Cuantificación de Proteínas

 

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR METODO DE CUANTIFICACIÓN BIURET Y BRADFORD

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BQ1L001 1/2019

Rev.: 03 Bioquímica de los Alimentos I Facultad Tecnológica Depto. Dep to. d de e Cienci Ciencias as y Tecn Tecnolo ología gía de los los Alime Alimento ntoss UNIVE UNIVERSI RSIDAD DAD D DE E SA SANTI NTIAG AGO O DE CH CHILE ILE Elaborado por: Bq Myriam Pizarro Cruz, Dr. (C) Waldo Díaz Vásquez

Laboratorio N °2 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR METODO DE BIURET Y BRADFORD 1. INTR INTROD ODUC UCCI CIÓN ÓN Fundamentos de la espectrofotometría La luz puede ser clasific ficada de acuerdo con sus propiedades electr ectro omag agn nética ticas, s, y corres responde a un pequeñ eño o ra ran ngo del es esp pectro electromagnético.. El tipo de radiación electromagnético radiación elec electroma tromagné gnética tica se defi define ne a partir de su longitud de onda, su frecuencia y su energía. (Fig. 1)

Fig. 1: espectro electromagnético

La espectrofotometría es una disciplina que se basa en la utilización de estas propiedades electromagnéticas para determinación de propiedades de la materia, existiendo la espectrofotometría de masas, la espectrofotometría de rayos X, X , de fluorescencia,, Infrarroja (IR), fluorescencia (IR), Resonancia Magnética Nuclear (RMN), (RMN), de Llama y Llama y la espect espectrofomet rofometría ría de absorc absorción ión UV-visible que será tratada con mas detalle, entre otras. Espectrometría de Rayos X, X , permite que los electrones de las capas interiores del átomo se excitan a orbitales vacíos externos, o bien son eliminados completamente, ionizándose el átomo. La absorción de rayos X y la espectroscopia de emisión se usan usa n en quími química ca y cie cienc ncias ias de lo loss mat materi erial ales es para determinar la composición elemental y el enlace químico. químico. X, donde En al actualidad se utiliza en biología y química la cristalografía de rayos X, se hace incidir la radiación a estructuras cristalinas, las intensidades de los rayos X dispersados dan información sobre las posiciones atómicas y permiten calcular la organización de los átomos dentro de la estructura cristalina. La esp espectr ectromet ometría ría de fluores orescen cencia cia usafotones fotonesdedeinferior energía más elevada para excitar una muestra, queflu emitirá entonces energía. Esta técnica

 

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se ha hecho popular en aplicaciones bioquímicas y médicas, y puede ser usada con microsco micr oscopía pía conf confocal ocal,, trans transferen ferencia cia de ener energía gía entr entre e par partícul tículas as fluo fluoresc rescentes entes,, y visualización de la vida media de fluorescencia. Espect Espectroscop roscopia infrarroja   se yba basa sa en es el decir, hech hecho o los de movimientos que que las las mo molé lécu lass tien tienen en frecuencias a ia las infrarr cualesoja  rotan vibran, decula rotación y vibració vibr ación n mole molecula culares res tien tienen en nive niveles les de ener energía. gía. Las frecu frecuenci encias as reso resonant nantes es o frecuencias vibracionales pueden ser determinadas con un detector apropiado y permiten determinar la naturaleza de la sustancia.

Fig. 2: Ejemplo de visualización de un espectro IR de un compuesto orgánico.

Espect Espe ctro rome metrí tríaa de res reson onan anci ciaa mag magné néti tica ca nu nucle clear, ar, anal analiza iza las prop propieda iedades des magnética magn éticass de cier ciertos tos núcl núcleos eos atóm atómicos icos para dete determin rminar ar dife diferente rentess amb ambient ientes es local locales es ele electr ctrón ónico icoss del hi hidró dróge geno, no, car carbon bono, o, u otr otros os áto átomos mos en un com compu puest esto o orgánico u otro compuesto. Se usa para determinar la estructura del compuesto. En general se comparan las resonancias magnéticas de Carbono y de Hidrógeno para determinar la estructura.

