Cromatografía USP-NF 〈621〉

Cromatografía USP-NF 〈621〉

17/4/23, 17:23 Impreso el: Mon Apr 17 2023, 17:22:33 pm Impreso por: COORDINACION SERVICIO AL CLIENTE Estado: Oficial Vigente al 17-abr-2023 Fecha oficial: Oficial desde 01-abr-2023 Tipo de Documento: Capítulo General DocId: GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_7_es-ES DOI: https://doi.org/10.31003/USPNF_M99380_07_01 DOI Ref: j7nh2 No Distribuir © 2023 USPC

AVISO: Disponible en inglés próximamente.

〈 621 〉 CROMATOGRAFÍA (Las secciones System Sensitivity y Peak Symmetry se harán oficiales el 1 de diciembre de 2023 como se indica).

INTRODUCCIÓN Las técnicas de separación cromatográficas son procedimientos de separación de varias etapas en los que los componentes de una muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado sobre un sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar empaquetada en una columna, esparcida como una capa o distribuida como una película, etc. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida o un fluido supercrítico. La separación puede basarse en adsorción, distribución de masa (partición), intercambio iónico, etc., o puede basarse en diferencias en las propiedades fisicoquímicas de las moléculas, como tamaño, masa, volumen, etc. Las partes del texto del presente capítulo general que son texto nacional USP–NF y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, están

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marcadas con símbolos (♦♦) para especificar este hecho.

♦Este capítulo describe procedimientos generales, definiciones y cálculos de parámetros comunes y requisitos generalmente aplicables para la idoneidad del sistema.

Los tipos de cromatografía útiles en el análisis cualitativo y cuantitativo empleados en los procedimientos de la USP son columna, gas, papel, capa fina (incluida la cromatografía de capa fina de alto rendimiento) y cromatografía líquida presurizada (comúnmente llamada cromatografía líquida de alta presión o de alto rendimiento). cromatografía).

PROCEDIMIENTOS GENERALES

Esta sección describe los procedimientos básicos que se utilizan cuando se describe un método cromatográfico en una monografía. Se siguen los siguientes procedimientos a menos que se indique lo contrario en la monografía individual.

Cromatografía en papel fase estacionaria

La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y espesor adecuados. El desarrollo puede ser ascendente, en el cual el solvente es

O

transportado por el papel por fuerzas capilares, o descendente, en el cual el flujo del solvente también es asistido por la fuerza gravitacional. La orientación del grano de papel con respecto al flujo de solvente debe mantenerse constante en una serie de cromatogramas. (La dirección de la máquina generalmente la designa el fabricante).

aparato

El equipo esencial para la cromatografía en papel consta de una cámara hermética al vapor con entradas para la adición de disolvente y una gradilla de material resistente a la corrosión unos 5 cm más corta que la altura interior de la cámara. La gradilla sirve de soporte para las cubetas de disolvente y para las varillas antisifón que, a su vez, sostienen las láminas cromatográficas. El fondo de la cámara se cubre con el sistema solvente prescrito o fase móvil. La saturación de la cámara con vapor de solvente se facilita revistiendo las paredes internas con papel humedecido con el sistema de solvente prescrito. punteo

La sustancia o sustancias analizadas se disuelven en un disolvente adecuado. Se colocan volúmenes convenientes de la solución resultante con micropipetas adecuadas, que normalmente contienen de 1 a 20 µg del compuesto, en puntos de 6 a 10 mm separados por no menos de 3 cm. procedimiento de cromatografía en papel descendente

1. Se suspende una hoja cromatográfica de puntos en el aparato, utilizando la varilla antisifón para sujetar el extremo superior de la hoja en el canal de disolvente. [ Nota : asegúrese de que la parte de la lámina que cuelga debajo de las varillas esté suspendida libremente en la cámara sin tocar el bastidor, las paredes de la cámara o el fluido de la cámara. ] https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_7_es-ES?source=Search Results&highlight=621

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2. La cámara se sella para permitir el equilibrio (saturación) de la cámara y el papel con el vapor del disolvente. Cualquier exceso de presión se libera según sea necesario. 3. Después de equilibrar la cámara, la fase móvil preparada se introduce en el canal a través de la entrada. 4. Se cierra la entrada y se permite que la fase solvente móvil viaje la distancia deseada por el papel. 5. La lámina se retira de la cámara. 6. La ubicación del frente del solvente se marca rápidamente y la hoja se seca. 7. El cromatograma se observa y mide directamente o después de un desarrollo adecuado para revelar la ubicación de las manchas del fármaco o fármacos aislados. procedimiento de cromatografía en papel ascendente

1. La fase móvil se agrega al fondo de la cámara. 2. La cámara se sella para permitir el equilibrio (saturación) de la cámara y el papel con el vapor del disolvente. Cualquier exceso de presión se libera según sea necesario. 3. El borde inferior de la fase estacionaria se sumerge en la fase móvil para permitir que la fase móvil se eleve en la hoja cromatográfica por acción capilar. 4. Cuando el frente del solvente ha alcanzado la altura deseada, se abre la cámara, se retira la lámina, se marca rápidamente la ubicación del frente del solvente y se seca la lámina. 5. El cromatograma se observa y mide directamente o después de un desarrollo adecuado para revelar la ubicación de las manchas del fármaco o fármacos aislados.

