Cromatografía en Capa Fina

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!inta negra siendo separada en una placa de CC" #a cromatografia en capa fina (CC"), ( CC"), !#C (!$in layer c$romatograp$y) es una técnica cromatográfica.. #a fase estacionaria es una capa uniforme de un adsorbente mantenido cromatográfica sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. %n cromatografía en capa fina se utili&a una placa cromatográfica inmersa verticalmente en un eluyente apolar' #a placa cromatográfica consiste en una fase estacionaria polar (comnmente se utili&a sílica gel) ad$erida a una superficie slida con algn agente cementante. %l eluyente debe ser un compuesto líquido apolar, generalmente orgánico. Para reali&ar la CC", se debe apoyar la placa cromatografica sobre algn recipiente o camara que contenga la fase líquida a apro*imadamente + cm (la distancia entre el  principio de la placa placa y la muestra que que se desea anali&ar). anali&ar).

Índice •

+ plicacin de las muestras

•

- %leccin del eluyente

•

 /esarrollo de la cromatografía

•

0 #ocali&acin de sustancias

•

1 Constantes 2f 3 2*

Aplicación de las muestras

#os productos a e*aminar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicacin, lo más comn es usar acetona. "recuentemente se emplean disoluciones al +4, de manera que al aplicar - 5l resulta en la carga -6 5g de producto slido. 7uc$os reactivos de revelado llegan a detectar 6.+ 5g de material' por esto con esta carga puede llegarse a observar un 14 de impure&as. %*isten una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para reali&ar el proceso de siembra de la muestra a anali&ar. !ambién pueden usarse tubos capilares. %l proceso de siembra se reali&a tocando con la punta del capilar (micropipeta, etc) sobre la placa  preparada. /ejando /ejando una distancia distancia al borde inferior de un un centímetro apro*imadamente. apro*imadamente. %l punto de aplicacin de la muestra se denomina toque. 8na ve& colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la  placa solo quedará quedará la muestra a anali&ar. se anota en el el cuaderno, no solamente solamente en adsorbente empleado, sino la identidad del eluyente y la relacin de los dos, o más que se $ayan utili&ado.

Elección del eluyente #a eleccin del eluyente depende del componente que se va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo. 8n método que se emplea para la seleccin del eluyente es una cromatografía en capa fina con distintos disolventes y unas muestras  patrn. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad •

9ter de petrleo

•

9ter dietílico

•

Ciclo$e*ano

•

cetato de etilo

•

!etracloruro de carbono:

•

Piridina

•

;enceno:

•

%tanol

•

Cloroformo:

•

7etanol

•

/iclorometano

#os productos a e*aminar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicacin, lo más comn es usar acetona. "recuentemente se emplean disoluciones al +4, de manera que al aplicar - 5l resulta en la carga -6 5g de producto slido. 7uc$os reactivos de revelado llegan a detectar 6.+ 5g de material' por esto con esta carga puede llegarse a observar un 14 de impure&as. %*isten una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para reali&ar el proceso de siembra de la muestra a anali&ar. !ambién pueden usarse tubos capilares. %l proceso de siembra se reali&a tocando con la punta del capilar (micropipeta, etc) sobre la placa  preparada. /ejando /ejando una distancia distancia al borde inferior de un un centímetro apro*imadamente. apro*imadamente. %l punto de aplicacin de la muestra se denomina toque. 8na ve& colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la  placa solo quedará quedará la muestra a anali&ar. se anota en el el cuaderno, no solamente solamente en adsorbente empleado, sino la identidad del eluyente y la relacin de los dos, o más que se $ayan utili&ado.

Elección del eluyente #a eleccin del eluyente depende del componente que se va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo. 8n método que se emplea para la seleccin del eluyente es una cromatografía en capa fina con distintos disolventes y unas muestras  patrn. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad •

9ter de petrleo

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9ter dietílico

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Ciclo$e*ano

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cetato de etilo

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!etracloruro de carbono:

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Piridina

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;enceno:

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%tanol

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Cloroformo:

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7etanol

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/iclorometano

•

gua

•

ay que estudiar la  polaridad del componente componente y probar probar con eluyentes cada cada ve& menos menos polares.

+. !oque !oque de de la muestr muestraa sin aplicar aplicar ningn ningn eluyen eluyente. te. -. plica plicando ndo un un eluye eluyente nte poco poco polar polar.. . plica plicando ndo un un eluye eluyente nte más más pola polar. r. l aplicar en primer pri mer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utili&ando la misma  placa para aplicar aplicar otros eluyentes más más polares, $asta dar con el más apropiado. ?tra técnica para reali&ar la eleccin del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. %sto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separacin se reali&a de una manera más efica&.

Desarrollo de la cromatografía %l desarrollo de los cromatogramas en capa fina se reali&a normalmente por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical,  por la accin de la capilaridad capilaridad.. #a cromatografía se reali&a en una cubeta. Para conseguir la má*ima saturacin posible de la atmsfera de la cámara, las paredes se impregnan del eluyente.

