Cultivo de Microorganismos 4

 

CULTIVO DE MICROORGANISMOS Medios de cultivo Técnicas de aislamiento Condiciones de incubación

M. en C. Lizeldi Bernardino Varo

 

CULTIVO CUL TIVO DE MICROORGANISMOS MICROO RGANISMOS Gran part Gran partee de la micr microb obio iolo logí gíaa depe depend ndee de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un la labo bora rato tori rio, o, y esto esto solo solo es posi posibl blee si se dispone de los medios de cultivo adecuados. Los medios especiales son imprescindibles para aisl aislar ar e iden identi tifi fica carr a los microorganismos,  evaluar la sen sensi sibil bilid idad ad de los antibióticos,  an  anal aliiza zarr el ag agu ua y los alimentos, en la microbiología muchas muc has ot otras ras act activ ivida idades des.

industrial y en

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

 

Aunque todos los microorganismos necesitan fuen fu enttes de energ nergía ía,, carb carbon ono, o, ni nittróge rógeno no,, fósforo, azufre y varios minerales, la composición precisa de un medio adecuado dependerá

de la especie que se quiere

cultivar,

porque las necesidades nutricionales varían considerablemente.

conocimiento del hábitat no El   co norm rmal al de un microorganismo   es es útil para elegir un medio de cu cult ltiv ivo o ap apro ropi piad ado o, porque sus necesidades de nutrientes reflejan su ambiente natural.

 

COMPOSICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

La célula: Obtiene la mayoría de las pequeñas moléculas del ambiente. Las macromoléculas son sintetizadas en el interior. La masa total está formada de 4 tipos de átomos: CHON. En meno menorr cant cantid idad ad:: fósf fósfor oro, o, ca calc lcio io,, magn magnes esio io,, azufre, fierro, zinc, zinc, manganeso, cobre, molibdeno, molibdeno, cobalto y tungsteno.

 

PRINCIPALES COMPONENTES CELULARES El agua co nstituye aproximada aproximadamente 98% delconstituye peso de una célula. mente el 94-

Peso seco principalmente de macromoléculas: macromoléculas: Proteínas Ácidos nucleicos (DNA y RNA) Lípidos Carbohidratos.

 

  om ompo posi sici ción ón qu quím ímic ica a de un una a cé célu lula la pr proc ocar ario iota ta Molécula

Peso seco ( ) 

Moléculas por

Clases diferentes

célula

Total de macromoléculas

96

24,610,000

~2,500

Proteína Polisacáridos Lípidos

55 5 9.1

2,350,000 4,300 22,000,000

1,850 2c 4d

DNA RNA

3.1 20.5

2.1 255,500

1 ~650

Total de monómeros

Aminoácidos y precursores Azúrcares y precursores Nucleótidos y precursores Iones inorgánicos TOTAL

3.5

~350

0.5 2 0.5 1

~100 ~50 ~200 18 100

Lo Los s datos Neicrecien Neidha dhardt rdt,,do F.C.activament y col (eds).1996. (ed s).1996. y Salmonella -Cellular -Cellula and Molecu Mol ecular lar Biology, 2a, ed, os ASM; b Pesoseco de una célulason célula de de creciendo activamente e (2.8 Escherichia x 10-13 g); ccoli Asumiendo Asumi endo quetyphimurium la peptidoglicana peptidoglicana yrel glucógeno glucóge no son los polisacárid polisacáridos mayoritarios E . coli presentes prese ntes;; d Exist Existen en div diversa ersas s cla clase ses s de fosfolípidos; fosfolípidos; de cada cadauno uno de ellos se present presentan an much muchas as formas debido a la variabilidad de los ácido ácidos s gra graso sos s entre las espec especies iesyy las condicio condiciones nes de crecimiento.

 

REQUERIMIENTOS DE LOS MICROORGANISMOS Requerimiento de factores de Requerimiento crecimiento

Auxotrofía

Prototrofía

Bactecruialas esinecnacpial mole iaalc, esson dinc inecafpaabcreicsarde aclrgeucnear en me medi dios os minimos. nimos.

B acdios teos riami s nimos ilvesstsint res etizand caando pacoesaut doenomamente crecer en medi me nsimo sintetiz auto nomamente toda todass las las ma macr crom omol oleeculas culas ese esencia nciales les

       !

       !         !

       !         !

       !

       !

 

REQUERIMIENTOS DE LOS MICROORGANISMOS Requerimientos de Nitrógeno: N2, NH4+, NO3-, NO2-, aminoácidos.

Requerimiento de Azufre: Requerimiento aminoácidos, SO, SO4-2

Requerimientos de macro y micronutrientes:

Requerimientos de Fósforo: PO4-2

Macronutrientes (10-3 a 10-4 M); Ca, Na, K, Mg  Micronutrinetes (10-5 a 10-6 M) ; Cu, Zn, Mn, Mo, Cr, Fe, etc.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

 

Lass sust La sustan anci cias as en el ambi ambien ente te util utiliz izad adas as por por los los orga organi nism smos os pa para ra el anabolismo

y el catabolismo se denominan nutrientes.

