas fases imiscíveis e é determinada pelos fatores que afetam este equilíbrio: composição da fase móvel, composição da fase estacionária e temperatura da separação. Mudanças em um ou mais destes  parâmetros levam a alterações na migração diferencial. Os processos físicos responsáveis pelo alargamento de bandas são: difusão de Eddy (ou de múltiplos caminhos), transferência de massa da fase móvel, transferência de massa da fase móvel estagnada, transferência de massa da fase estacionária e difusão longitudinal. Difusão de Eddy - A permeabilidade micro scopicamente diferente da fase estacionária causa o alargamento das bandas como conseqüência dos diferentes “caminhos” seguidos pela fase móvel (Figura 2.1a). Transfe rência de massa da fase móvel - Refere-se às diferenças de fluxo em um mesmo “caminho” seguido pela fase móvel, ou seja, entre as partículas, o fluxo central é maior do que os adjacentes a elas, levando a diferenças de transferência de massa e, conseqüentemente, ao alar gamento de bandas (Figura 2.1b). Transferência de massa da fase móvel estagnada - Com partículas porosas tem-se fase móvel estagnada. As moléculas do soluto que se difundem para essa fase móvel transferem-se mais lentamente do que aquelas que não se difundem, resultando no alargamento da band a (Figura 2.1c). Transferência de massa da fase estacionária - Resulta das diferenças de difusão das moléculas nos poros da fase estacionária (Figura 2.1 d). Difusão longitudinal - £ decorrente do fato de que as moléculas do soluto tendem a se difundir randomicamente em todas as direções. Este fenômeno geralmente não tem importância, sendo significativo apenas em baixos fluxos (Figura 2.1e). b

V ? < 9

1,0)

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Rs =1,18-

(3.12)

• Por comparação com curvas de resolução padrão (0,4 < Rs < 1,3) (Figura 3.2) 1/1

1/4

1/16

Rs= 0,6

R, -  0,8

R, = 1.0

R, = 1,25

 Figura 3.2 Curvas de resolução padrão.

• Por intermédio de cálculos baseados no vale entre duas bandas, os quais fornecem valores mais precisos para 0,8 < R < 1,5 (Figura 3.3 e Tabela 3.1)

 Figura 3 .3 Esquema para a medida da altura das bandas e do vale entre elas.

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Tabela 3.1 Estimativas do valor de Rs baseadas na altura do vale entre duas bandas (hv é expresso como a  porcentagem dele em relação ao menor pico). Rs

hv(%) 3 5 8 10 15 20 30 40 50 60 70 80

1/1 1,46 1,35 1,26 1,22 1,14 1,07 0,97 0,90 0,83 0,78 0,73 0,68

de acordo com a razão entre as bandas (hi/fe) 2/1 4/1 8/1  ®*. .1,50 1,42 1,48 1,52 1,40 1,33 1,45 1,29 1,41 1,35 1,21 1,27 1,33 1,21 1,15 1,27 1,06 1,12 1,19 0,98 1,06 1,12 0,92 1,00 1,07 1,02 0,87 0,95 0,82 0,90 0,97 0,78 0,86 0,93

16/1 1,47 1,39 1,33 1,24 1,18 1,12 1,08 1,03 0,99

Resolução de linha de base é alcançada com valores Rs ^ 1,5. Importante é a obtenção da resolução necessária com o menor tempo de análise. O Rs desejado deve corresponder, ao tipo de aplicação da separação, ou seja, análise qualitativa, quantitativa ou separações preparativas.

Referências GILBERT, M.T. (1987).  High Performance Liquid Chromatography.  Bristol, Whight. p.5-11. RILEY, C.M. (1995). Efficiency, retention, selectivity and resolution in chromatography. In: WAINER, I.W.; LOUGH, W.J. eds.  High Performance Liquid Chromatography, Fundamental   Principles and Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional, p. 15-35. SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J. (1979).  Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2.ed. New York, John Wiley and Sons. p. 15-82. SNYDER, L.R., KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1997).  Practical HPLC Method Development, 2.ed. New York, John Wiley and Sons, p.21-58.

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4. INSTRUMENTAÇÃO A instrumentação necessária para HPLC é extremamente sofisticada, muito diferente dos aparelhos utilizados pela Cromatografia Líquida Clássica. A Figura 4.1 mostra os componentes fundamentais de um equipamento para HPLC. Atualmente, existem equipamentos totalmente computadorizados. São divididos em módulos, que podem ser controlados individualmente ou por computador. Os softwares disponíveis são capazes de detectar problemas de funcionamento e também a necessidade de troca de alguma peça.

O desenvolvimento de colunas com fases estacionárias preparadas com partículas de menor diâmetro, as quais ofereciam maior resistência à passagem de fase móvel, tornou necessária a utilização de sistemas de bombeamento mais eficientes. As primeiras bombas utilizadas, conhecidas como bombas de baixa pressão, produziam fluxos pulsantes, sendo inadequadas para tal fim. Uma bomba de HPLC precisa ser capaz de produzir fluxo constante e reprodutível, sem pulsos, nas altas pressões necessárias, e ser resistente às fases móveis utilizadas. As bombas analíticas atuais operam em pressões de no máximo 500 bar (7000 psi), em fluxos de 0,01-10 mL/min, e são feitas de aço inoxidável (tubulações e demais partes), safira, cerâmica, quartzo ou titânio (pistões), rubi (assentos das check valves ) e teflon (selos) e outros polímeros.

4.1 Bombas Existem dois tipos de bombas para HPLC: as bombas que produzem fluxo variável a uma  pressão constante e as que produzem fluxo constante a uma pressão variável, sendo as últimas as utilizadas em HPLC.

Bombas de pressão constante Pneumáticas Bombas em que o líquido é deslocado mediante a pressão exercida por um gás inerte à alta  pressão.  Não são utilizadas em HPLC por fornecerem fluxos variáveis e com pulsação, devido ao seu mecanismo de ação, mas são muito utilizadas para o empacotamento de colunas, pelas altas pressões geradas.

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Bombas de fluxo constante Seringa Funciona de maneira análoga a uma seringa, sendo o êmbolo movido por um motor, que  possibilita o deslocamento do líquid o a um fluxo constante. Ás câmaras (seringas) possuem capacidade limitada de fase móvel, embora existam modelos  para até 500 mL.  Não são mais utilizadas por um a série de fatores, tais como: a necessidade de recarregamento constante da câmara de solvente ou troca deste e o tempo requerido para que ela chegue ao fluxo nominal. Atualmente, têm sido utilizadas em micro HPLC, pela ausência de pulsos.

Recíprocas Representam 85% das bombas utilizadas em HPLC. Também são chamadas de bombas de  pistão ou diafragma. O funcionamento destas bombas baseia-se em um pistão, movido por um motor elétrico, que empurra a fase móvel através do sistema cromatográfico (Figura 4.2). Safda de fase móvel

fase móvel

 Figura 4.2 Esquematização de uma bomba recíproca.

O grande problema destas bombas é a produção de fluxos pulsantes, decorrentes do movimento de “ida e volta” do pistão. Bombas com dois ou mais pistões e o uso de sistemas de amortecimento foram desenvolvidos  para contornar a pulsação. O uso de bombas com apenas um pistão, sendo este muito pequeno, já se tornou mais comum que o modelo anterior, de dois pistões, por ser mais simples e muito eficiente.

4.2 Injetores Inicialmente, a introdução da amostra era feita com microsseringas, de maneira análoga à Cromatografia Gasosa. Atualmente, são utilizados injetores de válvula e, embora existam diversos modelos no mercado, o princípio de operação de todos é o mesmo. A alça de amostragem (loop) de tais válvulas pode ser externa ou interna. As alças externas nada mais são que tubulações de volume preciso, as quais podem ser trocadas para que se permita a injeção de diferentes volumes de amostra. Estas válvulas possuem duas posições. Na posição LOAD, a amostra é injetada na alça de amostragem com uma seringa de ponta rombuda, sendo o excesso imediatamente descartado (Figura 4.3a, entradas 1-6-3-2).

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Seringa com amostra P  o s i ç ã o LOAD

Seringa com amostra

P   o s iç ã o in j e c t

Descarte Descarte Saída para a coluna

Saída para a coluna Entrada de fase móvel

4 Entrada de fase móvel

 Figura 4.3 Injetor de válvula, a) Posição LOAD e b) posição INJECT.

A posição INJECT abre a válvula para que a fase móvel empurre a amostra para a coluna (Figura 4.3b, entradas 4-3-6-5). A lavagem da alça de amostragem, antes da injeção da amostra, com aproximadamente dez vezes o volume desta, é recomendável, de modo a assegurar a remoção de possíveis resíduos. Estas válvulas, embora caras, possibilitam a injeção de amostras nas pressões necessárias a estes sistemas, com grande eficiência e precisão. São facilmente automatizáveis, por intermédio de motores elétricos ou pneumáticos, controlados por computador. Estes injetores automatizados são denominados auto-injetores e são capazes de injetar um grande número de amostras sem a presença do analista, além de operações como diluição, derivatização ou adição de reagentes.