@eneralmente el eluyente se introduce en la cámara una $ora antes del desarrollo, para  permitir la saturacin de la atmsfera. %l tiempo tiempo de desarrollo, por por lo general, no llega a los 6 minutos. %l tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de $oras. #as placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o $asta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. %sto se $ace para estandari&ar los valores de 2". "recuentemente esta distancia es de +6 cm, ya que parece ser la más conveniente para medir valores de 2". /espués /espués del desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente. #a mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impure&as i mpure&as que se despla&an con mayor y menor velocidad. %l frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.

Localización de sustancias Ai los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dic$os compuestos, para ello e*isten dos tipos de métodos 7étodos químicos. 7étodos físicos.

Mtodos !uímicos Consisten en reali&ar una reaccin química entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveri&a la placa con los reactivos reveladores. @eneralmente se utili&a como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos orgánicos (con tonos amarilloBmarrn), pero las manc$as desaparecen desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar sealar las manc$as aparecidas. ?tro reactivo revelador bastante utili&ado es el ácido sulfrico, que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manc$as negras. !ambién !ambién es utili&ado el permanganato potásico, que deja unas manc$as de color amarillo. %l tamao de las manc$as no está relacionado con la cantidad de componente separado. demás de estos reveladores generales, e*isten otros específicos -,0 B dinitrofenil$idracina (para alde$idos y cetonas). Derde Derde de bromocresol (para ácidos carbo*ílicos). Paradimetil aminoben&alde$ido (para aminas). =in$idrina (para aminoácidos).

Mtodos físicos.  %l más comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. /e tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manc$as fluorescentes en las &onas en las que $ay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente e*cepto donde $ay componentes.

lgunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que  pueden ser detectados detectados directamente directamente en una lámpara lámpara de ultravioleta.

Constantes "f # "$ #a constante 2" (2atio of "ront) es simplemente una manera de e*presar la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente. Ae define como 2"E /istancia de la muestra desde el origenF/istancia del eluyente desde el origen #a distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la manc$a, los cálculos se simplifican si el denominador es +6. Para que los 2" sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (%spesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). %l má*imo valor de 2" que se puede alcan&ar es de +, lo ideal es un 2" entre 6.11 y 6.G. Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. 8na ve& desarrollados se calculan los 2" y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba tr ataba del mismo compuesto. Por el contrario si los 2" son iguales los compuestos pueden pueden ser iguales o no serlo. Ai se sospec$a que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, $asta apreciar una separacin mínima. %n este caso no se pueden usar reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino indicador ultravioleta. !ambién !ambién se puede operar de la manera siguiente Ae selecciona un compuesto (H), que tenga una posicin de desarrollo conveniente' todos los demás compuestos sobre la  placa se relacionan relacionan con éste. /e esta manera se tiene el 2H 2*E /istancia recorrida por el compuesto de referencia(H)F/istancia recorrida por el eluyente Categoría Categoría •

Cromatografía

12. cromatografÍa > 12.2 cromatografÍa EN capa FiNa Y eN columna Índice

12.2.1 Cromatografía en capa na (CCF)

12.2.2 Cromatografía en columna (CC)

12.2.1 Cromatografía en capa na (CCF)

En la cromatografía en capa na (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa delgada de un adsorente (como por e!emplo gel de sílice" al#mina o celulosa) depositada sore un soporte plano como una placa de $idrio" o una l%mina de aluminio o de pl%stico. &a CCF es una t'cnica analítica  tiene como o!eti$o el an%lisis de una mecla de componentes. *

El proceso es similar a la cromatografía de papel con la $enta!a de +ue se desarrolla m%s r%pidamente" proporciona me!ores separaciones  se puede elegir entre diferentes adsorentes. &a CCF es una t'cnica est%ndar en el laoratorio de +uímica org%nica. ,eido a su simplicidad  $elocidad" la CCF se utilia a menudo para monitoriar las reacciones +uímicas  tami'n para el an%lisis cualitati$o de los productos de una reacci-n" puesto +ue permite conocer de manera r%pida  sencilla cu%ntos componentes a en una mecla.

/rocedimiento

0na placa de CCF es una l%mina de $idrio" metal o pl%stico recuierta con una capa delgada de un s-lido adsorente (gel de sílice o al#mina). e deposita una pe+uea cantidad de la muestra prolema en disoluci-n en un punto en la parte inferior de la placa. Entonces la placa se introduce en una cueta cromatogr%ca" de forma +ue s-lo la parte inferior de la placa +ueda sumergida en el lí+uido. Este lí+uido o eluente es la fase m-$il  asciende por la placa de CCF por capilaridad.

3 medida +ue el eluente pasa por el lugar donde est% la manca de la mecla prolema se estalece un e+uilirio entre las mol'culas de cada uno

de los componentes en la mecla +ue son adsoridas  las +ue se encuentran en disoluci-n.

En principio" los componentes se diferenciar%n en soluilidad  en la fuera de su adsorci-n" de forma +ue unos componentes se desplaar%n m%s +ue otros. Cuando el eluente llega a la parte superior de la placa" esta se saca de la cueta" se seca"  los componentes separados de la mecla se $isualian.

4isualiaci-n de las mancas

i los compuestos son coloreados se pueden oser$ar las mancas a simple $ista. i no es así" a $arios m'todos para $isualiar las mancas correspondientes a cada componente de la mecla.

