Curs Met.microbiologice Cepa

1.ASPECTE LEGISLATIVE PRIVIND CALITATEA MICROBIOLOGICĂ A ALIMENTELOR

Fiecare ţară are o legislaţie proprie ce constă în legi şi reglementări care prevăd compoziţia alimentelor, standarde şi specificaţii microbiologice pe care trebuie să le îndeplinească alimentele pentru a avea calitatea corespunzătoare şi pentru a prezenta siguranţa în consum. Diferitele reglementări pot conţine standarde şi specificaţii microbiologice pentru alimentele

uşor

perisabile,

măsuri

igienico-sanitare

ce

trebuiesc luate la preparare, păstrare, distribuţie, proceduri sau parametri de procesare (cum ar fi tratamentele termice), calificarea şi educaţia celor care manipulează alimentele, inspectarea şi controlul respectării acestora. Standardele microbiologice sau specificaţiile pentru unele produse alimentare trebuie să includă o prezentare a microorganismelor sau a toxinelor pe care acestea le-ar putea elabora, o descriere a metodologiei de recoltare a probelor destinate analizei microbiologice, limitele microbiologice, respectiv concentraţia de microorganisme sau toxine per unitatea de produs, metode analitice precise ce trebuiesc 1

folosite la recoltare, omogenizare, efectuarea diluţiilor, mediile de cultură, temperatură şi timp de cultivare, interpretarea rezultatelor. O

deosebită

importanţă

prezintă

standardizarea

metodelor de analiză aplicabile, atât pentru controlul microbiologic al produsului alimentar sau cel care se efectuează în diferite etape tehnologice de fabricare, păstrare, comercializare etc. Începând

din

1962

este

formată

Comisia

Internaţională pentru Specificaţii Microbiologice pentru Alimente (ICMSF) în scopul stabilirii unui acord internaţional de metodologii de laborator pentru a fi folosite la analiza produselor alimentare şi care să includă descrierea metodelor celor mai adecvate, ţinând cont ca acestea pot influenţa enorm asupra preciziei rezultatelor. De asemenea Organizaţia Internaţională de Standarde (ISO) publică procedurile standard recomandate

pentru analiza

microbiologică

a

alimentelor. Orientările actuale se îndreaptă spre standardizarea internaţională a metodelor de analiză microbiologică şi, în acest sens, a fost constituit, la Bruxelles, Comitetul European

2

pentru Standardizare (CEN/T C) (U p m a n şi B o n a p a r t e, 1999). 1.1. Definirea şi aplicarea criteriilor microbiologice Un criteriu microbiologic reprezintă o valoare (de exemplu număr de organisme per gram de aliment)) sau un domeniu ce poate fi stabilit prin efectuarea unor proceduri definite şi care poate fi folosit pentru ca produsul alimentar să fie acceptat. . Criteriile microbiologice pot fi incluse în cadrul standardelor, specificaţiilor sau a recomandărilor.  Standardul microbiologic este obligatoriu, este inclus într-o lege sau reglementare de control a modului în care alimentul este obţinut, procesat, depozitat, sau importat.  Specificaţiile microbiologice pot fi incluse într-un cod practic care atenţionează pe cei ce lucrează în domeniu despre obligativitatea respectării condiţiilor igienice sanitare în scopul creşterii inocuităţii alimentului.  Îndrumarul microbiologic, care este folosit atunci când pentru produsul fabricat sunt absente standarde sau specificaţii.

3

Comisia

Internaţională

pentru

Specificaţii

Microbiologice pentru Alimente recomandă un plan de evaluare a alimentelor stabilit pe baze statistice ce poate fi un ghid pentru utilizarea la nivel internaţional, care să faciliteze consumul fără risc, exportul/importul acestora. Un astfel de plan include numărul de probe (n) care trebuie să fie examinate, numărul de microorganisme (s) prezente într-un gram sau cm3 de aliment, valorile (m şi M) unde m este valoarea la care nu se poate produce nici un prejudiciu şi M este valoarea peste care lotul (respectiv cantitatea de alimente, produse, manipulate în condiţii uniforme) este respins, iar indicele C numărul maxim de probe de analiză cu valori între m şi M pentru ca lotul să fie acceptat (T o f a n şi colab., 2002).