A

B

Fig. 3: Espectros de RMN. A, resonancia magnética de 13C, B, resonancia de magnética de 1H.

Llama, las muestras de solución líquidas son aspiradas en En la espectrometría la espectrometría de Llama, un qu quem emad ador or o un una a co comb mbin inac ació ión n de ne nebu buliliza zado dor/ r/qu quem emad ador or,, deso desolv lvat atad adas as,, atomizadas, y a veces excitadas a un estado electrónico de energía más alta. Estos métodos son a menudo capaces de analizar elementos metálicos en partes por  millón, billones, o posiblemente rangos más bajos de concentración. Son necesarios

 

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detectores de luz para detectar la luz con información que viene de la llama, existe espectrometría de absorción y absorción y de emisión atómica. atómica.

ESPECTROMETRÍA VISIBLE Muchos átomos emiten o absorben la luz visible. A fin de obtener un espectro lineal fino, los átomos deben estar en fase gaseosa. Esto significa que la sustancia tiene qu que e ser ser va vapo pori riza zada da.. El es espe pect ctro ro se es estu tudi dia a en abso absorc rció ión n o emisi misión ón.. La espectros espe ctroscopi copia a de absorc absorción ión visible visible a  a menudo se combina con la de absorción ultravioleta (espectroscopia UV/Vis). UV/Vis) . Aunque esta forma pueda ser poco común al ser el ojo humano un indicador similar, todavía se muestra útil para distinguir colores. ESPECTROMETRÍA ULTRAVIOLETA Todos los átomos absorben en la región ultravioleta (UV) ya que estos fotones son bastante energéticos para excitar a los electrones externos. Si la frecuencia es lo bastante alta, se produce la fotoionización. La espectrometría UV también se usa para la cuantificación de proteínas y concentración de ADN, así como para la proporción de proteínas y ADN en una solución. En las proteínas se encuentran generalmente varios aminoácidos, como el triptófano, que absorben la luz en el rango de 280nm. El ADN absorbe la luz en el rango de 260nm. Por esta razón, la proporción de absorbancia 260/280nm es un buen indicador general de la pureza relativa de una solución en términos de estas dos macromolécu macromoléculas. las. También pueden hacerse estimaciones estimaciones razonables de la concentración de ADN o proteínas aplicando la ley de Beer.

A

B

Fig. 4: A, espectrofotómetro UV/VIS, B, Cubetas de cuarzo o de vidrio utilizadas para la determinación.

Ley de Beer y Lambert Ley de Beer  La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azúcar diluida y en otro tenemos un vaso con la misma cantidad de agua pero con más azúcar diluida. El

 

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detector es una celda fotoeléctrica, y la solución de azúcar es la que se mide en su concentración. Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad que del otrolas lado seriaelectromagnéticas mayor que si repitiéramos enun el segundo;de yaluz que ensaldría el segundo, ondas chocan esto contra mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos. Ley de Lambert En la Ley de Lambert se dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz. Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pero ahora, pensemos que ambos tiene la misma cantidad de agua y la misma concentración de azúcar, pero, el segundo tiene un diámetro mayor que el otro.

Consideremos Considere mos un rayo de energía radiante con una intensidad inicial I o que se hace pasar a través de una celda de vidrio cuadrada contiendo una solución homogénea de una sustancia que absorbe luz de cierta longitud de onda, como se ilustra en la Figura

Fig. 5: Transmisión de energía radiante a través de una celda de vidrio, donde Io representa la intensidad de la luz incidente e I s representa la intensidad de luz transmitida.