0tiliar lu ultra$ioleta (04256) para oser$ar la placa. Normalmente se adiciona un colorante 7uorescente al adsorente" de forma +ue la placa sea 7uorescente en todas partes e8cepto donde aa una manca correspondiente a un compuesto org%nico. 0tiliar re$eladores" por e!emplo" $apores de odo +ue es un reacti$o inespecíco. Emplear reacti$os especícos para desarrollar coloraci-n en las mancas. Esto se puede acer sumergiendo la placa de CCF en una disoluci-n +ue los contenga o en forma de spra.

C%lculo del factor de retenci-n 9f 

Cuando son $isiles" se puede determinar para cada una de las mancas el $alor de 9f (factor de retenci-n)" o la distancia +ue cada compuesto se desplaa en la placa. Cada compuesto tiene un 9f característico +ue depende del disol$ente empleado  del tipo de placa de CCF utiliada" pero es independiente del recorrido del disol$ente. ,e esta manera se puede audar a identicar un compuesto en una mecla al comparar su 9f con el

de un compuesto conocido (preferilemente cuando se acen eluir en la misma placa de CCF).

12.2.2 Cromatograa en columna

Es una t'cnica de puricaci-n" puesto +ue permite aislar los compuestos deseados de una mecla.

/rocedimiento

&a cromatografía en columna utilia una columna de $idrio $ertical +ue se llena con un soporte s-lido adsorente (fase estacionaria: los m%s utiliados son gel de sílice (i;2)  al#mina (3l2;e*ano

•

Patrn + 7entol

•

Patrn - cetoacetato de etilo

•

Patrn  Pirogalol

•

Patrn 0 "loroglucina

•

Patrn 1 ;en&ofenona

•

7uestra problema P+

•

7uestra problema P-

•

2evelador anisalde$ído (--1 ml etanol  +- ml anisalde$ído  + ml >-A?0)

2 +,tención de capilares&

Para la reali&acin de la práctica se deben de obtener G capilares de +6 cm apro*imadamente, uno para cada muestra ya sea patrn o problema. Ae podría $acer solo un capilar para las G muestras, pero ello conllevaría que fuese limpiado el capilar cada ve& que lo usemos con una muestra distinta a la anterior, con lo que se irían arrastrando errores. Para la reali&acin de los capilares, se tomará una varilla de vidrio de unos +1 cm apro*imadamente, esta será calentada en un mec$ero ;unsen $asta q se reblande&ca la seccin que estamos calentando. #legado a este punto, apartamos la varilla de la llama y rápidamente estiramos a*ialmente. 

2 "ealización de la cromatografía en capa fina&

%n este apartado se reali&aran 0 placas de cromatografía 0Q1 * 1 cm, las cuales solo se  podrán coger por los bordes y nunca tocar la parte de celulosa (la blanca), porque ello acarrearía errores en la medicin.

8na ve& obtenidas las placas, marcamos a lápi& una línea a + cm de la base. Aobre esa línea marcamos G puntos, donde se depositaran con los capilares pequeas cantidades de las muestras. %n los vasos de precipitado, que actan como tanque de elucin, se pondrán las disoluciones. 8tili&aremos 0 disoluciones de acetato de etilo (e) y $e*ano (>e*), cuyas composiciones serán del -6, 06, N6 y J6 4 de eF>e*. Aolamente utili&aremos 1 ml de cada disolucin, la cual no debe sobrepasar la línea dibujada a lápi&. "inalmente se revelarán las placas usando dos agentes reveladores •

 Reelador físico, usaremos una lámpara de rayos 8D, donde pondremos con

unas pin&as las placas cromatográficas. #as marcas que apare&can se sealarán con lápi&. •

 Reelador químico! una ve& pasada la placa por los rayos 8D, se introducirá

con una pin&a en un revelador anisalde$ído y posteriormente será colocada en una placa calefactora a +66R C. "inalmente anotamos los colores obtenidos.

"esultados. Para el calculo del factor de retencin, 2f, se usará la siguiente e*presin 2f E distancia recorrida por el compuesto distancia recorrida por el disolvente Ae tomará como distancia del compuesto la distancia comprendida entre la línea tra&ada donde se $a depositado el compuesto y el centro de la manc$a.

1laca 3 istema eluyente& -64 eF>e* Distancia recorrida por el disolvente&  1 mm 1atrón "ecorrido 4mm5

"f

67

Color

(om,re

+

-0

6.NJ1

=o

&ul

7entol

-

+G

6.0J1

Ai

2ojo

cetoacetato de etilo



-

6.61G

Ai

Dioleta

Pirogalol

0

6

6

Ai

marillo

"loroglucina

1

-G

6.GG+

Ai

Sncoloro

ben&ofenona

"f

67

Color

(om,re

1laca 8 istema eluyente& 064 eF>e* Distancia recorrida por el disolvente&  N mm 1atrón "ecorrido 4mm5 +

6

6.J

=o

&ul

7entol

-

-N

6.G--

Ai

2ojo

cetoacetato de etilo



M

6.-16

Ai

Dioleta

Pirogalol

0

0

6.+++

Ai

marillo

"loroglucina

1

+

6.JN+

Ai

Sncoloro

ben&ofenona

67

Color

(om,re

1laca 9 istema eluyente& N64 eF>e* Distancia recorrida por el disolvente&  G mm 1atrón "ecorrido 4mm5