Cromatografía de capa fina fase estacionaria

La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y uniforme de material seco, finamente pulverizado, que se aplica a una lámina o placa de vidrio, plástico o metal (normalmente llamada placa). La fase estacionaria de las placas de cromatografía en capa fina (TLC) tiene un

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tamaño de partícula promedio de 10 a 15 µm, y la de las placas de TLC de alto rendimiento (HPTLC) tiene un tamaño de partícula promedio de 5 µm. Se pueden usar placas comerciales con una zona preadsorbente si se especifican en una monografía. La muestra aplicada a la región preadsorbente se convierte en bandas estrechas y nítidas en la interfase preadsorbente-adsorbente. Las separaciones logradas pueden estar basadas en adsorción, partición o una combinación de ambos efectos, dependiendo del tipo particular de fase estacionaria. aparato

Se utiliza una cámara cromatográfica hecha de material inerte, transparente y que tiene las siguientes especificaciones: una cubeta de fondo plano o doble, una tapa bien ajustada y un tamaño adecuado para las placas. La cámara está revestida en al menos una pared con papel de filtro. Se añade a la cámara suficiente fase móvil o disolvente de revelado para que, tras la impregnación del papel de filtro, se disponga de una profundidad adecuada a las dimensiones de la placa utilizada. La cámara cromatográfica se cierra y se deja equilibrar. [ Nota —A menos que se indique lo contrario, las separaciones cromatográficas se realizan en una cámara saturada. ] detección/visualización

A menudo se utiliza una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta (254 nm) y larga

O

(365 nm) y una variedad de reactivos de pulverización para hacer visibles las manchas. punteo

Las soluciones se colocan en la superficie de la fase estacionaria (placa) en el volumen prescrito en porciones suficientemente pequeñas para obtener puntos circulares de 2 a 5 mm de diámetro (1 a 2 mm en placas de HPTLC) o bandas de 10 a 20 mm × 1 –2 mm (5–10 mm × 0,5–1 mm en placas de HPTLC) a una distancia adecuada del borde inferior y los lados de la placa. [ Nota : durante el desarrollo, la posición de la aplicación debe estar al menos 5 mm (TLC) o 3 mm (HPTLC) por encima del nivel de la fase móvil. ]Las soluciones se aplican en una línea paralela al borde inferior de la placa con un intervalo de al menos 10 mm (5 mm en placas HPTLC) entre los centros de los puntos, o 4 mm (2 mm en placas HPTLC) entre los bordes de bandas, luego se deja secar. procedimiento

1. Coloque la placa en la cámara, asegurándose de que los puntos o bandas estén por encima de la superficie de la fase móvil. 2. Cierra la cámara. 3. Permita que la fase móvil ascienda por la placa hasta que el frente del solvente haya recorrido las tres cuartas partes de la longitud de la placa, o la distancia prescrita en la monografía. 4. Retire la placa, marque el frente del solvente con un lápiz y deje secar. 5. Visualice los cromatogramas según lo prescrito. 6. Determinar los valores del factor de retardo cromatográfico ( R ) para los puntos o zonas principales. F

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7. La identificación presuntiva se puede hacer mediante la observación de puntos o zonas de valor R idéntico y aproximadamente de F

igual magnitud obtenidos, respectivamente, con una cromatografía desconocida y estándar en la misma placa. Una comparación visual del tamaño o la intensidad de las manchas o zonas puede servir para una estimación semicuantitativa. Las mediciones cuantitativas son posibles mediante densitometría (mediciones de absorbancia o fluorescencia).

Cromatografía de columna apoyo solido

La tierra silícea purificada se utiliza para la separación de fases normales. La tierra silícea cromatográfica silanizada se utiliza para la cromatografía de partición de fase inversa. fase estacionaria

El soporte sólido se modifica mediante la adición de una fase estacionaria especificada en la monografía individual. Si se utiliza una mezcla de líquidos como fase estacionaria, mezclar los líquidos antes de la introducción del soporte sólido. fase móvil

La fase móvil se especifica en la monografía individual. Si la fase estacionaria es una solución acuosa, equilibre con agua. Si la fase estacionaria es un fluido orgánico polar, equilibre con ese fluido. aparato

A menos que se especifique lo contrario en la monografía individual, el tubo cromatográfico tiene un diámetro interior de unos 22 mm y una longitud de 200 a 300 mm. Unido a él hay un tubo de suministro, sin llave de paso, de unos 4 mm de diámetro interior y unos 50 mm de longitud. Preparación del aparato: Coloque una torunda de lana de vidrio fina en la base del tubo. Combine el volumen especificado de fase estacionaria y la cantidad especificada de soporte sólido para producir una mezcla homogénea y esponjosa. Transferir esta mezcla al tubo