4.3 Detectores A função destes equipamentos é a detecção dos compostos vindos do eluente da coluna. Algumas das características desejadas ao escolher um detector são: alta sensibilidade, alta seletividade, linearidade; baixo limite de detecção e estabilidade frente a mudanças na composição da fase móvel e na temperatura. Os detectores para HPLC são classificados em duas categorias: os que detectam propriedades existentes tanto na fase móvel como nos solutos (não-seletivos) e os que apenas detectam  prop riedades inerentes ao soluto (seletivos). A lim itação em relação à utilização de detectores universais reside no fato de que muitas vezes as propriedades do soluto e da fase móvel são similares.

UV-Visível E o detector mais utilizado em HPLC. Princípio: absorção de luz ultravioleta ou visível, por parte da amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. E um detector seletivo para moléculas que possuem cromóforos. Há três diferentes tipos de equipamentos, operando de acordo com o princípio descrito acima: os fotômetros de comprimento de onda fixo, os espectrofotômetros e os detectores por arranjo de fotodiodos. Os fotômetros de comprimento de onda fixo têm sua aplicação restrita a moléculas que absorvam no comprimento de onda em que eles trabalham. Os espectrofotômetros são mais versáteis, perm itindo a escolha do comprimento de onda mais adequado a cada análise. Estes equipamentos podem emitir apenas luz ultravioleta, de 190-600 nm, através de lâmpadas de deutério, como também na região do visível, de 350-900 nm, utilizando-se lâmpadas de tungsténio.

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Os detectores por arranjo de fotodiodos fornecem espectros no UV-Vis do eluente da coluna em determinados intervalos de tempo. São especialmente úteis para o desenvolvimento de métodos,  por possibilitarem um a “varredura” da região UV-Vis em uma única corrida cromatográfica, para medidas de pureza de pico e para a análise de amostras desconhecidas. Recomenda-se a utilização do comprimento de onda máximo do analito, desde que este seja superior a 220 nm, pois abaixo deste valor geralmente observa-se interferência da fase móvel. Embora alguns eluentes possibilitem a análise em comprimentos de onda mais baixos (por exemplo, acetonitrila/água - 200 nm), sugere-se a utilização do comprim ento de onda de um cromóforo mais fraco, em um comprimento de onda mais alto. A Tabela 4.1 mostra os comprimentos de onda mínimos para que não se observe interferência da fase móvel. Tabela 4.1 Comprimento de onda mínimo dos solventes mais utilizados.

Solvente Acetona Acetonitrila Benzeno Tetracloreto de carbono Clorofórmio Ciclohexano Éter etílico Dimetilsulfóxido Etanol Acetato de etila Hexano Metanol Pentano 1-Propanol Tetraidro furano Tolueno Agua

UV (nm) mínimo 330 200 280 265 245 210 220 270 210 255 200 210 200 210 215 285 190

Fluorescência Princípio: emissão de energia fluorescente por um soluto que foi excitado por radiação UV. Baseia-se no fato de que, quando uma molécula absorve luz e um elétron é promovido a um estado de maior energia, existe uma série de caminhos pelos quais esta energia pode ser dissipada.  Normalmente, esta energia é perdida po r sua tra nsferência às moléculas vizinhas. Ent reta nto , algumas moléculas podem perder apenas parte da energia indo ao mais baixo nível vibracional do estado excitado. A energia restante pode ser perdida pela emissão de um fóton, sendo este processo denominado de fluorescência. É um detector seletivo, para moléculas que fluorescem, ou seja, sistemas aromáticos policíclicos ou que contenham duplas ligações conjugadas múltiplas. Devido ao seu princípio de operação (emissão de luz), é muito mais sensível e seletivo que o UV (absorção). Os comprimentos de onda de absorção e emissão devem ser escolhidos pelo espectro de fluorescência do(s) soluto (s). Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna, para que o analito se torne fluorescente. A fluorescamina e o cloreto de dansila são reagentes muito utilizados para tal fim.

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índice de refração Princípio: mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna. E um detector não-seletivo, sensível a variações na temperatura, pressão, fluxo e composição da fase móvel. Apresenta baixa sensibilidade e é difícil de estabilizar, sendo inadequado para eluição gradiente. E muito utilizado em análises de amostras que não absorvem no UV e não fluorescem e em cromatografia preparativa.

Infravermelho Princípio: absorção de luz infravermelha (4000 cm_1-670 c m '1), por parte da amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. Esta radiação causa apenas movimentos vibracionais na molécula e estes são característicos dos grupos presentes na mesma. E um detector não-seletivo, mas apresenta uma série de limitações, como necessidade de eliminação do solvente, material de fabricação da cela e limite de detecção alto. Embora muitas das limitações venham sendo contornadas pela evaporação do solvente e pelo uso de transformadas de Fourier (FT-IR), este detector é muito pouco utilizado.

Polarímetro e dicroísmo circular Princípio: medem o efeito da luz plana ou circularmente polarizada sobre compostos oticamente ativos. São equipamentos seletivos, específicos para a detecção de compostos quirais. São úteis para a determinação da ordem de eluição de pares enantioméricos, sendo possível a determinação da configuração absoluta destes, por dicroísmo circular, por intermédio de regras empíricas ou não empíricas. Enquanto o polarímetro opera em qualquer comprimento de onda, por dicroísmo circular a amostra só é vista nos comprimentos de onda em que ela absorva energia.

Eletroquímicos Princípio: baseiam-se em interações eletroquímicas úteis à detecção do analito por HPLC. Medem a condutância do eluente (Detectores de Condutividade) ou a corrente associada à oxidação ou redução dos solutos (Amperométrico, Coulométrico). Embora todos sejam detectores eletroquímicos, esta designação é usualmente empregada para aqueles que medem a corrente no fluxo da célula (Amperométrico, Coulométrico). São detectores seletivos, para solutos iônicos, oxidáveis ou redutíveis, e apresentam alta sensibilidade e baixos limites de detecção.  Não se popularizaram com o esperado, devido à necessidade de manutenção perió dica dos eletrodos e células e à complexidade de operação, sendo, entretanto, muito utilizados em cromatografia de troca iônica (Detector de Condutividade) e em pesquisas biomédicas. As condições adequadas são determinadas experimentalmente observando-se a resposta dada  pelo detector para uma série de potenciais aplicados.

Espalhamento de luz (light-scattering) Princípio: envolve a nebulização do eluente vindo da coluna em um aerossol, seguido de vaporização do solvente para produzir pequenas partículas que serão detectadas em uma cela de espalhamento de luz. A intensidade da luz espalhada depende do tamanho das partículas formadas no tubo de aquecimento, que, por sua vez, depende do tamanho das gotícuias formadas durante o

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processo de nebulização. A interação da luz com a partícula dependerá de seu tamanho, forma e propriedades superficiais. É um detector não-seletivo, destrutivo. É muito utilizado para a detecção de ácidos graxos e para análises de pureza.

Espectrometria de massas A utilização deste detector vem se tornando comum, apesar do seu alto preço, da necessidade de um operador especializado e dos gastos com manutenção. É um detector universal, embora destrutivo, que apresenta alta sensibilidade, fornece a massa molecular dos solutos e permite a elucidação estrutural destes. Pode ser utilizado como um detector extremamente seletivo, fixando-se um íon molecular. A utilização de MS-MS permite a fragmentação dos íons já formados, fornecendo informações estruturais e aumentando a seletividade. Devido à incompatibilidade entre o fluxo líquido vindo da coluna e o alto vácuo existente em tais equipamentos, é necessária a utilização de uma interface. Várias são as interfaces disponíveis, bem como os métodos de ionização e os analisadores de massa. É o detector ideal para estudos de bioequivalência.

Ressonância magnética nuclear Combina o poder de separação da HPLC às informações estruturais obtidas pela RMN. Não é um detector de uso rotineiro, devido à dificuldade encontrada em sua hifenação à HPLC. O desenvolvimento de interfaces adequadas tem sido investigado, de modo a contornar os problemas em relação ao tempo necessário para a aquisição de dados e a supressão dos sinais do solvente.

Referências FIELDEN, PR. (1992). Recent Developments in LC Detector Technology. /. Chromatogr Sei, v.30, p.45-51. LINDSAY, S. (1989).  High Performance Liquid Chromatography. New York, John Wiley and Sons. p.9-50. LLOYD, D.K. (1995). Instrumentation: Detectors and Integrators. In: WAINER, I.W.; LOUGH, W. J. eds.  High Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional, p. 14-142. NOCTOR, T. (1995). Instrumentation: Pumps, Injectors and Column Design. In: WAINER, I.W.; LOUGH, W.J. eds.  High Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and   Practice. Glasgow, Blackie Academic & Professional, p.97-113. SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L.,  Practical HPLC Method Development,  2.ed. New York, John Wiley and Sons. p.59-99.

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5. SILICA GEL Sílica gel é a matéria-prima mais importante das fases estacionárias da cromatografia líquida. E um material extremamente versátil, podendo ter sua superfície alterada por derivação química,  pos sibilitand o, desta form a, a criação de diversos tipos de fases estacio nária s com diferentes mecanismos de separação. E um polímero composto por átomos tetraédricos de silício conectados entre si por átomos de oxigênio (ligações siloxano, Si-O-Si), tendo grupos silanóis (Si-OH) de diferentes tipos (Figura 5.1a, b, c) em sua superfície. a

b

c

OH

/

OH

SI i \

HO. \

Si

/

PH /

.............