"f

+

0

6.M+J

=o

&ul

7entol

-

6

6.J+6

Ai

2ojo

cetoacetato de etilo



-+

6.1NG

Ai

Dioleta

Pirogalol

0

+0

6.GJ

Ai

marillo

"loroglucina

1

1

6.M01

Ai

Sncoloro

ben&ofenona

"f

67

Color

(om,re

1laca : istema eluyente& J64 eF>e* Distancia recorrida por el disolvente&  G mm 1atrón "ecorrido 4mm5 +

0

6.M+J

=o

&ul

7entol

-

-

6.JN0

Ai

2ojo

cetoacetato de etilo



-J

6.G1N

Ai

Dioleta

Pirogalol

0

-

6.N-+

Ai

marillo

"loroglucina

1

1

6.M01

Ai

Sncoloro

ben&ofenona

Discusión de resultados.

%n algunas placas no se ve el mentol, esto es debido a que es posible q $ayan $abido otras reacciones las cuales impiden poder valorarlas. %n el factor de retencin, las distancias $an sido medidas con una regla a simple vista,  por lo que los valores de polaridad no son e*actos sino una simple apro*imacin.

Conclusiones. #a técnica de cromatografía en capa fina (CC") tiene numerosas ventajas, aparte de ser rápida, sencilla, barata... tiene también la ventaja de utili&ar poca cantidad de muestra. #as muestras problemas P+ y P- son me&clas de muestras patrn, siendo P+ una me&cla de floroglucina y mentol, y P- una me&cla de Pirogalol y ;en&ofenona. %sto lo $emos averiguado gracias a las muestras patrn, ya que al ser las muestras problema me&clas entre ellas, al meterlas en el tanque de elucin, el disolvente subirá por la placa e irá separando la me&cla, dejando abajo el patrn más polar. #uego, gracias a los reveladores físicos y químicos, se ve que esta compuesta la me&cla problema.  partir del factor de retencin sabremos que sustancia es más polar, siendo el mas polar  aquel que tenga un 2f menor.  ben&ofenona T mentol T acetoacetato de etilo T pirogalol T floroglucina

; 1olar 2 1olar 1.

Resumen

2.

Antecedentes

3.

Investigación

4.

Procedimiento de análisis

5.

Determinación de la eficacia de desorción

Resumen La cromatografía de gases es el procedimiento comúnmente utilizado en el análisis químico, en concreto cromatografía de gases consiste en una muestra que se vaporiza  se inecta en la ca!eza de la columna cromatografía. La muestra se transporta a trav"s de la columna por el flu#o de fase inerte, m$vil gaseosa. La propia columna contiene una fase líquida estacionaria que se adsor!e so!re la superficie de un s$lido inerte.

 Antecedentes La cromatografía de gases fue inventado por %&' (artin, quien, con )L( *nge, propusieron que la fase líquida m$vil utilizada en la cromatografía líquida podría ser reemplazado por un gas adecuado. La !ase de esta recomendaci$n fue que, de!ido a difusividad de los gases es muc+o más alta de solutos en los gases en comparaci$n con los líquidos, el equili!rio en un proceso cromatográfico sería muc+o más rápido  por lo tanto, las columnas muc+o más eficiente con tiempos de separaci$n muc+o más cortos.  %sí, el concepto de cromatografía de gases fue conce!ido +ace más de cincuenta aos. La primera separaci$n pu!licado por cromatografía de gases fue la de una serie de ácidos grasos, un procedimiento de valoraci$n se utiliza, #unto con una micro !ureta, como detector, tiempo despu"s la !ureta se automatiz$ para proporcionar una respuesta integra más eficaz. -l cromat$grafo de gases fue

tam!i"n uno de los primeros instrumentos de análisis que se asocian con un ordenador que controla!a el análisis, procesar los datos e inform$ de los resultados. na forma más sofisticada de la cromatografía de gases fue construido por &ames  (artin  descrito por &ames en 1/55. -l instrumento era un dispositivo algo voluminoso con una columna recta llena con una camisa de vapor. 0nicialmente, el detector se encuentra en la !ase de la columna  consistía en el dispositivo de valoraci$n automática, la separaci$n se presenta como un cromatograma en forma de una serie de pasos, la altura de cada paso de ser proporcional a la masa de soluto diluida. -l aparato fue utilizado con "ito para separar algunos ácidos grasos, pero la capacidad limitada del dispositivo para detectar s$lo material i$nico motivado (artin para desarrollar un detector más versátil, el !alance densidad del gas.

