Cuantificacion Del ADN

 

NOTA MÉTODO RÁPIDO, ECONÓMICO Y CONFIABLE DE, MINI PREPARACIÓN DE ADN PARA AMPLIFICACIONES POR RAPD EN BANCOS DE GERMOPLASMA Asia Y. Zambrano*, Demey**, Gustavo Martínez*, Zambrano*, Jhonny R. Demey**, Francia Fuenmayor*, Zulay Gutiérrez*, Gustavo Saldaña* y María Torrealba* *Investigadores. *Investigador es. INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias. Agropecuarias. Unidad de Biotecnología. Av. Universidad, vía El Limón. Apdo. 4521. Maracay -2101, estado Aragua. Venezuela. **Consultor. TI-GC. Apdo. 4521. Maracay 2101. Venezuela. RECIBIDO: enero 14, 2002.

RESUMEN Existen numerosos métodos de extracción de ADN desarrollados para diferentes especies de plantas, sin embargo, la mayoría requieren una alta inversión de tiempo, material vegetal y reactivos, o producen bajo rendimiento de ADN. Cuando se trabaja con un gran número de plantas, como es el caso de los bancos germoplasma, se requiere un método rápido y eficiente de extracción que de produzcan ADN de alta calidad. La metodología de extracción de ADN descrita es rápida, sencilla y permite la obtención de ADN genómico de buena calidad, libre de compuestos secundarios, proteínas y polifenoles que coprecipitan con el ADN, los cuales inhiben la reacción de amplificación de ADN. Produce entre 15-25 μg de ADN por 100 mg de tejido fresco. La calidad de ADN fue validada a través de su consistente amplificación usando la técnica de RAPD en Saccharum spp., Musa sp., yManihot esculenta. El tiempo requerido para la extracción de ADN fue reducido a un 40% y su costo y nivel de toxicidad a un 50%, comparado con los métodos utilizados normalmente.

Palabras Clave: Extracción de ADN; RAPD; Saccharum spp.; Musa sp.; Manihot  esculenta.

INTRODUCCIÓN Las técnicas de biología molecular son normalmente laboriosas, con alto requerimiento de tiempo y dinero, siendo esto particularmente cierto cuando se trata de la extracción de ADN. El análisis de ADN genómico de plantas es realizado frecuentemente a través de aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reduciendo la necesidad del aislamiento de grandes cantidades de ADN. Numerosos métodos, entre otros los descritos por Dellaporta et al . (1983), Guillemaut y Marechal (1992), Honeycutt et al (1992), Hoisington et al . (1994), Harvey y Botha (1996), Aljanabi y Martínez (1997) y Chen y Ronald (1999) han sido desarrollados para diferentes especies de plantas, sin embargo, la mayoría requieren una alta inversión de tiempo, material vegetal y reactivos, o producen bajo rendimiento de ADN.

 

Cuando se trabaja con un gran número de plantas como es el caso de los bancos de germoplasma se requiere un método rápido y eficiente de extracción que produzcan ADN de alta calidad. En este trabajo se describe un protocolo modificado de extracción de ADN descrito por el CIAT (1999) para Pyricularia grisea, relativamente sencillo, económico, que produce alta cantidad de ADN de buena calidad en Saccharum spp., Musa sp., y Manihot esculentapara ser usado en la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), y que puede ser realizado completamente en 50 muestras por una persona en un día.

MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal Se utilizó tejido foliar joven de Saccharum spp., Musa sp., y Manihot esculenta, al cual se le realizó el procedimiento modificado de extracción de ADN descrito por el CIAT (1999) para Pyricularia grisea en arroz.

Protocolo de extracción de ADN 1. Pulverizar con nitrógeno líquido tejido foliar joven recién cortado. En un tubo eppendorf de 1,5 ml colocar material vegetal pulverizado hasta la 2. marca de 500 μl y resuspender con 750 μl de buffer CTAB (2X), (2% de CTAB, 100 mM de tris base pH 8,0, 10 mM de EDTA y 0,7 M de NAC1 agregar agua hasta 500 ml y autoclavar). Adicionar 30 μl de 2-β mercaptoetanol. Agitar suavemente e incubar por 30 minutos a 65 ºC.

