Curado del plásmido en bacterias, Ácido ascorbico, Movilizacion

Curado del plásmido en bacterias 1. RESUMEN Los plásmidos son fragmentos extracromosómicos de ADN de doble cadena circular que tiene la capacidad de replicarse independientemente del cromosoma del huésped, sin embargo, conviven con ella [1]. Hasta la fecha, muchas especies de bacterias aisladas de diversos hábitats se sabe que contienen ADN plásmido [2,3]. Algunos plásmidos son estables y pueden mantenerse a través de sucesivas generaciones al ser partioned a cada célula hija durante la división celular. Esto permite que cada celular para recibir al menos una copia del plásmido. En los últimos años, los plásmidos se han observado en una amplia variedad de bacterias. En parte, esto se debe al desarrollo de nuevos procedimientos que permiten la detección, aislamiento y caracterización molecular del ADN del plásmido. Cuando se trabaja con algunas bacterias que contienen el plásmido, a menudo es deseable para obtener un derivado del plásmido curado. Esto permite una comparación directa entre las células que contienen el plásmido y el plásmido curado. Algunos plásmidos someterse a la segregación y eliminación espontánea. Sin embargo, la mayoría son extremadamente estables, y requieren el uso de agentes de curado u otros procedimientos (temperatura de crecimiento elevado, el hambre timina), para aumentar la frecuencia de la segregación espontánea [4]. La utilidad de los agentes de curado es impredecible en muchas cepas bacterianas, ya que no existen protocolos estándar aplicable a todos los plásmidos. Sin embargo, existen algunos procedimientos que han dado buenos resultados con ciertas especies. Los objetivos de este manuscrito es un resumen y revisión plásmido agentes de curado y procedimientos. En vista de la importancia de los plásmidos en la especificación de los antibióticos y la resistencia a metales; propiedades metabólicas, patogenicidad, la especificidad del huésped y la nodulación (Rhizobium spp.), Las propiedades conyugales, y las propiedades de mantenimiento de la replicación [2], los procedimientos reproducible para la obtención de plásmido curado derivados son necesarios. 2. CURADO plásmido en bacterias Numerosas técnicas utilizadas actualmente para curar el plásmido se resumen en la Tabla 1. Otros agentes de curado también serán discutidos en el texto de este manuscrito. Dado que muchos plásmidos no se puede curar (refractario), se debe mencionar que no subsanar un plásmido no implica que el rasgo no es codificada por plásmidos. Además, la pérdida del plásmido completo o un fragmento del plásmido puede ser demostrado por eleetrophoresis gel vertical u horizontal de agarosa de lisados celulares despejado, o cesio etidio cloruro de gradientes de bromuro. Para una descripción de algunas técnicas utilizadas para aislar los plásmidos, los artículos de Trevor [2], Kado y Liu [5], y Schleif Wensink [6], Maniatis et al. [7]; Meyers et al. [8], Bimboim y Doly [9], y Summerton et al. [10] se recomienda. Además, Caro et al. [4] afirma que en ciertos organismos, incluso la pérdida de un plásmido que puede no ser suficiente evidencia para concluir que el rasgo es codificada por plásmidos. Esto se debe a muchos plásmidos son capaces de integrarse en el cromosoma huésped bacteriano. Si esto ocurre, el plásmido no se presente como una

circular cerrado covalentemente (CCC) molécula. Caro et al. [4] sugiere que los procedimientos sensibles, tales como transferencia de Southern de ADN total, seguido de hibridación con una sonda específica de plásmido, se utilizará para verificar la pérdida física del plásmido. 2.1. Colorantes intercalantes Colorantes intercalantes como acriflavina, naranja de acridina, bromuro de etidio y quinacrina se han utilizado con éxito en la curación de las bacterias plasraids. Un procedimiento general ha sido esbozada por Caro et al. [4], y se presenta en la Tabla 2. Básicamente, durante la noche (12 h) los cultivos se inoculan en caldo nutritivo (ajustado a pH 7,6) para dar 102 a 104 células / ml. Esterilizada por filtración, naranja de acridina (u otro agente de curado adecuado), se añade en concentraciones de 1,0 a 100 ~ tg / ml. Las concentraciones dependerá del organismo y el agente de curado. El cultivo se incuba durante la noche en su temperatura óptima de crecimiento, y el frasco de cultivo o de tubo que contiene la mayor concentración de agente de curado que todavía permite el crecimiento bacteriano se utiliza como fuente de inóculo para las células de revestimiento en placas de agar nutriente. Después de crecimiento de las colonias, las colonias individuales son examinados para detectar la pérdida del fenotipo bajo investigación. En el caso de plásmidos codifican la resistencia a los antibióticos o de metal, esto se hace generalmente por la chapa de réplica o placas de parche colonias individuales de una placa de maestro a un agar selectivo y pruebas de sensibilidad