Cultivo Por Lote Aliment Ado de Saccharomyces Cerevisiae en Tanque Agitado

Cultivo por Lote alimentado de Saccharomyces cerevisiae en Tanque Agitado Cristina Aguayo, Eduardo Feijoo, Macarena Unda1. Laboratorio de Ingeniería de Fermentaciones, Universidad San Sebastián, General Cruz 1577 Concepción, Chile. 1e-mail: [email protected] RESUMEN Se realizó un cultivo por lote alimentado de levadura Saccharomyces cerevisiae. Para ello se utilizó un medio de cultivo definido, utilizando como sustrato limitante glucosa con una concentración inicial de 6 g/L, y la alimentación se realizó a velocidad constante (3,3 mL/min). El volumen inicial fue de 2,5 L aprox. y terminó con un volumen de 3,1 L aprox; se comenzó la alimentación con una biomasa de 0,91 g/L y se terminó con 0,83 g/L. Los resultados obtenidos se alejaron a los esperados, es por esto que el bajo crecimiento celular y efectos inhibitorios ocasionarían una dilución del cultivo. Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, Cultivo por Lote Alimentado (CLA), alimentación constante, INTRODUCCIÓN Una forma de operar un biorreactor es empleando la técnica de lote alimentado (LA) o fedbatch. Esta técnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo. El lote alimentado es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la productividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa. (1) El lote alimentado es la técnica predominante para la producción industrial de la levadura. La formación aeróbica del etanol reduce el rendimiento de la biomasa. Procesos de alta concentración celular de la levadura se encuentran actualmente en estudio con el objeto de mejorar la economía del proceso. La

aplicación de las estrategias desarrolladas en la actualidad presenta varios inconvenientes para una aplicación industrial simple, comenzando por establecer una alimentación adecuada bajo la consideración de un volumen variable. (2) Para iniciar un lote alimentado se inicia la alimentación del cultivo cuando el sustrato limitante se ha agotado. Si bien éste no es un requisito indispensable, permite simplificar el tratamiento matemático y además es un buen punto de partida con respecto al objetivo del lote alimentado, es decir: controlar la velocidad de crecimiento mediante la velocidad de alimentación, con medio de cultivo fresco. (3) OBJETIVO. Desarrollar de una estrategia simple de alimentación del cultivo por lotes alimentado para controlar y maximizar el rendimiento del sustrato en biomasa. MATERIALES Y MÉTODOS Preparación del inoculo. Se utilizó S. cerevisiae en presentación de levadura comercial (Collico), se disolvió en un

1

volumen de 300 mL de medio de cultivo, previamente esterilizado. La preparación del inoculo se realizó en medio estéril bajo mechero; posteriormente el matraz se llevo al shaker con agitación constante (100 RPM), a 30°C durante 24 horas. Preparación de Medio de Cultivo. El medio se realizó para 5 g/L de levadura a un volumen final de 2,5 L. El volumen de medio preparado para el reactor fue de 2 L. En la tabla Nº 1 se resumen la cantidad de gramos para pesar, para cada compuesto del medio de cultivo en base a un volumen de 2,5 L, sin embargo, el reactor solo se lleno hasta los 2 L. Como sustrato limitante se utilizo glucosa y se considero un exceso del 50% de los sustratos no limitantes Tabla N° 1: Formulación de medio de cultivo para operación por lotes Fuente

PA

PM

%CEL

Yx/s

So* (g/L)

para 2,5 L

C6H12O 6

12

180

40

47

0,17

6

15

(NH4)2SO 4

14

132

%NUT

21,21

9,05

2,34

3,2

8

KH2PO 4

30,1

136

28,74

2,32

12,39

0,61

1,51

2

5

Extracto de levadura

La concentración de glucosa para la alimentación del cultivo por lotes alimentados se calculo mediante la ecuación 1, la cual rige para el sistema con velocidad de alimentación constante.

Ec. 1 Donde: Vo = volumen inicial = 2,5 L V = volumen final = 3,1 L F = flujo de alimentación = 3,3 mL/min Xo = biomasa inicial = 1 g/L ⁄ = rendimiento = 0,17 g celula /g glucosa t = tiempo de alimentación = 180 min Con esta consideración de parámetros se obtuvo una concentración de glucosa para la alimentación de 127,57 g/L. Las soluciones ya preparadas fueron esterilizadas mediante la autoclave (Quimis, mod. Q290-25) a 120°C por 15 min.