3. Agregar 300 μl de acetato de potasio (3 M, pH 4,8), mezclar suavemente e incubar en hielo por 15 min. Centrifugar 10 min a 14 000 rpm y transferir el sobrenadante a otro tubo.

4. Adicionar 500 μl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), mezclar suavemente por inversión del tubo y centrifugar 10 min a 14 000 rpm.

5. Cuidadosamente pipetear la fase superior en tubo con 500 μl de Isopropanol frío para precipitar el ADN. Incubar en hielo durante 60 min.

6. Centrifugar en 5 min a 14 000 rpm y descartar el sobrenadante. 7. Lavar el pellet de ADN dos veces con 500 μl de Etanol al 70% frío. Descartar el Etanol y permitir que el ADN se seque al aire libre por 30 min.

8. Resuspender el ADN en 30 a 50 μl de buffer TE (10 mM de Tris-HC1, 1mM de EDTA pH 8,4) o agua estéril y almacenar a -20 ºC.

Cuantificación de ADN La calidad del ADN fue determinada a través de la relación de absorbancia A260/A280. La concentración de ADN se evaluó en geles de agarosa al 1% por comparación con marcadores Bromuro de Etídio bajo luz UV.estándar de ADN de λ no digerido, visualizados con

 

Validación de la calidad de ADN a través su amplificación por RAPD Una vez extraído y cuantificado el ADN se procedió a su validación a través de la amplificación con iniciadores aleatorios, utilizando 15 μl de mezcla de reacción constituida por 1,5 μl de Buffer B 10X, 3 mM de MgC12, 0,2 mM de cada uno de los dNTPs, 1μM de primer, 0,5 U de Taq y 15 ng de ADN. La amplificación fue realizada en un Termociclador Ter mociclador MJ Research PTC 200, empleando un ciclo de desnaturalización inicial a 94 ºC por 5 min, seguido de 45 ciclos de amplificación a 94 ºC por 1 min, 36 ºC por 30 seg, y 72 ºC por 2 min, y un ciclo final de extensión a 72 ºC por 7 min. La separación de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa 1,2% corridos Por 2 h a 80 W y visualizados con Bromuro de Etídio bajo luz UV.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La metodología de extracción de ADN descrita es rápida, sencilla y permite la obtención de ADN genómico de buena calidad, libre de compuestos secundarios que atrapan el ADN en una matriz gelatinosa (Guillemaut y Marechal, 1992) y de proteínas y polifenoles que coprecipitan con el ADN (Demeke y Adams, 1992; Do y Adams, 1991) los cuales inhiben la reacción de amplificación de ADN (Pandey et al ., ., 1996).

spp., en la La Figurafila, 1 muestra a derecha de Saccharum primera deMusa de sp.,izquierda en la segunda fila yADN de Manihot esculentum tercera fila, donde se puede estimar visualmente 100 ng/μl por comparación con ADN de λ no digerido. La metodología de extracción descrita produce alto rendimiento de ADN entre 15-25 μg por 100 mg de tejido fresco, estable, con una relación A260/A280 entre 1,83 y 1,96 lo que sugiere que el ADN aislado esta libre de proteínas. La calidad del ADN fue validada a través de su amplificación, siendo consistentemente amplificable a través de la técnica de RAPD utilizando 20 oligonucleótidos de OPERON lo cual se muestra en las Figura 2, se observan los patrones generados por los productos de amplificación con 14 oligonucleótidos para Saccharum spp., (Figura 2a), con 16 oligonucleótidos para Musa sp., (Figura 2b) y con 20 oligonucleótidos para Manihot esculenta (Figura 2c), generándose en las tres especies productos de amplificación que oscilan entre 200 y 1 750 pb. No se requirió una segunda precipitación de proteínas y polifenoles con Cloroformo así como la purificación final con Fenol lo que reduce el uso de estos reactivos de alto riesgo. El tiempo requerido para la extracción de ADN fue reducido a un 40% y su costo y su nivel de toxicidad a un 50%, comparado con los métodos utilizados normalmente. En el Cuadro, se compara basados en el protocolo la metodología propuesta con las de Doyle y Doyle (1987) y Dellaporta et al . (1983) de uso común en yuca, musa y caña, respectivamente.

