Cromatografia

 

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Luís H. Melo de Carvalho

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Luís H. Melo de Carvalho

CLASSIFICAÇÃO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

EM COLUNA

Classificação geral

 Amostra

Fase móvel

Método

específico

Fase estacionária

Tipo de equilíbrio

Cromatografia líquida

Líquido-líquido

Líquido adsorvido

Partição entre líquidos

(LC)

ou partição

num sólido

imiscíveis

Líquido-fase

Espécies

Partição

ligada

orgânicas ligadas

líquido/superfície ligada

(fase móvel: líquido)

A+B

a uma superfície sólida

B A

Líquido-sólido ou

Sólido

Adsorção

Resina de troca

Troca iónica

adsorção Troca iónica

iónica

B A

Exclusão por

Líquido nos

tamanho

interstícios de um

Partição/peneiragem

sólido polimérico Cromatografia gasosa

B

A   r    t   o   c   e    t   e    d   o    d    l   a   n    i    S

t0

t1

t2

Gás-líquido

(GC)

B Detector 

A

(fase móvel: gás)

t4

t1

t2 Tempo

t3

Espécies

Partição gás/superfície

orgânicas ligadas

ligada

a uma superfície

B

sólida Gás-sólido

t0

Partição gás/líquido

num sólido

Gás-fase ligada

t3

Líquido adsorvido

t4

Sólido

Adsorção

Cromatografia de

Partição fluido

fluido supercrítico

supercrítico/superfície

(SFC)

ligada

(fase móvel: fluido supercrítico)

1

 

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SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

TEORIA DA CROMATOGRAFIA

t1 Fase móvel

A   o    ã   ç   a   r    t   n   e   c   n   o    C

Fase estacionária

K  =  =

C S C M 

B t2

A B Distância migrada

ALARGAMENTO DE BANDA

MELHORANDO A SEPARAÇÃO Comportamento ideal   r   o    t   c   e    t   e    d   o    d   a    t   s   o   p   s   e    R

Cromatograma original   r   o    t   c   e    t   e    d   o

Tempo

Comportamento real

 Aumento da separação

   d    l   a   n    i    S

das bandas

Diminuição do alargamento das bandas

Tempo

Tempo

2

 

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ALGUMAS QUANTIDADES IMPORTANTES

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QUANTIDADES IMPORTANTES (CROMATOGRAMA) Tempo de retenção (Tr ) Tr = Testacionária + Tmóvel

Tr    r   o    t   c   e    t   e    d   o    d    l   a   n    i    S

Tm

Tempo morto (Tm)

T’r 

W1/2

Tempo de retenção ajustado (Tr ’) Tr ’= Tr  - Tm

0 Tempo

Factor de retenção (k’) medida de retenção na fase estacionária

Tm= tempo morto

k' =

Tempo que o analito passa na f ase estacionária Tempo que o analito passa na f ase móvel

=

Tr = tempo de retenção total

=

T’r = tempo de retenção ajustado (ou líquido)

Tr  − Tm Tm

=

Tr ' Tm

W1/2 = largura do pico a meia altura

Coeficiente de separação ou selectividade (α) medida de retenção na fase estacionária

a

=

k'2 k'1

=

(Tr )2 − Tm (Tr )1 − Tm

3

 

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PROCESSOS CINÉTICOS QUE CONTRIBUEM

ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO

PARA O ALARGAMENTO DOS PICOS H  =

  s   a    l   u   c    é    l   o   m   e    d    º    N

Processo

+ C S u  + C M u

Termo na equação

Relação com as propriedades da

L (L-1σ)

coluna e do analito

(L+1σ) Difusão longitudinal

B u

Transferência de massa

B

 

u

C S u   C S u

(fase estacionária líquida*) estacionária  líquida*)

Distância migrada

Transferência de massa

Enchimento

Introdução da amostra

B u

DETERMINAÇÃO DE H E N 

C S u  

=

(fase estacionária sólida**) estacionária  sólida**)

2 k D DM 

u

 

qk ' d f 2u ( 1 + k '  ) 2 DS

C S u = 

2t d k ' u

( 1 + k '  ) 2

 

 

Detector 

C M u  

Transferência de massa

C M u

(fase móvel )   r   o    t   c   e    t   e    d   o    d    l   a    i   n    S

=

Tr 

=

2 f ( d  p2 ,d c  ,u )

DM 

u 

f : “função de”; k D, q : constantes; t d  tempo médio de dessorção do analito da superfície; d c : diâmetro da coluna; B: coeficiente de difusão longitudinal; C S e C M : coeficientes de transferência de massa nas fases estacionária e móvel, respectivamente. * a fase estacionária é um líquido imiscível imobilizado ** a fase estacionária é uma superfície sólida onde ocorre adsorção.