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cromatográfico y apisonar ejerciendo una presión suave para obtener una masa uniforme. Si la cantidad especificada de soporte sólido es superior a 3 g, transfiera la mezcla a la columna en porciones de aproximadamente 2 g y apisone cada porción. Si el ensayo o prueba requiere una columna multisegmento con una fase estacionaria diferente especificada para cada segmento, apisone después de agregar cada segmento, y agregue cada segmento subsiguiente directamente al anterior. Empaque una torunda de lana de vidrio fina sobre el relleno de la columna completa.[ Nota : la fase móvil debe fluir a través de una columna correctamente empaquetada como una corriente moderada o, si se aplica cromatografía de fase inversa, como un goteo lento. ]

Si se incorpora una solución del analito a la fase estacionaria, completar la transferencia cuantitativa al tubo cromatográfico lavando el vaso de precipitados utilizado para la preparación de la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g de soporte sólido y varias gotas del disolvente utilizado. para preparar la solución de muestra antes de agregar la porción final de lana de vidrio. procedimiento

1. Transfiera la fase móvil al espacio de la columna por encima del relleno de la columna y permita que fluya a través de la columna bajo la influencia de la gravedad.

2. Enjuague la punta de la columna cromatográfica con aproximadamente 1 ml de fase móvil antes de cada cambio en la composición de

O

la fase móvil y después de completar la elución.

3. Si el analito se introduce en la columna como una solución en la fase móvil, permita que pase completamente al relleno de la columna, luego agregue la fase móvil en varias porciones pequeñas, dejando que cada una se drene por completo, antes de agregar la mayor parte de la fase móvil.

4. Cuando el procedimiento indique el uso de múltiples columnas cromatográficas montadas en serie y se especifique la adición de fase móvil en porciones divididas, permita que cada porción se drene completamente a través de cada columna y enjuague la punta de cada una con fase móvil antes de agregar cada una de las siguientes. parte.

Cromatografía de gases (GC) fase estacionaria liquida

Este tipo de fase está disponible en columnas empaquetadas o capilares. columna empacada

GC

La fase estacionaria líquida se deposita sobre un soporte sólido inerte finamente dividido, como tierra de diatomeas, polímero poroso o carbón grafitado, que se empaqueta en una columna que suele tener entre 2 y 4 mm de diámetro interno y entre 1 y 3 m de longitud. . columna capilar

GC

En las columnas capilares, que no contienen un soporte sólido empaquetado, la fase estacionaria líquida se deposita en la superficie interna de la columna y puede unirse químicamente a ella.

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fase estacionaria sólida

Este tipo de fase solo está disponible en columnas empaquetadas. En estas columnas, la fase sólida es un adsorbente activo, como alúmina, sílice o carbón, empaquetado en una columna. Las resinas porosas poliaromáticas, que a veces se usan en columnas empaquetadas, no están recubiertas con una fase líquida. [ Nota : las columnas empaquetadas y capilares deben acondicionarse antes de su uso hasta que la línea de base y otras características sean estables. El proveedor de la columna o del material de relleno proporciona instrucciones para el procedimiento de acondicionamiento recomendado. ] aparato

Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas portador, un puerto de inyección, una columna, un detector y un dispositivo de registro. El puerto de inyección, la columna y el detector tienen temperatura controlada y se pueden variar como parte del análisis. El gas portador típico es helio, nitrógeno o hidrógeno, según la columna y el detector en uso. El tipo de detector utilizado depende de la naturaleza de los compuestos analizados y se especifica en la monografía individual. La salida del detector se registra en función del tiempo, y la respuesta del instrumento, medida como área de pico o altura de pico, es función de la cantidad presente. programa de temperatura

La duración y la calidad de una separación de GC se pueden controlar alterando la temperatura de la columna cromatográfica. Cuando es necesario un programa de temperatura, la monografía individual indica las condiciones en formato de tabla. La tabla indica la temperatura inicial, la tasa de cambio de temperatura (rampa), la temperatura final y el tiempo de permanencia en la temperatura final. procedimiento

1. Equilibre la columna, el inyector y el detector con un flujo de gas portador hasta que se reciba una señal constante. 2. Inyecte una muestra a través del tabique del inyector o utilice un inyector automático. 3. Comience el programa de temperatura. 4. Registre el cromatograma.

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5. Analizar como se indica en la monografía.

Cromatografía líquida

El término "cromatografía líquida" (LC), como se usa en los compendios, es sinónimo de cromatografía líquida de alta presión y cromatografía líquida de alta resolución. LC es una técnica de separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida. fase estacionaria

Las separaciones se logran mediante procesos de partición, adsorción o intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria utilizada. Las fases estacionarias más utilizadas son sílice modificada o perlas poliméricas. Las perlas se modifican mediante la adición de hidrocarburos de cadena larga. El tipo específico de relleno necesario para completar un análisis se indica mediante la designación "L" en la monografía individual (consulte también la sección Columnas cromatográficas ). El tamaño de las cuentas también se describe a menudo en la monografía. Los cambios en el tipo y tamaño del empaque se tratan en la sección Idoneidad del sistema de este capítulo. columna cromatográfica

El término "columna" incluye acero inoxidable, acero inoxidable revestido y columnas poliméricas, rellenas con una fase estacionaria. La