4

În cazul unor produse alimentare, decizia de acceptare este în funcţie de prezenţa sau absenţa unui grup de microorganisme. În cadrul acestui plan cu doi parametri, se iau în consideraţie numărul de probe de analiză şi dintre acestea numărul de probe pozitive. De exemplu, dacă n = 10 şi c = 0 înseamnă că, dacă o probă este pozitivă din cele 10 examinate lotul va fi respins, iar dacă de exemplu c = 2 înseamnă că dacă una sau două probe sunt pozitive, lotul este acceptat dacă numărul este mai mare de 2 lotul este respins. ICMSF recomandă şi planuri în care se iau în consideraţie 3 parametri şi anume n - numărul de probe ce trebuiesc analizate dintr-un lot, c1 - numărul de probe acceptate de a avea un număr de microorganisme în exces faţă de valoarea m (minimă, lipsită de risc) şi c2 = 0 ceea ce înseamnă că nici o probă din cele n analizate nu se admite de a avea un număr în exces faţă de valoarea M (maximă); prin depăşire, valoarea ar reprezenta o populaţie microbiană neacceptată fie că aceasta poate include microorganisme de risc pentru sănătatea consumatorilor sau este cauza alterării senzoriale detectabile.

5

În Tabelul 1.1 se dau valori pentru principalii parametri recomandaţi pentru evaluarea microbiologică a unor produse alimentare. Tabelul 1.1Limite microbiologice pentru diferite produse alimentare propuse de ICMSF (D a n, 1999) Produse Carne, carne pui Conserve de carne Peşte şi produse din peşte (proaspăt, congelat) Carne sau preparate cu gelatină, concentrate proteice din peşte Lapte praf

Brânză Îngheţată ingrediente

cu

Microorganisme testate Bacterii aerobe mezofile Salmonella Bacterii aerobe mezofile Bacterii aerobe mezofile Coliformi fecali Staphylococcus aureus Salmonella

n

c

m

M

5

3 1

106 0

107 -

5

2

103

104

5 5 5 5

3 3 3 0

106 4 103 0

Clostridium perfringens Staphylococcus aureus Salmonella

5 5 10

1 1 0

102 102 0

107 4x 102 5x 103 104 104 -

Bacterii aerobe mezofile Coliformi Staphylococcus aureus Salmonella Staphylococcus aureus Bacterii aerobe mezofile Coliformi

5 5 5 10

2 2 1 0

5 x 104 2 10 0

5 5 5 5

1 2 2 1

103 2,5 x 104 102

6

5x 105 102 102 104 2,5 x 105 103

Cereale şi produse derivate Legume proaspete şi congelate Legume deshidratate Fructe deshidratate Ouă şi produse din ouă (pasteurizate, congelate, praf) Supe instant

Produse instant pentru copii Condimente

Staphylococcus aureus Salmonella Bacterii aerobe mezofile Escherichia coli Mucegaiuri Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli

10

Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Salmonella Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Salmonella Bacterii aerobe mezofile Coliformi Bacterii aerobe mezofile Mucegaiuri Escherichia coli

0

102

5 5 5

3 2 2

10 0 104 2 102

5 5 5

2 2 2

10 2 2

103 102 10

5 5 10 …6 5 5 10

2 2 0

5 x 104 10 0

106 103 -

1 2 0

104 10 0

106 103 -

5 5

2 1

103 2

104 20

5 5 5

2 2 2

104 102 10

106 104 103

-

106 102 104

Uniformizarea criteriilor de evaluarea a calităţii microbiologice a alimentelor a fost posibilă prin elaborarea standardelor internaţionale şi a specificaţiilor microbiologice, general valabile, care include o prezentare generală a 7

microorganismelor şi a toxinelor pe care acestea le-ar putea elabora, descrierea strategiilor de eşantionare, a metodelor analitice

(pentru

recoltarea

probelor,

omogenizarea

şi

realizarea diluţiilor), a mediilor de cultură şi a condiţiilor de termostatare,

precum

şi

indicaţii

privind

interpretarea

rezultatelor. Aprecierea corectă a parametrilor de calitate, în acord cu cerinţele prevăzute de aceste standarde, se va putea realiza numai respectând condiţiile analitice impuse de aceste normative, ceea ce constituie garanţia realizării corecte a analizelor şi interpretării cât mai fidele a rezultatelor.

