cuestionarios bioqimica

EQUIPO 3. Gálvez Hernández Omar Flores Mendoza Brenda Mortera Romero Paulina Rivera Linares Belén Cuestionario 1 PARTE I EXTRACCION Y PRECIPITACION POR SALADO 1. Menciona cuatro usos que se les puede dar a las proteínas purificadas  Precisar secuencias de aminoácidos  Investigar la función bioquímica  Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas  Establecer relaciones evolutivas 2. Dentro de la guía para purificar una proteína se plantea que es importante establecer cuál va a ser el uso final de la proteína purificada. Explica porque Porque de acuerdo al uso que se le va a dar las cantidades requeridas y el costo es diferente por lo tanto no hay procedimiento único para la purificación de proteínas 3. ¿Qué propiedades de la Lactato deshidrogenasa se provecharan en cada paso de su purificación?  Peso molecular: La información es útil para detectar la proteína a través de SDS-PAGE, también es importante cuando seleccionamos un método de filtración en gel.  pl: selección de columna de intercambio iónico, pH de trabajo  Solubilidad: Esto debe ser considerado para evitar la agregación y precipitación de la proteína.  Unión específica: Ligandos útiles para separar la proteína en cromatografía por afinidad.  Estabilidad: Las características físicas y químicas de la proteína son importantes a lo largo del proceso 4. ¿Por qué es importante mantener la mezcla de proteínas a 4°C? Porque a una temperatura alta se podrían desnaturalizar las proteínas 5. De acuerdo con la reacción que cataliza y su función el organismo ¿Por qué crees que se seleccionó el musculo esquelético de pollo para aislar la lactato deshidrogenasa? La LDH es una enzima que abunda en hígado, músculo esquelético y eritrocitos; también se encuentra en menor cantidad en corazón, riñón y aún menos en páncreas y pulmón. Se eligió el musculo esquelético de pollo porque es fácil de encontrar, está en abundancia y es barato. 6. ¿Qué tipo de columna y eluyente recomiendas para su purificación y porque? Columna de afinidad debido a que es una enzima y presenta afinidad especifica por un cofactor (NAD+), se utilizaría una resina de Cibacrón blue 3GA, y por este método normalmente se obtienen rendimientos altos y una mejor purificación a diferencia de intercambio iónico y como eluyente se utilizaría NAD+.

7. Existen varios métodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, ¿Por qué existe esa variedad si todos purifican a la misma proteína? Porque el método de purificación depende del uso final que se le dara a la proteína purificada. 8. Menciona al menos dos proteínas que tienen actualmente un eso farmacéutico o médico y cuál es la fuente biológica de la que se obtienen  Albumina, fuente biológica hígado  Alfa glucosidasa, fuente biológica materia vegetal

BIBLIOGRAFÍA.  http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/3825/1/58117A949.pdf  http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php? action=cuaderno&opt=5&tipo=1¬e=49  http://www.tuotromedico.com/temas/albumina_en_sangre.htm  https://bqexperimental.files.wordpress.com/2010/01/seccion2_815221.pdf  http://www.ehu.eus/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm Cuestionario PARTE II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE AFINIDAD 1. ¿Por qué es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la o las fracciones con alto contenido de sal en protocolo experimental antes de someterla a cromatografía de afinidad o de intercambio iónico? Debido que en el proceso de desalado se retienen las sales, y la proteína sale más rápido debido a su tamaño así separándolas, también ayuda tener a la proteína en condiciones óptimas. 2. ¿Cuáles otros usos tiene la cromatografía de exclusión molecular que no sea la de ayudar a desalar una suspensión de proteínas?  Cambios de buffers. Después de cromatografías de intercambio iónico, afinidad o de interacción hidrofóbica.  Eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos nucléicos.  Eliminación de compuestos de bajo peso molecular marcados. I125, FITC de las soluciones de marcaje de proteínas.  Para reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo peso molecular.  Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas.  Purificación de macromoléculas.  Determinación del peso molecular de las proteínas.

3. ¿Qué intervalo de fraccionamiento de moléculas tiene el Sephadex-G25 y que aplicaciones tiene? Aplicaciones: se usa en cromatografía de afinidad, cromatografía de proteínas y cromatografía de filtración en gel como también para estudiar la aceleración de la cicatrización de la herida diabética y el tratamiento del daño epitelial. Exclusion limite Mr 5000 4. ¿Qué es el volumen vacío en una columna de filtración en gel? Volumen del disolvente del espacio que rodea a las moléculas o también llamado volumen existente entre las esferas del gel. 5. ¿A qué se refiere el término volumen muerto en una columna cromatográfica? Volumen de fase móvil requerido para eluir una especie no retenida. 6. Investiga la composición de la matriz de intercambio iónico que se usó para purificar a la LDH. Macro-pep High S de BIORAD Grupo functional –SO3Copolímero de ácido metacrílico 7. De acuerdo con PI de la LDH, si contaras con una columna de intercambio aniónico como DEAE-celulosa, ¿a qué pH mantendrías a tu proteína y a qué pH mantendrías el amortiguador para eluir a la proteína de la columna? Fundamenta tu respuesta. Mantendremos a la proteína y el pH del amortiguador con un pH mayor a su punto isoeléctrico ya que la LDH estará cargada negativamente. 8. ¿Qué propiedad de la proteína se utiliza para purificar a la proteína mediante una columna de intercambio catiónico? EL Punto Isoeléctrico. 9. ¿Qué debe contener el eluyente para la purificación del LDH en la cromatografía de intercambio iónico que se propone en este protocolo y por qué? Amortiguador a diferentes concentraciones de NaCl y mediante las diferente fuerza iónica, la LDH eluira por la competencia de los componentes del amortiguador con la matriz por los sitios de unión. 10. ¿Qué propiedad de la proteína estás utilizando para purificarla por cromatografía de afinidad y cuál es el componente clave para la purificación de la LDH en esta columna? La capacidad de afinidad por su cofactor (NADH) Bibliografía:  Análisis Químico Cuantitativo, D. Harris 3ra edición pp 101-102

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http://www.reallaboratory.com/protocols/Molecular%20Biology %20Protocols/RBMS02_03.pdf http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g2580? lang=en®ion=US&gclid=CPPy3Zyfw8sCFVBffgodzusHuw

Cuestionario Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A. Determinación de la concentración de proteínas 1. Compara ambos métodos de cuantificación de proteínas utilizados en la práctica y enlista sus diferencias. Considera tanto el fundamento de las técnicas como la metodología para llevarlas a cabo.