Nutriente

Sustanci ciaa obtenida del ambie biente, qu quee es requ queerida p olula r lare lores s soyrgpara anra ism s nera paraci ración la de sínen tesergí isgía. de materiales ce celu pa laoge gene ón ener a.

Macronutrientes

Micronutrientes

Los que se requieren en grandes cantidades.

Aquellos que se necesitan en pequeñas pequeñ as cantid cantidades. ades.

Algunos nutrientes constituyen la base sobre la cual la célula sintetiza macromoléculas u otras impo import rtan ante tess estr estruc uctu tura rass mi mien entr tras as que que ot otro ross nu nutr trie ient ntes es sirv sirven en so solo lo co como mo ge gene nera rado dore ress de en ener ergí gíaa sin sin se serr di dire rect ctam amen ente te in incor corpo pora rado doss al ma mate teri rial al cel celul ular ar;; algu alguno noss ot otro ross tien tienen en lo loss dos dos pa pape peles les..

 

MACRONUTRIENTES EN LA NATURALEZA Y EN LOS MEDIOS DE CULTIVO Elem El emen entto

For orma ma hab habit itua uall del del nutr nutrie ient nte e en en el amb ambie ient nte e

For orma ma quí quími mica ca uti utili liza zada da en en medi medios os de de cul culti tivvo

Carbono Oxígeno

CO2, Compuestos orgánicos H2O, Compuestos orgánicos

Glucosa, malato, acetato, piruvato, extracto de levadura, peptona, etc. H2O, Compuestos orgánicos

Nitrógeno

NH3, NO3-, N2, Compuestos orgánicos nitrogenados.

Inorgánicos: NH4Cl, (NH4) SO4, KNO3, N2 Orgánicos: aminoácidos, bases nitrogenadas

Fósforo

Compuestos orgánicos. PO43-

de nucleótidos, compuestos con nitrógeno KH2PO4, Na2HPO4

Azufre

H2S, SO42-, Compuestos orgánicos azufrados, sulfuros metálicos (FeS, CuS, ZnS, NiS, etc.)

Na2SO4, Na2S2O7 Na2S, Compuestos orgánicos azufrados

Potasio

K+ en solución o como sal.

KCl, KH2PO4

Magnesio

Mg2+  en solución o como sal.

MgCl2, MgSO4

Sodio

Na+ en solución o como sal.

NaCl

Calcio

Ca+ en solución o como sal.

CaCl2

Fe2+ o Fe3+ en solución o como FeS,

FeCl2, FeSO4, soluciones de Fe quelado con

Hierro

Fe(OH)3, u otras sales.  

EDTA o citrato.

MICRONUTRIENTES EN LA NATURALEZA Y EN LOS MEDIOS DE CULTIVO Elemento

Cromo

Función Celular

 

Requerido por los mamíferos mamíferos en el metabolismo metabolismo de la glucosa, no se conoce algún microorganismo microorganismo que lo requiera

 

Vitamina B12, Transcarboxilasa Transcarboxilasa (bacterias del ácido láctico)

Cobalto  

Cobre

Lo requieren como cofactor algunas proteínas proteínas implicadas en la respiración (citocromo c oxidasa), la fotosíntesis fotosínt esis (plastocianina) y las destoxificación de radicales libres (superóxido dismutasa)  

Manganeso

Va Varias rias enzima enzimas s lo requier requieren en como como cofactor cofactor.. Por ejemplo, ejemplo, la superóxido superóxido dis dismut mutasa, asa, la fotolia fotoliasa sa del fotosistema fotosistem a II.

 

Molibdeno

La mayoría de las hidrogenasas, coenzima F430 de las l as metanógenas, deshidrogenasa deshidrogenasa de monóxido de carbono, ureasa, etc.

Niquel Selenio

 

Tungsteno

Hierro

Formato Formato deshidrogenasa deshidrogenasa,, selenocisteína  

Vanadio Zinc

Presente en enzimas que contienen flavina. También También presente en la nitrogenasa, nitrogenasa, nitrato nitrato reductasa, reductasa, sulfito oxigenasa, DMSO y TMAO reductasas, reductasas, formato deshidrogenasas, etc.

   

Formato Formato deshidrogenasa deshidrogenasas, s, oxotransferasas oxotransferasas de termofílicos Vanadio nitrogenasa, bromoperoxidasa Anhidrasa Anhidrasa carbónica carbónica,, alcohol alcohol deshidroge deshidrogenasa nasa,, DNA y RNA polimeras polimerasas as y pro proteín teínas as que se unen unen al

 

DNA Citocr Citocrom omos, os, catal catalasa asas, s, peroxi peroxidas dasas, as, pr prot oteín eínas as con hier hierro ro y azufre azufre (ferr (ferredo edoxin xina), a), oxige oxigena nasas sas,,

nitrogenasas.  