2. INDICATORI AI CALITĂŢII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR Pentru a reflecta calitatea microbiologică a produselor alimentare în timpul fabricaţiei, fie în timpul conservării, cât şi pentru a asigura protecţia faţă de microorganismele patogene transmisibile prin alimente se pot folosi microorganisme indicatori care trebuie să îndeplinească următoarele condiţii: să fie prezente în toate alimentele a căror calitate este cercetată în vederea aprecierii; 8

creşterea acestora şi numărul lor trebuie să prezinte o corelaţie directă, negativă, cu calitatea produsului; să fie uşor şi rapid detectate, ceea ce presupune ca acestea să se diferenţieze de alte microorganisme prezente în produsul analizat, iar creşterea să nu fie influenţată de alte microorganisme din microbiota alimentului. Termenul de organism indicator poate fi aplicat oricărui grup taxonomic, fiziologic sau ecologic, a cărei prezenţă sau absenţă furnizează o evidenţă indirectă privind o caracteristică a modului de prelucrare, a istoriei probei (sursă, durată). Acest termen a fost introdus ca un marker, care să indice eventuala prezenţă a unor patogeni similari ecologic cu organismul indicator (index). Organismele indicator sunt grupe (sau specii) bacteriene a căror prezenţă în alimente peste o anumită.limită numerică se consideră a indica expunerea la astfel de condiţii, care ar putea introduce organisme de hazard şi/sau înmulţirea de specii patogene sau toxicogene. Aceşti indicatori au valoare în asigurarea atât a calităţii cât şi a siguranţei în consum a alimentului (fără risc de îmbolnăvire). Interpretarea din punct de vedere igienic a prezenţei în produse alimentare a unui grup sau altul de microorganisme 9

este condiţionată de prezenţa microorganismelor indicatori ai contaminării cu materii fecale, prezenţa şi caracteristica unor microorganisme-indicatori

tehnologici,

rolul

microorganismelor în formarea calităţii, influenţa enzimelor eliberate de aceste microorganisme asupra compoziţiei şi valorii biologice a produsului, posibilitatea lor de a produce toxiinfecţii în anumite condiţi date. 2.1. Indicatori ai calităţii biologice Pot fi utilizaţi indicatori ai calităţii, microorganisme de alterare, care în urma creşterii în aliment duc la alterarea alimentului. Prezenţa lor poate fi detectată prin determinarea prin metode chimice a produselor lor de metabolism. Astfel se pot determina diamine (cadaverina, putresceina, histamina) în produse de carne. În sucul de portocale diacetilul produce modificări de aromă chiar la concentraţii de 0,8 ppm şi denotă iniţierea alterării. În conserve de somon, prezenţa alcoolului în concentraţii mai mari de 75 ppm presupune alterarea (J a y, 1992) . Toţi reprezentanţii genului Proteus au provenienţă fecală şi deşi se află în număr mai mic decât coliformii, pot avea valoare de indicator pentru evaluarea eficienţei proceselor tehnologice fermentative (în brânză numărul creşte în primele 10

48 ore de maturare şi are loc reducerea şi moartea acestora după aproximativ 25 zile), pentru aprecierea duratei şi a condiţiilor de păstrare a alimentelor (în carne tocată, păstrată la rece, se menţine gradul iniţial de contaminare, iar la temperatura camerei numărul lor a crescut la 10 5.g-1 după 24 ore şi la valori 108. g-1 după 72 ore). 2.2. Indicatori ai siguranţei alimentelor Se folosesc pentru a confirma siguranţa în consum şi gradul

de

inocuitate

microbiană

a

alimentului.

Microorganismele utilizate în acest scop trebuie să fie uşor de detectat, să se distingă de microorganisme însoţitoare, să prezinte o asociaţie constantă cu microorganismele patogene a căror prezenţă ar trebui să o poată indica, să persiste mai mult decât patogenii şi drept condiţie suplimentară să fie absenţi, sau în număr minim, în alimente în care sunt absente microorganisme patogene. Au rol de microorganisme indicatori igienico-sanitari următoarele grupe: Bacteriile coliforme Conform definiţiei ISO sunt bacterii (bacili) Gram negative nesporulate, mobile, oxidazo-negative, aerobe sau 11

facultativ anaerobe, ce pot să se înmulţească în prezenţa sărurilor biliare (care inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor agenţi cu proprietăţi echivalente), capabile de a fermenta lactoza cu producere de acizi şi gaze, în 48 ore la temperaturi de 35 - 370C. Se decelează prin producerea de acid şi gaz în bulion-lactoză şi se identifică prin aspectul caracteristic al coloniilor formate pe medii selective. Pe baza acestei definiţii, grupul coliformilor cuprinde speciile: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloaceae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii,