Investigación Diagrama de flujo funcional del Cromatografo de gases

Principio de funcionamiento del cromatografo de gases: 'uesto que esto estudiando ingeniería química petrolera, relacionare al cromat$grafo de gases es con una destilaci$n fraccionada con millones de platos. enemos un gas que !uscamos analizar  separar en sus componentes, este se pasa por un aparato a una temperatura fi#a, en este aparato, el gas pasa por una columna que contiene un s$lido ,o en su defecto, un s$lido em!e!ido en líquidos esto se llama ase i#a  el gas, se llama fase m$vil. La columna es mu larga, como de unos 2 mts  medio cm de espesor, este tu!o está lleno de polvo de cerámica, el cual está en forma de espiral metido en un +orno a unos 1567 La separaci$n se efectúa porque los diferentes componentes de la mezcla de gases interactúan con la fase fi#a. Los que más sean afines a la fase fi#a, tardan más en salir del tu!o  los otros tardan menos. 7on este principio, la separaci$n de los componentes. Luego, a la salida pones un detector que analiza los gases  te informa que componente sale primero  cuál despu"s, a medida que sale se van quemando  por la cantidad de calor  sa!emos la cantidad  por el tiempo en que salen la sustancia que es  la concentraci$n de cada componente. Aplicaciones industriales de la cromatografía de gases La cromatografía de gases se puede aplicar a gases  cualquier compuesto que pueda ser volatilizado o co nvertido en un derivado volátil la cromatografía de gases tiene amplia aplicaci$n, en las industrias se enfoca principalmente a evaluar la pureza de los reactantes  productos de reacci$n o !ien a monitorear la secuencia de la reacci$n, para los fa!ricantes de reactivos químicos su aplicaci$n para la determinaci$n de la pureza es lo más importante. -n la investigaci$n es un auiliar indispensa!le para diversas t"cnicas de evaluaci$n, entre las principales están los estudios cin"ticos, análisis de adsorci$n a temperatura programada, determinaci$n de áreas específicas por adsorci$n de gas  determinaci$n de isotermas de adsorci$n. -n el campo tam!i"n pueden ser aplicados, principalmente en estudios de contaminantes del agua8 insecticidas en agua, pesticidas en aguas de lagos, lagunas, ríos desec+os industriales descargados en ríos o lagunas.

En la industria del petróleo #uega una funci$n primordial, por medio de la cromatografía se pueden

analizar los constituentes de las gasolinas, las mezclas de gases de refinería, gases de com!usti$n, etc. Medición de hidrocaruros mediante cromatografía de gases! -ste m"todo de análisis se +a desarrollado para determinar concentraciones medias ponderadas en el tiempo de vapores de +idrocar!uros aromáticos en aire, mediante la utilizaci$n de equipos de toma de muestras de !a# o caudal, tanto para muestreos personales como en lugares fi#os. 9o puede ser utilizado para medir concentraciones instantáneas $ fluctuaciones de concentraci$n en periodos cortos de tiempo. Metodología La muestra se recoge +aciendo pasar una cantidad conocida de aire a trav"s de un tu!o relleno d" car!$n activo, mediante una !om!a de muestreo personal, que dando los vapores orgánicos adsor!idos so!re el car!$n. 'osteriormente se desor!en con sulfuro de car!ono  se analiza la disoluci$n resultante en un cromat$grafo de gases equipado con detector de ionizaci$n de llama. *e o!tienen las áreas de los picos de los analitos de inter"s  del patr$n interno, determinando la cantidad: presente en la muestra.  % partir de la masa de los analitos presentes en la muestra se o!tienen las concentraciones am!ientales. Reactivos " productos ;ases 9itr$geno purificado %8 **%970% (@ 09L%(%=L- @ (@ >?07%. Disoluciones Disoluci$n desor!ente8 sulfuro de car!ono conteniendo el patr$n interno en una concentraci$n de 1 ElFml. Disoluci$n patr$n para la cali!raci$n a un nivel de concentraci$n. *e prepara aadiendo mediante micro  #eringas de precisi$n, una cantidad determinada de cada analito a un volumen de disoluci$n desor!ente a fin de o!tener una disoluci$n patr$n de concentraci$n similar a la muestra a analizar. Dic+a concentraci$n se de!e epresar en t"rminos de mgFml de disoluci$n desor!ente. Disoluci$n patr$n para la cali!raci$n multinivel. *e preparan cinco disoluciones aadiendo mediante micro  #eringas de precisi$n diferentes cantidades de cada analito a un volumen de disoluci$n desor!ente a fin de o!tener disoluciones patr$n de concentraciones que cu!ran el intervalo de aplicaci$n del m"todo. Dic+as concentraciones se de!en epresar en t"rminos de mgFml de disoluci$n desor!ente.