Instalación del equipo. El fermentador utilizado (Biotron, Liflus GS) de una capacidad de 5L. El control de pH estuvo a cargo de un electrodo sensible a la acidez y/o basicidad del medio (electrodo de pH), conectado al control automático del reactor, el cual dosifica soluciones de HCl (1N) y NaOH (1N) para ajustarlo en un pH de 4,5. Las condiciones de agitación fueron de 400 rpm de manera constante, conectado al control automático Biotron. Se utilizaron para la agitación un rotor rushton a 5 cm del fondo del bioreactor. Además de forma de evitar la espuma, se dispuso de un antiespumante de silicona (Winkler, AN-0378). La temperatura de monitorio mediante una termocupla (Digi – Sence, mod. A – 12990628) dentro del biorreactor y el control se realizo mediante un baño termostatizado (JULABO, F12-ED) a 30°C. Posterior al armado del equipo se procedió a autoclavarlo con las mangueras de 14 mm de silicona. La autoclave utilizada (Quimis, mod Q290-25) se llevo a 121°C por 15 min. Y posterior al proceso de esterilización se sello el biorreactor. Una vez autoclavado se conecto la aireación con un filtro de algodón hidrófobo a un compresor conectado al rotámetro incorporado en el sistema Biotron con un flujo de 5 L/min. Para la alimentación de fuente de carbono se utilizo una bomba peristáltica (Master Flex, HV-77911-20) para un flujo de 3,3 mL/min. Cultivo por lote. En la etapa de crecimiento por lote se llevó el inóculo previamente preparado al bioreactor a un volumen de 2,5 L. Se tomaron muestras cada 30 min. incluyendo tiempo cero. La muestra se obtuvo desde una zona de muestreo definida constituida por una manguera conectada a la zona media del biorreactor y una jeringa para extraer la muestra, determinando así las mismas

2

condiciones de muestreo para toda la experiencia; el volumen extraído para cada toma de muestra fue de 5 mL aprox. Se midió absorbancia para cada muestra, determinando su biomasa; el resto de las muestras fueron refrigeradas para una posterior medición de sustrato mediante el método de DNS. Estos procedimientos se detallan más adelante. Cultivo por lote alimentado. El cultivo por lote alimentado comenzó inmediatamente posterior al cultivo por lotes, siendo este con un flujo constante de 3,3 mL/min y con un volumen inicial de 2,5 L y un volumen final de 3,1 L. las condiciones de operación son las mencionadas anteriormente para ambos cultivos. Las tomas de muestras fueron de la misma forma que en el cultivo por lote y cada 30 min. Medición de Biomasa y Sustrato.

RESULTADOS Tabla N° 2: Datos crecimiento biomasa y consumo de sustrato de CLA, a 30 °C y pH 4,5. Tiempo (h) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 6,8 7,3 7,8

Para medir biomasa se midió la absorbancia a 650 nm de cada muestra y, utilizando la curva de calibrado desarrollada por Osorio et al(4), con un rango de 0,054 a 0,338 g/L.

S -0,11711146 -0,13281005 -0,13594976 -0,10141287 -0,12967033 -0,11711146 -0,12025118 -0,10455259 -0,00094192 0,81538462 1,11051805 1,20470958 1,20470958 1,29262166 1,30518053 1,36797488 1,51240188

S (corregido) 0,018838305 0,003139717 0 0,034536892 0,006279435 0,018838305 0,015698587 0,031397174 0,135007849 0,815384615 1,110518053 1,204709576 1,204709576 1,292621664 1,305180534 1,367974882 1,512401884

Biomasa vs tiempo 1,2

comienza la alimentación

1,1 1

X (g/L)

Para la medición de Sustrato se utilizo una curva de calibrado realizado por Osorio et al, con un rango de 0,2 g/L a 2 g/L de glucosa.

X 0,50725038 0,57077752 0,62049441 0,67297335 0,71716614 0,74202458 0,74202458 0,78897942 0,9160337 1,09556691 1,01546748 1,03756387 1,03756387 0,97679878 0,93536804 0,83041016 0,83869631

0,9 0,8

0,7

Para preparar el reactivo DNS se disolvió 16 g de NaOH en 200 mL de agua destilada. Se disolvió 1 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS, C7H4N2O7) y 300 g de tartrato de sodio y potasio (NaK(COO)2(CHOH)2 x 4 H2O) en dicha solución, aforandola hasta 1 L con agua destilada.

0,6

0,5 0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

Tiempo (h)

Figura N° 1: Curva de crecimiento en CLA de S. cerevisiae.

Se tomó 1 mL de muestra y se agregó 1 mL de reactivo DNS a cada una. Se realizo el blanco de la misma forma reemplazando la muestra por agua destilada. Los tubos fueron tapados y llevados a baño María por 15 min., luego se enfriaron en un baño de hielo por 3 min., con el fin de detener la reacción. Se agregaron 10 mL de agua destilada, se agitó y se dejó reposar durante 10 min. a temperatura ambiente; luego se midió la absorbancia a 540 nm UV-visible.

3

1,6

Tabla N° 4: Oferta y Demanda de S. cerevisiae en CLA.