a los antibióticos adecuados (s) o de metal (s) . Colonias sospechosas de la pérdida de plásmido puede ser examinada por plásmidos usando la electroforesis en gel de agarosa. Carlton y Brown [11] informó de que la concentración más efectiva de un agente de curado en particular puede variar considerablemente, en el rango de 100 - a 1000 veces. Esto depende de la especie a tratar, la eficiencia de agente de curado, y el modo de ha utilizado con éxito en la curación de las bacterias plasraids. Un procedimiento general ha sido esbozada por Caro et al. [4], y se presenta en la Tabla. Esto depende de la especie a tratar, la eficacia del agente de curado, y el modo de la Tabla 2. Procedimiento generalizado de curado del plásmido (1) cultura de la noche, logarítmica de crecimiento se utiliza para inocular una serie de frascos de cultivo o tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo o medio de crecimiento apropiado modificado con una gama de concentraciones de agente de curado. (2) Los cultivos se incuban durante la noche (o más si es necesario) a la temperatura óptima de crecimiento o apropiado de otro modo para la cepa en particular se está investigando. (3) Cultura tubo o frasco mostrar turbidez observable y que contiene la mayor concentración de agente de curado se utiliza para la placa de las diluciones en agar nutriente o medio similar. (4) Las colonias individuales pueden ser réplica chapada, o un parche chapado a un medio de agar selectivo para la detección de pérdida de plásmidos codifican rasgos (por ejemplo, sensibilidad a los antibióticos o de metal) y / o colonias individuales pueden ser probados para la pérdida del plásmido con un micro procedimiento de aislamiento del

plásmido [2]. la acción del agente de curado [11]. Por estas razones, es necesario utilizar un rango de concentraciones, especialmente cuando las bacterias aisladas son de origen ambiental y / o se sabe muy poco sobre el organismo de investigación. Hohn y Korn [12] han utilizado con naranja de acridina para curar el plásmido F (F gala 'cI857) a partir de células de Escherichia coli. La pérdida del fenotipo seguido cinética de primer orden, lo que sugiere que acridina produjo una inhibición inmediata y completa de la replicación del plásmido. Sin embargo, esto puede ser especie-dependiente y similares no se puede esperar con otros organismos. Salisbury et al. [13] también se utiliza para curar el naranja de acridina lac F 'a partir de E. coli K12. La eliminación del factor F parece ser debido a la interferencia selectiva de la replicación del plásmido, y se observa fácilmente en cultivos con crecimiento exponencial. Además, el curado de acridina por lo general causa la pérdida de todo el plásmido [13]. Acridina también ha sido utilizado con éxito por otros investigadores para el curado del plásmido en E. coli [14-17]. Wechsler y Kline [15] también han identificado una región del locus F-plásmido que determina la resistencia a la. naranja de acridina cura en ciertas bacterias. El bromuro de etidio se ha utilizado ampliamente para curar plásmidos en una amplia variedad de cepas bacterianas. En 1969, Bouanchaud et al. [18] se describe el uso de bromuro de etidio para eliminar plásmidos de enterobacterias resistentes a los antibióticos y los estafilococos. Curado por lo general se observó una alta frecuencia, y los resultados obtenidos fueron más reproducible que con colorantes de acridina. Rubin y Rosenbaum [19] también curado con éxito peni.cillinase plásmidos en cepas de Staphylococcus aureus con bromuro de etidio. Otros colorantes intercalantes de ADN, como acriflavina y quinacrina, también se han utilizado para la curación de plásmido. Hahn y Ciak [16] han informado sobre el uso de la quinacrina como un agente de curado. Concentraciones subinhibitorias que van de 10 - 3 a 10 a 5 M eliminado lac F 'del plásmido de una cepa de E. coli. Hay situaciones donde el uso de tintes intercalantes, tales como la acridina y bromuro de etidio, no tienen éxito. Por ejemplo, estos agentes no se cura plásmidos de gran tamaño (> 250 MDa) se encuentran en Rhizobium y Agrobacterium spp. [20]. Además, un 151 mercurio cepa resistente de Bacillus cereus [21] actualmente bajo investigación en mi laboratorio no podía ser bromuro de etidio curado de sus plásmidos. 2.2. Coumermycin y novobiocina Ambos coumermycin y novobiocina son inhibidores de la girasa de ADN en las células intactas de E. coli [22]. ADN girasa cataliza negativo se convierte en superhelical de doble cadena de ADN cerrado, circular [21]. Caro et ai. [4] informó de que la curación de ColE1 plásmidos de E. bobina K12C600 ocurrió con las concentraciones coumermycin 1 a 7 / tg / ml, con un óptimo curado en 5 / ~ g / ml. Además, estas concentraciones no reducir el número de células viables en un grado significativo. Novick [23] también ha informado sobre el uso de coumermycin en la curación de algunos plásmidos S. aureus penicilinasa.