O

longitud y el diámetro interior de la columna afectan la separación y, por lo tanto, las dimensiones típicas de la columna se incluyen en la monografía individual. Los cambios en las dimensiones de las columnas se analizan en la sección Idoneidad del sistema de este capítulo. Las monografías complementarias no incluyen el nombre de las columnas apropiadas; esta omisión evita la apariencia de aprobación del producto de un proveedor y los cambios naturales en el mercado. Consulte la sección Columnas cromatográficas para obtener más información. En los procedimientos de CL, se puede usar una precolumna con los siguientes requisitos, a menos que se indique lo contrario en la monografía individual: (a) la longitud de la precolumna debe ser no más del 15 % de la longitud de la columna analítica, (b) la el diámetro interior debe ser igual o menor que el de la columna analítica, y (c) el material de relleno debe ser el mismo que el de la columna analítica (p. ej., sílice) y contener la misma fase ligada (p. ej., C18). En cualquier caso, con la precolumna instalada se deberán cumplir todos los requisitos de idoneidad del sistema especificados en el procedimiento oficial. fase móvil

La fase móvil es un solvente o una mezcla de solventes, tal como se define en la monografía individual. aparato

Un cromatógrafo de líquidos consta de un depósito que contiene la fase móvil, una bomba para forzar la fase móvil a través del sistema a alta presión, un inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna cromatográfica, un detector y un dispositivo de recopilación de datos.

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elución en gradiente

La técnica de cambiar continuamente la composición del solvente durante la ejecución cromatográfica se denomina elución en gradiente o programación de solventes. El perfil de elución del gradiente se presenta en la monografía individual como una tabla de gradientes, que enumera el tiempo y la composición proporcional de la fase móvil en el tiempo indicado. procedimiento

1. Equilibre la columna y el detector con fase móvil al caudal especificado hasta que se reciba una señal constante. 2. Inyecte una muestra a través del inyector o utilice un inyector automático. 3. Comience el programa de gradiente. 4. Registre el cromatograma. 5. Analice como se indica en la monografía.

COLUMNAS CROMATOGRAFICAS En USP–NF , Reactivos, indicadores y soluciones — Columnas cromatográficas , se encuentra una lista completa de los rellenos (L), las fases (G) y los soportes (S) utilizados en las pruebas y ensayos USP–NF . Esta lista pretende ser una referencia conveniente para el cromatógrafo en la identificación de la columna cromatográfica pertinente especificada en la monografía individual.♦ Cambiar para leer:

DEFINICIONES Los criterios de idoneidad y aceptación del sistema en las monografías se han establecido utilizando los parámetros que se definen a continuación. Con algunos equipos, ciertos parámetros, como la relación señal-ruido y la resolución, se pueden calcular mediante el software proporcionado por el fabricante. Es responsabilidad del usuario asegurarse de que los métodos de cálculo utilizados en el software sean equivalentes a los requisitos de la Farmacopea de EE. UU. y realizar las correcciones necesarias si este no es el caso.

FI CI AL

Cromatograma: Una representación gráfica o de otro tipo de la respuesta del detector, la concentración del efluente u otra cantidad utilizada como medida de la concentración del efluente en función del tiempo o el volumen. Los cromatogramas idealizados se representan como una

O

secuencia de picos gaussianos en una línea base (Figura 1).

VM t

tR

tR

1_

1

VR

2_

2

Qué?

yo

= volumen de retención = tiempo de espera

M

VR

¿

_

Figura 1.

_

= volumen de retención del pico 1 = tiempo de retención del pico 1 = volumen de retención del pico 2 = tiempo de retención del pico 2 = anchura del pico a media altura = anchura del pico en el punto de inflexión

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h

= altura del pico

h /2

= la mitad de la altura del pico

Constante de distribución ( K ): En la cromatografía de exclusión por tamaño, las características de elución de un componente en una 0

columna en particular pueden estar dadas por la constante de distribución (también conocida como coeficiente de distribución), que se calcula mediante la siguiente ecuación: k

t t t

0

=

tR− t0 tt −t0

= tiempo de retención

R

= tiempo de retención de un compuesto no retenido

0

= tiempo total de fase móvil

t

Volumen de permanencia ( D ) (también conocido como V ): El volumen de permanencia (también conocido como volumen de retardo D

de gradiente) es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada de la columna. Se puede determinar mediante el siguiente procedimiento. columna: Reemplace la columna cromatográfica por un tubo capilar adecuado (p. ej., 1 m × 0,12 mm). fase móvil: Consulte la Tabla 1.

A: Agua

fase móvil

B: Solución de acetona en agua al 0,1% v/v

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fase móvil

tabla 1

Tiempo (min) 0–20 20–30

Fase móvil A

Fase móvil B

(% v/v)

(% v/v)

100→0

0→100

0

100

tasa de flujo: Configure para obtener una contrapresión suficiente (p. ej., 2 ml/min). detección: Espectrofotómetro a 265 nm

t

F

), en minutos, cuando la absorbancia ha aumentado en un 50% (Figura 2).

= t 0,5 — 0,5 tG (mín.)