Sustrato corregido versus tiempo

1,4

Oferta Demanda

1,2

8,8427 g glucosa/h 1,9009 g glucosa/h

S (g/L)

1 0,8

Además, se observa en la Figura N° 2, una acumulación de sustrato en el cultivo, lo que confirmaría que la oferta es mucho mayor que la demanda.

0,6 0,4 0,2 0 0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

Tiempo (h)

Figura N° 2: Curva de consumo de sustrato corregido en CLA de S. cerevisiae. Tabla N° 3: Datos utilizados para cálculo de velocidad máxima de crecimiento.

Para los cálculos de concentración de fuente de carbono mediante la utilización de glucosa (C6H12O6), se utilizo un ⁄ de 0,17 g célula/g glucosa. El valor que debería haberse utilizado es de 0,49. Debido a la siguiente expresión:

Tiempo Ln X 3,5 -0,23701504 4 -0,08770213 4,5 0,09127196

⁄

Ec. 2 Donde:

Cálculo velocidad máxima de crecimiento Elemento

0,1 0,05

C

y = 0,328x - 1,391 R² = 0,997

0

12

Fuente

PM [g/gmol]

C6H12O6

180

%Ei %Ec 40

49

f

Yx/s

0,6 0,49

Este rendimiento teórico re-calculado en comparación con el utilizado presenta gran diferencia en las concentraciones de la alimentación y la de medio para el cultivo por lotes como se resume en la tabla N° 4.

-0,05

Ln X

PM [g/gmol]

-0,1 -0,15

-0,2 -0,25 -0,3 3

3,5

4

4,5

5

Tiempo (h)

Figura N° 3: Cálculo velocidad máxima de crecimiento, en cultivo batch para, S. cerevisiae. DISCUSIÓN En relación a la demanda y oferta, se calcularon estos utilizando el rendimiento teórico Yx/s = 0,49 gcél/gglucosa (Tabla N° 4), obteniéndose así una mayor oferta que demanda, es por esto se descarta la falta de suministro de fuente de carbono como causa de la disminución del crecimiento luego de la alimentación.

Tabla N° 4. Comparación rendimiento recalculado y empleado. empleado

recalculado

Yx/s

0,17

cultivo por lote

S0 (g/L)

6

2,55

cultivo por lote alimentado

SF (g/L)

127,57

44,66

0,49

Como puede observarse en la tabla N° 4 los valores utilizados en la experiencia son mucho mayores que los con el rendimiento recalculado, por lo que la fuente de carbono en ningún momento actuó como sustrato limitante para ninguno de las experiencias. Este parámetro puede resultar responsable de no obtener una curva clásica de biomasa para un cultivo por lote alimentado.

4

Xfinal

S

[g/L]

[g/L]

17

86,77

En relación a una inhibición por sustrato presente en el medio, luego de comenzar la alimentación, se observa (Figura N° 1) una disminución de la concentración celular. Ya que en este tipo de fermentación, no hay salida en el sistema hay un aumento constante del volumen, y al haber una inhibición del cultivo (no hay generación de biomasa), el medio se diluyen dando como resultado en las mediciones de biomasa una disminución de esta. (5)

(2) Melchy O., Ortega C., Martinez A. (2001) Cultivo por lote alimentado de S. cerevisiae a alta concentración celular. IPN Sn pedro Zacatenco. Mexico. (3) J.E. Bailey and D.F. Ollis.Mc. (1986) Biochemical Engineering Fundamentals. Graw-Hill Book Company.

CONCLUSIONES

(4) Osorio,C. Barrientos, C. Diaz, I. Salazar, J. Saludes, M. 2010 Medición y calibración de variables y equipos. Preparación, esterilización e inoculación en medio líquido definido.

No se logró alcanzar el crecimiento celular deseado, ya que se observó inhibición del crecimiento por sustrato.

(5) Acevedo, F. Gentina, J. Illanes A. (2008). Fundamentos de Ingeniería Bioquímica. 2° edición. Universitarias de Valparaíso.

El sistema de cultivo por lote alimentado, fue correctamente implementado y operado, controlando distintos parámetros como: flujo de alimentación, aireación, pH, agitación, entre otros. Eliminando así problemas de control en el resultado del cultivo. NOMENCLATURA

PA:

Peso atómico (u)

PM:

Peso molecular (g/mol)

%NUT: Porcentaje de nutrientes en la composición del medio %CEL: Porcentaje contenido en la célula para la composición del medio. Yx/s: sustrato So:

Rendimiento de biomasa sobre

Sustrato inicial (g/L)

DNS: ácido 3,5 dinitrosalicílico REFERENCIAS (1) Madigan M., Martinko J., Parker J. (2003). Biología de los Microorganismos. 10 Ed. Southern Illinois University Carbondale.

5