Las bajas concentraciones de coumermycin eliminado efectivamente los plásmidos; pBR 322, PMB9 y otros ColE1 plásmidos de E. coli K-12 cepas [24]. La acción de curado del antibiótico parece involucrar a más de inhibición de la replicación. Un lisado celular crudo de cloranfenicol tratados con las células que contienen el plásmido ColE1 se sometió a electroforesis en gel de agarosa. La banda ColE1 plásmido que normalmente se encuentran en esta cepa no se ha encontrado si las células fueron tratadas con coumermycin. Parece como si coumermycin hace que el ADN plásmido que se resolviera simplemente causar una acumulación de formas replicativas intermedias de ADN plásmido, que se degradan, y como resultado, la curación [24]. 2.3. Rifampicina La rifampicina se une directamente a la molécula de ARN polimerasa, tanto en la bobina E. y S. aureus [25]. Este mecanismo de acción es muy diferente de los dos mecanismos de curado anteriormente. Johnston y Richmond [25] investigó el aumento de la pérdida de plásmidos de penicilinasa (COMI) de S. aureus en presencia de rifampicina. Este plásmido codifica la resistencia a la penicilina, los iones de cadmio y la eritromicina. La curación más eficaz se obtuvo cuando un inóculo inicial de 105 organismos / ml fue empleado, y el agente de curado se utilizó en un 0,01 btg / ml. De las colonias negativas penicilinasa prueba, todos tenían también 152 perdieron su resistencia tanto a cadmio y eritromicina. Esto sugiere que la plasmidhad toda sido eliminado de la célula, en lugar de genes justthe penicilinasa. Los autores también sugirieron que debido a que la rifampicina ejerce un efecto diferencial sobre el crecimiento bacteriano y el mantenimiento del plásmido, una determinada molécula de ARN polimerasa o un grupo de moléculas pueden estar implicados en la replicación del plásmido y la segregación a las células hijas en S. aureus [25]. Bazzicalupo y Tocchini Valentino [26] confirman que la rifampicina inhibe específicamente la ARN polimerasa mediante el uso de un mutante de E. coli que la RNA polimerasa resistente a este antibiótico. Células que poseen esta resistencia no se curaron de plásmidos durante el tratamiento con rifampicina [26]. Observaciones similares fueron reportados por Riva et al. [27]. Además, también encontraron que la curación de las células que no contienen resistente a la ARN polimerasa, se produjo en condiciones muy similares a las requeridas para naranja de acridina curado (tamaño de inóculo de baja, 103 a 104 células / ml, medio de caldo de nutrientes, temperatura de incubación no debe ser inferior 30 ° C). 2.4. La mitomicina C La mitomicina C debe su actividad inhibidora de la activación metabólica a través de la reducción a un hidroquinona correspondiente [28]. La hidroquinona sufre cambios y produce un intermediario reactivo que puede reaccionar con bases de purina [28]. Debido a este tipo de ataque nucleofílico, puede insertar alquilantes enlaces cruzados entre las dos hebras de ADN de doble cadena. Cualquier entrecruzamiento de ADN es suficiente para bloquear la transcripción por la ARN polimerasa [28]. Rheinwald et al. [29] utilizado con éxito la mitomicina C para curar plásmidos codifican genes que

especifican el alcanfor (CAM) de oxidación en Pseudomonas putida. Concentraciones casi tóxica de mitomicina C en caldo L (triptona, extracto de levadura, y cloruro de sodio) se inocularon con aprox. 105 células / ml de un cultivo en fase estacionaria y se incubaron con agitación durante 48 h. Cultureswere diluciones seriadas en solución salina réplica, chapada en los medios de comunicación completo, y luego colocadas en un medio mínimo o D-alcanfor placas de agar para seleccionar a las colonias individuales muestran la CAMphenotype [29]. 2.5. Dodecilsulfato de sodio Dodecil sulfato sódico (SDS) es capaz de curar ciertos plásmidos. Algunas células que contienen el plásmido se supone que son más sensibles a la SDS por plásmidos específicos pili en su superficie celular [4]. Un método para la curación de la R (resistencia) y F (factor sexo) plásmidos en E. coli K-12 por el tratamiento SDS ha sido reportado por Tomoeda et al. [30]. Penassay caldo que contiene 10% de SDS se utiliza como medio de curación. Hallazgos similares se han observado en S. aureus, con una concentración de SDS relativamente bajo. S. aureus PC1 y 196E fueron cultivadas en un caldo de tripticasa de levadura-extracto de soja modificada con 0,002% de SDS, y mostró una 96,1 a 100% de pérdida de la capacidad de producir penicilinasa ~. [31]. Al mismo tiempo, tanto el cadmio y el zinc se han perdido resistencia. Los autores sugirieron que el SDS fue un agente de curado más eficaz que el crecimiento del cultivo a una temperatura elevada o el tratamiento con bromuro de etidio. 