Citrobacter diversum, Citrobacter

amalonatica. Din punct de vedere fiziologic şi în funcţie de sursă, coliformii pot fi divizaţi în: - Coliformi fecali (CF) caracterizaţi prin creştere rapidă în 16 ore în mediu de bulion nutritiv, la 410C şi mai puţin activ la 44°C. Nu se înmulţesc la 44°C şi sunt coliformi mezofili. - Coliformi nonfecali (CNF) de origine acvatică sau telurică, se înmulţesc la 4°C în 2 - 4 zile, sunt incapabili să crească la 410C sau la 44°C şi sunt coliformi psihrotrofi. Astfel pentru testul de comportare la temperaturi ridicate, temperatura 12

adecvată. pentru separarea coliformilor şi stabilirea sursei de contaminare a alimentelor este de 410C ( 44° - 44,5°C) deoarece la această temperatură timpul de generaţie este cel mai scăzut pentru coliformii fecali, în timp ce la coliformii nonfecali creşterea este absentă. - Escherichia coli este un indicator al poluării fecale (se elimină pe aceeaşi cale ca şi bacteriile patogene de origine intestinală, prezente la indivizii bolnavi) . Supravieţueşte un timp mai îndelungat în alimente cu pH acid, comparativ cu bacteriile patogene sau moare odată cu acestea în alte medii. Escherichia coli are un domeniu al temperaturilor de creştere între -2°... 50°C, la valori de pH 4,4... 9 se poate înmulţi în ape, alimente. Enterococii fecali Sunt coci sferici sau ovalari, Gram-pozitivi, imobili, aţezaţi izolaţi, în perechi sau lanţuri scurte care se dezvoltă la temperatura de 44±0,50C, în prezenţa a 40 % săruri biliare şi a azidei de sodiu. Includ speciile Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium sunt de origine fecală dar se găsesc şi în microbiota naturală a vegetalelor, încât prezenţa lor în alimente nu are semnificaţie sanitară. Spre deosebire de coliformi nu se pot înmulţi în apă şi se caracterizează printr-o rezistenţă 13

superioară la temperaturi negative (deoarece numărul de enterococi nu se schimbă în timpul congelării) şi prin supravieţuirea în alimente congelate. Printr-un

studiu

comparativ,

prin

păstrarea

la

temperatura de -20°C timp de 1 - 3 luni, au supravieţuit 81% din enterococi şi 75% din coliformi, iar după păstrarea timp de un an, gradul de supravieţuire a fost de 89% pentru enterococi şi numai de 60% pentru coliformi. În timp ce Escherichia coli moare în alimente congelate după 2 luni, enterococii pot supravieţui peste doi ani. Datorită acestei proprietăţi, metoda de determinare a enterococilor fecali este recomandată în controlul microbiologic al produselor congelate şi a produselor gata preparate, păstrate în stare congelată. Pentru cultivare se foloseşte bulion nutritiv glucozat cu 0,75% sare şi adaos de azidă de sodiu 20 mg% care inhibă bacteriile

însoţitoare

şi

nu

influenţează

dezvoltarea

enterococilor. În unele norme se admit în alimente, până la 10 4 – 105 celule.g-1 şi un titru mai mic de 0,1 g. Bifidobacteriile Pot fi folosite ca indicatori ai unei contaminări fecale recente, deoarece frecvenţa lor în materii fecale umane este de 10 - 100 ori mai mare decât a coliformilor şi enterococilor. Se 14

cunosc 25 specii; se prezintă sub formă de bastonaşe imobile, au domeniul de temperaturi de creştere între: 25°...45°C şi de pH. 5...8. Bifidobacteriile sunt exclusiv de origine fecală (mai pot fi întâlnite şi la porci fiind absente la vite, păsări) şi supravieţuiesc în aliment un timp mai scurt decât coliformii.

3. METODE MODERNE DE ÎNSĂMÂNŢARE A MICROORGANISMELOR 3.1. Sistemul automat de însămânţare în spirală Metoda de însămânţare în spirală este un sistem automat de obţinere a numărului de celule viabile . Prin folosirea unui tub capilar cu vârf, se poate distribui proba lichidă în forma spiralată (spirala Arhimede) pe suprafaţa unei plăci cu agar preturnat (selectiv sau neselectiv) având concentraţia gradientului descrescătoare dinspre centru înspre exteriorul plăcii aflate în rotaţie ( Fig. 3.1 ). Se cunoaşte volumul lichidului depozitat în orice segment al plăcii cu agar . După ce lichidul care conţine microorganisme este distribuit, placa cu agar se incubează peste noapte la o temperatură adecvată dezvoltării coloniilor. Coloniile apărute de-alungul traiectoriei spiralei pot fi numărate fie, manual, fie electronic. 15