CLASIFICACIÓN CLASIFICA CIÓN NUTRICIONAL Y FISIOLÓGICA TIPO DE FUENTE Fuente de energía

Fuente de carbono

Donador inicial de e-

COMPUESTO

NUTRICIÓN

Física (Luz)

Fototrofía

Química Únicamente CO2

Quimiotrofía Autotrofía

 

Orgánico

Heterotrofía

Inorgánico

Litotrofía

Orgánico

Organotrofía

 

CLASIFICACIÓN CLASIFICA CIÓN NUTRICIONAL Tipos nutricionales

Fuente de energía

Fuente de C

Ejemplos

Fotoautótrofos

Luz

CO2

Cianobacterias, bacterias púrpura y verdes

Fotoheterótrofos

Luz

Compuestos orgánicos

Algunas bacterias púrpuras y verdes

Compuestos Quimioautótrofos ó litótrofos

inorgánicos. Ej: H2, NH3, NO2, H2S

CO2

Algunas Archaea bacterias y muchas

Quimioheterótrofos

Compuestos

Compuestos

La mayoría de las bacterias y

ó heterótrofos

orgánicos

orgánicos

algunas Archaea

NUTRICIÓN MICROBIANA

 

Consiste en aportar a las células los ingredientes químicos que necesitan para la síntesis de monómeros, componentes base de las macromoléculas, para construir sus estructuras celulares. MONÓMEROS

Macromoléculas

Monosacáridos

Polisacáridos

Aminoácidos

Proteínas

Estructuras celulares

Par Pared ed cel celula ularr Glicocálix Membranas Ribosomas Flagelos Pelos y fimbrias Enzimas

Ácidos grasos

Lípidos

Membranas

Bases nitrogenádas

Ácidos nucléicos

Cromosoma Ribosomas

Plásmidos  

MEDIO DE CULTIVO Es un sustrato o solución de nutrientes que imita las condiciones favorables les para el cult ltiivo de los microorganismos y que proporciona los lo s req requeri uerimi mien enttos nece necesa sari rios os para para su crec crecim imie ient nto o y desa desarr rrol ollo lo..

 

MEDIOS DE C CUL ULTIVO TIVO NATURALES NATURALES

Leche Sangre Alimentos

 

PRIMEROS MEDIOS MED IOS DE CUL CULTIVO TIVO

Los primeros medios se prepararon tomand ndo o como base la experiencia y la observación. Eran medios hechos a par tir de inffus in usio ione nes s de div divers rso os tej ejid ido os tant tanto o de vegetales como de carne de distintos animales.

 

HISTORIA HIST ORIA MEDIOS DE CUL C ULTIVO TIVO Bre Brefe feld ld (micólog (micó logo), o),deaisló y cultiv cultivóó esporas esporas de hongos hongos en medios medios sól sólido idoss realizados a base gelatina. 1878. Lister populariza un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido. 1881. Koch, 1881. Koch, añade gelatina gelatina al caldo de carne líquido, líquido, diseñado por Löeffler logr logran ando do un medi medioo sóli sólido do transpa transpare rent ntee idea ideall para para la obse observa rvaci ción ón de la morfología macroscópica de las colonias microbianas. Walter Hesse (médico (médico alemán) alemán) introduce introduce el agar-agar agar-agar (polisacárido (polisacárido extraído extraído de algas rojas) como solidificante.

 

HISTORIA HIST ORIA MEDIOS DE CUL C ULTIVO TIVO 188 1887 7. Petri Pe tri,, se unllaman ayudant ayudante e deentonces Koch, Koch, comien com ienza zadeaPetri. utiliz utilizar ar placas placas de crista cristall planas, que desde placas 1888.. Beijer 1888 Beijerinc inckk y Winogr Winograds adsky ky realiz realizar aron on sus inve investi stigac gacion iones es sob sobre re las bacterias bact eriasgran quimioaut quimimportancia ioautótro ótrofas fas (utilizació (utili n de nitrógeno nitróg enomedios y azufreselectivos sobre todo) tuvieron en elzación desarrollo de los y dey enriquecimiento. 18 1892. 92. Würtz Wüsrtzdeimpu im ó composici el uso us o deónlos lode s ciertos medi medios os medios dif difdios eren erenci cial ales es, inco in corp rpor ando do indicadore indic adores pHpuls alsó la com posición me con lo, cual seoran podía podí a obse bserv rvaar la pro producción de ácidos en la fermenta ntación en ciert rtoos microorganismos.