2.6. Temperatura de crecimiento elevado Elevada temperatura de incubación (5-7 ° C por encima de la temperatura de crecimiento normal o óptima) puede ser empleado como un método de curación. Por ejemplo, las cepas que normalmente tienen una temperatura óptima de crecimiento de 37 ° C pueden ser incubadas a 43 ° C [11]. Un protocolo para el uso de esta técnica de curación se pueden encontrar en un capítulo escrito por Carlton y Brown [11]. La cultura bajo investigación se incuba a la temperatura elevada hasta llegar a la fase de registro tarde, momento en el que se diluye (1: 20) y reincuban a la temperatura elevada hasta finales de la fase de registro de crecimiento que se alcance de nuevo. Diluciones seriadas se preparan, y se colocaron para obtener colonias individuales que pueden ser probados individualmente por la pérdida del rasgo plasmidencoded, y la ausencia física del plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa [2]. Temperatura de crecimiento elevado se ha utilizado con éxito para curar resistentes a la tetraciclina, penicilinasa-positivos cepas de S. aureus [32]. Las culturas se desarrollaron en 43-44 ° C para obtener células negativas tetraciclina sensibles y penicilinasa. Sin embargo, estas células no apareció hasta después de varias generaciones de células a la temperatura elevada [32]. E. coli K-12 también ha sido curado de plásmidos F por un crecimiento elevado en 42-44 ° C. Esta temperatura también impidió el restablecimiento de los plásmidos en células de curarse si la cultura se le permitió llegar a miembros de la célula> 105/ml [331. 2. 7. Timina limitación Limitación de timina puede ser utilizado para curar la timina-que requieren auxótrofos. Caro et al. [4] informó de que se sólo se ha empleado con E. coli, y ha resumido un

protocolo para su uso con este organismo. A medio mínimo que contenía 50 # g / ml timina es inoculado con la cepa auxotróficos, y se incubaron durante la noche (12 h). Las células son asépticamente diluido en una serie de tubos que contienen el mismo medio y mínimo de las concentraciones de timidina entre 0-25 # g / ml. Después de la incubación durante la noche, diluciones en serie y la placa están preparados DONTO timinacomplementado agar nutritivo [4]. Las colonias individuales pueden ser probados por la pérdida del plásmido. Clowes et al. [34] y Pinney y Smith [35] han descrito curado timina hambre plásmido en E. coli K12. Este organismo contiene una 1818 R-Factor, que es refractaria a la cura de acridina y bromuro de etidio. Sin embargo, se curó con éxito en los mutantes thymineless de este organismo en condiciones de hambre timina crecimiento [35]. Similares experimentos curado también se han descrito para los plásmidos Col en E. coli K12. 2.8. Formación y regeneración de protoplastos Se ha informado de que la eliminación de ciertos plásmidos en el 80% de las células de S. aureus puede ocurrir durante la formación y regeneración de lysostaphin producidos protoplastos [36]. Se sugirió que la curación de plásmido puede ocurrir durante las divisiones de protoplastos varios que tienen lugar antes de la regeneración de las células de la pared. Curado se postula que se debe a una alteración del mecanismo de fraccionamiento plásmido cuando la pared celular se ha eliminado. Este proceso de curado puede llegar a ser especialmente adecuado para bacterias Gram-positivas que son difíciles de curar mediante otros procedimientos, sin embargo, son fáciles de hacer en los protoplastos a través de tratamiento de lisozima. 2. 9. Curado incompatibilidad plásmido Caro et al. [4] han comentado sobre el uso de la incompatibilidad de plásmido curado en su excelente capítulo sobre el estudio de la replicación del plásmido en vivo. El método se basa en el hecho de que dos plásmidos similares no pueden existir de manera estable en la misma celda. Un incompatible plásmido se introduce en el organismo que está siendo curado, y la selección se mantiene para el nuevo plásmido durante el crecimiento del organismo. Las células que han perdido el primero (residente) plásmido se curan del plásmido introducido mediante la selección de las condiciones que conducen a su pérdida. Esta técnica requiere que los mutantes inestable o sensibles a la temperatura de los plásmidos están disponibles que son similares a los residentes con el plásmido curado se [4]. Además, el derivado del plásmido debe llevar un marcador selectivo que puede ser usado para distinguirlo del plásmido residente que está siendo curada. Otro requisito es que un procedimiento adecuado está disponible (conjugación, transducción, transformación) para introducir el segundo plásmido en la célula. 3. Ejemplos específicos de plásmido agentes de curado Ejemplos específicos de agentes de curado del plásmido de las bacterias y las referencias correspondientes se presentan en la Tabla 3. A pesar de todos los agentes de curado del plásmido discutido en este manuscrito han sido "utilizados para aumentar la frecuencia de la pérdida de plásmido, que sólo son útiles contra algunos plásmidos. Por lo tanto, cuando inicialmente el trabajo con nuevos plásmidos y cepas bacterianas, una amplia variedad de métodos de curación puede tener que ser tratado antes de obtener un método