D

tG

0,5

_

O

Determinar el tiempo ( t

re = t

re

×F

= tiempo de gradiente predefinido, 20 min = caudal (mL/min)

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Figura 2. [ Nota : cuando corresponda, esta medición se realiza con el muestreador automático en la posición de "inyección" para incluir el volumen del circuito de inyección en el volumen de permanencia. ]

Tiempo de espera ( t

M

): Tiempo requerido para la elución de un componente no retenido (consulte la Figura 1, la escala de referencia está en

minutos o segundos). En la cromatografía de exclusión por tamaño, se utiliza el término tiempo de retención de un compuesto no retenido ( t

Volumen de

0 ).

retención ( VM ): Volumen de la fase móvil requerida para la elución de un componente no retenido. Puede calcularse a partir del

FI CI AL

tiempo de espera y el caudal ( F ) en mililitros por minuto usando la siguiente ecuación: V

En la cromatografía de exclusión por

METRO

=t

METRO

×F

tamaño, se utiliza el término "volumen de retención" de un compuesto no retenido V0 .

Cima: Porción de un cromatograma que registra la respuesta del detector cuando se eluye de la columna un solo componente (o dos o más componentes sin resolver).

La respuesta del pico puede estar representada por el área del pico o la altura del pico ( h ).

Relación pico-valle ( p / v ): La relación pico a valle se puede emplear como criterio de idoneidad del sistema cuando no se logra la

O

separación de la línea de base entre dos picos (consulte la Figura 3).

Figura 3.

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pag/ v =

Hp Hv

Hpag Hv

= altura por encima de la línea de base extrapolada del pico menor

_

= altura por encima de la línea base extrapolada en el punto más bajo de la curva que separa los picos mayor y menor

_

Altura de placa ( H ) (altura equivalente a una placa teórica [HETP]): Relación entre la longitud de la columna ( L ), en micrómetros, y el número de placa ( N ): H =

L norte

Número de placa ( N ) (número de placas teóricas): Un número indicativo del rendimiento de la columna (eficiencia de la columna) solo se puede calcular a partir de los datos obtenidos en condiciones isotérmicas, isocráticas o isodensas, según la técnica, como el número de placa, utilizando la siguiente ecuación, los valores de t y W Expresándose en las mismas unidades: R

h

norte =

t

tR Wh

2

)

= tiempo de retención del pico correspondiente al componente

R

¿

5,54  (

Qué?

= anchura del pico a media altura ( h /2)

El número de platos varía con el componente así como con la columna, la temperatura de la columna, la fase móvil y el tiempo de retención.

Altura placa reducida ( h ): Relación entre la altura de la placa ( H ), en micrómetros, y el diámetro de la partícula ( d ) en micrómetros: p

Retardo relativo ( R

rel

=

H

FI CI AL

h

d pag

): El retardo relativo, utilizado en la cromatografía de capa fina, se calcula como la relación de las distancias recorridas

O

por la mancha del compuesto de interés y un compuesto de referencia (Figura 4).

Figura 4.

Rr miyo =  

a

= distancia de migración de la fase móvil

b

= distancia de migración del compuesto de interés

C

= distancia de migración del compuesto de referencia

segundo/ c

Retención relativa ( r ): La retención relativa se calcula como una estimación utilizando la siguiente ecuación: r =

tRi −tMETRO tRst −tMETRO

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ri

= tiempo de retención del pico de interés

_

primero t

= tiempo de retención del pico de referencia (generalmente el pico correspondiente a la sustancia a examinar)

_

= tiempo de espera

M

Retención relativa, sin ajustar ( r )♦o (RRT)♦ G

La retención relativa no ajustada se calcula utilizando la siguiente ecuación: tRi

rGRAMO =

tRst

A menos que se indique lo contrario, los valores de retención relativa establecidos en las monografías corresponden a la retención relativa no ajustada.

♦Tiempo de retención relativo (TRR): Ver Retención relativa, sin ajustar ♦ Resolución ( Rs : La resolución entre picos de dos componentes (Figura 1) se puede calcular utilizando la siguiente ecuación: )

RS =

1.18 (tR2 −tR1 ) +1 W hora W hora

2

tR 2 > tR 1

1

Wh ,Wh 1

= tiempos de retención de los picos

2

= anchos de pico a media altura

2

FI CI AL

tR ,tR

En la cromatografía cuantitativa en capa fina, utilizando densitometría, se utilizan las distancias de migración en lugar de los tiempos de retención y la resolución entre picos de dos componentes puede calcularse mediante la siguiente ecuación: RS =

1.18 a (RF 2 −RF 1 ) W hora +1 W hora

2

RF 2 > RF 1

RF , RF 1

2__

Wh ,Wh 1

2

a

= factores de retardo de los picos = anchos de pico a media altura

= distancia de migración del frente del solvente

Factor de retardo ( R ): El factor de retardo, utilizado en la cromatografía de capa fina, es la relación entre la distancia desde el punto de F

O

aplicación hasta el centro de la mancha y la distancia recorrida simultáneamente por el frente del disolvente desde el punto de aplicación (Figura 4).