Timpul pentru insămînţarea probei este de ordinul a câtorva secunde , comparativ cu metoda convenţională, în care este de ordinul minutelor. De asemenea, utilizând un numărător cu laser, analistul poate obţine o numărătoare corectă în câteva secunde, comparativ cu procedeul de numărare cu ochiul liber a coloniilor care este greoi şi durează câteva minute . Acest sisitem a fost folosit considerabil timp de peste 20 de ani având rezultate microbiologice satisfăcătoare pentru carne, carne de pasăre, fructe de mare, legume, fructe, produse lactate, condimente. Noile versiuni ale acestei metode automate de însămânţare în spirală sunt cunoscute sub numele de Autoplater şi Whitly. Cu aceste instrumente automate , analistul nu trebuie decît să introducă proba lichidă şi instrumentul o va procesa complet şi automat incluzînd stilizarea unităţii pentru o nouă probă.

16

Fig.3. 1 Moduri de distribuire a probei pentru maximă eficienţă

3.1.1. Sistemul avansat de însămânţare în spirală Autoplate Sistemul automat de însămânţare în spirală a fost special conceput pentru a creşte productivitatea şi pentru a îmbunătăţii rezultatele în cadrul laboratorului de microbiologie.

17

Fig. 3.2 Sistemul avansat de însămânţare în spirală Autoplate

1- Staţie inovativă de spălare pentru dezinfectare totală 2- Windows CE cu LCD şi ecran digital care garantează uşurinţa în utilizare 3- Tub unic capilar conceput pentru a permite umplerea din tuburile de testare, cupele sau eprubetele pentru centrifugare. 4- Fascicul luminos de precizie care să asigure o operaţiune adecvată. 5- Compartiment pentru spălarea şi aruncarea recipientelor.

18

3.1.2. Avantajele sistemului Acest aparat prezintă avantajele:  se elimină nevoia de diluţii repetate,  se economiseşte timp,  se economisesc bani,  are loc automatizarea laboratorului Aparatul Autoplate® - este un microprocesor reglabil de însămânţare în spirală, folosit pentru numărarea bacteriilor, testarea sensibilităţii antimicrobiene, precum şi pentru testele de mutagenitate. Această tehnologie unică are drept rezultat reducerea a ¾ din materialele disponibile şi economisirea semnificativă de timp şi muncă. Autoplate posedă o mai mare sensibilitate de detectare şi repetabilitate a probei decat în cazul tehnicilor

convenţionale de însămînţare. Autoplate

-creşte productivitatea laboratorului, cu o performanţă intr-un domeniu de 2 cfu / ml pâna la 1.000.000 cfu / ml, făra a fi necesară nici o diluţie, reducând utilizarea elementelor consumabile de 3 / 4.

19

Fig.3. 3 Prezentarea metodei de însămînţate în spirală în comparaţie cu metoda de însămânţare standard

3.1.3. Aplicaţii În industria alimentară, metoda de însămânţare în spirală este utilizată într-un domeniu foarte larg de aplicaţii, incluzând testări pentru bacterii patogene şi de alterare. În industria farmaceutică, aceasta metodă de însămânţare în spirală este utilizată pentru testele de conservare(PET), şi testele de sensibilitate efectuate de SGE (Spiral Gradient Endpoint). Agricultura şi industriile de mediu utilizează această metodă

pentru testarea aplicării biopesticidelor,

prevenirea îngheţurilor şi pentru studierea frunzelor. 20

3.1.4. Mod de lucru Tubul capilar cu vârf sub formă de siringă dispersează proba in interiorul unei cutii cu agar aflate în mişcare de rotaţie. Tubul capilar cu vârf se deplasează din apropierea centrului spre exterior în timp ce placa se roteşte, depozitând o cantitate de probă din ce în ce mai mică pe măsură ce înaintează spre exterior. Acest mod special de însămânţare elimină o serie considerabilă de diluţii prin funcţionarea continuă, reducând numărul microorganismelor plasate de-a lungul traiectoriei spiralei. 3.2. Sistemul Petrifilm Sistemul Petrifilm este un sistem ingenios cu nutrienţi rehidratabili corespunzători, integraţi într-o serie de filme în unitatea respectivă. Unitatea este puţin mai mare decât mărimea unei cărţi de credit. Pentru obţinerea unui număr de celule viabile, stratul superior protector este ridicat şi se introduce 1 ml din proba lichidă în centrul unitaţii, după care capacul este aşezat la loc. Pentru a se crea o formă rotundă se aşează pe capac un şablon din plastic. După incubarea la temperatură şi timp adecvat, mediul rehidratat va suporta dezvoltarea microorganismelor. Coloniile sunt numărate direct 21