Procedimiento de análisis 'reparaci$n de muestras  !lancos  %adir 1 ml de la disoluci$n desor!ente G4.3.1.H a un tu!o roscado  cerrarlo inmediatamente. P#C $as been used for medical (e.g. detecting vitamin / levels in blood serum), legal (e.g. detecting performance en$ancement drugs in urine), researc$ (e.g. separating t$e components of a comple* biological sample, or of similar synt$etic c$emicals from eac$ ot$er), and manufacturing (e.g. during t$e production process of p$armaceutical and biological products) purposes. _+` C$romatograp$y can be described as a mass transfer  process involving adsorption. >P#C relies on pumps to pass a pressuri&ed liquid and a sample mi*ture t$roug$ a column filled Lit$ a sorbent, leading to t$e separation of t$e sample components. !$e active component of t$e column, t$e sorbent, is typically a granular material made of solid particles (e.g. silica, polymers, etc.), -V16 micrometers in si&e. !$e components of  t$e sample mi*ture are separated from eac$ ot$er due to t$eir different degrees of interaction Lit$ t$e sorbent particles. !$e pressuri&ed liquid is typically a mi*ture of solvents (e.g. Later, acetonitrile andFor met$anol) and is referred to as a ^mobile p$ase^. Sts composition and temperature play a major role in t$e separation process by influencing t$e interactions taKing place betLeen sample components and sorbent. !$ese interactions are p$ysical in nature, suc$ as $ydrop$obic (dispersive), dipoleV  dipole and ionic, most often a combination t$ereof. >P#C is distinguis$ed from traditional (^loL pressure^) liquid c$romatograp$y because operational pressures are significantly $ig$er (16V16 bar), L$ile ordinary liquid c$romatograp$y typically relies on t$e force of gravity to pass t$e mobile p$ase t$roug$ t$e column. /ue to t$e small sample amount separated in analytical >P#C, typical column dimensions are -.+V0.N mm diameter, and 6V-16 mm lengt$. lso >P#C columns are made Lit$ smaller sorbent particles (-V16 micrometer in average particle si&e). !$is gives >P#C superior resolving poLer  L$en separating mi*tures, L$ic$ is L$y it is a popular c$romatograp$ic tec$nique. !$e sc$ematic of an >P#C instrument typically includes a sampler, pumps, and a detector. !$e sampler brings t$e sample mi*ture into t$e mobile p$ase stream L$ic$ carries it into t$e column. !$e pumps deliver t$e desired floL and composition of t$e mobile p$ase t$roug$ t$e column. !$e detector generates a signal proportional to t$e amount of sample component emerging from t$e column, $ence alloLing for quantitative analysis of t$e sample components.  digital microprocessor  and user softLare control t$e >P#C instrument and provide data analysis. Aome models of mec$anical pumps in a >P#C instrument can mi* multiple solvents toget$er in ratios c$anging in time, generating a composition gradient in t$e mobile p$ase. Darious detectors are in common use, suc$ as 8DFDis, p$otodiode array (P/) or based on mass spectrometry. 7ost >P#C instruments also $ave a column oven t$at alloLs for adjusting t$e temperature t$e separation is performed at.

Contents •

+ ?peration

•

- !ypes o

-.+ Partition c$romatograp$y

o

-.- =ormalVp$ase c$romatograp$y

o

-. /isplacement c$romatograp$y

o

-.0 2eversedBp$ase c$romatograp$y (2PC)

o

-.1 Ai&eBe*clusion c$romatograp$y

o

-.N SonBe*c$ange c$romatograp$y

o

-.G ;ioaffinity c$romatograp$y

o

-.J queous normalBp$ase c$romatograp$y

•

 Ssocratic and gradient elution

•

0 Parameters o

0.+ !$eoretical

o

0.- Snternal diameter 

o

0. Particle si&e

o

0.0 Pore si&e

o

0.1 Pump pressure

•

1 Aee also

•

N 2eferences

•

G "urt$er reading

•

J %*ternal linKs

+peration !$e sample mi*ture to be separated and analy&ed is introduced, in a discrete small volume (typically microliters), into t$e stream of mobile p$ase percolating t$roug$ t$e column. !$e components of t$e sample move t$roug$ t$e column at different velocities, L$ic$ are function of specific p$ysical interactions Lit$ t$e sorbent (also called stationary p$ase). !$e velocity of eac$ component depends on its c$emical nature, on t$e nature of t$e stationary p$ase (column) and on t$e composition of t$e mobile p$ase.

!$e time at L$ic$ a specific analyte elutes (emerges from t$e column) is called its retention time. !$e retention time measured under particular conditions is considered an identifying c$aracteristic of a given analyte. 7any different types of columns are available, filled Lit$ sorbents varying in particle si&e, and in t$e nature of t$eir surface (^surface c$emistry^). !$e use of smaller particle si&e pacKing materials requires t$e use of $ig$er operational pressure (^bacKpressure^) and typically improves c$romatograp$ic resolution (i.e. t$e degree of separation  betLeen consecutive analytes emerging from t$e column). Sn terms of surface c$emistry, sorbent particles may be $ydrop$obic or polar in nature. Common mobile p$ases used include any miscible combination of Later  Lit$ various organic solvents (t$e most common are acetonitrile and met$anol). Aome >P#C tec$niques use LaterBfree mobile p$ases (see  =ormalBp$ase c$romatograp$y beloL). !$e aqueous component of t$e mobile p$ase may contain acids (suc$ as formic,  p$osp$oric or trifluoroacetic acid) or salts to assist in t$e separation of t$e sample components. !$e composition of t$e mobile p$ase may be Kept constant (^isocratic elution mode^) or varied (^gradient elution mode^) during t$e c$romatograp$ic analysis. Ssocratic elution is typically effective in t$e separation of sample components t$at are not very different in t$eir affinity for t$e stationary p$ase. Sn gradient elution t$e composition of t$e mobile p$ase is varied typically from loL to $ig$ eluting strengt$. !$e eluting strengt$ of t$e mobile p$ase is reflected by analyte retention times Lit$ $ig$ eluting strengt$ producing fast elution (Es$ort retention times).  typical gradient  profile in reversed p$ase c$romatograp$y mig$t start at 14 acetonitrile (in Later or aqueous buffer) and progress linearly to M14 acetonitrile over 1V-1 minutes. Periods of constant mobile p$ase composition may be part of any gradient profile. "or e*ample, t$e mobile p$ase composition may be Kept constant at 14 acetonitrile for +V min, folloLed by a linear c$ange up to M14 acetonitrile. !$e c$osen composition of t$e mobile p$ase (also called eluent) depends on t$e intensity of interactions betLeen various sample components (^analytes^) and stationary  p$ase (e.g. $ydrop$obic interactions in reversedBp$ase >P#C). /epending on t$eir affinity for t$e stationary and mobile p$ases analytes partition betLeen t$e tLo during t$e separation process taKing place in t$e column. !$is partitioning process is similar to t$at L$ic$ occurs during a liquidVliquid e*traction but is continuous, not stepBLise. Sn t$is e*ample, using a LaterFacetonitrile gradient, more $ydrop$obic components Lill elute (come off t$e column) late, once t$e mobile p$ase gets more concentrated in acetonitrile (i.e. in a mobile p$ase of $ig$er eluting strengt$). !$e c$oice of mobile p$ase components, additives (suc$ as salts or acids) and gradient conditions depends on t$e nature of t$e column and sample components. ?ften a series of trial runs is performed Lit$ t$e sample in order to find t$e >P#C met$od L$ic$ gives adequate separation.