La intensidad de la energía radiante transmitida Is es menor a la intensidad inicial I o de debid bido o que la sus sustan tanci cia a con conten tenid ida a en la cub cubeta eta fue cap capaz az de abs absorb orber er cie cierta rta cantidad de luz, en ese sentido la Transmitancia se refiere a la luz que fue capaz de atravesar la muestra y se calcula como: (1) (2)

T= Is / Io %T= T= Is / Io x 100

De acue acuerd rdo o co con n esta esta ecua ecuaci ción ón,, la lu luzz qu que e es abso absorb rbid ida a debe debe ser ser inversa inversa   y logarítmica a logarítmica (A).  a la que se transmite, t ransmite, a esta relación se le llama Absorbancia (A). (1)

A= -log Is / Io.= -log T= log 1/T

(2)

A= log 1/T x 100%= log 100% / %T

(3)

A= log 100% - log %T

 

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(4)  A= 2- log %T La ley de Lambert–Beer es fundamental en la absorciometria porque relaciona la absorción de la luz con la concentración de las soluciones.   Donde

 A = ξbc  A = absorbancia absorbancia ξ= coeficiente de extinción molar  b = paso óptico (de la cubeta en este caso) c = concentració concentración n

     

 Aplicaciones:  Aplicacion es:  

Determinaciones de concentración de un cromóforo puro Determinación Determina ción de Proteínas

Fig. 6: Relación entre la Absorbancia y el porcentaje de transmitancia. Se muestra la construcción de una curva de calibración con soluciones estándar.

La ley de Beer es una relación matemática ideal que contiene ciertas limitaciones. Desviaciones de la misma, es decir circunstancias en las cuales la relación entre la absorbancia y la concentración de una muestra no es lineal pueden ocurrir cuando: 1. La concentración de la solución a medir es muy elevada 2. La luz incidente no es monocromática 3. La cantidad de luz absorbida por el solvente es significativa con respecto a la sustancia en solución que se desea medir  4. Hay luz transmitida que no es generada a partir de la sustancia a cuantificar  5. Los lados de la celda donde se deposita la muestra no son paralelos 6. Mezcla de varias especies químicas que absorben luz de la misma longitud de on onda da:: las las espe especi cies es “c “com ompe petitirá rán” n” en entre tre sí po porr la luz, luz, cada cada una una con con dife difere rent nte e absortividad. En ela caso del punto uno, la mejor forma de evitar esta situación la muestra cuantificar. Para el punto tres, es necesario corroborar queesladiluyendo cantidad

 

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de luz absorbida por el solvente no es significativa. Para ello, se debe utilizar cada vez que se hace una determinación espectrofotométrica el blanco reactivo.   Este procedimiento se conoce comúnmente como “calibración del cero” Las Proteínas El nombre proteína proteína proviene  proviene de la palabra griega “proteion” que significa primero. La Lass pr prot oteí eína nass ocup ocupan an un lu luga garr de má máxi xima ma impo import rtan anci cia a entre entre las las mo molé lécu cula lass constituy cons tituyente entess de los sere seress vivo vivos. s. Prác Práctica ticamente mente todos los proc procesos esos bio biológi lógicos cos dependen de la presencia y/o actividad de este tipo de sustancias. Bastan algunos ejem ejempl plos os pa para ra da darr id idea ea de la va vari ried edad ad y tras trasce cend nden enci cia a de func funcio ione ness a ella ellass asigna asi gnada das. s. So Son n pr prote oteína ínass cas casii tod todas as la lass enz enzima imass que que cat catali alizan zan las rea reacci ccione oness bioquímicas en organismos vivientes, así como muchas hormonas, reguladores de actividadess celulares y otras molécula actividade moléculass con ffunciones unciones de transporte en la sangre. De igual manera los anticuerpos son polipéptidos, así como los receptores celulares, las proteí pro teína nass res respon ponsab sables les del del aco acorta rtamie miento nto del mús múscul culo o dur duran ante te la con contra tracci cción ón y aquellas macromoleculares macromoleculares integrantes de las fibras de los tejidos de sostén. Niveles de estructuración de las proteínas primaria es la forma de organización más básica de las proteínas. La estructura primaria es Está determinada por la secuencia de aminoácidos de la cadena proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados por medio de enlaces peptídicos. La secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica determina el tipo de interacciones interaccion es electrónicas que se producirán, existen: Aminoácidos hidróf Aminoácidos hidrófobos obos alifát alifáticos icos:: Gli Glicin cina a (Gl (Gly), y), Ala Alanin nina a (Al (Ala), a), Val Valin ina a (Va (Val), l), Isoleucina (Ile), Leucina (Leu)): Aminoácidos hidrófobos aromáticos: aromáticos: Fenilalanina (Phe), Tirosina (Tyr), Triptófano (Trp): Aminoácidos polares sin carga neta: neta : Treonina (Thr), Serina (Ser), Asparagina (Asn) (As n),, Glu Glutam tamin ina a (Gl (Gln)) n)),, áci ácido doss (As (Aspa parta rtato to (As (Asp), p), Glu Glutam tamato ato (Gl (Glu) u))) y básic básicos os (Histidina (His), Lisina (Lys), Arginina (Arg).  Además existe Cisteína (cys): que posee un grupo tiol reactivo capaz de oxidarse formando puentes disulfuro (S-S). y la prolina que posee su estructura cíclica. La estructura secundaria de secundaria de las proteínas es el plegamiento regular local entre residuos aminoacídicos cercanos de la cadena polipeptídica. Hélice alfa: En alfa: En esta estructura la cadena polipeptídica se enrolla en espiral sobre sí misma debido a los giros producidos en torno al carbono alfa de cada aminoácido. Esta estructura estructura se manti mantiene ene gracias a los enla enlaces ces de hid hidróge rógeno no intr intracate acatenari narios os formados entre el sigue. grupo -NH de un enlace peptídico y el grupo -C=O del cuarto aminoácido que le