satisfactorio. AGRADECIMIENTOS Esta investigación fue financiada por una subvención de funcionamiento de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. Sincero agradecimiento se expresa a B. McGavin para la preparación del manuscrito y KM para Oddie por su ayuda en las búsquedas de la literatura. Tabla 2 Procedimiento generalizado de curado del plásmido (1) cultura de la noche, logarítmica de crecimiento se utiliza para inocular una serie de frascos de cultivo o tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo o medio de crecimiento apropiado modificado con una gama de concentraciones de agente de curado. (2) Los cultivos se incuban durante la noche (o más si es necesario) a la temperatura óptima de crecimiento o apropiado de otro modo para la cepa en particular se está investigando. (3) Cultura tubo o frasco mostrar turbidez observable y que contiene la mayor concentración de agente de curado se utiliza a la placa de las diluciones en agar nutriente o medio similar. (4) Las colonias individuales pueden ser réplica chapada, o un parche chapado a un medio de agar selectivo para la detección de pérdida de plásmidos codifican rasgos (por ejemplo, sensibilidad a los antibióticos o de metal) y / o colonias individuales pueden ser probados para la pérdida del plásmido con un micro procedimiento de aislamiento del plásmido [2]. Disminución de la resistencia a los antibióticos y la pérdida del plásmido en el plásmido portador de cepas de Staphylococcus aureus tratado con ácido ascórbico. Resumen El efecto del ácido ascórbico en el plásmido con código de resistencia a antibióticos en Staphylococcus aureus fue investigado. Varias cepas de S. aureus fueron cultivadas en presencia de ascorbato 1 mM durante 6 h. Este tratamiento indujo un aumento de la pérdida de marcadores de resistencia en 4 de 6 cepas probadas, y geles de agarosa mostró esta desaparición de ADN plásmido en ascorbato inducido por las colonias susceptibles. La presencia de ascorbato induce una disminución del 50-75% en concentraciones mínimas inhibitorias de los diferentes antibióticos de cepas resistentes. Cuando se añade el ascorbato, las concentraciones antes subinhibitorias de la penicilina o tetraciclina tienen un mayor efecto inhibitorio sobre las cepas resistentes y llevó incluso a la muerte del 25-93% de la población inicial. Estos resultados sugieren que el ascorbato puede provocar la pérdida de varios plásmidos de S. aureus, y que los niveles de resistencia a los antibióticos también se ven afectados por la presencia de este compuesto. L-ácido ascórbico (vitamina C) se ha encontrado para ser capaz de modificar las propiedades del ADN (McCarty, 1945). El ascorbato puede inactivar los fagos varias inducción de roturas de cadena sencilla en su ADN (Murata y Kitagawa, 1973;. Murata et al, 1971, 1986), y puede inducir múltiples rupturas en los cromosomas de los mutantes deficientes en la reparación de Escherichia coli (Van Sluys et al., 1986a). Este efecto se

atribuyó inicialmente a la generación de peróxido de hidrógeno (H202) y / o radicales libres hidroxilo (HO -), pero esto no parece ser clara. E. coli xthA, un mutante H202hipersensibles (Demple et al., 1983), no es sensible al tratamiento con ascorbato (Van Sluys et al., 1986b). Una rotura sequencespecific después del tratamiento con ascorbato, es poco probable que se generan aleatoriamente por los radicales de oxígeno, se ha observado en ADN del fago (Kobayashi et al., 1988). La mayoría de las pruebas in vivo no detectan actividad mutagénica o cancerígenos para el ácido ascórbico (Douglas et al, 1984;. Norkus et al, 1983).. Parece que el ascorbato puede dañar sólo las moléculas de ADN pequeños y sin protección, especialmente las formas covalentemente cerrado circular (ADNccc), que dependen para su replicación y transcripción eficiente en el mantenimiento de su estado superenrollado. Este laboratorio ha informado previamente a la eliminación de plásmidos de penicilinasa de S. aureus después de un tratamiento de 6 h con el ascorbato 1 mM (Amfibile-Cuevas, 1988). La posibilidad de que la eliminación de los factores determinantes de la resistencia bacteriana puede ser de alguna ayuda en el control de la incidencia de resistencia a los medicamentos extracromosómico, como se ha sugerido (Bouanchaud y Chabbert, 1971; Hahn, 1976), nos ha inducido a examinar el alcance de esta pérdida de la resistencia causada por el ácido ascórbico. Hemos probado los efectos de este compuesto en varias plásmido portador de cepas resistentes de S. aureus, incluyendo cepas clínicas y cepas laboratoryconstructed, la resistencia a diferentes antibióticos, y en el caso de los plásmidos de penicilinasa, diferentes "familias" de los elementos extracromosómicos (Shalita et al., 1980). Creemos que un agente capaz de eliminar plásmidos de resistencia pueden ser útiles en el tratamiento de las enfermedades infecciosas con multi-resistentes a la etiología, si se administra junto con un antibiótico común. Con el fin de determinar si un organismo resistente a los antibióticos puede ser inhibida por la presencia de ácido ascórbico y un fármaco antimicrobiano, hemos expuesto estas cepas resistentes a la acción conjunta de ascorbato y los antibióticos. A pesar de ascorbato no se puede inducir la pérdida de plásmidos en todas las cepas estudiadas, se encontró un aumento en la acción inhibitoria de los antibióticos en las cepas resistentes