' Si

OH ! ' Si

I  Figura 5 .1 Tipos de silanóis. a) Livre; b) geminai; e c) com ligações de hidrogênio.

E uma forma amorfa, altamente porosa e parcialmente hidratada de sílica, preparada usualmente pela hidrólise ácida do silicato de sódio, seguida por emulsificação em uma mistura álcool/água e subseqüente condensação, quando então é lavada e seca para uso. As condições de preparação da sílica gel (pH, catalisadores, temperatura) determinarão suas  propriedades. As características mais importantes, reguladoras de sua performance cromatográfica, são: tamanho médio de partícula, formato da partícula, área superficial específica, tamanho do poro,  pH , número de grupos silanóis e a presença de íons metálicos. A superfície da sílica é função de suas condições de preparação. Sílicas com grande número de silanóis livres (Figura 5.1a) são mais ácidas que as sílicas com grupos hidroxilados (Figura 5.1b e 5.1c). A Tabela 5.1 mostra uma escala da acidez relativa de diferentes sílicas comerciais. Deve-se ter em mente que sílicas ácidas são boas para compostos ácidos e ruins para básicos, e vice-versa. Tabela 5.1

Escala da acidez relativa de algumas sílicas comerciais.

Zorbax RX Vydac Rsil Nucleosil Polygosil Novapak m-Bondapak Supelcosil DB Spherisorb 2 LiChrosorb Chrompack Hypersil Perkin-Elmer Supelcosil Zorbax Micropak

Menos ácida

Mais ácida

24 EdUFSCar -  Apontamentos

Suas partículas podem ser esféricas (Figura 5/2a) ou irregulares (Figura 5.2b). O uso de  partículas esféricas, embora mais caras, tem sido preferido, por estas apresentarem maior durabilidade e eficiência.

 Figura 5.2 Partículas a) esféricas e b) irregulares.

A sílica gel é utilizada como fase estacionária em cromatografia no modo normal, não sendo recomendado seu uso com fases móveis aquosas. Devido à alta polaridade da água e sua forte afinidade com os grupos silanóis da superfície da sílica, mesmo a presença de pequenas quantidades de água altera o comportamento cromatográfico de tais colunas, causando a desativação da sílica. Colunas de sílica não podem ser usadas em pH > 8, pois ela começa a se tornar solúvel. As principais desvantagens do uso de colunas de sílica estão associadas à água. Além da impossibilidade de seu uso na fase móvel, sua presença em traços afeta profundamente a reprodutibilidade das análises. Outro problema é sua inadequação ao uso em eluição gradiente.

Referências SCOTT, R.P.W. (1993). Silica Gel and Bonded Phases: Their Production, Properties and Use in LC.  New York, John Wiley and Sons. p. 1-261. SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1988).  Practical HPLC Method Development.  New York, John Wiley and Sons. p.54-83.

Desenvolvimento Desenvolvimento de Métodos Métodos por HPLC: HPLC: Fundamentos, Estratégias e Validação

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6. FASES QUIMICAMENTE LIGADAS São as fases estacionárias mais utilizadas atualmente. A alta polaridade da sílica tornava difícil a separação de compostos polares. Para contornar este  proble  pro blema, ma, foram for am inicia ini cialm lmen ente te desenvolvidas desenv olvidas fases com co m líquid líq uidos, os, geralm ger alment entee óleos, mecani me canicam camente ente aderidos em um suporte inerte. Estas fases apresentavam baixa eficiência e reprodutilidade. As fases quimicamente ligadas foram desenvolvidas visando ã eliminação destas falhas,  buscand  busc ando-se o-se fases estacion est acionárias árias que pudessem pudess em reter ret er os soluto sol utoss por po r meio de outros out ros tipos tip os de interaçã inte raçãoo que não a polaridade. A proposta inicial era a produção de fases que mimetizassem as fases líquidas aderidas, sendo estáveis, eficientes e reprodutíveis. A superfície da sílica pode ser modificada de várias maneiras: 1. Por reação dos grupos silanóis com um álcool, produzindo um alcoxisilano. si — OH

+

R — OH

------- ►

— Si Si — O —

R

2. Por halogenação dos grupos silanóis e posterior reação com um nucleófilo, produzindo, por exemplo, um alquilaminosilano. —

Si —

OH

+

S 0 2CI 2

-------- ^

—

Si —

Cl

R — NH2

— Si — NH NH — R 3. Por reação com organosilanos, levando à formação de ligações siloxano.

 \ —

__ O

Si

0Et —

I

OH

+

R — Si — OEt OEt

 /

Si —

OH

|

OEt OE t

---/

Si

—

O

OH \

---------------- O 2)

\ —

\  1) Refluxo em tolueno

✓

gj CH3OH/H20 _

Si —

\ / O

v  R

/ 

Das formas descritas acima, a última é a mais utilizada. Enquanto a primeira leva a um produto  pouc  po ucoo estável, estáve l, facilm fac ilm ente en te hidrol hid rolisáv isável, el, a formaç for mação ão da ligação liga ção siloxano silox ano é m uito ui to conve con venie niente nte por po r  prod  pr oduz uzir ir uma um a fase conside con siderav ravelm elment entee estável. A variação variação da cadeia lateral lateral do organosilano possibilita a preparação de um a grande variedade de fases estacionárias a serem utilizadas nos diferentes modos de separação. Grupos octadecil, octil e propil, na cadeia lateral, são usados na preparação de fases estacionárias a serem utilizadas no modo reverso, enquanto grupos aminoalquil, fenil e cianopropil são utilizados na derivação de sílica, com aplicabilidade em modo reverso ou normal. Grupos dióis na cadeia lateral são úteis à preparação de fases para cromatografia em fase normal e exclusão. A utilização de grupos octadecil leva à formação da fase octadecilsilano, conhecida por ODS ou C18, sendo esta a fase mais utilizada em HPLC analítico. A presença deste grupo torna a fase apoiar, em relação à sílica não derivada.

26 EdUFSC EdUFSCar ar -  Ap  Apontam tamentos tos

A retenção nestas fases é dependente da quantidade de carbono presente, geralmente expressa em porcentagem. Desta porcentagem e da quantidade de silanóis residuais dependerá a qualidade da separação a que se aplica. Esta derivação, por razões estéricas, não atinge todos os grupos silanóis. Os grupos silanóis restantes, em alguns casos, ao interagir com o soluto, causam rabeamento dos picos. Este problema pode ser minimizado reagindo-se a sílica, após a derivação, com trimetilclorosilano, que, por ser menor, tem acesso a alguns destes grupos, formando trimetilsilanos, embora não seja possível a derivação de todos os grupos silanóis. Este processo é chamado capeamento (end capping . Em cromatografia por pareamento de íons, é recomendável a utilização deste tipo de fase.

Referências  High Per Perfo form rman ance ce Liquid Chro Chroma mato togr gra aphy. phy. New York, John Wiley and Sons. LINDSAY, S. (1989).  High p.9-50. Phases: s: Their Production, Production, Properties and Use Use in LC. SCOTT, R.P.W. (1993). Silica Gel and Bonded Phase New York, John Wiley and Sons. p. 1-261.  Introd oduc ucti tion on to to Mode Modern rn Liquid Ch Chrom romatogr togra aphy. phy. 2.ed. New SNYDER, L.R.; KIRKLAND, JJ. (1979).  Intr York, John Wiley and Sons, p.269-348.

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7. MODOS DE SEPARAÇÃO A classificação da cromatografia líquida de acordo com a fase estacionária levou a uma grande variedade de tipos. A primeira grande divisão feita foi: cromatografia de adsorção e cromatografia de partição, referindo-se às fases estacionárias sólida e líquida, respectivamente.  No caso das fases esta cionárias cionár ias serem líquidas, líquid as, estas podem pod em estar simplesme simpl esmente nte adsorvidas adsorvida s sobre so bre um suporte sólido ou imobilizadas sobre ele. No primeiro caso, a cromatografia é referida como cromatografia de partição. A cromatografia de pa rtição pe rdeu espaço para a cromatografia de fases fases quimicamente ligadas, devido à maior estabilidade conferida por estas quando comparadas com as fases líquidas adsorvidas. Estas fases com suportes modificados são consideradas à parte por dife rirem dos outros dois modos em seu mecanismo de separação. O grande desenvolvimento conseguido a partir das fases líquidas quimicamente ligadas fez com que estas sejam as fases majoritariamente usadas em HPLC analítico. A separação de uma mistura por HPLC se dá por uma ou mais interações entre o soluto, a fase estacionária e a fase móvel, as quais podem ser pontes de hidrogênio, interações eletrostáticas e hidrofóbicas ou forças de Van der Waals, entre outras. Os modos de separação podem ser classificados de acordo com a natureza destas interações. São eles: cromatografia em fase reversa, em fase normal, por pareamento de íons ou por troca iônica e por exclusão. A escolha do modo mais adequado à separação de um soluto é baseada em sua natureza, peso molecular, polaridade e caráter iônico.

