CUMARINAS 12

CUMARINAS

CONTENIDO

I.

Pgs. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….2

II.

PRINCIPIOS TEORICOS…………………………………………………...3

III.

DETALLES EXPERIMENTALES 3.1 Materiales………………………………………………………………...6 3.2 Reactivos………………………………………………………………...6 3.3 Muestra…………………………………………………………………...6 3.4 Procedimiento 3.4.1 Obtención del Extracto………………………………………….7 3.4.2 Reacción de identificación……………………………………...9 3.4.2.1 resultados…………………………………………………….9 3.4.3 Análisis cromatográfico………………………………………...10

IV.

REACCIONES QUÍMICAS………………………………………………....11

V.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS y CONCLUSIONES……………...…...12

VI.

RECOMENDACIONES……………………………………………………..12

VII.

BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………….......13

VIII.

CUESTIONARIO…………………………………………………………….14

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CUMARINAS

I. INTRODUCCIÓN

Las cumarinas están biogenéticamente relacionadas a los fenilpropanos como flavonoides y ligninas así como a las sustancias derivadas del acetato, como esteroides y terpenoides, ya que la biosíntesis trascurre por ambas vías shikimato y policetido del acetato. Las cumarinas debido a su anillo lactónico, son solubles en soluciones acuosas o alcohólicas de NaOH dando una coloración amarilla. Las cumarinas son productos naturales ampliamente distribuidos en la naturaleza. En el humano el principal metabolito de la cumarina es la 7hidroxicumarina, el cual es la forma activa del compuesto. Estos y otros compuestos relacionados presentan actividades biológicas de importancia terapéutica, entre las cuales destaca su efecto antitumoral. En esta práctica se realizo la extracción de la cumarina a partir de la ruda la cual se seco por dos días en la estufa, luego se trituró y colocó en un cartucho para llevarla al soxhelt, posteriormente se realizaron las pruebas de identificación en el papel watman y finalmente se realizó el análisis cromatográfico (CCD)

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I. PRINCIPIOS TEÓRICOS CUMARINAS Las cumarinas son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas, principalmente en las familias Umbeliferae y Rutaceae; se encuetran en todas las partes de la planta desde la razí a flores y frutos siendo más abundante en estos últimos; se presentan a menudo como mezclas, en forma libre o como glicósidos. Los desarrollos en los procesos de aislamiento y análisis estructural en estos últimos años han conducido a un marcado incremento en el número de cumarinas aisladas de plantas; ello unido al interés despertado por el amplio rango de actividad biológica que muchas cumarinas han mostrado, como por ejemplo la acción anticoagulante y antibacterial del dicumarol, la acción antibiótica de la novobiocina, el agua hepatotoxidad y carninogenicidad de ciertas aflatoxinas astrogénica del cumestrol, la acción fotosensibilizadora de furanocumarinas como el bergapteno y la xantotoxina, la acción insexticida de los surangin A y B, entre otros; cabe destacar también las aplicaciones de las cumarinas como saborizantes y en perfumería. (Figura 6) Las cumarinas de las cuales solo el 5% aproximadamente carece de oxígeno en la posición 7, pueden clasificarse como:  Simples, o sus derviados hidroxilados, alcoxilados y alquilados, y sus glicósidos.  Furanocumarinas, lineales o angulars  Piranocumarinas, análogas a las anteriores con un anillo de pirano, pueden ser también lineales o angulares.  Cumarinas preniladas, y  Cumarinas sustituidas en el anillo de pirona. Proceden de la lactonización del ácido 2-hidroxi-cinámico

•Sustituciones en el C-7: OH. •Tri-hidroxiladas en 6,7,8 •OH: metilarse, heterósidos : Ej.: Fraxósido, Esculósido