în unitate. Acest sistem rezistă

peste 1 an la temperaturi

scăzute. Ceea ce atrage la acest sistem este uşurinţa de utilizare, mărimea mică, durata mare de păstrare. Nu este necesară prepararea agarului, şi rezultatele sunt uşor de citit. Recent, companiile au introdus un numărator Petrifilm, la care analistul trebuie doar să aşeze Petrifilmul cu coloniile în unitate, şi acesta va număra automat şi va înregistra numărul de celule viabile pe calculator. Formatul manual al sistemului Petrifilm a fost utilizat pentru multe sisteme alimentare, şi câştigă acordul internaţional, fiind o metodă alternativă pentru numărarea celulelor viabile. Rondelele

Petrifilm conţin nutrienţi modificaţi bilă

roşu violet, agenţi gelifianţi solubili în apă rece şi indicatorul tetrazoliumn care facilitează deosebirea coloniilor. Filmul de la partea superioară captează gazul produs în urma fermentării lactozei de către coliformi. Timpul şi temperatura de incubare, precum şi interpretarea cutiilor Petri variază în funcţie de metodă. ISO defineşte coliformii în funcţie de abilitatea de a creşte în medii selective utilizând metode specifice. Metoda ISO 4832, enumerând coliformii proveniţi din metoda numărării de colonii, îi defineşte 22

în funcţie de mărimea

coloniei şi producerea de acid pe mediu de VRB cu agar lactoză (VRBL). Pe rondelele

CC Petrifilm , această

producere de acid de către coliformi este indicată de colonii roşii cu sau fără gaze (vezi cercul 1). Metoda ISO 4831 enumerând coliformii după metoda celui mai probabil număr (MPN), defineşte coliformii după abilitatea lor de a creşte şi de a produce gaz din lactoză într-un mediu selectiv de bulion de carne. Pe aceste rondele Petrifilm CC coliformii sunt indicaţi sub forma unor colonii roşii asociate cu gaz (vezi cercul 2). AOAC INTERNATIONAL şi FDA (Administratia alimentelor şi medicamentelor) /BAM definesc coliformii ca fiind bastonaşe gram negative care produc acid şi gaz din lactoză în timpul fermentării metabolice. Coloniile de coliformi care cresc pe rondelele Petrifilm CC , produc acid determinând indicatorul de pH să închidă culoarea gelului. Gazul captat în jurul coloniilor indică coliformii. Utilizarea rondelei Petrifilm este indicată pentru detectarea coliformilor totali şi a celor termorezistenţi ( fecali). AOAC®, AFNOR şi NMKL au validat utilizarea rondelelor Petri CC în anumite condiţii.

23

Fig.3.4.Numărul coloniilor producătoare de gaze: 75 Numărul coloniilor producătoare de non - gaze: 24 Numărul total: 99

Fig.3.5. Citirea pentru determinarea numărului total de coliformi prin folosirea Metodelor Oficiale AOAC® (986.33, 989.10 şi 991.14) • Enumerarea coliformilor în lapte, lapte crud, şi în produsele lactate. 24

Fig.3.6.Numărul coloniilor ce produc gaz: 4 Când un număr mare de organisme non-coliforme precum Pseudomonas sunt prezente în plăcile de Petrifilm CC, gelul ar putea să capete o culoare galbenă.

Fig.3.7.Numărul de colonii ce produc gaz: 2 Particulele alimentare au o formă neregulată şi nu sunt asociate cu bule de gaz.

25

Fig.3.8.Forme de bule asociate cu o colonie considerate coliforme. 3.2.1.Mod de utilizare Plăcile Petrifilm pentru determinarea numărului de colonii aerobe sunt un sistem bazat pe un mediu cultural gata preparat, ce conţine nutrienţi, un agent gelifiant, solubil in apă rece, şi un indicator colorat ce determină vizibilitatea coloniilor. Plăcile Petrifilm AC sunt concepute cu o grilă de fond care să uşureze numărarea coloniilor. 26

Plăcile Petrifilm AC pot fi folosite în locul unui mediu cu nutrienţi standard, precum plăcile de bulion-agar Luria, plăcile cu nutrient agar sau plăcile cu

soia-agar in multe

aplicaţii: 

Plăcile Petrifilm pot fi hidratate cu o cultură bacteriană, sau

cu

diluţia

unei

culturi,

pentru

numărarea

organismelor viabile prezente. Vezi metoda A. 