al ascorbato está presente. Material y métodos Las cepas y los productos químicos Las cepas de S. aureus utilizados se enumeran en la tabla 1. Cultivos líquidos se cultivaron en caldo infusión cerebro corazón (BHI) y los sólidos en agar Muller-Hinton (ambos de Difco). L-ácido ascórbico (Sigma) fue utilizado como la sal de sodio, el ajuste de 100 soluciones madre mM a un pH de 7,2 mediante la adición de NaHCO3. Amikacina, penicilina, espectinomicina, tetraciclinas y tobramicina se obtuvieron de Laboratorios Bristol de M6xico, Lakeside Farmac6uticos, Upjohn, Rorer de M6xico, y Upjohn, respectivamente. Determinación de la pérdida del plásmido Tratamiento de ascorbato se realizó de la siguiente manera: inóculos pequeños (106 células / ml) de cada cepa fueron cultivadas en BHI con o sin ascorbato 1 mM, durante 6 horas a 37 ° C con burbujeo de aire constante. Las muestras de estos cultivos fueron sembradas en placas de agar para obtener colonias aisladas. Los plásmidos fueron anotados por la presencia o ausencia de sus marcadores de resistencia, determinado por

toothpicking a los medios selectivos y no selectivos. Concentraciones selectiva fueron: 50 t ~ g / ml de amikacina, espectinomicina y tobramicina, usados por separado para las cepas DIM; 50 / ~ g / ml de tetraciclina, para la cepa RN2424, 0,1 # g / ml de penicilina de las cepas RN11 y RN794. Pérdida del plásmido fue confirmada por electroforesis de agarosa al examen de ADN extracromosómico, realizado por el método de Nahaie et al. (1984) con un 0,8% en geles de agarosa en una losa horizontal. Concentraciones inhibitorias mínimas Determinaciones de los PRM en la presencia o ausencia de ácido ascórbico se realizaron mediante la técnica de tubedilution, en BHI con o sin ascorbato 1 mM. Determinaciones preliminares fueron realizadas por diluciones de los antibióticos, y los rangos de la actividad se divide en 10 - # g aumenta. Las concentraciones ensayadas fueron: 40-100 # g / ml de tetraciclina y la penicilina ~ 40250 g / ml. Los tubos se incubaron a 37 º C durante 12 h, y la inhibición del crecimiento fue confirmada 'por la medida turbidimetría a 620 nm en un colorímetro Corning 252. Culturas de los antibióticos y ~ o ascorbato El efecto del tratamiento simultáneo con el ascorbato y concentraciones subinhibitorias de antibióticos se determinó por el crecimiento de las células en BHI con 1 mM ascorbato y 50 # g / ml de tetraciclina para la cepa RN2424, de 40 # g / ml de penicilina para la cepa RN794, y 15 / / ~ ml de RNll cepa. Los cultivos se incubaron a 37 º C con burbujeo de aire constante. Unidades formadoras de colonias (ufc / ml) se determinó mediante la dilución de las células adecuadamente, placas Resultados La pérdida de plásmidos de resistencia debido a ascorbato ascorbato aumentado la incidencia de la pérdida de resistencia en resistencia aminoglucósidos las cepas, y en una de las cepas resistentes a la penicilina, pi258 (pen r) y PT 181 (tet r) no se pueden eliminar mediante el tratamiento con 1 mM ascorbato. Una comparación de la pérdida espontánea e inducida ascorbato de marcadores de resistencia se muestra en la Tabla 2. La suma de los resultados de tres experimentos simultáneos se muestra, estos valores son típicos de 4 series de experimentos independientes. La desaparición de ADN plásmido en la detección electroforética de lisados crudos de las colonias de las drogas susceptibles ascorbateinduced confirma que la pérdida de marcadores de resistencia es el resultado de la eliminación de plásmidos de resistencia (Fig. 1). 10-20 colonias susceptibles de cada experimento y cada cepa fueron analizadas y todas las pantallas de la pérdida de las bandas de plásmido. Reducción de la CIM por la presencia de ascorbato La adición de ascorbato 1 mM reduce la CIM de penicilina por 52 ° 70 para la cepa RN11, y en un 75% de RN794. Tetraciclina MIC se redujo en un 50% de RN2424. Los valores en la Tabla 3 son de un experimento típico, pero han sido reproducidos en al menos tres experimentos independientes. La inhibición del crecimiento y muerte celular con antibióticos si se presenta una ascorbato mM ascorbato no se modifican el crecimiento de las cepas RNll, RN794, y RN2424. Sin embargo, la asociación de las concentraciones de ascorbato y subinhibitorias de antibióticos puede inhibir el crecimiento de las poblaciones de bacterias,

e incluso provocar la muerte de 25, 93, y 89o70 del inóculo inicial de RNll, RN794, y RN2424, respectivamente, mientras que los propios antibióticos sólo inducen una tiempo de retraso (Fig. 2-4). Discusión L-ácido ascórbico está involucrado en una amplia gama de actividades biológicas, en especial contra los ácidos nucleicos (Shamberger, 1984). Los presentes resultados sugieren que una variedad de plásmidos S. aureus son sensibles a la 'curar' efecto de ascorbato, el cual fue reportado previamente por el laboratorio (Amfibile-Cuevas, 1988). 