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•Cumarinas policíclicas: -Furanocumarinas: Ej . Bergapteno, Psoraleno -Piranocumarinas: Ej.: Visnadina Con el nombre de cumarinas se conoce a un grupo muy amplio de principios activos fenólicos que se encuentran en plantas medicinales y tienen en común una estructura química de 2H-1-benzopiran-2-ona, denominada cumarina. Sobre esta estructura, que se origina biosintéticamente por lactonización del ácido cumarínico (2-hidroxi-Z-cinámico), se disponen sustituyentes de distinta naturaleza química lo que da lugar a distintos tipos de cumarinas: sencillas y complejas. Prácticamente todas las cumarinas, a excepción de la cumarina propiamente dicha, poseen un sustituyente hidroxílico en posición 7 ya sea libre, como sucede en la umbeliferona, o combinado (metilo, azúcares, etc.). Las cumarinas sencillas pueden poseer además hidroxilos adicionales también libres o combinados. Ejemplo de ellas son el esculetol del castaño de Indias con dos hidroxilos libres sobre los carbonos C-5 y C-7 o el escopoletol presente en algunas Solanáceas (belladona) que posee un hidroximetilo en C-5 y un

hidroxilo libre en C-7. •Distribución: Ampliamente distribuidas: -ASTERÁCEAS -FABÁCEAS -APIÁCEAS -RUTÁCEAS •Propiedades físico-químicas: extracción y caracterización -Sólidos cristalizables -Color blanco o amarillento -Frecuentemente en forma de heterósidos por los grupos OH

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-Solubilidad: -glucósidos: mezclas hidroalcohólicas -geninas: disolventes orgánicos apolares (ac. de etilo; cloroformo, eter -Fluorescencia a la luz UV: azul, amarillo o púrpura) •Identificación: -Extracción con mezclas hidroalcohólicas -Separación por CCF -Identificación : luz UV •Valoración -Técnicas espectrofluorimétricas •Importancia farmacológica: (Limitada) •Entre las principales: •Vitamínica P •Tónicos venosos (esculósido) •Fotosensibilizantes (psoraleno) •Vasodilatadores coronarios (visnadina) •Anticoagulantes (dicumarol) Drogas con cumarinas: •Meliloto •Castaño de Indias •Kela

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II. DETALLES EXPERIMENTALES

3.1 Materiales: 2 vasos de 250 mL Equipo soxhlet Equipo CCD Lámpara uv 365nm Bagueta Probeta Cromatofolio 2.1 x 4.8cm



     

3.2 Reactivos:  Etanol  NaOH 10% Sistema: hexano : EtOAc (3:1) CHCl3 : MeOH (1:1) 3.3 Muestra:  Ruda

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3.4Procedimiento 3.4.1Obtención del extracto Se pesó unos 30g aproximadamente de hojas de ruda, y se llevo a un extractor soxhlet con EtOH durante 3 horas. Se concentro en un rotavapor.

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Referencias: 1. buzo / agitador / granallas o esferas. 2. Balón. 3. brazo para ascenso del vapor. 4. cartucho de extracción o cartucho Soxhlet. 5. muestra (residuo). 6. entrada del sifón. 7. descarga del sifón. 8. Adaptador. 9. refrigerante (condensador). 10. entrada de agua de refrigeración. 11. salida de agua de refrigeración.

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3.4.2 Reacción de identificación: Métodos cualitativos 3.4.2.1Resultados Para la reacción de identificación se obtuvo una coloración amarilla fluorescente.

3.4.3 Análisis Cromatográfico Del extracto obtenido se le practico una CCD. Para ello se realizo usando los sistemas: Sistema: hexano : EtOAc (3:1)

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CHCl3 : MeOH (1:1)

FLUORESCENCIA VERDE

Se calculo el Coeficiente de Reparto (RF) : RF =

Distancia recorrida por la muestra (cm) Distancia recorrida por el solvente(cm)

Sistema 1: hexano : EtOAc (3:1) Muestra Ruda

BANDA 1

BANDA 2

BANDA 3

Distancia recorrida por La muestra (cm) Distancia recorrida por el solvente (cm)

5.0

5.0

5.0

1.8

3.8

4.4

RF

0.36

0.76

0.88

Sistema 2:CHCl3 : MeOH (1:1) Muestra Ruda

BANDA 1

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CUMARINAS Distancia recorrida por La muestra (cm) Distancia recorrida por el solvente (cm)

RF

4.9 4.05 0.827

III. REACCIONES QUÍMICAS

IV. DISCUSION DE RESULTADOS y CONCLUSIONES  La ruda dio un resultado positivo para ambas pruebas debido a la alta presencia de cumarinas y furanocumarinas como el bergapteno.

