CROMATOGRAFIA EXCLUSIÓN

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓIGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA CURSO PRÁCTICO DE MÉTODOS DE ANALISIS VERIFICACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE UN ESPECTROFOTÓMETRO PROFESOR: HERNANDEZ DERRAMADERO FERNANDO CEVADA SANTIAGO KAREN JAZMIN 5QM1 SECC. 4 FECHA DE ENTREGA: 31 DE OCTUBRE DEL 2017

OBJETIVOS Determinar algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatográfico. Efectuar la desalación de la albúmina, utilizando la técnica de cromatografía por exclusión.

FUNDAMENTO La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes presentes en una misma muestra. El método está basado en la circulación de una fase móvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a través de una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos presentes en la mezcla resultará su separación. La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel o de tamiz molecular) es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fín y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (partículas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado. Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular. Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero.

RESULTADOS Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna Tabla 1. Resultados de absorbancia y volumen para la determinación del volumen vacío de la columna. Volumen de elución (mL) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33

A615 0.045 0.020 0.014 0.016 0.846 0.548 0.053 0.020 0.017 0.015 0.014

Separación de la proteína del sulfato de amonio Tabla 2. Resultados de absorbancia y volumen para la separación de la albúmina. Datos de volumen y masa del sulfato de amonio en la separación por cromatografía por exclusión. Volumen de elución (mL)

A280

3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

0.202 0.191 0.200 0.099 0.135 0.072 0.170 0.145 0.147 0.193 0.280 0.107 0.296 0.178 0.263 0.194

Masa del tubo vacío (g)

8.5222 8.5415 8.5217 5.1844 7.5212 7.7100 6.3078 6.2129 6.4736

Masa del tubo con precipitado seco (g)

(NH4 )2 SO4 (mg)

8.5527 8.5355 5.2255 7.5871 7.77327 6.3145

11.2 13.8 41.1 65.9 22.7 6.7

51 54 57 60 63 66 69 72 75

0.137 0.199 0.215 0.162 0.384 0.236 0.157 0.287 0.130

6.1177 5.1955 7.7278 6.4586 6.4596

perfil de elución 0.45

70

0.4

60

0.35 50

   m    n 0.3    0    8    2    a 0.25    a    i    c    n 0.2    a     b    r    o    s 0.15     b    a

   g

40    m    n    e    a    s 30    a    m

20

0.1 10

0.05 0

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

volumen en mL albúmina

sulfato de amonio

Figura 1. Gráfica a dos ejes de los perfiles de elución de la albúmina en color azul a absorbancia de 280 nm y del sulfato de amonio en color anaranjado con masa en mg. a) ¿qué sustancia eluyó primero y cuál después? Explique porqué Primero eluyó la albúmina debido a que una proteína de un peso molecular grande, por lo cual al momento de la separación en la cromatografía, esta rodea los geles y sale más rápidamente, mientras que el sulfato de amonio al ser de menor tamaño molecular pasa por en medio de los poros del gel por lo tanto se retarda su salida en la cromatografía. b) ¿Qué es un gel?¿que características debe tener el que es cromatográficamente útil? Es una matriz porosa polimérica cuyos poros se llenan con el solvente que se usará en la fase móvil. La separación por cromatografía en gel está influenciada

por las propiedades de los poros de la red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material para el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polímeros entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente suave. Los aerogeles son sólidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el vidrio y silica porosos. El nombre de los geles más comúnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel c) Mencione por lo menos tres aplicaciones, diferentes a las usadas en la práctica, que puede tener esta técnica. La cromatografía en gel se utiliza para separar proteínas, péptidos, ácidos nucléicos, polisacáridos, enzimas, hormonas y los químicos en polímeros, para determinar distribuciones de pesos moleculares en mezclas de polímeros. d) Escribe las estructuras químicas del Sephadex, del Bio-Gel A y del Bio-Gel P , indicando donde y de qué forma se da el entrecruzamiento en cada caso y el tipo de enlace que se presenta. Los geles de poliacrilamida Bio-Gel P, para la filtración en gel de alta resolución, se preparan por copolimerización de acrilamida y N , N ' -metilenbisacrilamida. Geles Bio-Gel P: Se suministran secos y están disponibles en varios rangos de tamaño de partículas con límites de exclusión de peso molecular que van de 100 a 100.000.Son extremadamente hidrofílicos y esencialmente no iónicos Proporcione filtración en gel eficiente y suave de compuestos sensibles. Los geles son compatibles con ácidos orgánicos diluidos, urea 8 M, agentes caotrópicos, detergentes y disolventes orgánicos miscibles. El alcohol, hasta 20% v / v, puede usarse para mejorar la solubilidad de nucleótidos, péptidos y taninos sin alterar las propiedades de exclusión de los geles. La formamida también se puede usar con toda su potencia ya que los geles Bio-Gel P están completamente hinchados en este solvente.