Plăcile de Petrifilm pot fi hidratate pentru început cu apă sau soluţie tampon, iar apoi inoculate

prin

înţepare, striaţie, sau atingerea de suprafeţe.Vezi metoda B. 

Se pot adăuga antibiotice la fluidul de hidratare pentru selecţionarea organismelor rezistente, folosind Metoda A sau B.



Celulele pot fi izolate din coloniile care s-au dezvoltat pe plăcile Petrifilm şi pot fi folosite pentru o posibilă inoculare în culturi sau pentru a forma pete.



Rezultatele experimentale din plăcile de Petrifilm pot fi salvate pentru referinţe viitoare prin scanarea plăcilor pe un calculator.

27

Plăcile Petrifilm au fost realizate pentru folosirea lor în industria alimentară şi a băuturilor. Acestea au fost certificate pentru analize oficiale în multe ţări. Metoda A. Inocularea cu probă lichidă Dacă ambalajul plăcii Petrifilm a fost depozitat într-un sistem de refrigerare ambalajul trebuie lăsat să ajungă la temperatura camerei înainte de desfacere. Acest pas previne condensarea care se poate forma în interiorul pachetului.Se aşează placa Petrifilm pe un nivel al suprafaţei, cu partea grilată în jos. Se desface partea superioară a filmului . Cu o pipeta perpendiculară pe placa de Petrifilm, se pipetează 1 mL de probă în centrul filmului inferior. Dacă este necesar, probele pot fi diluate cu apă distilată, cu mediu de cultură lichid, sau cu soluţie tamponată cu Ph între 6,6 şi 7,2. Dacă mediului i se adaugă antibiotice, acestea se vor adauga in lichidul de inoculare la concentraţia de lucru. Se dă drumul părţii superioare a filmului. Se lasă sa cadă liber pe suprafaţa filmului inferior. Nu se rulează partea superioră în jos. Se ţine distribuitorul cu partea circulară în jos. Se aşează distribuitorul pe partea superioară a filmului, peste lichidul de inoculare. 28

Se apasă cu grijă pe distribuitor, pentru a împrăştia substanţa de inoculare

pe o suprafaţă circulară. Distribuitorul nu se

mişcă sau nu se roteşte Se ridică distribuitorul şi se aşteaptă cel puţin un minut pentru ca gelul să se solidifice Se incubează plăcile cu partea transparentă în sus, în grămezi de pană la 20 de plăci. Temperatura şi timpul de incubare vor varia în funcţie de metoda şi echipamentul disponibil.Coloniile din plăcile

Petrifilm pot fi numărate cu ajutorul unui

instrument de numărare standard a coloniilor, sau cu alte surse de lumină .Coloniile bacteriene din plăcile Petrifilm sunt de culoare roşie din cauza culorii indicatorului din mediu. Coloniile pot fi izolate pentru studii amănunţite sau pentru a inocularea diferitelor culturi. Se desface suprafaţa superioară a filmului şi se selecteaza colonia din gel. Mediul se va lipi de partea superioara a filmului. Se dezinfectează înainte de a se aruncare. Plăcile Petrifilm pot fi dezinfectate prin tratare în autoclavă sau prin înmuierea în 20% clor timp de o 1 oră. Apoi pot fi aruncate la gunoi. Se deschid plăcile în clor pentru a expune organismele din plăci în soluţie. De asemenea, ele pot fi duse la un spital sau date unei

29

şcoli sanitare pentru aruncarea cu alte materiale de pericol biologic. Nu se folosesc diluanţi ce conţin citraţi sau tiosulfat de sodiu pentru că ei pot inhiba creşterea coloniilor din plăcile Petrifilm. Aceste substanţe nu se găsesc în mediile microbiologice obişnuite precum bulionul de carne Luria sau bulionul cu nutrienţi. Metoda B. Hidratarea şi folosirea ca mediu solid. Se hidratează si se desface fiecare placă Petrifilm înainte de a trece la următoarea placă. Se urmează paşii de la 1 la 6 din metoda A, folosind un mL de apă distilată, mediu de cultură lichid, sau soluţi tampon cu pH între 6,6 si 7,2 pentru hidratarea plăcii Petrifilm. Dacă se adaugă antibiotice mediului, acestea se adaugă în lichidul de hidratare la concentraţia de lucru. Se ridică distribuitorul şi se aşteaptă cel puţin 2 ore ca gelul să se solidifice. Plăcile aerobe hidratate pot fi depozitate intr-un sistem de refrigerare într-o pungă sigilată până la 14 zile înainte de utilizare. Pentru a inocula mediul, se ridică filmul superior.