b

= distancia de migración del componente

a

= distancia de migración del frente del solvente

RF =

b a

Factor de retención ( k ): El factor de retención (también conocido como relación de distribución de masa ( D ) o factor de capacidad ( k′ )) m

se define como: k =

KC VS

_

_

VM

_

un mo _tun t   oF  C ometro pagon en t  i norte s t una t i on VSa r y  pagtiene _ _ mi

= k C un mo _tun t  oF  C ometro pagon en t   i norte  mo _biV yo mi pagtiene _ _ mi METRO

= constante de distribución (también conocida como coeficiente de distribución de equilibrio) = volumen de la fase estacionaria = volumen de la fase móvil

El factor de retención de un componente puede determinarse a partir del cromatograma utilizando la siguiente ecuación: https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_7_es-ES?source=Search Results&highlight=621

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k =

t t

tR −tMETRO tMETRO

= tiempo de retención

R

M

= tiempo de espera

Tiempo de retención ( t ): Tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición de la respuesta del pico máximo de la zona de R

muestra eluida (Figura 1, escala de referencia en minutos o segundos). Volumen de

retención ( VR ):

Volumen de la fase móvil necesaria para la elución de un componente. Puede calcularse a partir del tiempo de retención y el caudal ( F ), en mililitros por minuto, mediante la siguiente ecuación: V R = tR × F  

Tiempo de retención de un compuesto no retenido ( t ): En cromatografía de exclusión por tamaño, tiempo de retención de un 0

O

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componente cuyas moléculas son más grandes que los poros más grandes del gel (Figura 5).

Figura 5.

Volumen de retención de un compuesto no retenido ( V ): En cromatografía de exclusión por tamaño, volumen de retención de un 0

componente cuyas moléculas son más grandes que los poros más grandes del gel. Puede calcularse a partir del tiempo de retención de un compuesto no retenido y el caudal ( F ), en mililitros por minuto, utilizando la siguiente ecuación: V 0 = t0 ×

F

Factor de separación ( α ): Retención relativa calculada para dos picos adyacentes (por convención, el valor del factor de separación siempre es >1): α

k k

1

2

= k 2 /k 1

= factor de retención del primer pico = factor de retención del segundo pico

Relación señal/ruido ( S/N ): El ruido a corto plazo influye en la precisión y exactitud de la cuantificación. La relación señal-ruido se calcula utilizando la siguiente ecuación: https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_7_es-ES?source=Search Results&highlight=621

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S / norte =

H

2 horas h

= altura del pico (Figura 6) correspondiente al componente en cuestión, en el cromatograma obtenido con la solución de referencia prescrita, medida desde el máximo del pico hasta la línea base extrapolada de la señal observada sobre una distancia ▲ de al menos 5 ▲

( RB

1-abr-2023)

h

veces el ancho a media altura

= rango del ruido en un cromatograma obtenido después de la inyección de un blanco (Figura 7), observado en una distancia ▲ nos 5

▲ (RB 1-Abr-2023)

de al meveces el ancho a la mitad de la altura del pico en el cromatograma obtenido con la solución de referencia prescrita

y, si es posible, situado igualmente alrededor del lugar donde se encontraría este pico

FI CI AL

▲

O

Figura 6. Cromatograma de la solución de referencia

Figura 7.

▲ (BR 1-abr-2023)

Factor de simetría ( A ): El factor de simetría de un pico (también conocido como factor de asimetría o factor de cola) (Figura 8) se calcula S

utilizando la siguiente ecuación: As =

W 0.05 2 días

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W

0.05

d

= ancho del pico a una vigésima parte de la altura del pico = distancia entre la perpendicular caída desde el máximo del pico y el borde de ataque del pico a una vigésima parte de la altura del pico

Un valor de A de 1.0 significa simetría. Cuando A > 1.0, el pico se está desviando. Cuando A < 1.0, el pico está al frente. s

s

s

Figura 8.

Repetibilidad del sistema: La repetibilidad de la respuesta se expresa como una desviación estándar relativa porcentual estimada (% RSD) de una serie consecutiva de mediciones para no menos de tres inyecciones o aplicaciones de una solución de referencia, y se calcula usando la siguiente ecuación. − − −− −− 2

% RSD =

y

yo

¯ y

100

√

¯) Σ (yi −y

¯ y

norte - 1

= valores individuales expresados ​como área del pico, altura del pico o relación de áreas por el método de estandarización interna = media de valores individuales

norte = número de valores individuales

t

FI CI AL

Tiempo total de fase móvil ( t ): En cromatografía de exclusión por tamaño, tiempo de retención de un componente cuyas moléculas son más pequeñas que los poros más pequeños del gel (Figura 5).