 

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Láminas beta o láminas plegadas: algunas plegadas: algunas regiones de proteínas adoptan una estructura en zigzag y se asocian entre sí estableciendo uniones mediante enlaces de hid hidróge rógeno no inte intercat rcatenar enarios. ios. Todo Todoss los enla enlaces ces pept peptídico ídicoss parti participa cipan n en esto estoss enlaces confiriendo gran estructura. La forma entídica beta es una una cruzados, con confor formac mación ión sim simpl ple easí for formad mada aestabilidad por dos aolamás cad caden enas as polip polipep eptíd icass paralelas   (q paralelas antíparalelas   (que (qu ue cor orrren en el mi missmo sen senti tid do) o antíparalelas (que corr corren en en direcciones opuestas). La est estruct ructura ura ter terciar ciaria ia   de la lass pr prot ote eínas ínas es el mo modo do en el qu que e la cade cadena na polipeptídica polipeptídi ca se pliega en el espacio. Es la disposición de los dominios en el espacio es decir esta adquiere forma tridimensi tridimensional onal de manera precisa como en las proteinas globulares. Poseen cantidades variables de helices-alfa y beta y otras con una estructura flexible que puede cambiar al azar (random coil). La estructura terciaria se realiza de manera que los aminoácidos apolares se sitúan hacia el interior y los polares hacia el exterior. La estructura cuaternaria deriva cuaternaria deriva de la conjunción de varias cadenas peptídicas que, asociada asociadas, s, conf conforma orman n un ente ente,, un multímero (homo o hetero), hetero) , que posee propiedades distintas a la de sus monómeros componentes. Dichas subunidades se asocian entre sí mediante interacciones no covalentes, como pueden ser puentes de hidró hi dróge geno, no, intera interacci ccione oness hi hidro drofób fóbic icas as o pue puente ntess sal salin inos. os. Pa Para ra el cas caso o de una pr prot oteí eína na cons constititu tuid ida a po porr do doss mo monó nóme meros ros,, un dí dímer mero o, éste puede ser un homodímero,, si los monómeros constituyentes son iguales, o un heterodímero homodímero heterodímero   si no lo son. En cuanto a uniones covalentes, también pueden existir uniones tipo puente disulfuro entre residuos de cisteína situados en cadenas distintas.

Fig. 7: Niveles de estructuración de una proteína.