30

Suprafaţa circulară cu gel se va lipi de suprafaţa superioară a filmului . Petrifilmul hidratat poate fi folosit în mai multe feluri: 

Trasarea dungilor pentru coloniile izolate cu o ansă

sterilă, cu o presiune mai mică decât în cazul aplicării pe o placă standard. Se înfăşoară placa Petrifilm pe o suprafaţă plană cu poziţia pentru striaţie la vedere. 

Se atinge suprafaţa circulară cu gel de o suprafaţă de

interes. Aceasta poate fi partea superioară a mesei de lucru, degetul, clanţa uşii sau alte obiecte fine. 

Se iau probe de aer prin redeschiderea filmului superior

care prezintă suprafaţa circulară cu gel cu scopul expunerii ei şi prin înfăşurarea plăcii deschise Petrifilm pe o suprafaţă verticală. După ce timpul de expunere a trecut, se dă la o parte placa Petrifilm, se inchide şi se incubează. Coloniile bacteriene de pe plăcile de Petrifilm sunt roşii din cauza culorii indicatorului din mediu. Culoarea roşie ajută la distingerea lor de particulele de praf sau de alţi contaminanţi din mediu. Coloniile pot fi izolate pentru studii viitore sau pentru a inocula diferite culturi. (vezi pasul 10 de la metoda A)

31

Nu se folosesc diluanţi care conţin citraţi sau tiosulfat de sodiu pentru că ei pot inhiba creşterea coloniilor din plăcile de Petrifilm. Aceste substanţe nu se găsesc în mediul microbiologic obişnuit precum bulionul de carne Luria sau bulionul cu nutrienţi. 3.3.. Metoda membranelor filtrante 3.3.1. Introducere Cerinţele mereu în creştere ale consumatorilor privind calitatea şi perioada de valabilitate a alimentelor şi băuturilor trebuie permanent satisfăcute de către producători. Aceştia nu mai pot limita controlul de asigurare a calităţii la produsul finit precum băutura îmbuteliată sau un aliment preambalat, ci trebuie să efectueze atât verificări ale materiilor prime cât şi teste de calitate în procesul de producţie, pentru a evita pierderi ulterioare şi reclamaţii din partea clienţilor. Controlul microbiologic şi aseptic joacă un rol important într-o astfel de asigurare a calităţii. În

industria

băuturilor

răcoritoare,

calitatea

microbiologică şi igienică, inclusiv stabilitatea biologică a produselor, sunt criterii importante de performanţă.

32

Motivul: câţiva microbi sunt deseori suficienţi pentru a altera cantităţi mari de băutură. Cu toate că progresul tehnologic rapid a redus riscul de contaminare cu microbi alteranţi,

problema

microorganismelor

a

căpătat

noi

dimensiuni ca rezultat al cantităţilor uriaşe posibile de produs în prezent.Controlul calităţii la îmbuteliere/umplere, în ceea ce priveşte stabilitatea chimică şi mai ales cea biologică, trebuie adaptate la această evoluţie prin metode moderne de control. Cerinţele principale impuse unei metode practice de control microbiologic sunt de a permite o determinare cantitativă şi reproductibilă a unor urme de contaminare şi de a putea fi aplicată eficient şi economic în condiţii de rutina. Aceste cerinţe

sunt

indeplinite

optim

de

metoda

filtrelor

membrană.Principiul acestei metode este bazat pe concentrarea microorganismelor din probe relativ mari, pe suprafaţa unor filtre membrană, urmată de o incubare a acestora pe medii de cultură sub formă de cartonaşe sau agar. 3.3.2. Descriere Într-un suport este montat un filtru membrană cu o porozitate adecvată iar proba este filtrată prin acesta. În acest proces microorganismele din proba de controlat este reţinută 33

pe suprafaţa filtrului prin efectul de separare al membranei acestuia. La metoda Monitor MF - monitorul este gata de utilizare, datorită unui filtru membrană asamblat în interior la un mediu nutritiv. Inhibitori ai creşterii pot fi îndepărtaţi prin clătirea suportului cu soluţie sterilă de NaCl după filtrare. Filtrul membrană este plasat apoi pe un mediu de cultură şi incubat. La metoda monitor se adaugă mediu nutritiv pe la partea de sus şi se crează un scurt vid (