Tm

Variável

Símbolo Unidades

Velocidade linear da fase móvel

W 

(a)

Coeficiente de difusão na fase móvel   (a)

Coeficiente de difusão na fase estacionária  

Tempo

-1

u

cm.s  

DM  

cm .s  

DS 

cm .s  

2

-1

2

-1

Coeficiente de capacidade

k’

-

Diâmetro de partícula do enchimento

d  p 

cm

Espessura do revestimento líquido na fase estacionária

d f f  

cm

(a)

 Aumenta quando a temperatura aumenta e a viscosidade diminui

4

 

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EQUAÇÃO DE VAN DEEMTER   m   c  ,

 H 

 B

= + C S u  + C   M  u

ALARGAMENTO DE BANDAS

H 

Efeito de percursos múltiplos

u

Largura de banda inicial

      H

  a   r   a   p   o    ã   ç    i   u    b    i   r    t   n   o    C

C Su

1

2

C M u

B/u Velocidade linear de fluxo, cm/s

Largura de banda final

glc 2

4

6

8

10

8

0.8 GLC

6   m   m  ,

      H

Fase móvel “estagnada”

0.6

Fluxo de fase móvel

0.4

4 LC 2

0.2

1.0

Grau de alargamento de banda

2.0

Velocidade linear de fluxo, cm/s

lc

5

 

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SEPARAÇÃO E RESOLUÇÃO

LARGURA DE PICO NA BASE (W) E A MEIA ALTURA (W 1/2)

RS=0.75

 A

B

RS=1.0

  r   o    t   c   e    t   e    d   o    d    l   a   n    i    S

 A

B

(Tr )B

Tm

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RS=1.5

∆Z

(Tr ) A

B

W A

W 1/2= 2.35σ

h

h 2

 A W A/2

  r   o    t   c   e    t   e    d   o    d   a    t   s   o   p   s   e    R

WB/2

W = 4σ

Tempo WB

Tempo

6

 

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TÉCNICAS PARA MELHORAR A RESOLUÇÃO Objectivo: Separações eficientes em tempos de análise curtos.

EFEITO DO COMPRIMENTO DA COLUNA NA RESOLUÇÃO E NO TEMPO DE RETENÇÃO

1. Aumenta Aumentarr a distância distância entre os picos, ∆Tr =T2-T1 (a) Aume Aumentar ntar o comprim comprimento ento da coluna coluna,, L (b) Aume Aumentar ntar a quantid quantidade ade de fase fase estacion estacionária ária,, VS ou VL (c)

•• •

Usar um coefi coeficien ciente te de selecti selectivida vidade de melhor, melhor, α=T2’/T1’

Diminuir a temperatura Escolher uma fase estacionária diferente Escolher uma fase móvel diferente (se for líquida)

2. Diminuir a largura da banda, W (a) Usar um enchim enchiment ento o mais mais unifor uniforme me

• •

Encher mais cuidadosamente Usar partículas mais pequenas

(b) Aumentar Aumentar a área área de interf interface ace entre entre as as fases fases (c) Opti Optimiza mizarr a vel velocid ocidade ade de flux fluxo o (d) Redu Reduzir zir o tamanh tamanho o da da amost amostra ra (e) Redu Reduzir zir o esp espaço aço mort morto o no sist sistema ema (f) Reduzir Reduzir a cons constant tante e de temp tempo o do dete detector  ctor  (g) Dimin Diminuir uir o diâme diâmetro tro da colu coluna na

7

 

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EFEITO DO TAMANHO DE PARTÍCULA E H 

EFEITO DA TEMPERATURA TEMPERATURA NA CG Isotérmica a 45ºC 1

0.2

2

0.6 –0.8 mm

  m   c  ,

4 3

0.4 –0.6 mm 0.3 –0.4 mm

      H

5

0.1

x4

0.25 –0.3 mm

Isotérmica a 145ºC

5

0.1 –0.15 mm

6 5

10

15

20 7

Velocidade linear, cm/s

8

EFEITOS DO FACTOR DE CAPACIDADE

Programada de 30ºC a 180ºC

Resolução, RS 4

   ’    Q    /    B    )   r    T    (   u   o      Q    /    S    R

Tempo de eluição, (T r )B

1 2

5

3

10

0

5 .0

10.0

Coeficiente de capacidade, k’B

15.0

30º

60º

7

Tempo (min) 90º

9

8

6

20

120º

30

150º

180º

Temperatura (ºC)