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 Las cumarinas debido a su anillo lactónico son solubles en soluciones acuosas o alcohólicas de NaOH dando una coloración amarilla.  La muestra tratada con hidróxido de sodio 1 mol/L provoca una marcada disminución de la cumarina, lo cual evidencia una degradación del compuesto en este medio, aspecto que era de esperar pues se conoce que las cumarinas presentan en su estructura un agrupamiento lactónico, los cuales en medio básico sufren rompimiento del anillo y forman sales de cadenas abiertas.

 El método para extraer cumarinas de manera confiable es utilizando el método soxhlet.  Las furanocumarinas presentan actividad fotosensible debido a la reactividad del estado triplete que presentan las cumarinas que se genera cuando estas interactúan con la radiación UV.  La extracción de las cumarinas puede realizarse tanto sobre material seco como fresco, con solventes de polaridades diferentes, dependiendo de los tipos de estructura, algunas son ligeramente solubles en solventes apolares. V. RECOMENDACIONES  Dado que los ensayos son cualitativos se debe usar una cantidad adecuada de muestra para poder notar el cambio de coloración y dar una respuesta de veracidad.  Cuando se prepara el sistema de cromatografía de capa delgada, los cromatofolios no deben ser movidos del solvente, es decir no se debe trasladar de un lugar a otro hasta que el solvente haya alcanzado la distancia máxima. VI. BIBLIOGRAFÍA

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 Domínguez, Xorge A. Métodos de Investigación fotoquímica. Editorial Limusa, México, 1973  Lock de Ugaz. Investigación Fotoquímica, Segunda Edición. 1994. Editorial fondo PUCP. Pág 146-160  G. G Alicia, Burton Seldes y Gerardo, Introducción al Estudio de los Productos Naturales, Tercera Edición, Tomo 14 1985  García Barriga, Hdo. Flora Medicinal de Colombia: Tomo II Instituto Nacional de Ciencias Naturales Bogotá Colombia, 1975, p 340 http://es.wikipedia.org/wiki/cumarina#mw-head http://www.elergonomista.com/fitoterapia/cumarinas.htm http://farmacia.udea.edu.com http://www.elergonomista.com/fitoterapia/cumarinas.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Extractor_Soxhlet

VII.

CUESTIONARIO

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1.- cuales son las funciones de actividad biologica de estos compuestos. De 5 ejemplos con su actividad biologica Sus principales actividades son: a) Tienen propiedades vitamínicas, disminuyen la permeabilidad capilar y aumentan la resistencia de las paredes de capilares (protegen la fragilidad capilar y actúan como tónico venoso). b) Las piranocumarinas tienen acción antiespasmódica y vasodilatadora de coronarias. c) Algunos tienen propiedades sedantes, como la angelicina. d) Acción antibacteriana. e) Reconocimiento de algunas drogas (mana, solanacaeas midriaticas, castaño de indias). 2.- Nombre 5 cumarinas con sus estructuras.

La Psoralen (furanocumarina):

Escopoletina (hidroxicumarina):

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Umbeliferona (hidroxicumarina):

3.- ¿a qué cree ud que se debe la fotosensibilidad de estos compuestos? Esta actividad fotosensibilizante es explicable debido a la reactividad del estado triplete de las furanocumarinas que se genera cuando estas interactúan con la radiación UV y cuyas posibles reacciones se pueden agrupar en dos categorías. -

Los fotoenlaces directos con macromoléculas como el DNA, el RNA y las proteínas.