 

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Métodos para la cuantificación de proteínas: ventajas e inconvenientes Se han descrito numeroso métodos de cuantificación de proteína, cada uno con ventajas y desventajas, la elección del método se debe hacer de acuerdo a la sensibilidad del método, tipo pro sensibilidad proteína, teína, interferenci interferencias as y la se sencillez ncillez d del el mé método. todo. Los métodos de cuantificación están basados en reacciones químicas, absorción ultravioleta, ultraviole ta, fluorescencia fluorescencia y determinaci determinación ón del nitrógeno. Metodos cualitativos Reacción Xantoproteica, es un método cualitativo, se puede utilizar para determinar  la ca cant ntid idad ad de pr prot oteí eína na so solu lubl ble e en un una a solu soluci ción ón,, em empl plea eand ndo o ácid ácido o nítr nítric ico o concentrado.. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácid concentrado aminoácidos os portadores de grupos aromáticos, aromáticos , especialmente en presencia de tirosina. Si una oscuro. vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo oscuro. Método turbidimetri turbidimetrico co a) Absorción de proteínas Las proteínas absorben en un rango amplio del espectro UV, donde regiones 210280 nm corresponden al enlace peptídico. b) Precipitante Precipitantes: s: La Lass pro proteí teínas nas pre precip cipita itan n cua cuand ndo o se me mezcl zclan an con soluc solucio ione ness dilu diluida idass de áci ácido do tricloroacetico, tricloroace tico, sulfa salicílico o ferrocianuro de potasio en ácido acético. El rango útil es de 0,1 y 0,3 mg. de proteína agregada. Métodos colorimétricos cuantitativos método de  de  Lowry (1951), (1951), corresponde al método colorimétrico más difundido, la reacción consta de dos etapas: a) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu 2+proteí pro teína na tienen tienen un color azul claro. claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura estru ctura tridime tridimensio nsional nal de la pro proteína teína,, expo exponié niéndos ndose e los resi residuos duos fenó fenólico licoss de 2+ tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu  se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. Folin-Ciocalteau,, por los B) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau grupos gru pos fen fenóli ólicos cos de lo loss res residu iduos os de tirosi tirosina na,, pre presen sentes tes en la may mayorí oría a de las las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente constituyente del reactivo fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, amarillo, que al de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, intenso. ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

 

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Fig. 8: Reacción del método Lowry.

Método de Biuret Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO 4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC 4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de ca cade dena na co cort rta. a. El Hi Hidr dróx óxid ido o de Po Pota tasi sio o no part partic icip ipa a en la reac reacci ción ón,, pero pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. Permite detectar los oligopéptidos de tres y más aminoácidos. La prueba consiste en la formación de un complejo entre al menos dos enlaces peptídicos consecutivos con un ión cúprico Cu(ll) en medio alcalino. El complejo es de color  violeta y la intensidad depende del número de enlaces presentes, la cantidad de reactivo añadida debe ser controlada para evitar positivos falsos. El nombre se proviene del compuesto “Biurea” (NH 2-CO-NH-CO-NH 2) el cual da positiva la prueba.

A

B

  Fig. 8: A, Reacción del método Biuret, B, estructura de la Bi-urea.

Método de Bradford, Bradford, utiliza la propiedad del co colorante lorante azul de Coomasie Coomasie G -250 de unirse a la proteína. El colorante presenta un máximo de absorción a 465 nm, cuando está unido a proteína éste es de 598 nm, las proteínas deben ser incubadas

 

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al menos 5 minutos con el reactivo. Este método sirve para medir en el rango de 10 μg de proteína. Método BCA BCA,, El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar  1+

un complejo púrpuraanalítico intenso con iones  en medio Esteproducido reactivo forma la base de un método capaz de Cu monitorizar el alcalino. ión cuproso en una reacción entre las proteínas con Cu2+  en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de pr prot oteí eína nass qu que e es se senc ncilillo lo,, rá rápi pido do,, mu muyy sens sensib ible le,, y que que mu mues estra tra una una gran gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos. Se incuba a 10 min a 60 ºC y se lee Absorbancia a 562 nm frente al blanco   OHProteína + Cu2+ → Cu1+ Cu1+ + BCA → complejo púrpura BCA-Cu1+ Tabla 1: Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de sensibilidad.