8

 

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Luís H. Melo de Carvalho

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Luís H. Melo de Carvalho

EFEITO DA COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL

PARÂMETROS USADOS NAS TÉCNICAS

NA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

DE OPTIMIZAÇÃO Variação de N 

70% metanol, 30% água

 Alteração do comprimento da coluna 60% metanol, 40% água 50% metanol, 50% água

40% metanol, 60% água

Variação de H   Alteração da velocidade do fluxo da fase mó vel  Alteração do tamanho de partícula do en chimento  Alteração da espessura do filme líquido q ue serve de fase estacionária (LC)  Alteração do diâmetro da coluna  Alteração da viscosidade da fase móvel (e assim DM  ou ou D  DS)  Alteração da temperatura da coluna (GC)

Variação de k’ e de α  Alteração da temperatura Tempo de retenção, min

1 → 9,10-antraquinona

 Alteração da composição da fase móvel  Alteração do enchimento da colu na Utilização de efeitos químicos especiais

2 → 2-metil-9,10-antraquinona 3 → 2-etil-9,10-antraquinona 4 → 1,4-dimetil-9,10-antraquinona 5 → 22-t  t -butil-9,10-antraquinona -butil-9,10-antraquinona

9

 

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Luís H. Melo de Carvalho

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EFEITOS DE αE N NA RESOLUÇÃO DE PICOS

VARIAÇÃO DA RESOLUÇÃO Tm

Inicial

diminuir k’ 

Factor de separação fraco N pequeno N  pequeno

Factor de separação bom N pequeno N  pequeno

Factor de separação fraco elevado N elevado N 

Factor de separação bom elevado N elevado N 

aumentar k’ 

Variação de k’ 

 Aumento de N 

 Aumento de

  r   o    t   c   e    t   e    d   o    d   a    t   s   o   p   s   e    R

α

Tempo

10

 

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Luís H. Melo de Carvalho

O PROBLEMA GERAL DA ELUIÇÃO

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Luís H. Melo de Carvalho

Razão de altura dos picos = 1:1 RS = 0.4

  r   o    t   c    t   e   e    d   o    d    l   a   n    i    S

0.5

0.6

0.8

1.0

0.7

1.25

Razão de altura dos picos = 8:1 RS = 0.4

0.5

0.6

0 .7

Tempo

0.8

1.0

1.25

11

 

Complementos de Química I 

Luís Herculano Melo de Carvalho

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SOBREPOSIÇÃO DE PICOS

SOBREPOSIÇÃO DE PICOS 1) Localização Posição aparente

Erro na quantificação por área de pico Rs = 1 1 :1

4:1

100%

96%

Posição verdadeira

8:1

16:1

2) Medição de áreas 93%

88%

% erro na área do pico menor = (% indicada -100 %) % erro na área do pico maior = - (1/x) % erro na área do pico menor

12

 

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Luís H. Melo de Carvalho

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  EXPRESSÕES E QUANTIDADES IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA QUANTIDADES EXPERIMENTAIS EXPERIMENTAIS IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA

Nome Tempo morto Tempos de retenção (de  A e de B) Tempo de retenção ajustado (de  A e de B)

Símbolo T m 

Nome Velocidade linear da fase

Determinada a partir de:

Cromatograma

u  =

móvel Volume da fase móvel

(T’  ) r  A e r  (T’  ) r  B  r 

V M  = T m F   k ' =  (T r  − T m )   T m

Coeficiente de capacidade

(T’  )  ) r  A= (T  r  r  A - T m  r 

K  =  =

W  A e W B  Cromatograma

Comprimento do enchimento da coluna Velocidade média das moléculas da fase móvel Volume da fase estacionária

L u

Medição directa

Factor de selectividade

Medição directa Resolução

V S 

=

α

R S

=

2

C M  e C S 

k ' V M   

(T r  )B

− (T r  ) A + W B

α

 

2

enchimento

Nº de pratos

Análise e dados da preparação

 Altura de prato

 T r           W   

  N  = 16 

R S

=

=

k ' B

=

k '  A

N  α  4

C M 

   

K B   K  A

k '     − 1     B     1 + k ' B    

α

2

 1  + k ' B       α  2         k ' B    α − 1      

N  = 16R S2 

H  = L   = N  2

Tempo de retenção

C S  

K  =  =

V S

W  A

Dados da preparação do

k '  = KV S   V M 

(T r  )B − T m   (T r  ) A −  T m

Concentração de analito nas fases móvel e estacionária

quantidades

L   T m

(T  ) r  A e (T  ) r  r  B  Cromatograma r 

Coeficiente de partição Largura de picos (de  A e de B)