-

Las fotomodificaciones indirectas a los sustratos biológicos a través de formas reactivas del oxigeno.

Las furanocumarinas se han usado, junto con la radiación UV en el tratamiento de varias enfermedades d la piel como psoriasis, el vitiligio y la micosis fungoides; el bergapteno, además se usan como protectores solares en preparaciones cosméticas. La actividad fotosensibilizante de las furanocumarinas

sobre las células, se

manifiesta como fototoxicidad que altera y desorganiza numerosos procesos biológicos en diferentes tipos de células como células bacteriales o fúngicas, en

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virus a nivel de DNA, en células de mamíferos in vitro, en tejidos vegetales, y en células epidérmicas en aves y mamíferos.

4.- ¿Porque se usa la cromatografia para su detección? cual es la diferencia de usar una cromatografia de celulosa y otra de silicagel? Se usa la cromatografía por ser un método sencillo que nos permite ver a través de la lámpara UV y porque permite una buena expansión, permitiendo así separarse de alguna impureza que se encuentre. Cromatografía en papel: Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una única técnica muy potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el solvente. Luego el disolvente empleado como la fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo. Después de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección dl solvente y la del papel de filtro. Cromatografía de silicagel: La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de

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Hidrógeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es expuesta a un flujo por acción capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el solvente. • La diferencia es que se pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre l papel destruirán el cromatograma. 5.- ¿que son aflatoxinas? ¿Cómo se forman? ¿Quién las produce? ¿Cómo se les puede identificar? Las aflatoxinas son micotoxinas producidas por muchas especies del género de hongos Aspergillus, como metabolitos secundarios. Las aflatoxinas son un grupo de compuestos que cobraron importancia a partir de la muerte repentina en Escocia (1960), de cien mil pavos alimentados con maní infectado con una especie fúngica: Aspergilus flavus proveniente del Brasil. Las aflatoxinas son generadas por diferentes especies de hongos que aparecen en distintos cultivos que se encuentren expuestos a altas temperaturas durante bastante tiempo o por el contrario están sufriendo sequias severas, condiciones que se dan en países con climas húmedos y cálidos. Los cultivos afectados por los hongos comprenden cereales, especias, oleaginosas, etc. Cuanto más propicias son las condiciones, mayores son los niveles de aflatoxinas. El crecimiento de este hongo se ve afectado por la termohigrotropía, es decir que responde al estímulo de la temperatura y la humedad relativa de la atmósfera y del sustrato. Así, la formación de aflatoxinas en el maní tiene lugar si este se almacena entre 20° y 40°C con un 10-20% de humedad y con un 7090% de humedad relativa en el aire: el crecimiento del hongo se ve favorecido si los granos están dañados por insectos o roedores. Pero, aún en ausencia de estas condiciones, si ya han germinado algunas esporas en el sustrato, se pueden formar "nichos ecológicos" que favorecen el desarrollo de sectores con

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micelios generadores de aflatoxinas porque al crecer produce agua por respiración aumentando así la humedad de algunas semillas o granos.

6.- ¿en qué tipos de alimentos se pueden formar las aflatoxinas y que daño causaría al hombre? Los micelios de ésta y otras especies afines productoras de aflatoxinas, son capaces de colonizar semillas y tortas de oleaginosas de maní, girasol, algodón, soja, sésamo, avellanas, almendras y cereales y sus derivados dispuestos en sacos o silos. Los posibles efectos que se pueden mostrar en el hombre pueden ser: La aflatoxicosis aguda cuando se consumen niveles medios a altos de aflatoxinas. Los efectos de esta intoxicación pueden incluir hemorragia, daño agudo del hígado, el edema, la alteración en la digestión, la absorción y/o el metabolismo de alimentos, y posiblemente la muerte. La aflatoxicosis crónica resulta del consumo de niveles bajos a moderados de aflatoxinas. Los efectos son generalmente subclínicos y difíciles de reconocer. Algunos de los síntomas comunes son una difícil y deteriorada absorción de los alimentos e índices de crecimiento más lento. Para que un animal (o ser humano) haya muerto por causa de aflatoxinas debió ser suministrado con grandes dosis de las mismas -y 'posiblemente' durante largo tiempo-, esto pone en duda la cadena entera de control de calidad sobre la que el gobierno nacional (además de la empresa) tiene una gran cuota de responsabilidad. 7.- ¿que son ligninas? de ej. con sus respectivas estructuras.