Volumen total de la fase móvil ( V ): En cromatografía de exclusión por tamaño, volumen de retención de un componente cuyas moléculas t

son más pequeñas que los poros más pequeños del gel. Puede calcularse a partir del tiempo total de la fase móvil y el caudal ( F ), en mililitros/minuto, mediante la siguiente ecuación:

V t = tt ×

Cambiar para leer:

F

IDONEIDAD DEL SYSTEMA

[ Nota : esta sección solo cubre la cromatografía de líquidos y la cromatografía de gases ]

Los diversos componentes del equipo empleado deben estar calificados y ser capaces de lograr el rendimiento requerido para realizar la

O

prueba o el ensayo. Las pruebas de idoneidad del sistema representan una parte integral del procedimiento analítico y se utilizan para garantizar el rendimiento adecuado del sistema cromatográfico. El número de platos de la columna, el factor de retención (relación de distribución de masa), la repetibilidad del sistema, la relación señal/ruido, el factor de simetría y la relación de resolución/pico a valle son los parámetros que se pueden emplear para evaluar el rendimiento del sistema cromatográfico. Cuando así se indique en la monografía individual, en el caso de perfiles cromatográficos complejos (p. ej., para productos biotecnológicos y biológicos), la comparación visual de los perfiles puede utilizarse como prueba de idoneidad del sistema. Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatográfico incluyen: Composición y temperatura de la fase móvil Fuerza iónica y pH del componente acuoso, de la fase móvil Caudal, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y presión Características de la fase estacionaria, incluido el tipo de soporte cromatográfico (basado en partículas o monolítico), tamaño de partículas o poros, porosidad y área de superficie específica La fase inversa y otras modificaciones superficiales de las fases estacionarias, el alcance de la modificación química (expresada por la protección de los extremos, la carga de carbono, etc.) Los tiempos de retención y las retenciones relativas se pueden proporcionar en las monografías solo con fines informativos, a menos que se indique lo contrario en la monografía. No se aplican criterios de aceptación a las retenciones relativas. Se requiere el cumplimiento de los criterios de idoneidad del sistema durante todo el procedimiento cromatográfico. Ningún análisis de muestra es aceptable a menos que se haya demostrado la idoneidad del sistema. Se deben cumplir los siguientes requisitos, además de cualquier otro criterio de idoneidad del sistema establecido en la monografía. Cuando se establecen requisitos específicos en la monografía, reemplazan los requisitos mencionados en este capítulo.

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Repetibilidad del sistema ♦ Cuando se especifica un requisito de desviación estándar relativa en una monografía individual, si el requisito es 2,0 o menos, el cálculo se basa en datos de cinco inyecciones repetidas del analito, si el requisito es superior al 2,0 %, se utilizan datos de seis inyecciones repetidas. .♦ En un ensayo de una sustancia activa o un excipiente, donde el valor objetivo es 100 % para una sustancia pura y no se especifica un requisito de repetibilidad del sistema, se calcula la desviación estándar relativa máxima permitida (% RSD max ) para los límites definidos

para

una serie ( n = 3 a 6) de inyecciones de la solución de referencia. La desviación estándar relativa máxima permitida de la respuesta pico no excede el valor apropiado dado en la Tabla 2. = % RSD má ximo

k

= constante (0.349), obtenida de la expresión k

0.6

=

√2

×

t90

k B√norte t90

% , norte - 1

en el cual

% , norte - 1

√6

0.6

representa la desviación estándar relativa porcentual

√2

requerida determinada en 6 inyecciones para B = 1.0 B

= límite superior dado en la definición de la monografía individual menos 100%

norte

= número de inyecciones repetidas de la solución de referencia (3 ≤ n ≤ 6)

t

= t de Student al nivel de probabilidad del 90% (doble cara) con n −1 grados de libertad

90%,

n

–1

Tabla 2. Desviación estándar relativa máxima permitida de la respuesta máxima (ensayo)

O FI CI AL

Número de inyecciones individuales ( n ) 3

b (%) 2.0 2.5 3.0 B

4

5

6

Desviación estándar relativa máxima permitida (%)

0.41

0.59

0.73

0.85

0.52

0.74

0.92

1.06

0,62

0.89

1.10

1.27

= límite superior de contenido dado en la monografía individual menos 100% ▲

Sensibilidad del sistema

La relación señal-ruido se utiliza para definir la sensibilidad del sistema. El límite de cuantificación (que corresponde a una relación señal/ruido de 10) es igual o inferior al umbral de notificación.

Simetría máxima

A menos que se indique lo contrario, en una prueba o ensayo, el factor de simetría (factor de cola) del pico utilizado para la cuantificación es de 0,8 a 1,8.

▲ (RB 1-dic-2023)

AJUSTE DE LAS CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS Las condiciones cromatográficas descritas han sido validadas durante la elaboración de la monografía. La medida en que los diversos parámetros de una prueba cromatográfica se pueden ajustar sin modificar fundamentalmente los procedimientos analíticos de la farmacopea se enumeran a continuación. Cambios distintos a los indicados requieren revalidación del trámite. Múltiples ajustes pueden tener un efecto acumulativo en el rendimiento del sistema y deben ser evaluados adecuadamente por los usuarios. Esto es particularmente importante en los casos en que el patrón de separación se describe como un perfil. En esos casos, se debe realizar una evaluación de riesgos. Cualquier ajuste debe hacerse sobre la base del procedimiento de la farmacopea. Si se realizan ajustes a un procedimiento farmacopeico, es posible que se requieran pruebas de verificación adicionales. Para verificar la idoneidad del procedimiento farmacopeico ajustado, evalúe las características de rendimiento analítico relevantes potencialmente afectadas por el cambio. Cuando un procedimiento farmacopeico ha sido ajustado de acuerdo con los requisitos establecidos a continuación, no se permiten más ajustes sin la revalidación correspondiente. https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_7_es-ES?source=Search Results&highlight=621