7.1 Modos de Retenção Retenção A retenção em cromatografia líquida é dependente das interações entre soluto-fase móvel, soluto-fase estacionária e fase móvel-fase estacionária. Assim, a escolha do modo de separação depende da escolha da fase estacionária e da fase móvel para cada classe de soluto. Dois modelos de retenção em cromatografia líquida foram propostos. O primeiro por Scott e Kucera, interação-solvente, e o segundo por Snyder, competição-solvente. Os dois modelos são equivalentes, uma vez que ambos consideram que, em uma dada separação, a interação do soluto com a fase estacionária permanece constante e, portanto, a retenção é determinada pela composição da fase móvel.

7.2 Cromatogr Crom atografia afia no Modo Normal Normal A fase estacionária é mais polar que a fase móvel; o oposto ocorre em cromatografia no modo reverso. Os solventes usados são normalmente uma mistura de solventes orgânicos sem a adição de água. As As fases fases estacionárias são adsorventes orgânicos (sílica, (sílica, alumina) ou fases polares quimica mente ligadas (ciano, diol, fenil, amino). Os dois modelos de retenção, interação-solvente (Figura 7.1a) e competição-solvente (Figura 7.1b), têm sido usados com sucesso para descrever o efeito da fase móvel em cromatografia líquida no modo normal. Independentemente do modelo usado, a retenção em fase normal aumenta com o decréscimo da polaridade da fase móvel. Embora moléculas iônicas ou ionizáveis possam ser separadas por cromatografia no modo normal, a aplicação majoritária tem sido para moléculas neutras. As moléculas hidrofóbicas (menos polares) são eluídas primeiro, enquanto as moléculas hidrofílicas (mais polares) são mais retidas. O oposto acontece em cromatografia no modo reverso. Grandes mudanças em seletividade são conseguidas por alteração na fase móvel ou estacionária. É o modo de separação preferido, por isso, para separações de isômeros de posição ou estereoisômeros.

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Quando a dissolução da amostra apresenta problemas em solventes polares e dificulta a injeção no modo reverso de eluição, a separação no modo normal é recomendada. Devido à maior facilidade no manuseio da amostra em solventes orgânicos, para o isolamento, em separações preparativas é o modo mais aplicado. A força de diferentes misturas de solventes para eluição no modo normal pode ser medida experimentalmente e é representada por £°. A Tabela 7.1 lista alguns dos solventes mais usados em cromatografia, tendo sílica gel como fase estacionária. A força relativa para os solventes em outras fases estacionárias segue o mesmo caminho. Tabela 7.1 Força ( e °) e seletividade de alguns solventes.

Localização Solvente e° Não 0,00 Hexano, heptano Não 0,26 Clorofórmio Não 0,30 Diclorometano Sim 0,38 Éter etílico Sim 0,48 Medi í-butil éter Sim 0,48 Acetato de etila Sim Dioxano 0,51 Sim 0,52 Acetonitrila Sim THF 0,53 Sim 0,60 1 ou 2-propanol Sim 0,70 Metanol a) a basicidade é irrelevante para solventes não-localizados  b) apresenta diferente seletividade devido ao grupo doador de prótons

Basicidade a a a Sim Sim Não Sim Não Sim b b

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O solvente para eluição no modo normal é selecionado escolhendo-se um solvente fraco e misturando com um solvente forte para conseguir a força desejada. A presença de traços de água na fase móvel é provavelmente a causa mais comum da pobre reprodutibilidade na retenção quando se trabalha no modo normal, especialmente quando se usa sílica não modificada como fase estacionária. Este problema tem sido resolvido trabalhando-se com solventes anidros com um volume conhecido de água, metanol ou ácido acético para desativar os grupos silanóis mais reativos da fase estacionária. Além de melhorar a reprodutibilidade, melhora o formato do pico. O mesmo efeito pode ser conseguido adicionando-se trietilamina, essencial na separação de aminas em sílica gel. O uso de sílicas quimicamente modificadas em eluição no modo normal tem sido preferida, uma vez que elas oferecem sítios específicos de interação com o soluto, além de oferecer uma superfície mais homogênea quando comparada com a sílica gel, que tem uma variedade de grupos silanóis de diferentes polaridades. As fases quimicamente ligadas são úteis para cromatografia de compostos moderadamente polares, entretanto, estes solutos podem também ser eficientemente resolvidos no modo reverso de eluição, e a escolha entre eluição no modo normal ou reverso é, usualmente, mais dependente da matriz que do soluto.

7.3 Cromatografia no Modo Reverso Enquanto na cromatografia em fase normal a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, no modo reverso a fase móvel é mais polar que a fase estacionária. A cromatografia em fase reversa é a mais utilizada em HPLC, uma vez que permite a separação de uma grande variedade de solutos e o uso de fases móveis aquosas. A fase móvel mais comumente utilizada é uma mistura de acetonitrila/água, sendo a acetonitrila, quando necessário, substituída por metanol ou tetraidrofurano (THF). O uso de apenas esses três solventes deve-se à pequena quantidade de solventes orgânicos miscíveis com água. Já no modo normal, há uma maior variedade de solventes disponíveis. O princípio da retenção em fase reversa é a hidrofobia. A separação em fase reversa se deve  principalm ente a interações entre a parte não-polar do soluto e a fase estacionária, isto é, à repulsão desta parte do soluto pela fase móvel aquosa. A aplicação da teoria solvofóbicâ de Sinanoglu, por Horváth e colaboradores, à cromatografia de fase reversa é provavelmente o tratamento mais completo do assunto. A teoria engloba elementos dos modelos de solvente-interação e solvente-competição, levando em consideração todas as interações entre soluto-solvente-fase estacionária que levam à retenção. A retenção em fase reversa aumenta com o aumento de água na fase móvel. O logaritmo do fator de retenção, k, para um determinado soluto varia linearmente com o volume de solvente orgânico na fase móvel de acordo com a equação: logk = logkw- S O

(7.1)

kwé o fator de retenção quando o solvente é 100% aquoso. O coeficiente de inclinação, S, pode ser usado para indexar a força do solvente em fase reversa. A relação mostrada na equação abaixo  pode ser feita, sendo k o fator de retenção de um soluto de referência quando O é igual a 1. S = logkw-lo g k s

(7.2)

Estas relações são mantidas somente quando variações da ordem de 0,3 são feitas. Para maiores variações deve-se usar uma relação quadrática: log k = log kw+ A O + BO2

(7.3)

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A força do solvente em fase reversa depende não só do percentual de B, mas também do tipo de solvente orgânico usado. Devido à limitação de miscibilidade, o nomógrafo a seguir (Figura 7.2) tem sido amplamente usado para ajustar a força entre os três solventes mais comumente utilizados em fase reversa. E importante ressaltar que a força do solvente em fase reversa aumenta com o decréscimo da polaridade do solvente. Assim, água (solvente mais fraco) < metanol < acetonitrila < tetraidrofurano < diclorometano. Diclorometano, por não ser sóluvel com água, não é usado em fase reversa, mas por ser um solvente muito forte é, às vezes, usado para limpar as colunas de fase reversa que foram contaminadas por solutos fortemente retidos. Acetonitrila, além de poder ser usada em uma baixa faixa de absorção no ultravioleta, apresenta soluções aquosas com baixa viscosidade, o que é desejável; Assim, juntamente com metanol e THF, estes são os solventes mais usados para controlar a seletividade e separação no modo reverso de eluição. ApM/u n 0,---10,---201 301 40,---501 601 -------------701 ----801----901----100 AON/ttjU 1 MaHM/M n Me0 H/H20 T H  p / h

n

0|

,

20!

|

40|

,

601----- 1------801

-----

1

100 1

------- --------

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 l------1------1----- 1----- 1----- 1------ 1------ 1------ 1-------1-------1

 Figura 7.2 Nomógrafo para alteração de solventes no modo reverso.

Quando, por algum motivo, não se usa água na fase móvel, usando fases estacionárias apoiares, a cromatografia é dita cromatografia não-aquosa de fase reversa. Ela só é usada quando se trabalha com solutos muito hidrofóbicos, como lipídios e polímeros, e o solvente normalmente consiste em uma mistura de solventes polares, como acetonitrila ou metanol (solvente A), com um solvente mais fraco (B), como THF, clorofórmio, diclorometano, acetona, metil-í-butil éter. A retenção, neste caso, também é alterada pelo percentual de/ou o tipo B.

7.4 Cromatografia de Compostos lônicos Separações cromatográficas de compostos iônicos tendem a ser mais complicadas que a de moléculas neutras, mas, por outro lado, o espaçamento de bandas é usualmente conseguido com maior facilidade. A separação de compostos ionizáveis pode ser conseguida por supressão da ionização ou, então, por completa ionização e separação por pareamento de íons ou por troca iônica. Estas duas últimas opções também se aplicam a íons. Em cromatografia de fase reversa, a retenção diminui para compostos mais hidrofílicos, assim, quando um ácido ou uma base são ionizados, eles se tornam menos hidrofóbicos e, conseqüente mente, a retenção é reduzida. Assim, com o aumento de pH, a retenção para ácidos diminui e para  bases aumenta. Quando o pH é igual ao pKa de um composto, este se encontra parcialmente ionizado. Todas as mudanças de retenção ocorrem d entro de uma faixa de ± 1,5 unidade de pKa Fora desta faixa, o composto ou está ionizado ou está não ionizado, e a retenção não muda muito. A situação é mais complicada para compostos que contêm múltiplos grupos ácidos ou básicos. Para compostos anfóteros, a retenção pode ser ainda mais complexa. A molécula é mais hidrofílica quando a carga total de íons é zero, ou seja, maximamente ionizada (Figura 7.3).