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La lignina es un grupo de compuestos químicos usados en las paredes celulares de las plantas para crear madera. La palabra lignina proviene del término latino lignum, que significa madera; así, a las plantas que contienen gran cantidad de lignina se las denomina leñosas. La lignina está formada por la extracción irreversible del agua de los azúcares, creando compuestos aromáticos. Los polímeros de lignina son estructuras transconectadas con un peso molecular de 10.000 uma. Se caracteriza por ser un complejo aromático (no carbohidrato) del que existen muchos polímeros estructurales (ligninas). Resulta conveniente utilizar el término lignina en un sentido colectivo para señalar la fracción lignina de la fibra. Después de los polisacáridos, la lignina es el polímero orgánico más abundante en el mundo vegetal. Es importante destacar que es la única fibra no polisacárido que se conoce. Las ligninas son polímeros insolubles en ácidos y solubles en álcalis fuertes como el hidróxido de sodio, que no se digieren ni se absorben y tampoco son atacados por la microflora del colon. Pueden ligarse a los ácidos biliares y otros compuestos orgánicos (por ejemplo, colesterol), retrasando o disminuyendo la absorción en el intestino delgado de dichos componentes.

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Estructura generalizada de la Lignina (reproducida con permiso de "RealWorld Cases in Green Chemistry," copyright 2000 de la Sociedad Americana de Química)

8.- ¿porque es importante el uso de bloqueadores solares? Son importantes porque evita que los rayos UV e IR penetren la piel de manera intensa, se dice intensa por el debilitamiento de la capa de ozono. son productos que tienen ingredientes químicos que nos ayudan a protegernos de la radiación UV. El mecanismo de acción es por absorción, reflexión y dispersión de los rayos ultravioleta que llegan a la piel. Incrementa su acción la capacidad que tenga el bloqueador para adherirse. Es importante usar bloqueadores solares porque estos podrían causar:

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• Cáncer de piel, tiene una rápida ramificación que podría producir metástesis en otros órganos del cuerpo. Pudiendo llegar a producir la muerte. • Debilitamiento de las defensas del organismo • Manchas en la piel • Daños en los ojos • Foto envejecimiento 9.-¿ qué tipo de cumarinas está presente en la ruda y el apio? Las cumarinas que estan presentes en la ruda y el apio son: APIO: Piranocumarina de la familia Apiaceae. RUDA: Furanocumarina (bergapteno y psoraleno) de la familia Rutaceae. 10.- ¿Dónde se encuentran a las cumarinas generalmente? Se encuentran en los tegumentos d las semillas. Frutos. Flores. Raíces. Hojas. Y tallos; aunque la mayor concentración se encuentra en general en frutos y flores. 11.-Fundamente el mecanismo de acción. Acción farmacológica y empleos -Escina -Extracto de Castaño de Indias -Esculósido: tónico venoso Probadas propiedades anti-inflamatorias y antiedematosas •EXPERIMENTAL Extracto: protector de pequeños vasos: red capilar •USOS: Extracto y escina: componentes de preparados indicados en la insuficiencia venosa: vía tópica y vía oral. •Flebología:-úlceras varicosas, flebitis •Proctología:-hemorroides, fisuras anales •Traumatología:-edemas, inflamaciones, contusiones La corteza del tronco: extracción de esculósido 12.- ¿en qué consiste la fluorescencia? Indique 3 ejemplos que reportan esta propiedad.