'ypes 1artition c*romatograp*y

>S#SC Partition !ec$nique 8seful 2ange Partition c$romatograp$y Las t$e first Kind of c$romatograp$y t$at c$emists developed. !$e partition coefficient principle $as been applied in paper c$romatograp$y, t$in layer c$romatograp$y, gas p$ase and liquidBliquid applications. !$e +M1- =obel Pri&e in c$emistry Las earned by rc$er Uo$n Porter 7artin and 2ic$ard #aurence 7illington Aynge for t$eir development of t$e tec$nique, L$ic$ Las used for t$eir separation of amino acids. Partition c$romatograp$y uses a retained solvent, on t$e surface or Lit$in t$e grains or fibers of an ^inert^ solid supporting matri* as Lit$ paper c$romatograp$y' or taKes advantage of some coulombic andFor $ydrogen donor interaction Lit$ t$e stationary p$ase. nalyte molecules partition betLeen a liquid stationary p$ase and t$e eluent. Uust as in >ydrop$ilic Snteraction C$romatograp$y (>S#SC' a subBtec$nique Lit$in >P#C), t$is met$od separates analytes based on differences in t$eir polarity. >S#SC most often uses a bonded polar stationary p$ase and a mobile p$ase made  primarily of acetonitrile Lit$ Later as t$e strong component. Partition >P#C $as been used $istorically on unbonded silica or alumina supports. %ac$ LorKs effectively for separating analytes by relative polar differences. >S#SC bonded p$ases $ave t$e advantage of separating acidic, basic and neutral solutes in a single c$romatograp$ic run._-` !$e polar analytes diffuse into a stationary Later layer associated Lit$ t$e polar stationary p$ase and are t$us retained. !$e stronger t$e interactions betLeen t$e polar analyte and t$e polar stationary p$ase (relative to t$e mobile p$ase) t$e longer t$e elution time. !$e interaction strengt$ depends on t$e functional groups part of t$e analyte molecular structure, Lit$ more polari&ed groups (e.g. $ydro*ylB) and groups capable of $ydrogen bonding inducing more retention. Coulombic (electrostatic) interactions can also increase retention. 8se of more polar solvents in t$e mobile p$ase Lill decrease t$e retention time of t$e analytes, L$ereas more $ydrop$obic solvents tend to increase retention times.

(ormalp*ase c*romatograp*y  =ormalVp$ase c$romatograp$y Las one of t$e first Kinds of >P#C t$at c$emists developed. lso KnoLn as normalBp$ase >P#C (=PB>P#C) t$is met$od separates analytes based on t$eir affinity for a polar stationary surface suc$ as silica, $ence it is  based on analyte ability to engage in polar interactions (suc$ as $ydrogenBbonding or dipoleBdipole type of interactions) Lit$ t$e sorbent surface. =PB>P#C uses a nonBpolar,

nonBaqueous mobile p$ase (e.g. C$loroform), and LorKs effectively for separating analytes readily soluble in nonBpolar solvents. !$e analyte associates Lit$ and is retained by t$e polar stationary p$ase. dsorption strengt$s increase Lit$ increased analyte polarity. !$e interaction strengt$ depends not only on t$e functional groups  present in t$e structure of t$e analyte molecule, but also on steric factors. !$e effect of steric $indrance on interaction strengt$ alloLs t$is met$od to resolve (separate) structural isomers. !$e use of more polar solvents in t$e mobile p$ase Lill decrease t$e retention time of analytes, L$ereas more $ydrop$obic solvents tend to induce sloLer elution (increased retention times). Dery polar solvents suc$ as traces of Later in t$e mobile p$ase tend to adsorb to t$e solid surface of t$e stationary p$ase forming a stationary bound (Later) layer L$ic$ is considered to play an active role in retention. !$is be$avior is someL$at  peculiar to normal p$ase c$romatogra$y because it is governed almost e*clusively by an adsorptive mec$anism (i.e. analytes interact Lit$ a solid surface rat$er t$an Lit$ t$e solvated layer of a ligand attac$ed to t$e sorbent surface' see also reversedBp$ase >P#C  beloL). dsorption c$romatograp$y is still Lidely used for structural isomer separations in bot$ column and t$inBlayer c$romatograp$y formats on activated (dried) silica or alumina supports. PartitionB and =PB>P#C fell out of favor in t$e +MG6s Lit$ t$e development of reversedBp$ase >P#C because of poor reproducibility of retention times due to t$e  presence of a Later or protic organic solvent layer on t$e surface of t$e silica or alumina c$romatograp$ic media. !$is layer c$anges Lit$ any c$anges in t$e composition of t$e mobile p$ase (e.g. moisture level) causing drifting retention times. 2ecently, partition c$romatograp$y $as become popular again Lit$ t$e development of >S#SC bonded p$ases L$ic$ demonstrate improved reproducibility, and due to a better understanding of t$e range of usefulness of t$e tec$nique.