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pH

 Figura 7.3 Relação teórica entre o fator de retenção (k) e o pH da fase móvel.

Devido à maior facilidade, a primeira alternativa de separação para moléculas ionizáveis é a supressão da ionização e eluição no modo reverso. A adição de um par iônico deve ser considerada quando a primeira alternativa falhar. E importante ressaltar que, dependendo da concentração do contra-íon, há uma contínua transição entre modo reverso e par iônico. A cromatografia de par iônico e de fase reversa tem várias propriedades em comum. As fases estacionárias e móveis são as mesmas, diferindo simplesmente na adição do contra-íon. A cromatografia de troca iônica é usualmente a última alternativa a ser examinada para compostos ionizáveis. A retenção em cromatografia de par iônico é dependente da concentração e hidrofobicidade do contra-íon. Dois mecanismos de separação têm sido propostos para a retenção em par iônico. O primeiro modelo assume que o par iônico é formado na fase móvel e a separação ocorre pela distribuição do par entre as fases estacionária e móvel. O segundo modelo assume que o contraíon primeiro adsorve na fase estacionária e o par iônico é feito por uma interação dinâmica do soluto com a monocamada do contra-íon adsorvido. Ambos os mecanismos de retenção propostos são  possíveis e a expressão matem ática para a relação fator de retenção k e concentração do co ntra-ío n é a mesma nos dois modelos propostos. Grupos residuais de silanóis na fase estacionária representam sítios adicionais de retenção. O grupo silanol é fracamente ácido, com pK na faixa de 4 a 6, e, portanto , interage com os solutos. Estas interações são particularmente importantes em par iônico, pois podem levar à retenção irreversível do soluto ou do contra-íon, e devem ser evitadas pelo uso de fases estacionárias capeadas.

7.5 Cromatografia de Troca Iônica E o método de escolha para análise de íons inorgânicos e, às vezes, é também o preferido para a análise de pequenos íons orgânicos. A retenção em troca iônica se dá por atração eletrostática entre os íons na fase móvel e os íons de carga oposta na fase estacionária. As fases estacionárias são referidas como resinas trocadoras de íons e são classificadas em aniônicas e catiônicas (fortes e fracas). As aniônicas fortes têm usualmente um íon amónio quaternário imobilizado, enquanto a catiônica forte tem um ácido sulfônico, sendo

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ionizados na faixa completa de pH. As resinas aniônicas fracas apresentam aminas imobilizadas, enquanto as catiônicas fracas têm ácidos carboxílicos. As resinas catiônicas são usadas para separação de catíons como bases protonadas, enquanto as aniônicas são usadas para a separação de ânions ou solutos acídos. As primeiras resinas foram feitas de materiais peliculares e atualmente são de sílica ou de  polímeros porosos. En quanto as de sílica têm maior resistência mecânica, as poliméricas têm resistência à degradação em pH alto. A retenção em troca iônica é determinada pelo pH da fase móvel. Força iônica, temperatura e a natureza dos íons do tampão são também um fator importante. Se a fase estacionária for denominada R" (catiônica) ou R (aniônica), podemos representar a retenção como mostrado abaixo: a) para troca catiônica e b) para aniônica, considerando potássio e cloro como contra-íons da fase móvel e o soluto um íon univalente. a) X++ R_K+X+R" + K+  b) X" + r +c r x_R++ cr Assim, a retenção pode ser diminuída pelo aumento da concentração do tampão, e este efeito é tanto maior quanto maior for a carga iônica do soluto. A força iônica da fase móvel é alterada  para conseguir diferenças em retenção e em seletividade. Como a retenção se dá por atração eletrostática, só moléculas ionizadas são retidas. Assim, para ácidos, um aumento de pH leva a maior ionização e, conseqüentemente, a maior retenção em troca aniônica, enquanto o decréscimo do pH favorece a retenção de bases em troca catiônica. A adição de solventes orgânicos pode ser explorada e, como em fase reversa, a retenção e a seletividade são alteradas.

7.6 Cromatografia de Exclusão E usada especialmente para: separação preliminar de amostras complexas visando isolar ou  purificar polímeros, na análise de polímeros para observar a presença de dímeros, trímeros etc. ou  para estimar o peso molecular de polímeros sintéticos ou naturais. A separação por exclusão requer que o tamanho do poro da fase estacionária seja adequadamente selecionado de acordo com o tamanho das moléculas que se pretende separar. As moléculas pequenas devem penetrar nos poros, enquanto as moléculas grandes devem ser excluídas de todos os poros da fase estacionária. As de tamanho intermediário serão só parcialmente excluídas. A resolução em cromatografia de exclusão é determinada pela retenção em decorrência do tamanho molecular e pela eficiência da coluna ou, em outras palavras, largura de banda. Assim, o critério importante em cromatografia de exclusão é a distribuição do tamanho dos poros. Qualquer interação com a fase estacionária levará à retenção e a um aumento de volume de retenção, assim a redução de interações com a fase estacionária deve ser conseguida quando se usa a cromatografia de exclusão para determinação de peso molecular. A escolha do solvente em cromatografia de exclusão requer somente que o soluto seja solúvel no mesmo e que este tenha baixa viscosidade, além de compatibilidade com o soluto e a fase estacionária. Em HPLC, as fases estacionárias que podem ser usadas em cromatografia de exclusão são sílica gel, sílica derivada ou polímeros rígidos. A determinação da massa molecular relativa é feita por intermédio de calibração com polímeros de massa molecular relativa conhecida. A escolha da fase estacionária apropriada é importante porque a faixa de massa molecular relativa que pode ser separada em uma única coluna é de somente 1,5 unidade de log e, assim, várias colunas de exclusão são usualmente necessárias.

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Referências GILBERT, M.T. (1987).  High Performance Liquid Chromatography. Bristol, Wright, p. 125-225. RILEY, C.M. (1995). Modes of Chromatography. In: WAINER, I.W.; LOUGH, W.J. eds.  High  Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principles and Practice.  Glasgow, Blackie Academic & Professional, p.36-78. SCOTT, R.P.W. (1993). Silica Gel and Bonded Phases: Their Production, Properties and Use in LC. New York, John Wiley and Sons. p. 1-261. SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1997).  Practical HPLC Method Development, 2.ed. New York, John Wiley and Sons, p.233-349. SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1988).  Practical HPLC Method Development. New York, John Wiley and Sons. p. 1-260.

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8. OTIMIZAÇÃO As Equações 3.10, 3.11 e 3.12 são usadas para medir o grau de separação, mas não relacionam os parâmetros cromatográficos com a resolução. A equação abaixo relaciona os parâmetros cromatográficos k, (X e N com a resolução. Uma separação pode ser otimizada sabendo-se como a resolução varia experimentalmente com estes  parâmetros.

R'*B)°-D ^Í7k



A otimização de uma separação é feita alterando-se os parâmetros cromatográficos, de acordo com a equação básica da resolução, mostrada abaixo, em busca da resolução necessária. O primeiro e mais fácil parâmetro a ser alterado é o fator de retenção, seguido pelo fator de separação. Em último caso, torna-se necessária a alteração no número de pratos teóricos. Como estes parâmetros não são interdependentes, pode-se variar os três parâmetros cromatográficos conjuntamente ou separadamente.

8.1 Resolução x Fator de Retenção (k) Considerando a equação básica da resolução (Equação 8.1), sabendo que migração diferencial requer retenção preferencial das moléculas do soluto pela fase estacionária, isto é, que o termo k/(l+ k) seja diferente de zero, e que a resolução depende da migração diferencial dos componentes da amostra para bandas adjacentes, é razoável dizer que Rs é proporcional a k/(l+k). Quando k é inicialmente pequeno (k < 1), a resolução aumenta rapidamente com o aumento de k, mas para valores de k > 5 ela é pouco afetada. Para valores altos de k, Rs pode ser aumentado  pelo seu decréscimo. O fator de retenção (k) é, normalmente, o primeiro parâmetro cromatográfico a ser ajustado. Ele não deve ser muito pequeno, pois isto significa que o composto pouco interage com a fase estacionária, nem muito grande, por causar alargamento das bandas. Um k muito pequeno significa que a fase móvel é muito forte e/ou o soluto tem pouca interação com a fase estacionária, enquanto um k muito grande significa que a fase móvel é muito fraca e/ou o soluto tem muita afinidade com a fase estacionária. E importante ressaltar que, em separações de misturas complexas pelo modo isocrático, raramente serão obtidos valores ideais de k para todos os componentes da amostra, sendo recomendável o uso de eluição gradiente. O fator de retenção em fase reversa pode ser aumentado pelo aumento do percentual de água e, conseqüentemente, diminuído pelo acréscimo do percentual do modificador orgânico. A troca de uma fase C18 por uma C8 também pode ser feita para alterar o fator de retenção. A Figura 8.1 ilustra a influência da porcentagem de água nos fatores de capacidade obtidos na análise de uma série de benzoatos.  No modo normal de eluição, o aumento do fator de retenção é conseguido pelo aumento do  percentual do solvente de maior polaridade. Fases estacionárias de diferentes polaridades também  podem ser usadas para conseguir a desejada retenção. Em cromatografia de compostos ionizáveis, o pH deve ser alterado para o ajuste de k. A concentração do contra-íon também influencia. Convém lembrar que sílicas de diferentes manufatores apresentam diferentes graus de acidez e, portanto, as fases preparadas a partir destas sílicas apresentarão retenção diferenciada.