 

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Tabla II. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e inconvenientes

En este trabajo práctico se compararán las metodologías de cuantificación por el método de Biuret y Bradford, se realizarán curvas de calibración y se determinarán muestras problema. Cuantificación de proteínas método Biuret y Bradford. Comparación de ambos métodos. 2. OBJETIVOS - Realizar una curva de calibración de proteínas usando método de Biuret y Bradford - Determinar la concentraci concentración ón de proteína de una muestra problema. 3. REACTIVOS, SOLUCIONES, MATERIALES Y EQUIPOS Reactivo de Biuret Reactivo de Bradford Solución estándar seroalbumina de bovino (BSA) 10 mg/mL (20 ml por sección) y 1 mg/ml (a partir de una dilución de la anterior, preparar 4 ml por sección), mantener a 4 grados, preparar en agua destilada autoclavada (esteril) para evitar contaminación.  Agua destilada destilada Espectrofotómetro Espectrofotóme tro visible Tubos de ensayo 5-10 ml Cubetas de 1 ml. Tubos dede 1,5plástico, ml

 

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4. PROCEDIMIENTO CUANTIFICACIÓN POR METODO DE BIURET 1.- Preparación de Reactivo de Biuret. Coloque 1,5 g. de CuSO 4 X H2O y 6 g de ta tartrato rtrato de sod sodio io y potasio (NaKC4H4O6 X 4 H2O). Agr Agreg egue ue al alred reded edor or de 500 ml de ag agua ua desti destila lada da y agi agite te hasta hasta la diluci dilución. ón. Posteriormente agregue lentamente y agitando constantemente, 300 ml NaOH 2.5 N. Las dos soluciones soluciones deben estar a tempera temperatura tura ambiente. Agregar 1.0 g de yodu yoduro ro de potasio y agite hasta que éste totalmente disuelto. Llevar a un volumen final de 1 L y guardar en un frasco de vidrio oscuro. Este reactivo es estable indefinidamente. indefinidamente. 2.-Curva de Calibración de proteína. Tome seis tubos de ensayo ensayo y coloque en ello elloss volúmenes de sol solución ución estándar qu que e contengan 2, 4, 6, 8 y 10 mg de albúmina, de acuerdo a la solución patrón. El sexto tubo corresponderá al blanco donde no se agregará proteínas. 3.- En los tubos dond donde e está pre presente sente la muestra patr patrón ón llével llévelo o e 1 mL con agua destilada, incluido el blanco. Agregue 4 ml de reactivo Biuret a cada tubo (incluido el blan blanco co). ). Me Mezc zcle le bi bien en,, de deje je de desa sarr rrol olla larr el colo colorr dura durant nte e 30 min, min, lueg luego o mida mida absorbancia a 540 nm 4.- Determinación de la concentración de proteínas de la muestra problema, agregue 1 ml de agua a la muestra problema entregada por su ayudante, agregue 4 ml de reactivo Biuret, agite y deje desarrollar color por 30 min y mida absorbancia a 540 nm. 5.5.- Si es ne nece cesa sari rio o di dilu luir ir la mues muestra tra,, re repi pita ta el proc proced edim imie ient nto o toma tomand ndo o las las consideraciones adecuadas para esta nueva medición. 6.Interferentes de la medición: Repitaen la un determinación muestra problema, agregando los siguientes interferentes tubo de 1,5 de ml la nuevo, recuerde que sus muestras quedarán a la mitad de la concentración debido al volumen de interferente agregado INTERFERENTE Dodecil sulfato de sodio (SDS)  Acido tricloroacético tricloroacético (TCA)

1% 20%

CONCENTRACIÓN FINAL 0,5 % 10 %

7.- Cazadores de Mitos: Se dispone de 3 muestras de leche: Leche entera, leche semidescremada semidescrem ada y leche descremada descremada.. Determine si las 3 muestras poseen la misma cantidad de proteínas. Puede que resulte necesario diluir la muestra 10 veces, los fabricantes indican que la Leche posee 3 gramos de proteínas por cada 100 ml de leche.