Sephadex es una resina de filtración en gel bien establecida para la desalinización y el intercambio de tampón en aplicaciones industriales. Desalma rápidamente, elimina contaminantes y transfiere a un nuevo buffer en un solo paso. Excelente recuperación y mínima dilución de muestra. Disponible en columnas preevainadas HiPrep Desalin y HiTrap Desalting para una desalación rápida y conveniente. Resina BioProcess compatible con aplicaciones industriales y bien establecidas para la desalación y el intercambio de tampón en aplicaciones industriales. Sephadex es una resina de filtración en

gel preparada por entrecruzamiento de dextrano con epiclorohidrina. Los diferentes tipos de Sephadex difieren en su grado de entrecruzamiento y, por lo tanto, en su grado de hinchamiento y su rango de fraccionamiento molecular. Sephadex tiene cinco tipos de G que van desde G-10 para moléculas pequeñas hasta G-75 para moléculas más grandes.

Bio-Gel Un gel de 1.5m, ideal para la purificación de anticuerpos y agregados, consiste en perlas de agarosa en las que el tamaño de poro está controlado por el porcentaje de agarosa en el gel. Este soporte es compatible con todos los buffers comúnmente utilizados y se puede usar con buffers con alto contenido de sal sin cambiar significativamente el volumen de la cama. Bio-Gel Se puede usar un gel de 1.5m a pH 4-13 y a 2-30 ° C. El rango de fraccionamiento es de 10,000 a 1,500,000.

DISCUSIÓN Se realizó la separación de la albúmina del sulfato de amonio (desalación), donde primeramente se tuvo un montado de la columna en regulador de pH de 7.25 tratando de evitar un mal empaquetamiento, se procedió a realizar la determinación del volumen vacío debido a que en este tipo de cromatografía la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico, el gel está constituido por partículas esféricas que tienen poros de un determinado tamaño, las

moléculas de pequeño tamaño difunden a través de los poros de las partículas del gel y por ello son retardadas en su paso por la columna mientras que las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello eluyen rápidamente en lo que es el volumen vacío de la columna que fue de 15 mL, se dice que son excluidos del gel, de esta forma, las moléculas se separan en función de su tamaño, eluyendo en orden decreciente de peso molecular, es debido a esto que para esta determinación se utilizó la dextrana debido a que es una molécula de gran tamaño y peso molecular y eluya fácilmente por los intersticios y cuya absorbancia máxima al espectrofotómetro se correlaciona con el volumen que se presentan entre las partículas de gel. Después se procedió a la aplicación de la muestra y obtención de los eluatos, los cuales fueron leídos a una absorbancia de 280 nm debido a que la albumina es una proteína y posee enlaces peptídicos los cuales presentan una absorbancia característica a esta longitud de onda, obteniéndose las absorbancias correspondientes donde los datos arrojan (tabla 2) que en todos los eluatos existe proteína, y realizando el perfil de elución para la albúmina mostrado en la figura 1, donde de manera teórica la albúmina debió ser la primera en eluír por su gran tamaño y peso molecular y después el sulfato debido a que es una molécula más pequeña y retenida por el gel separador, de manera práctica solo se puede observar la separación del sulfato de amonio y comparando con la teoría la albúmina debe de estar a volúmenes menores inclusive casi debe de salir con el volumen vacío debido a que la dextrana y la albúmina tiene tamaño semejantes, sin embargo esto no se obtuvo y se puede comprobar esto debido a que se observan constantes fluctuaciones en la lecturas (varios picos y valles), esto puede ser debido a varios factores como los volúmenes de los tubos, debido a que si estos no eran constantes con el volumen indicado (3 mL) se tendía a concentrar (menor volumen del indicado) o diluir (mayor volumen de lo indicado) los eluatos, modificando así las lectura. Otro factor puede ser un cambio en la velocidad de elución, ya que si comienza a eluír los compuestos de forma más rápida impide que los analitos de menor tamaño puedan pasar por los poros del gel de manera efectiva eluyendo demasiado rápido por la columna así como también por los espacios intersticiales, si el la velocidad de elución disminuyera provocaría que el analito de mayor tamaño se retenga por su trayecto por la columna ocasionando que llegara a salir con el compuesto de menor tamaño y no lograr una separación. Un factor más que puede ser el causante, es un error en la calibración de las lecturas en el espectrofotómetro, donde de manera errónea se pudo utilizar de blanco el tubo que no era el indicando provocando así lecturas erróneas. Para el perfil de elución del sulfato de amonio se utiliza un método gravimétrico para su determinación donde se precipita el compuesto con cloruro de bario formando una sal que precipita y posteriormente se calcula su masa y elabora el segundo perfil de elución (figura 1, color anaranjado), en este cromatograma muestra que un volumen de elución que es el volumen necesario para eluír un compuesto de una columna de 36 mL.

CONCLUSIÓN El volumen vacío de la columna es de 15 mL. El volumen total de la columna es de 33.17 mL. El volumen del gel Sephadex G-25 es de 1.59 mL. El volumen interno de la columna es de 16.58 mL. Se obtuvo una separación de sulfato de amonio de la proteína a un volumen de elución de 36 mL. BIBLIOGRAFÍA Rojo Callejas F., Manual de Química Analítica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Química UNAM, México 2002. BERMEJO, F. - Química Analítica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma edición, Madrid 1991. HARRIS, D. - Análisis Químico Cuantitativo - Ed. Reverté - 2ª edición - España, 2001.