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 Figura 8.1 Influência da porcentagem de água no fator de retenção.  Eluente Me0H/H 20 : a) 90:10; b) 80:20; c) 70:30; e d) 60:40.

8.2 Resolução x Fator de Separação (a) O fator de separação (a) é uma medida termodinâmica da separação. E definido piara dois picos como a relação entre os coeficientes de distribuição, relacionando a separação pico a pico. A seletividade da separação é normalmente ajustada após o ajuste de k, e deve manter o k conseguido. Para este fim, são utilizados nomógrafos. O nomógrafo da Figura 7.2, no Capítulo 7, é usado para fase reversa e o nomógrafo mostrado na Tabela 8.1, para fase normal. Tabela 8.1 Nomógrafo com misturas de solventes para fase normal.

Solvente n-hexano Tetracloreto de carbono Clorofórmio Tetraidrofurano Acetonitrila 2-propanol Metanol A£°* * Ae° =

e °B

£# 0,01 0,18 0,40 0,45 0,65 0,82 0,95

A

B

45

55

55

Composição, por volume, para que £*= 03 H D E F G C 35 55 25 80 85 75

J 70

75 65

45 25

45 20

0,22

I 65

0,27

0,29

0,37

0,44

0,64

35

0,64

15

30

0,77

0,94

  - e°A

Alterações em a são feitas levando-se em consideração as interações do sol uto com o solvente, resultantes de suas características, tanto no modo reverso quanto no modo normal. Snyder classificou os solventes de acordo com estas características e produziu os triângulos de seletividade

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dos solventes, comumente usados em cromatografia para o modo reverso e para o modo normal. De modo geral, maior seletividade será obtida variando-se de um ápice a outro do triângulo. As propriedades do solvente que afetam a seletividade em cromatografia líquida no modo reverso são: acidez, basicidade e polaridade. Baseado nestas propriedades, Snyder desenvolveu o triângulo da seletividade (Figura 8.2). Os vértices do triângulo representam as propriedades anteriorm ente citadas. O seu uso pressupõe que bastam somente três solventes para que se consiga a seletividade desejada, e isso justifica a utilização de apenas acetonitrila, metanol e tetraidrofurano como modificadores orgânicos em fase reversa.

 Figura 8 .2 Triângulo da seletividade - modo reverso.

Um exemplo da aplicação deste triângulo é mostrado na Figura 8.3:

(min.)

(min.)

 Figura 8 .3 Exemplo da seletividade obtida com a troca de solvente, a) 50% MeOH/HJO', b) 25% THF/Hfi. Compostos: 1. p -nitrofenol, 2. p-dinitrobenzeno, 3. nitrobenzeno e 4. benzoato de metila.

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A Figura 8.4 mostra um esquema, sugerido por Kirkland, para a otimização sistemática da separação. Este procedimento mantém constante a força do solvente, misturando-se estes três solventes em todas as proporções. O primeiro cromatograma é feito utilizando-se uma porcentagem de acetonitrila, tal que 0,5 < k < 20. Com o uso do nomógrafo (Figura 7.2), vão sendo feitas outras corridas cromatográficas até que se obtenha a seletividade desejada.

 Figura 8.4 Esquema para otimização da separação em fase reversa.

 No modo normal, grandes mudanças em seletividade são conseguidas alterando-se o solvente mais polar do eluente. Enquanto acidez, basicidade e polaridade governam a seletividade no modo reverso, a capacidade do solvente em se ligar com a fase estacionária (localização) é a responsável  pela seletividade no modo normal. A Tabela 7.1 apresenta a classificação dos solventes mais usuais para o modo normal em relação a sua localização e basicidade. A otimização de uma separação no modo normal pode ser feita da mesma forma que no modo reverso, utilizando-se o triângulo da Figura 8.5. A utilização de solventes que estejam nos vértices do triângulo levará a maiores alterações em seletividade. Solventes não-localizados

Solventes básicos

Solventes não-básicos

 Figura 8 .5 Triângulo para otimização da separação - modo normal.

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A seletividade pode também ser alterada quando os solutos são ionizáveis, por adição de um contra-íon, para formação de um par iônico. Variação de pH e temperatura são também fatores importantes para conseguir seletividade com estes solutos. A seletividade pode ainda ser alterada por troca da fase estacionária, levando-se em consideração as interações específicas, resultantes de cada tipo de fase: Clg, sílica, aminopropilsílica, ciano, fenil, diol etc. e/ou por interações com os grupos silanóis residuais nas fases quimicamente derivadas. E importante salientar que uma troca na fase estacionária também afetará a retenção e,  portanto, k deve ser reajustado.

8.3 Resolução x Número de Pratos Teóricos (N) O efeito do número de pratos teóricos (N) na resolução é dado pela sua raiz quadrada, de acordo com a equação básica da resolução. Para uma determinada condição de operação, N é aproximadamente constante para diferentes  bandas em um crom atog rama, sendo fácil pe rceb er que a largura das bandas au men tará  prop orcion almen te com o tempo de retenção, en qu an to as bandas, em separações por eluição gradiente, tendem a ter a mesma largura. Como mostra a fórmula:  N - j j

(3.6)

 N é diretam ente proporcio nal ao tamanho da coluna (L) e inversamente proporcional à altura dos pratos teóricos (H). Conseqüentemente, mantendo-se os outros parâmetros constantes, um aumento de L resulta em um aumento de N, e quanto menor for H, maior será o valor de N. Os fatores que favorecem a obtenção de baixos valores de H são: utilização de colunas de partículas  pequenas, fluxos de fase móvel baixos, fases móveis pouco viscosas, altas temperaturas de separação e separação de pequenas concentrações de amostra.

Referências LOUGH, W.J.; WAINER, I.W. (1995). Method Development and Quantitation. In: WAINER, I.W.; LOUGH, W.J. eds.  High Performance Liquid Chromatography, Fundamental Principies and  Practice.  Glasgow, Blackie Academic & Professional. p. 143-167. SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; Glajch, J.L. (1997). Practical HPLC M ethod Development,  2.ed.  New York, John Wiley and Sons. p. 233-349. SNYDER, L.R.; KIRKLAND, J.J.; GLAJCH, J.L. (1988). Practical HPLC Method Development.  New York, John Wiley and Sons. p.85-121. SNYDER, L.R.; CARR, P.W.; RUTAN, S.C. (1993). Solvatochromically based solvent-selectivity triangle.  J. Chromatogr. A,  656, p.537-547.

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9. ELUIÇÃO GRADIENTE A eluição gradiente é feita aumentando-se a força da fase móvel durante a separação cromatográfica. Faz-se necessária quando se trabalha com misturas complexas com solutos que  possuem uma grande variedade de fatores de capacidade, k. Gradientes binários são os mais usados e podem ser formados em uma variedade de modos como ilustrado pela Figura 9.1, mas usualmente o gradiente linear resolve a maioria dos problemas a que se aplica.

Figura 9.1 Exemplos de curvas para eluição gradiente.

A eluição isocrática é normalmente preferida à gradiente devido a uma série de desvantagens atribuídas ao uso de gradiente, tais como: 1. O equipamento para uso de gradiente é mais complexo. 2. Não pode ser usado com alguns detectores. 3. O desenvolvimento e a otimização são mais complexos, pois têm um número maior de variáveis a ser examinadas. 4. O tempo de análise é prejudicado pelo tempo que deve ser concedido para reequilíbrio da coluna e normalmente se têm problemas com a linha de base. 5. Não é possível aplicá-lo a todos os tipos de fases estacionárias e a combinação fase móvel/ fase estacionária deve ser cuidadosamente selecionada. 6. A transferência de método é complicada, pois as diferenças entre os equipamentos podem afetar muito a separação conseguida.

9.1 Gradiente versus   Isocrático Apesar dos problemas inerentes à eluição gradiente, muitas separações somente são possíveis com o uso de gradientes. Saber quando a eluição isocrática deve ser preterida em relação à eluição gradiente é muito importante no desenvolvimento de um método. A eluição gradiente é recomendada nas seguintes situações: 1. Amostras com uma ampla faixa de k (0,5 < k < 20). 2. Amostras contendo interferentes com valores de k altos que aumentem o tempo de análise. 3. Soluções diluídas em um solvente fraco. 4. Separações de macromoléculas: proteínas, peptídeos, polímeros sintéticos etc. A eluição gradiente pode também ser feita exclusivamente para determinar a força da fase móvel a ser usada em eluição isocrática. A Figura 9.2a mostra uma separação na qual solutos com altos fatores de capacidade são apresentados em um mesmo cromatograma com solutos com baixos fatores de capacidade. Qualquer aumento na força da fase móvel para alterar o k dos solutos com alto fator de retenção irá diminuir 

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ainda mais o k dos solutos com baixo fator de retenção e irá provavelmente prejudicar a resolução obtida para os compostos do início do cromatograma. Esta é uma situação típica em que a eluição gradiente (Figura 9.2b) é preferida à isocrática. Separações em que se têm interferentes com altos fatores de retenção podem levar à perda da seletividade devido ao acúmulo dos solutos retidos nas condições de eluição isocrática. Nestes casos, a eluição gradiente é preferida, mesmo sendo a separação dos compostos de interesse conseguida com sucesso em eluição isocrática.