4 de las 6 cepas estudiadas mostraron una pérdida del fenotipo de resistencia cuando son tratados con el ascorbato que pueden atribuirse a la eliminación de la codificación del plásmido, como puede comprobarse por examen de electroforesis. En el caso de la RN2424, 1 mM ascorbato no induce la pérdida de resistencia por parte de cualquier célula. Esta podría ser la consecuencia del número elevado de copias del plásmido pT181 (20-25), por lo que no se debe descartar la posibilidad de que el ascorbato podrían inducir a la pérdida de algunas de las copias, pero no de todos. El efecto bactericida de la asociación de ascorbato y los antibióticos en las cepas resistentes, que pueden ser observados en las determinaciones de los PRM, así como en las curvas de crecimiento, podría ser la consecuencia de una variedad de eventos posibles: (a) la reducción en el número de plásmidos dentro de la población bacteriana, (b) la inhibición de la expresión de determinantes de resistencia a la interferencia con la transcripción del plásmido o por daños en el ADN del plásmido (por ejemplo, la conversión de ADNccc a ocDNA, previamente reportado como un efecto del ascorbato en el ADN circular ( Morgan et al, 1976));. o (c) un efecto sinérgico del ascorbato, que sólo potencia la actividad antimicrobiana de los medicamentos. Creemos que la última posibilidad es poco probable, teniendo en cuenta que los dos antibióticos implicados, la penicilina y la tetraciclina, tienen objetivos muy diferentes celulares y mecanismos de acción. Además, el efecto del ascorbato difieren en la magnitud en diferentes cepas de RN que sólo se diferencian en su resistencia plásmidos. Por lo tanto, parece que el ascorbato actúa a través del plásmido, y no en la célula huésped. Por otra parte, países de ingresos medios para el anfitrión, sin plásmidos no ha cambiado debido a la presencia de ascorbato (no mostrado). Sin embargo, la pérdida de plásmidos (Tabla 2) no parecen estar en correlación con el efecto de la asociación de ascorbato y los antibióticos, especialmente para la cepa RN2424. Ascorbato no eliminó los plásmidos a partir de cualquier célula, pero redujo la CIM de tetraciclina a 50 ° 7o y puede inducir la muerte de 89% de una población original expuesto a una concentración subinhibitorias del antibiótico. Este podría ser el resultado de una reducción en el número de copias del plásmido porque hay una dependencia de la dosis de genes de resistencia a este plásmido (Carleton et al, 1984;. Thomas, 1986). Aunque no hay evidencia de que la resistencia a la penicilina tiene el mismo comportamiento, los mecanismos de esta o similar puede ser propuesto, junto con una interferencia con la expresión de genes de plásmidos, como se mencionó anteriormente. Ninguno de estos resultados dan ninguna indicación sobre el mecanismo de acción del ascorbato en los plásmidos.

Pero parece poco probable que este podría ser el resultado de la generación extracelular de radicales libres que entran en la célula y dañar el ADN u otras structuresinvolved en la replicación del plásmido o la estabilidad. Los radicales libres, en su caso, se debe generar muy cerca de ADN, tal vez incluso de un complejo de ADN-ascorbato, como se ha informado anteriormente (Jamaluddin et al., 1981). Daño del ADN inducido por el ascorbato parece haber dos intermediarios diferentes: (a) peróxido de hidrógeno, producido durante la auto-oxidación de ascorbato, el cual genera radicales hidroxilo, la especie radical más reactivo que participan en el daño por el ascorbato de ADN del fago in vitro (Morgan et al,. 1976; Murata et al, 1986) y el cromosoma de E. coli en vivo (Van Sluys et al, 1986a),.., y (b) otros productos de la oxidación de ascorbato, los radicales probablemente peroxi o alcoxilo de ascorbato, que pueden estar implicados en el secuencia específica de daño de ADN del fago, a diferencia de la división uniforme causada por HO-(Kobayashi et al., 1988). Extracelular catalasa o tiourea impide la matanza de mutantes uvrArecA de E. coli por el ascorbato, lo que sugiere la participación de H202 y HO " (Van Sluys et al., 1986a). Sin embargo, la concomitante ADN de cadena sencilla rotura inducida por el tratamiento con el ascorbato, el cual puede ser, al menos en parte, responsable de la muerte celular, no puede ser causada por H202 o sus productos, ya que el mutante xthA, que es hipersensible al peróxido de hidrógeno, no es sensible al tratamiento de ascorbato / cobre (Van Sluys et al., 1986b). NGR-374 mutantes de S. aureus (Tam y Pattee, 1986), que también son hipersensibles a H202, no son sensibles a ascorbato (Am ~ ibile-Cuevas, resultados no publicados). Por otra parte, H202 sí mismo no induce la pérdida del plásmido en cualquiera de las cepas de S. aureus utilizada en este trabajo (Amfibile-Cuevas, resultados no publicados). Estos resultados sugieren que la H202 no está involucrado directamente como intermediario en el daño del ADN o en la pérdida de plásmido por el ácido ascórbico en el S. aureus. También existe la posibilidad de que productos genotóxicos de la peroxidación lipídica de las componentes de la membrana puede actuar como intermediarios reactivos de la eliminación del plásmido con el tratamiento ascorbato, como se ha propuesto para la mutagénesis radiación (Petkau, 1980). El ascorbato puede promover la peroxidación lipídica extensa en algunas preparaciones