 

FIGURA 1. Análisis electroforético de la calidad de ADN extraído en (a) Saccharum spp. (b)Musa sp. sp., (c) Manihot esculenta, comparado con 100 mg de ADN de λ no digerido (Primera columna de la izquierda).

 

FIGURA 2. Patrones de ADN polimórfico de Saccharum spp. (a), Musa sp. (b) y Manihot esculenta (c). Oligonucleóticos: OPA01, OPA02, OPA04, OPA07, OPA10, OPA11, OPA17, OPA18, OPA19, OPA01 (primera fila de izquierda a derecha) y OPB06, OPB07, OPC13, OPC15, OPE02 OPE02,, OPF13, OPF14, OPM04, OPM14, y OPM20 (segunda fila de izquierda aderecha).

  CUADRO. Comparación entre metodologías de extracción. Doyle y Doyle Dellaporta et al. Protocolo (1987) (1983) Tejido vegetal Tiempo Lisis Purificación de ADN

3g >1 día CTAB 5X Cloroformo fenol

2g >1 día SDS Intercambio aniónico (columna de Miracloth)

Método propuesto ~1g 3 horas CTAB 2X Cloroformo

Esta metodología de extracción de ADN ha sido usada en la obtención consistente de ADN de alta calidad no sólo en las especies señaladas, sino también en Zea mays L., Phaseolus vulgaris y anacardium occidentale. SUMMARY Numerous method for extraction of DNA haveabeen plant species, however, the majority require high developed investmentfor of different time,

 

plant material and reagents, or produce low yields of DNA. When working with a great number of plants as with germoplasm collections, a fast and efficient method of extraction to produce DNA of high quality is required. The methodology describes for DNA extraction is fast, simple and renders genomic DNA of good quality, free of secondary compounds, proteins and polyphenols that coprecipitate with the DNA inhibiting the reaction of DNA amplification. Methodology produced between 15-25 μg per 100 mg of  fresh tissue. Quality of DNA was validated through its consistent amplification using RAPD technique in Saccharum spp., Musa sp., and Manihot esculenta. Time required for DNA extraction was reduced to a 40% and its cost and level of toxicity to 50%, compared with other commonly used methods. Key Words: DNA extracción; RAPD; Saccharum spp.; Musa sp.; Manihot  esculenta. BIBLIOGRAFÍA ALJANABI, S. M. and I. MARTÍNEZ. 1997. Universal and rapid saltextraction of high quality genomic DNA for PCR- based techniques. Nucleic Acids Res. 25:4692-4693. CHEN, D. H. and P. C. RONALD. 1999. A rapid DNA minipreparation meted suitable for AFLP and other PCR applications. Plant Mol Biol Rep. 17:53-57. CIAT. 1999. Taller integración de fitopatología, mejoramiento y biología molecular para el desarrollo de resistencia al añublo del arroz. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cal¡. Colombia, 14-18 de octubre. DELLAPORTA, S. J., J. WOOD and J. B. HICKS. 1983. A plant DNA minipreparation: versión II. Plant Mol Biol. Rep. 1:19-21. DEMEKE, T. and R. P. ADAMS. 1992. The effect of plant polysaccharides and buffer additives of PCR. Bio Techniques. 12:332-334. DO, N. and R. P. ADAMS. 1991. A simple technique for removing plant polissacharide contaminants from DNA. Bio Techniques. 10:162-166. DOYLE, J. J. and J. L. DOYLE. 1987. A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull. 19:11-15. GUILLEMAUT, P. L. and D. MARECHAL. 1992. Isolation of plant DNA: a fast, inexpensive and reliable meted. Plant Mol. Biol. Rep. 10:60-65. HARVEY, M. and F. C. BOTHA. 1996. Use of PCR-based methodologies for determination of DNA diversity between Saccharum varieties. Euphytica. 89:257-265. HOISINGTON, D., M. KHAIRALLAH and D. GONZÁLEZ de LEÓN. 1994. Laboratory Protocols: CIMMYT. Applied Molecular Genetics Laboratory. Second Edition. México. CIMMYT. 51 p.

 

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