 

REQUERIMIENTOS DE UN MEDIO DE CULTIVO  

Fuente de carbono

2

Fuente de nitrógeno

3

Fuente de energía

4

Agua

5

Sales minerales

6

Factores de crecimiento

 

CL SIFIC CIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Composición química

Aporte nutricional

Consistencia

Por su uso

 

COM OMPO POSI SI IÓN IÓN QU QUÍM ÍMII Químicamente definidos sintéticos)

Se conoce su composición química exacta. Son cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente purificados en cantidades controladas

Vogel Bonner Medium

Czapek Dox Agar

A medium for determining the mutagenicity of a chemical reag reagen entt usin using g the the Am Ames es Test. est.

Medium Medi um for cult cultiv ivat atin ing g fung fungii and and bact bacter eria ia fr from om cl clin inic ical al specimen spec imens s and env environ ironment mental al samples. samples.

 

COM OMPO POSI SI IÓN IÓN QU QUÍM ÍMII Indefinidos o complejos

No se conoce con precisión la composición química ni la cantidad Exacta de cada uno de los nutrientes. Se utilizan lisados de caseína de carne, de soya, de Levadura o cualquier sustantancia altamente nutritiva (químicamente indefinda). Ejemplo: suero, sangre, jugos de verdura, frutas, etc. BHI Caldo nutritivo Medio Ludira de Bertani Medio de Baird Parker

Medio de Luria Bertani

 

APO PORT RTE E NUT NUTR R ION ION L Medios simples

Medios utilizados para fines generales. Mantienen el crecimiento de microorganismos que no son muy Exigentes, sólo requieren un tipo de infusión o extracto además de Otros componentes.

Ejemplos: PDA Gelosa nutritiva Caldo simple Caldo nutritivo Sclerotium rolfsii culture

Gelosa nutritiva

on Potato dextrose agar.

   

APO PORT RTE E NUT NUTR R ION ION L Útil para el desarrollo de microorganismos protótrofos.

Medios Mínimos

Contiene los ingredientes básicos para el crecimiento De microorganismos no exigentes. No incluyen factores de crecimiento. Ejemplos: Agar Czapek Agar Arginina Glicerol Cicloheximida Medio E

Agar Arginina Glicerol Cicloheximida

 

APO PORT RTE E NU NUTR TR ION ION L

Idea Ideale les s par par a el desa desarr rrol ollo lo de mic mic roo roorr g ga an nis ismo mos s ex iige gen n ttes es ó fa s sti tidi dios osos os que r e eq quier uieren en fac factor tores es de cre crecim cimient iento: o: Streptococcus Neisseria y mu much chos os má más. s.

Es Está tán n co cons nsttit itu uidos idos po porr su sust stan anci cias as qu quee lo ha hace cen n más nutr nutrit itiv ivos os y

Medios Enriquecidos

co comp mple lejo jos. s. Se le less pued puedee adic adicio iona narr sa sang ngre re,, su suer eroo de hu huev evo, o, ye yema ma de hu huev evoo y dive divers rsos os ex extr trac acto toss nu nutr trit itiv ivos os ha haci cién éndo dolo loss ad adec ecua uado doss paraa el cre par crecimi cimient entoo de micr microor oorgan ganism ismos os exi exigent gentes. es. Ejemplos: BHI Gelosa sangre Gelosa chocolate Lowestein-jensen Caldo de hígado (infusión)

Agar Chocolate Colonia de Haemophilus influenzae

 

CL

SIFI SI FI

IÓN IÓ N PO POR R CONSISTEN I

Líquidos Fluídos Semisólidos Sólidos

Los medios medios sóli sólidos dos,, semisólid semisólidos os y fluidos, fluidos, puede pueden n con conten tener er los mismos mismos ingr ingredie edient ntes es que los los medios med ios líq líquid uidos, os, per peroo pose poseen en ade además más age agente ntess soli solidifi difican cantes tes que pue pueden den ser aga agarr, gelatin gela tina, a, huevo, huevo, suer sueroo ó síli sílica ca gel en dif difere erent ntes es pr propo oporci rcione ones. s.

 

CL SI SIFI FI

IÓN IÓ N PO POR R  CONSISTEN I

Medio líquido

Crecimiento en caldo nutritivo de diversos actinomicetos marinos. (B) Crec Crecim imie ient nto o en fo form rma a de memb membra ra

Medio sólido

Agar Kligler

 

Medio semisólido

Medio SIM

 

Medio fluido

Medio fluido de tioglicolato con resazurina

(izquierdo), crecimiento floculento (centro y (izquierdo), derecha).

 

Medio líquido

En estos medios se pueden determinar los diferentes tipos de crecimiento: Homogéneo, membrana, película, floculento, floc ulento, anular anular,, etc.

EJEMPLO: CALDOS INFUSIONES LECHE

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