biológicas, tales como los ensayos in vitro de enzimas de la membrana (Schaefer et al., 1975), o los ensayos de unión de los neurotransmisores a los receptores de membrana (Heikkila, 1984). Interacción con las membranas de ascorbato también puede dar lugar a la distorsión de la arquitectura de la membrana, ya sea como consecuencia de la peroxidación lipídica, o por otros mecanismos que no implican la generación de radicales libres o la peroxidación (Matsuda et al., 1990). Las membranas de otros compuestos que actúan como SDS (Sonstein y Baldwin, 1972), y las fenotiazinas y la imipramina (Molnfir et al., 1982) también son capaces de eliminar los plásmidos bacterianos. Sin embargo, los plásmidos pi258 y pT181, que puede ser eliminado por la formación de regeneración de protoplastos (Novick et aI., 1980), no son susceptibles de ascotbate. La inestabilidad del plásmido durante la regeneración de protoplastos se ha atribuido a la participación de la envoltura celular en el mantenimiento del plásmido (Novick et al, 1980;. Gruss y Novick, 1986). Por lo tanto, cabría esperar

inicialmente estos plásmidos para ser eliminados por el tratamiento ascorbato, si el ácido ascórbico altera la membrana celular, lo que no es el caso. Es necesario seguir trabajando para determinar el mecanismo por el cual el ácido ascórbico actúa. Agradecimientos Nos gustaría expresar nuestra gratitud a Bruce Demple y Ludgar Mauricio por sus críticas y sus valiosos comentarios, RP Novick, PA Pattee, y B. Baca por su amable envío de cepas y de Isabel Niv6n por su excelente técnica de asistencia. Movilización y transferencia de los cromosomas No todos los plásmidos son capaces de lograr esta transferencia a otra celda sin ayuda, los que pueden son conocidos como plásmidos conjugativos. En algunos casos, un plásmido conjugativo es capaz de promover la transferencia de (movilizar a) un segundo de lo contrario nonconjugative plásmido de la célula donante. Esto no sucede por casualidad y no todos los plásmidos no conjugativos pueden ser movilizados. A fin de comprender la movilización de los ColEI plásmido puede ser tomado como un ejemplo (ver Figura 5.3). Movilización involucra al gen multitud, que codifica una nucleasa específica, y el sitio de bom (¼ oriT, el origen de la transferencia), donde la mafia nucleasa hace una muesca en el ADN. ColE1 tiene los genes necesarios para la transferencia de ADN, pero no lleva los genes necesarios para la formación de apareamiento de pares. La presencia de otro (conjugación) plásmido permite a los donantes para formar parejas de apareamiento con la célula receptora y ColE1 continuación, puede utilizar su propia maquinaria para llevar a cabo la transferencia de ADN. Algunos plásmidos que pueden ser movilizados no tienen un gen multitud. La movilización de entonces depende de la capacidad de la mafia de la nucleasa plásmido conjugativo de reconocer el sitio nació en el plásmido que se moviliza. Esto sólo funciona si los dos plásmidos están estrechamente relacionados. Por otro lado, el sitio nacido es esencial para la movilización. Este es un factor importante en la modificación genética como la eliminación del sitio nació de un vector plásmido se asegura de que los plásmidos modificados no pueden ser transferidos a otras cepas bacterianas (véase el capítulo 8). En la mayoría de los casos, el ADN que se transfiere desde el donante hasta el receptor consiste simplemente en una copia del plásmido. Sin embargo, algunos tipos de plásmidos pueden también promover la transferencia de ADN cromosómico. El primero de ellos por descubrir, y la más conocida, es la F (fertilidad) del plásmido de E. coli, pero existen sistemas similares en otras especies, sobre todo por Pseudomonas aeruginosa. En algunos casos, como se describe más adelante, esto implica la integración del plásmido conjugativo en el cromosoma de los donantes (de modo que el cromosoma es, en efecto transferidos como parte del plásmido). Sin embargo, en muchos casos, la transferencia cromosómica se produce sin ningún tipo de asociación estable con el plásmido, posiblemente por un mecanismo análogo a la movilización de un plásmido no conjugativo. Cuando un plásmido se transfiere de una célula a otra por conjugación, el plásmido completo se transfiere. Por el contrario, la transferencia de los cromosomas no se trata de

una copia completa del cromosoma intacto. Una razón para esto es el tiempo requerido para la transferencia. El proceso es menos eficiente que la replicación normal del ADN y la transferencia del cromosoma entero tomaría cerca de 100 min (en E. coli). La pareja de apareamiento muy rara vez se mantiene junto todo este tiempo. Por el contrario, un plásmido de decir 40 kb es equivalente al 1 por ciento de la longitud del cromosoma, - por lo tanto la transferencia del plásmido se espera que esté terminado en 1 min. La transferencia incompleta del ADN cromosómico significa que no constituye un replicón intacto en la célula receptora. Para este fragmento para ser replicado y heredado debe recombinarse con el cromosoma del huésped, por lo general reemplazar los genes receptores correspondientes en el proceso.