 

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Bioquímica de los Alimentos I Facultad Tecnológica Depto. Dep to. d de e Cienci Ciencias as y Tecn Tecnolo ología gía de los los Alime Alimento ntoss UNIVE UNIVERSI RSIDAD DAD D DE E SA SANTI NTIAG AGO O DE CH CHILE ILE Elaborado por: Bq Myriam Pizarro Cruz, Dr. (C) Waldo Díaz Vásquez

CUANTIFICACIÓN POR MÉTODO DE BRADFORD 1.-Reactivo siguiente modo: mezclar 10 mg de Coomassie Blue100 G-250 con 10 ml depreparado fosfórico del al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto. Añadir H2O hasta ml. Filtrar a través de papel de filtro y guardar en la oscuridad. 2.- Tome 6 tubos de 1,5 ml y agregue 1 ml de reactivo de Bradford, el sexto tubo corresponde al blanco que contendrá solo Bradford. Agregue a cada tubo 2, 4, 6, 10 y 12 µl de BSA 1 ug/ul, agite y deje reaccionar por 5 minutos, luego realice la determinación. 3.- Para realizar la determinación de la muestra problema, agregue 2 ul de la muestra problema a 1 ml de reactivo de Bradford, agite y deje reaccionar por 5 minutos, luego realice la determinación. 6.- Interferentes de la medición: Repita la determinación de la muestra problema, agregando los siguientes interferentes en un tubo de 1,5 ml nuevo, recuerde que sus muestras quedarán a la mitad de la concentración debido al volumen de interferente agregado INTERFERENTE Dodecil sulfato de sodio (SDS)  Acido tricloroacético tricloroacético (TCA)

1% 20%

CONCENTRACIÓN FINAL 0,5 % 10 %

7.- Casadores de Mitos: Se dispone de 3 muestras de leche: Leche entera, leche semidescremada semidescrem ada y leche descremada descremada.. Determine si las 3 muestras poseen la misma cantidad de proteínas. Puede que resulte necesario diluir la muestra 10 veces, los fabricantes indican que la Leche posee 3 gramos de proteínas por cada 100 ml de leche. RESPONDA EN EL INFORME ¿Qué es el SDS y el TCA? ¿Qué provocan en la muestra?¿Cómo ocurre esto? ¿Cómo se realiza el proceso de “descremado” de la leche? 5. BIBLIOGRAFÍA   

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 Amato M, S y Granados Granados P, F. (1994) (1994) Manual de Laboratorio. Laboratorio. Cátedra de Bioquímica. Bioquímica. Universidad Nacional. Nacional.  Angulo Ugalde, Ugalde, Y. (1999) Bioquímic Bioquímica a Manual de Laboratorio. Laboratorio. Universidad de Costa Costa Rica. Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254. Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein using bicinchoninic acid.  Anal Biochem Biochem 150: 76-85. Kaplan, Kap lan, L et al. (1989) Clinical Clinical Chemistry: Chemistry: theory, analysi analysiss and correlation. correlation. 2nd edit edition. ion. CW. Mosb Mosbyy Company Lehninger, Albert (1993). Principles of Biochemistry, 2nd Ed.. Worth Publishers. ISBN 0-87901-711-2. Lodish y col.(2005). Biología celular y molecular (5ªEd.). Editorial Médica Panamericana. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. y Randall R.J. (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275 Mathews C., Van Holde K. E., Ahern. K. (2003). Bioquímica (3ªEd.).Addisson (3ªEd.).Addisson Wesley.

 

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR METODO DE CUANTIFICACIÓN BIURET Y BRADFORD

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BQ1L001 1/2019 03

Bioquímica de los Alimentos I Facultad Tecnológica Depto. Dep to. d de e Cienci Ciencias as y Tecn Tecnolo ología gía de los los Alime Alimento ntoss UNIVE UNIVERSI RSIDAD DAD D DE E SA SANTI NTIAG AGO O DE CH CHILE ILE Elaborado por: Bq Myriam Pizarro Cruz, Dr. (C) Waldo Díaz Vásquez 

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Monod J., Wyman J., Changeux J.P.. (1965). On the nature of allosteric transitions:A plausible model. J. Mol. Biol., May;12:88-118. Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley & Sons, New York. Switer R., Garrry, L. (1999) Experimental Biochemistry, Biochemistry, Theory and Exercises in Fundamental Methods. 3º ed. W.H. Freemand and Co. N.Y.