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La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta, rayos catódicos o rayos X. Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano), son transformadas en luz visible, o sea, de una longitud de onda mayor al incidente. En el proceso, una molécula absorbe un fotón de alta energía, el cual es emitido como un fotón de baja energía (mayor longitud de onda). La diferencia de energía entre la absorción y la emisión, es disipada como calor (vibraciones moleculares). Todo el proceso es muy corto (millonésimas de segundo) y este tiempo es la principal diferencia con otro conocido fenómeno luminoso, la fosforescencia. Las sustancias que producen este tipo de radiación se denominan fluoritas, mientras que el fenómeno en sí mismo, se debe a la presencia de materia orgánica o de iones de tierras raras. Sin embargo, en una muestra de minerales que poseen propiedades fluorescentes, no todos ellos, incluso los que se han extraído de un mismo lugar, presentan la característica luminiscencia. Por otro lado existe una amplia variedad de colores, dependiendo de la longitud de onda emitida. Existen muchos compuestos naturales y sintéticos que exhiben fluorescencia, y tienen un número de aplicaciones. Algunos animales del fondo del océano, como los ojiverde, usan la fluorescencia. Las moléculas biológicas pueden ser marcadas con un grupo químico fluorescente (fluorocromo) mediante una reacción química simple, lo cual permite una detección sensible y cuantitativa de la molécula. Algunos ejemplos: •

•

La microscopía de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares es lograda marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que éste encuentre su antígeno correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios anticuerpos con diferentes fluorocromos se puede lograr la visualización de múltiples objetivos dentro de una misma imagen. Secuenciación automática de ADN por el método de terminación de la cadena: cada uno de los cuatro ddNTP’s se encuentra marcado con un fluorocromo específico de tal forma que se generan cadenas de diferente longitud que al ser sometidas a una fuente de UV se puede determinar la base nitrogenada terminal de cada cadena debido a la longitud de onda emitida característica de cada fluorocromo.

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Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. El bromuro de etidio se intercala en el ADN y fluoresce naranja cuando se expone a luz UV. •

• •

•

• •

Detección de ADN: el compuesto bromuro de etidio, libre de cambiar su conformación en solución, tiene poca fluorescencia. La fluorescencia del bromuro de etidio se aumenta enormemente cuando se une al ADN, de tal forma que este compuesto es muy útil para visualizar la localización de fragmentos de ADN en el método de electroforesis en geles de agarosa. El bromuro de etidio puede ser tóxico por tanto, una alternativa más segura es teñir con SYBR Green. Microarreglos Inmunología: los sitios de unión de un anticuerpo a un espécimen microscópico por ejemplo, pueden ser vistos, e incluso cuantificados, empleando la fluorescencia si se le ha unido previamente un grupo químico fluorescente al anticuerpo específico. La fluorescencia ha sido empleada para el estudio de la estructura y conformación del ADN, así mismo como de proteínas, con técnicas como la transferencia de energía de resonancia, la cual mide distancias a nivel de angstroms. Lo anterior es especialmente importante en complejos de biomoléculas múltiples. FACS (Citometría) La Proteína Verde Fluorescente (GFP), de la medusa Aequorea victoria, se ha convertido en una herramienta de investigación muy importante. GFP y otras proteínas relacionadas son usadas como reporteros de un sin número de eventos biológicos incluyendo aquellos de localización subcelular. Los niveles de expresión génica son medidos en algunas ocasiones uniendo el gen de producción de GFP con el gen de interés.

También, diversas moléculas biológicas tienen fluorescencia intrínseca y por tanto, pueden ser empleadas sin necesidad de unirlas a una etiqueta química. Algunas veces, esta fluorescencia intrínseca cambia cuando la molécula se encuentra en un ambiente específico, de tal forma que la distribución o el ligamiento de la molécula pueden ser medidos. La bilirrubina, por ejemplo, es altamente fluorescente cuando se une a la albúmina sérica en un sitio específico. La protoporfirina zinc, la cual se encuentra en las células sanguíneas cuando la producción del grupo hemo es inhibido por la existencia de plomo o la ausencia de hierro en la sangre, tiene una fuerte fluorescencia y puede ser, por tanto, empleada para detectar estos problemas.