0

10

20

Figura 9.2 Exemplo de uma separação a) isocrática e b) gradiente.

Amostras diluídas dissolvidas em um solvente fraco podem ser injetadas em grandes volumes se a eluição for feita em gradiente. A amostra se concentra no topo da coluna durante a injeção e volumes relativamente grandes de amostra são possíveis. Com eluição isocrática também é possível realizar este tipo de concentração, mas a mistura da amostra com a fase móvel usualmente leva a um alargamento de bandas maior do que em eluição gradiente. Moléculas com alto peso molecular são preferencialmente separadas por eluição gradiente. A separação deste tipo de amostras em eluição isocrática é altamente sensível a pequenas mudanças na fase móvel, tornando difícil o controle da retenção.

Princípios da separação gradiente Em eluição gradiente, a força da fase móvel aumenta durante a separação cromatográfica, o que significa dizer que o k decresce enquanto a banda migra na coluna.

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Assim como em eluição isocrática, o valor de k é importante para cada banda, mas em eluição gradiente o valor de k será aquele de quando a banda migrou metade do comprimento da coluna e é representado por k*. E importante ressaltar que, em eluição com gradiente linear, têm-se valores de k* aproximadamente constantes e, assim, as bandas em eluição gradiente são de mesma largura. Os valores de k* podem ser estimados a partir de condições experimentais. k.=_20t£_

Vm(A%B)

(9.1)

em que (tç) é tempo de gradiente; F (mL/min), fluxo; V , volume morto; e A%, a diferença entre o % final de 6 e o % inicial. A equação se aplica a moléculas com peso molecular entre 100 e 500 Da, ou seja, S « 4. O volume morto pode ser calculado com a seguinte equação; V„ = 0,5Ld?

(9.2)

O volume morto é às vezes calculado multiplicando-se o t„ pelo fluxo. Conhecer o volume morto da coluna é importante para poder calcular quanto de fase móvel deve ser usada para equilibrar a coluna.

Efeito da inclinação do gradiente A resolução aumenta inicialmente quando k* aumenta, mas assim como em eluição isocrática, quando se passa do valor ideal do fator de retenção, as bandas começam a alargar e aumenta-se o tempo de análise. O efeito da inclinação do gradiente pode ser melhor medido por Gt, ou seja, a inclinação corrigida do gradiente.  _ Vm(A%B) G.= c, r »G

(9.3)

A combinação das Equações 9.1 e 9.3 permite que a Equação 9.4 seja representada da seguinte forma: , • 20 k -Q -

(9-4>

Se o fluxo e as dimensões da coluna não mudarem, a inclinação do gradiente (%min) pode ser medida como: o/ • = —-— A%B % min

(9.5)

Esta medida é usada para descrever mudanças na separação decorrentes do aumento ou diminuição na inclinação do gradiente. Qualquer valor de k* pode ser selecionado de acordo com as condições experimentais,  porta nto, a Equação 9.4 pode ser representada pela Equação 9.6. k‘ ^ 2 0 ^ 2 -

%min

(9-6)

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E importante observar que um aumento na inclinação do gradiente é similar a um aumento no percentual do solvente B em eluição isocrática. Como em eluição isocrática, o primeiro parâmetro que deve ser otimizado em busca de uma melhor resolução é o fator de retenção, k*, e só então a seletividade, CX, e as condições de separação,  N, devem ser alteradas.

Efeito da faixa do gradiente A faixa do gradiente refere-se à diferença entre os percentuais final e inicial do solvente forte. Gradientes exploratórios são usualmente feitos com amplas faixas de gradiente, 5% a 100% de B (B sendo, por definição, o solvente forte).  Não é recomendado que se use 100% de solvente aquoso em colunas de fase reversa, uma vez que isto deteriora mais rapidamente a performance da coluna. De qualquer modo, a faixa do gradiente deve ser ajustada para não se perder tempo no início do gradiente, por começar com um gradiente muito fraco. O tempo de terminar o gradiente deve também ser considerado para que ele não termine antes da eluição dos solutos mais retidos.

O desenvolvimento de uma separação gradiente Otimização sistemática pode ser feita como na separação isocrática. Vale a pena seguir estes  passos: 1. Selecione as condições iniciais. O primeiro gradiente deve usualmente ser amplo (5-100% de B). Otimize para obter k* > 2, com um Gs não muito alto. Para moléculas pequenas, tG= 20 min é recomendado. 2. Ajuste a faixa do gradiente para minimizar o tempo de análise. Elimine os tempos vazios no início e fim do gradiente. Troque tGem proporção a A% de B. 3. Otimize a separação. Aumente N aumentando tGou tamanho da coluna e/ou diminuindo o tamanho da partícula e o fluxo. Mantenha k* constante ou tG (F/Vm) enquanto faz estas mudanças. 4. Avalie o melhor modo de reequilibrar a coluna.

Considerações importantes Uma mudança na inclinação do gradiente ou no formato, que venha alterar k*, pode ser feita  para otimizar diferentes partes do cromatograma. O co ntrole de espaçamento de bandas, por alteração de k ou k*, é um parâmetro muito mais poderoso em eluição gradiente do que em eluição isocrática. O espaçamento de bandas pode ser alterado por mudança no tipo de solvente, fase estacionária, pH e temperatura. Em par iônico, a concentração do contra-íon é também fator de importância, assim como em eluição isocrática. Em eluição gradiente é importante lembrar que k* depende das dimensões da coluna e do fluxo e, conseqüentemente, se o tamanho da coluna ou o fluxo for alterado, a separação pode ser afetada de duas importantes maneiras: 1. O número de pratos será alterado de forma previsível e 2. k* e talvez o fator de separação a serão afetados. Assim, uma vez que k* tenha sido ajustado para alterar as condições da coluna, este deve ser mantido constante para não se perder em (Xo que se ganhará em N. k* é mantido constante mantendo-se Gt   constante. Isto pode ser convenientemente feito variando o tempo do gradiente tGquando se muda o fluxo (F) ou o tamanho da coluna (V^. Se a coluna for aumentada por um fator qualquer, este mesmo fator deve ser usado para o aumento do tQ. Quando se diminui o fluxo por um dado fator, este fator também deve ser usado para aumentar o tempo do gradiente.

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Em fase reversa, o tGótimo pode ser calculado da seguinte forma:

Pode-se manter k* constante variando tGna mesma proporção em que A% de B é alterado. Otimizar o formato do gradiente normalmente requer um grande número de experimentos e o ganho quase sempre é marginal, quando comparado ao gradiente linear na inclinação correta. Para reequilibrar a coluna necessita-se normalmente usar em torno de 5 a 10 vezes o volume da coluna de fase móvel.

Cuidados experimentais A escolha da fase estacionária é um item importan te em eluição gradiente. Recomenda-se que eluição no modo reverso seja preferida. O uso de sílica não é recomendado para gradientes com eluição no modo normal e, sim, o uso de fases quimicamente ligadas. O uso de uma fase estacionária muito polar pode causar alterações nas bandas po r retenção do solvente polar pela fase estacionária. A Figura 9.3 exemplifica este problema. Em cromatografia de par iônico, não se recomenda o uso de gradientes, pois os aditivos usados na fase móvel prejudicam o equilíbrio da coluna e, conseqüentemente, a performance do gradiente. Gradiente

inicial

isopropanol

Figura 9.3 Efeito do uso de sílica como fase estacionária com gradiente hexano/isopropanol.

Um gradiente em branco deve sempre ser feito para observar a compatibilidade dos solventes com a detecção escolhida e para observar a presença de artefatos e também de material retido no topo da coluna por uso de fases móveis mais fracas que as do gradiente escolhido. Diferenças em absorbância causam alterações na linha de base, especialmente quando THF é usado como fase móvel em água devido a sua absorbância abaixo de 250 nm. Quando as diferenças são grandes pode-se adicionar íons inorgânicos como nitrito, nitrato ou azida ou ainda íons orgânicos como formiato ou acetato, que são altamente hidrofílicos e servem para minimizar a diferença de absorbância entre os solventes A e B. Diferentes equipamentos apresentam diferentes volumes entre o misturador e a coluna. Estes volumes, conhecidos como VD, precisam ser considerados pois afetam os tempos de retenção na transferência de métodos, de acordo com suas diferenças. Aumentar VDé equivalente a ter um tempo adicional isocrático no início do gradiente. E impor tante considerar que auto-injetores, de um m odo geral, aumentam o VD, assim como este volume é, também, alterado pelas mudanças da alça de amostragem no injetor manual. Assim sendo, é importante que o VDseja especificado no proce dimento do método para que o mesmo possa ser bem transferido. Pode-se também atrasar a injeção

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da amostra por um tempo (tD) igual a F X VD, fazendo assim que a amostra e o gradiente cheguem ao topo da coluna em tempos iguais, o que equivale a dizer que o efeito de VDfoi eliminado na separação.