Relação com outras

Expressão

(T r  )B =

2       (1 + k ' B )3        − 1   (k ' B )2

  16R S H  u

α

α

13

 

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Luís H. Melo de Carvalho

COMPONENTES FUNDAMENTAIS DE UM SISTEMA DE GC Injector 

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COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA

Detector 

Tipo de coluna Capilar  Característica Comprimento (m)

Enchimento

(WCOT) 10 - 100

1-6

Diâmetro interno (mm)

0.25 – 0.75

2-4

Eficiência (pratos/m)

1000 - 4000

500 - 1000

Gás de arraste Q uan uantt ida idade de de am amos ostt ra ra (n (ng) g) Forno

Coluna

Gás de arraste

Pressão relativa Tratamento de dados

Velocidade re relativa

3

10 - 10 10

10 - 106

Baixa

Alta

Rápida

Lenta

INJECTOR DIRECTO COLUNA TUBULAR ABERTA ( ou COLUNA

Septo Coluna

Seringa

Purga do septo

CAPILAR )

 Agulha da seringa

Câmara de vaporização

Gás de arraste

14

 

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Luís H. Melo de Carvalho

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EFICIÊNCIA DE COLUNAS CAPILARES E EMPACOTADAS

GASES DE ARRASTE

106

N2 1.2

 )  C O T   W    (  (   s  e   e  la r  i l  a  C a p

105       N

104

1.0    )   m 0.8   m    (

 a d a s  a  a c o t  E m p

      H

103

He

0.6

H2

0.4 102

10

103

104

0.2

Tempo (s) 20

40

60

80

2.0 Velocidade linear média (cm/s)    )   m   m    (

      H

 a s  a d   t a  c o  a   p   E  m

1.5

1.0

 WCO T )  s  ( W  lare s Cap i la

0.5

20

40

60

Velocidade linear média (cm/s)

15

 

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DETECTOR DE EMISSÃO ATÓMICA

DETECTOR DE IONIZAÇÃO DE CHAMA

Bateria de díodos

Colector 

Rede de difracção

170 nm 250 nm 480 nm

ar  Chama ar-H2

656 nm

Bico de queima

Plasma

690 nm 748 nm 777 nm

H2

Parede do forno

Coluna

Gás de complemento

Coluna

 Amostra duma gasolina Monitoração da linha do C

DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA

Fluxo de saída

  r   o    t   c   e    t   e    d   o 0    d    l   a   n    i    S

0

Fluxo de entrada

10

20

30

Monitoração da linha do O

1

2

3

4

5

Tempo (min)

16

 

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SISTEMA DE INJECÇÃO DA AMOSTRA COMPONENTES PRINCIPAIS DE UM SISTEMA DE HPLC 2) Injecção da amostra

1) Carregamento da amostra

“loop”

“loop”

Unidade de injecção Para a coluna

Para a coluna

Coluna Da bomba

Solventes

Detector 

Da bomba Saída

Saída

DETECTOR DE UV PARA HPLC Da coluna

Bomba + sistema de gradiente

Janelas de quartzo

 Aquisição e processamento de dados

Fonte de UV

Detector 

Para o esgoto

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EFEITO DA ELUIÇÃO EM GRADIENTE

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Mistura de clorobenzenos Eluição Eluiçã o em gradiente gradiente

Polaridades dos solutos: A > B > C

Inicio: 40:60 (v/v) MeOH/H2O

Eluição isocrát isocrática ica

MeOH ä 8%/min

50:50 (v/v) MeOH/H2O

Fase normal

Fase reversa

Fase móvel de polaridade baixa

Fase móvel de polaridade alta

C

B

A

Tempo

 A

B

C

0

5

Tempo

10 1 0 15 20 Tempo (min)

25

30

0

5

10 1 0 15 20 Tempo (min)

25

30

BOMBA RECÍPROCA PARA HPLC Fase móvel de polaridade média

Fase móvel de polaridade média Coluna Junta selada

C B A Tempo

 A B C

Motor 

 Amortecedor  de pulsações

Válvulas de esfera

Tempo

Pistão de vaivém Solvente

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APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA IÓNICA

Eluente:

Eluente:

NaHCO3 0.0028M / Na2CO3 0.0023M

Fenilenodiamina.2HCl 0.025M / HCl 0.0025M

Volume de amostra: 50 µL

Volume de amostra: 100 µL

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