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13.- Esquematice el método de extracción de las cumarinas e indique otro método de extracción. METODO DE SOXHLET Ruda seca por dos días en la estufa

Molido de muestra

Llevar al soxhlet con EtOH durante 3horas

Reacción de identificación en papel watman colocando NaOH 10%

Análisis Cromatográfico (CCD)

MÉTODO DE ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Para la determinación de cumarina en la muestra, se desarrolló un método de análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Este método fue aplicado en la planta Justicia pectoralis Jacq. es una especie vegetal de la familia Acantaceae. Nativa de los trópicos de América, se encuentra tanto en las Antillas, como en la zona continental. Comúnmente recibe diversas denominaciones como son curia (Puerto Rico), sana herida (Jamaica), anador (Brasil), entre otras. En Cuba es conocida como tilo o tila, carpintero o té criollo y se emplea en general como neurosedante en forma de decocción de las

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hojas frescas o secas,acción esta que ha sido demostrada por diversos autores a lo largo de los últimos 20 años. Se ha comprobado que entre los elementos mayoritarios que aparecen en los extractos obtenidos a partir de esta planta, se encuentra la cumarina simple, componente al que se le atribuyen propiedades antiinflamatorias, analgésicas y sedantes, entre otras. Estudios recientes, no publicados, han demostrado que después de realizarse diversos fraccionamientos, la acción sedante se mantiene de manera significativa, en las fracciones donde se encuentra presente la cumarina. Por tal razón se ha decidido usar este componente como marcador analítico para el control de la calidad y estudio de estabilidad de la materia prima y las formas terminadas. Se emplearon para ello las condiciones experimentales siguientes: precolumna Aluspher 100 (RP-select B 5 mm) con columna Lichrospher100, RP 18 (25 cm de longitud y 4 mm de diámetro y 5 micras), utilizándose como fase móvil una mezcla de metanolagua (40:60) y detector UV a una longitud de onda de 274 nm. El flujo de la fase móvil fue de 1 mL/min y el volumen de inyección fue de 20 mL. La preparación de las muestras se realizó de la manera siguiente: se pesaron con exactitud alrededor de 25 mg de extracto seco y se trasvasaron a un matraz aforado de 25 mL de capacidad. Se adicionaron 15 mL de fase móvil y se agitaron en forma circular hasta disolución de la muestra. Posteriormente se llevó a volumen con fase móvil y se mezcló. La cuantificación se realizó mediante una curva de calibración de un estándar de referencia de cumarina simple (Aldrich Chemical Co.) que abarcó un rango entre 4,0 y 20,0 mg/mL a partir de una solución madre de 0,22 mg/mL. Para la validación del método, primeramente se evaluó la especificidad, donde se estudió la influencia de un medio básico sobre el polvo seco, para lo que se colocaron 25 mg del polvo seco en otro tubo para ensayo con tapa de rosca y se adicionó 1 mL de solución de hidróxido de sodio 1 mol/L, se mezcló y se mantuvo por 5 min en estufa a 45 ºC. Por otro lado, se sometieron muestras del polvo a condiciones extremas de oxidación con peróxido de hidrógeno 30 %. El experimento consistió en colocar 25 mg del polvo en un tubo para ensayo con tapa de rosca, adicionarle 2 mL de peróxido de hidrógeno 30 % y colocarlo en una estufa a 45 ºC durante 60 min. Se puede afirmar que el método desarrollado es específico, preciso, exacto y lineal, por lo que puede ser empleado para la cuantificación de cumarina en muestras de polvo seco obtenidas mediante secado por aspersión.

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