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Se requiere el cumplimiento de los criterios de idoneidad del sistema para verificar que se logren las condiciones para el desempeño satisfactorio de la prueba o ensayo. El ajuste de las condiciones con elución en gradiente (HPLC) o programación de temperatura (GC) es más crítico que con elución isocrática (HPLC) o isotérmica (GC), ya que puede cambiar algunos picos a un paso diferente del gradiente o a diferentes temperaturas de elución. provocando potencialmente la coelución parcial o completa de los picos adyacentes o la inversión de los picos y, por lo tanto, provocando la asignación incorrecta de los picos y el enmascaramiento de los picos o un cambio tal que la elución se produzca más allá del tiempo de elución prescrito. Para algunos parámetros, los ajustes se definen explícitamente en la monografía para garantizar la idoneidad del sistema.

Cromatografía de capa fina Composición de la fase móvil : la cantidad de los componentes menores del solvente se puede ajustar en ±30 % relativo o ±2 % absoluto, lo que sea mayor; ningún otro componente se altera en más del 10% absoluto. Un componente minoritario comprende menos o igual al (100/ n )%, nsiendo el número total de componentes de la fase móvil. Para un componente menor al 10 % de la fase móvil, un ajuste relativo del 30 % permite un rango de 7 % a 13 %, mientras que un ajuste absoluto del 2 % permite un rango de 8 % a 12 %, por lo que el valor relativo es mayor; para un componente menor al 5 % de la fase móvil, un ajuste relativo del 30 % permite un rango de 3,5 %–6,5 %, mientras que un ajuste absoluto del 2 % permite un rango de 3 %–7 %, siendo el valor absoluto el mayor en este caso. pH del componente acuoso de la fase móvil : ±0,2 unidades de pH, a menos que se indique lo contrario Concentración de sales en el componente tampón de una fase móvil : ± 10% Volumen de aplicación : 10 %–20 % del volumen prescrito si se utilizan placas de partículas finas (2–10 µm)

Cromatografía líquida: elución isocrática parámetros de columna y caudal

Fase estacionaria : Sin cambio de identidad del sustituyente (p. ej., sin sustitución de C18 por C8); las demás características fisicoquímicas de la fase estacionaria, es decir, el soporte cromatográfico, la modificación de la superficie y el grado de modificación química deben ser

O FI CI AL

similares; se permite el cambio de columnas de partículas totalmente porosas (TPP) a columnas de partículas superficialmente porosas (SPP) siempre que se cumplan los requisitos mencionados anteriormente.

Dimensiones de la columna (tamaño de partícula, longitud) : El tamaño de partícula y/o la longitud de la columna pueden modificarse, siempre que la relación entre la longitud de la columna ( L ) y el tamaño de partícula ( dp ) permanezca constante o en el rango entre −25 % a +50% de la relación L/dp prescrita .

Ajustes de partículas totalmente porosas a partículas superficialmente porosas : Para la aplicación del ajuste del tamaño de partículas de partículas totalmente porosas a partículas superficialmente porosas, se pueden usar otras combinaciones de L y dp , siempre que el número de placa ( N ) esté entre -25 % y + 50%, relativo a la columna prescrita. Estos cambios son aceptables, siempre que se cumplan los criterios de idoneidad del sistema y se demuestre que la selectividad y el orden de elución de las impurezas especificadas a controlar son equivalentes. Diámetro interno : en ausencia de un cambio en el tamaño y/o la longitud de las partículas, se puede ajustar el diámetro interno de la columna.

Es necesario tener precaución cuando el ajuste da como resultado volúmenes pico más pequeños debido a un tamaño de partícula más pequeño o a un diámetro de columna interno más pequeño, una situación que puede requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento de la banda extracolumna por factores como las conexiones del instrumento, el volumen de la celda del detector y la frecuencia de muestreo. y volumen de inyección.

Cuando se cambia el tamaño de las partículas, la tasa de flujo requiere un ajuste, porque las columnas de partículas más pequeñas requerirán velocidades lineales más altas para el mismo rendimiento (medido por la reducción de la altura de la placa). El caudal se ajusta tanto para el cambio en el diámetro de la columna como para el tamaño de las partículas utilizando la siguiente ecuación: F2 = F1 ×

F F

doble penetración doble penetración

2

× d pag ) / (d C × d pag ) ] 1 1 2

= caudal ajustado (mL/min)

2

corriente continua

2

= caudal indicado en la monografía (mL/min)

1

corriente continua

2

[ (d C

1

2

1

2

= diámetro interno de la columna indicado en la monografía = diámetro interno de la columna utilizada (mm) = tamaño de partícula indicado en la monografía (µm) = tamaño de partícula de la columna utilizada (µm)

https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-6C3DF8B8-D12E-4253-A0E7-6855670CDB7B_7_es-ES?source=Search Results&highlight=621

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Cuando se realiza un cambio de partículas de ≥3 µm a