Destructivo

Absorbancia a 280nm No

Interferencias

DNA, RNA

Absorvancia

280 50µg/mL a 2mg/mL

sensibilidad Cuantificación mezcla de proteinas

Bradford Si Flavonoides, Detergentes, Sulfato de amonio 595 1µg/mL a 1.5 mg/mL

No

Si

2. ¿Qué desventajas tiene determinar la concentración de proteína por Abs 280 con respecto al método de Bradford en muestras que tienen una cantidad variable de proteínas, como en nuestras fracciones de la purificación del lactato deshidrogenasa?  Contaminación por ácidos nucleicos ya que también absorben en la Región de 280nm.  El contenido de aminoácidos aromáticos difiere considerablemente en varias Proteínas.  La solución debe ser clara e incolora ya que la Turbidez puede producir resultados erráticos  Se requiere un sistema relativamente puro para utilizar este método ya que una mezcla de proteínas no pueden ser cuantificadas por los diferentes valores del coeficiente de extinción molar de cada proteína. 3. ¿Qué sustancias pueden interferir en el método empleado?  Flavonoides  Detergentes



Sulfato de amonio

4. Investiga el intervalo de concentración de proteínas que detecta el método. 1 µL/ml -1.5 mL /ml y es más sensible que la medida de absorbancia a 280 nm 5. ¿Por qué es necesario construir una curva de calibración en la determinación colorimétrica de proteínas por el método de Bradford? Para determinar la concentración de una sustancia (analito) en una muestra desconocida basado en la comparación de una relación lineal entre la concentración y la absorbancia de una muestra conocida. 6. Investiga qué otro método existe para cuantificar proteínas y explica su fundamento.

Métodos de absorción 280nm Las proteínas muestran un fuerte grado de absorción a 280nm en uv, principalmente debido a los residuos de triptófano y la tirosina de las proteínas. Dado que cada proteína tiene una composición única de aminoácidos aromáticos, el coeficiente de extinción (e280) o su absortividad molar (em) deben ser determinados para proteínas individuales para la estimación del contenido protéico. Método rápido y relativamente sensible (varias veces más sensible que el método de biuret) ,no existe interferencia del sulfato de amonio y otras sales buffer , no destructivo utilizado en detección post-columna de las proteínas. Métodos derivados colorimétricos Biuret.- Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad

del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). Lowry.- Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas. Este método consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso. BCA El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos Referencias.  https://analisisinstrumentalmeh.files.wordpress.com/2011/04/anc3a1lisis-delasprotec3adnas.pdf  http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS %20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE %C3%8DNAS.pdf

Cuestionario Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida-SDS 1¿En cuál de los pasos de la purificación se obtuvo una mayor cantidad de LDH? En la fracción purificada C mediante la cromatografía de afinidad. 2. ¿Cuál de los dos métodos de purificación cromatográfica produce una mayor cantidad de LDH, la cromatografía de afinidad o la de intercambio iónico? La cromatografía de afinidad ya que en la cromatografía de intercambio iónico presentaron varios contaminantes. 3. Usualmente, en una purificación se utilizan la cromatografía de intercambio iónico y la de afinidad como pasos secuenciales, una después de otra, pero por costos hemos utilizado sólo una de ellas. Con los resultados que obtuvo tu equipo y los otros equipos, predice cuál sería el resultado si primero se realizara la cromatografía de intercambio catiónico y luego la cromatografía de afinidad. Se mejoraría la purificación de la LDH ya que por la cromatografía por intercambio iónico se podrían eliminar las dos bandas que se observan en la parte superior del gel (presentes al usar solo la cromatografía por afinidad) y con la cromatografía por afinidad se eliminarían todos los contaminantes que se observo dejo la cromatografía por intercambio iónico. 4. ¿Cuántos contaminantes se tienen en la mezcla de proteínas obtenida en el proceso cromatográfico final? Se puede inferir que existen dos contaminantes por la presencia de dos bandas en la parte superior del gel. 5. Elabora un esquema de purificación para la proteína malato sintasa a partir de semillas de girasol. Para ello busca: A) Cuál es la función de la proteína Cataliza la condensación y posterior hidrólisis de la Acetil-CoA y glicoxilato para formar malato y CoA B) En qué material biológico se encuentra Organismo.- Escherichia coli (strain K12) C) En qué compartimento subcelular se encuentra Locación.- Citoplasma D) Busca la información estructural y/o fisicoquímica de la proteína.

E) Realiza un diagrama de flujo del protocolo de purificación propuesto, fundamentando el porqué de cada paso de purificación, indicando en cada paso en dónde está la proteína. Recuerda que tiene características muy distintas a la lactato deshidrogenasa por lo que no necesariamente se tienen que usar los pasos de purificación usados en este protocolo experimental. Bibliografía: o

UniprotKB – P37330 (MASZ_ECOLI). Consultado el 16 de Marzo del 2016. Disponible en: www.uniprot.org/uniprot/P37330