Usando gradiente para determinar se a eluição deve ser isocrática ou gradiente Um gradiente inicial de ampla faixa pode servir para determinar: 1. Se o uso de eluição isocrática é preferível à eluição gradiente. 2. Sendo a eluição isocrática preferível, estimar qual o percentual de B que dará o k desejável  para os compostos-problema. 3. Quando a eluição gradiente é a escolhida, estimar o percentual de B para começar e terminar o gradiente. Snyder e Dolan desenvolveram uma metodologia para o uso de gradientes de ampla faixa para servir de guia no desenvolvimento de métodos por HPLC. Para isso, algumas condições básicas são recomendadas: o uso de colunas Cg ou Clg de 15 X 0,46 cm, gradiente de 5% a 100% de acetonitrila com um tempo de gradiente de 60 min e fluxo de 2 mL.min-1. Deve ser observado se a amostra é muito hidrofílica (muitas bandas perto de t_) ou se é muito hidrofóbica, ou seja, se eluição em fase reversa não é aconselhável. Com o cromatograma (Figura 9.4) inicial determina-se a diferença de tempos de retenção pela diferença t - tM. A razão Atr/tGdetermina se o uso de eluição isocrática é possível. Como sabemos que 0,5 < k < 20, ou seja, At/tGdeve ser menor que 0,40 ou, em outras palavras, a faixa de retenção deve ser menor que 40% do tempo do gradiente. -----------   At, ------------- ►

4 

 Figura 9.4 Cromatograma do gradiente inicial para desenvolvimento de método.

A Tabela 9.1 lista os valores máximos permitidos de tapara eluição isocrática baseados nos valores de t . No exemplo dado por Snyder e Dolan, o tn é de 9,5 min enquanto o t^ é de 24,5 min, assim o Atr/tc é de 0,25. Usando a Tabela 9.1 observa-se que o tn máximo permitido para 0,5 < k < 20 é de 32 min, enquanto para 1 < k < lOéde 22. Considerando a faixa de 0,5 < k < 20, pode-se desenvolver a separação em eluição isocrática.

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Tabela 9.1 Avaliação dos tempos de retenção obtidos no gradiente inicial.

t„(min) 40 Incerteza Condições: coluna 15 x a) retenção muito baixa b) retenção muito alta

Valores aceitáveis de tn (min) para 0,5 < k < 20 1 6), para que se investigue a possível presença de compostos que interfiram ou se sobreponham ao sinal do composto de interesse. Avaliações adicionais incluem análises de produtos de degradação, excipientes (fármacos) e impurezas. Em estudos farmacológicos, examina-se a possível co-eluição com metabólitos. O uso de detectores de arranjo de fotodiodos ou espectrômetros de massa tem sido especialmente útil para este fim.

13.2 Linearidade E a capacidade de um método analítico gerar resultados proporcionais à concentração do composto em questão, dentro de uma faixa analítica especificada (Intervalo Dinâmico), sendo  possível relacionar a resposta do detector à concentração. E avaliada por intermédio de medidas da amostra em diversas concentrações, ou seja, da construção de curvas de calibração. Sua determinação é normalmente realizada por intermédio da análise de amostras extraídas da matriz apropriada em, no mínimo, cinco concentrações diferentes. Recomenda-se a análise das amostras em replicata (n > 2). Após o processamento dos dados obtidos, a linearidade é avaliada por intermédio do cálculo de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados, e verifica-se o quanto esta reta descreve os pontos, por intermédio de seu coeficiente de correlação (r). Valores de r > 0,99 são aceitáveis na maioria dos métodos analíticos. Métodos que apresentem baixa linearidade devem ser tratados como não-lineares e devem-se usar outros modelos mais complexos para a calibração.

13.3 Exatidão E a relação entre o valor encontrado pelo método e o valor aceito como verdadeiro ou de referência, sendo calculada pela seguinte fórmula: ExatidãO *=

C 0 n C e n ^r a ^ ^ 0

0b tkla

concentraçãoteórica

x 1 qqo/ o

(1 3

v

1)

'

A exatidão pode ser determinada de várias formas: • Análise de uma amostra certificada e sua comparação com o valor medido. • Comparação com resultados obtidos por intermédio da utilização de um método já existente e de exatidão conhecida. • Baseando-se na preparação de uma solução de concentração conhecida, por intermédio da adição de uma determinada quantidade da amostra à matriz. A exatidão é normalmente determinada por intermédio de, no mínimo, análises em quintu plicata de três diferentes concentrações, usualmente uma em baixa concentração (11096-120% do

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 ponto mais diluído da curva de calibração), outra em média (40%-60% do ponto mais concentrado) e uma em alta (75%-95% do ponto mais concentrado).

13.4 Precisão E a habilidade do método de reproduzir o mesmo resultado, embora não necessariamente o correto, sempre que o procedimento é executado. A avaliação da precisão é subdividida em três etapas, que são diferenciadas pelo intervalo de tempo em que são feitas as análises e pelas condições de realização destas, embora esta classificação não seja universal. 1.  Repetibilidade -  mede o grau de variação de uma série de replicatas de injeção em um curto intervalo de tempo, ou seja, em uma mesma seqüência, nas condições originais do método. O procedimento anterior é às vezes considerado como uma avaliação da repetibilidade do equipamento. E um procedimento desnecessário quando se trabalha com auto-injetor, a menos que se queira certificar o equipamento. Quando envolve a preparação de múltiplas amostras de mesma concentração é denominada  precisão intradia,  por intermédio da qual se avalia o método em questão. 2. Precisão intermediária -   expressa o efeito das variações dentro do laboratório devido a análises em diferentes dias não consecutivos. Pode incluir medidas feitas em diferentes equipamentos, por diferentes analistas. Envolve a preparação de múltiplas amostras. 3.  Reprodu tibilidad e   - mede a precisão do método quando executado em diferentes la  boratórios. A precisão de um método é por intermédio do desvio-padrão e/ou do coeficiente de variação das medidas obtidas. Em muitos métodos, é comum a avaliação da precisão por intermédio de medidas de precisão intra e interdias, para múltiplas amostras. É normalmente determinada por intermédio de, no mínimo, análises em quintuplicata de três diferentes concentrações, uma em baixa, uma em média e uma em alta concentração. Em geral, para um método de análise de amostras em fluidos biológicos ser considerado preciso, os coeficientes de variação não devem ultrapassar 15%, com exceção do limite de quantificação, quando ele pode chegar a 20%.

13.5 Recuperação Avalia a eficiência do método de tratamento da amostra. Sua percentagem é calculada pela seguinte fórmula: Re cup era ção (%) =

va Orot)tid° - x 100 %

(13.2)

v a l° radicionado

A porcentagem de recuperação é determinada por intermédio da comparação de análises em quintuplicata de três concentrações, de amostras extraídas com soluções-padrão não extraídas, as quais representam 100% de recuperação. Embora porcentagens de recuperação próximas a 100% sejam desejadas, admitem-se valores menores, por exemplo de 50%-60%, desde que a recuperação seja precisa e exata.

13.6 Sensibilidade É a habilidade de um método distinguir, com determinado nível de confiança, duas concentrações próximas. A avaliação da sensibilidade compreende a determinação dos limites de quantificação e detecção.

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Limite de quantificação É definido como a menor concentração do composto que pode ser medida com uma precisão especificada, dentro do critério de aceitação do método.

Limite de detecção É definido como a menor concentração do composto que produz uma resposta maior do que três vezes o ruído.

13.7 Robustez É a habilidade do método em fornecer resultados inalterados quando sujeito a pequenas mudanças como diferentes analistas, variações no pH e/ou concentração da fase móvel, alterações na performance da coluna, temperatura do ambiente etc. Pode ser determinado por intermédio da análise individual ou simultânea dos parâmetros mais sujeitos à variação.

13.8 Considerações Finais Ao avaliar a precisão e a recuperação, geram-se os controles de qualidade do método, em baixa, média e alta concentração. Esses controles devem possuir concentração dentro da faixa linear utilizada, embora diferentes das concentrações utilizadas para a construção da curva de calibração. Esses controles de qualidade são avaliados quando da utilização do método, para que se verifique sua validade. Os parâmetros de validação aqui definidos são os mais utilizados, embora outros parâmetros possam ser empregados em função do problema em questão. Os critérios de aceitação destes parâmetros, entretanto, variam amplamente de acordo com a aplicação à qual o método se refere. Estes critérios devem ser coerentes com a aplicação pretendida, explicitados numérica e matematicamente. É ideal que cada laboratório elabore seu próprio protocolo de validação, levando em consideração sua área de atuação. Métodos com a devida seleção dos parâmetros de validação e que possuam critérios de aceitação pertinentes têm qualidade agregada a eles e transmitem confiabilidade aos clientes.

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