Displacement c*romatograp*y !$e basic principle of displacement c$romatograp$y is  molecule Lit$ a $ig$ affinity for t$e c$romatograp$y matri* (t$e displacer) Lill compete effectively for binding sites, and t$us displace all molecules Lit$ lesser affinities. _` !$ere are distinct differences  betLeen displacement and elution c$romatograp$y. Sn elution mode, substances typically emerge from a column in narroL, @aussian peaKs. Oide separation of peaKs,  preferably to baseline, is desired in order to ac$ieve ma*imum purification. !$e speed at L$ic$ any component of a mi*ture travels doLn t$e column in elution mode depends on many factors. ;ut for tLo substances to travel at different speeds, and t$ereby be resolved, t$ere must be substantial differences in some interaction betLeen t$e  biomolecules and t$e c$romatograp$y matri*. ?perating parameters are adjusted to ma*imi&e t$e effect of t$is difference. Sn many cases, baseline separation of t$e peaKs can be ac$ieved only Lit$ gradient elution and loL column loadings. !$us, tLo draLbacKs to elution mode c$romatograp$y, especially at t$e preparative scale, are operational comple*ity, due to gradient solvent pumping, and loL t$roug$put, due to loL column loadings. /isplacement c$romatograp$y $as advantages over elution c$romatograp$y in t$at components are resolved into consecutive &ones of pure substances rat$er t$an YpeaKs\. ;ecause t$e process taKes advantage of t$e nonlinearity

of t$e isot$erms, a larger column feed can be separated on a given column Lit$ t$e  purified components recovered at significantly $ig$er concentration.

"eversed2p*ase c*romatograp*y 4"1C5

 c$romatogram of comple* mi*ture (perfume Later) obtained by reversed p$ase >P#C "or more details on t$is topic, see 2eversedBp$ase c$romatograp$y. 2eversed p$ase >P#C (2PB>P#C) $as a nonBpolar stationary p$ase and an aqueous, moderately polar mobile p$ase. ?ne common stationary p$ase is a silica L$ic$ $as been surfaceBmodified Lit$ 27e -AiCl, L$ere 2 is a straig$t c$ain alKyl group suc$ as C +J>G or CJ>+G. Oit$ suc$ stationary p$ases, retention time is longer for molecules L$ic$ are less polar, L$ile polar molecules elute more readily (early in t$e analysis). n investigator can increase retention times by adding more Later to t$e mobile p$ase' t$ereby maKing t$e affinity of t$e $ydrop$obic analyte for t$e $ydrop$obic stationary  p$ase stronger relative to t$e noL more $ydrop$ilic mobile p$ase. Aimilarly, an investigator can decrease retention time by adding more organic solvent to t$e eluent. 2PB>P#C is so commonly used t$at it is often incorrectly referred to as ^>P#C^ Lit$out furt$er specification. !$e p$armaceutical industry regularly employs 2PB>P#C to qualify drugs before t$eir release. 2PB>P#C operates on t$e principle of $ydrop$obic interactions, L$ic$ originates from t$e $ig$ symmetry in t$e dipolar Later structure and plays t$e most important role in all  processes in life science. 2PB>P#C alloLs t$e measurement of t$ese interactive forces. !$e binding of t$e analyte to t$e stationary p$ase is proportional to t$e contact surface area around t$e nonBpolar segment of t$e analyte molecule upon association Lit$ t$e ligand on t$e stationary p$ase. !$is solvop$obic effect is dominated by t$e force of Later for ^cavityBreduction^ around t$e analyte and t$e C +JBc$ain versus t$e comple* of  bot$. !$e energy released in t$is process is proportional to t$e surface tension of t$e eluent (Later G.+6N UFcm, met$anol -.-+6 N UFcm) and to t$e $ydrop$obic surface of t$e analyte and t$e ligand respectively. !$e retention can be decreased by adding a less polar solvent (met$anol, acetonitrile) into t$e mobile p$ase to reduce t$e surface tension of Later. @radient elution uses t$is effect by automatically reducing t$e polarity and t$e surface tension of t$e aqueous mobile p$ase during t$e course of t$e analysis. Atructural properties of t$e analyte molecule play an important role in its retention c$aracteristics. Sn general, an analyte Lit$ a larger $ydrop$obic surface area (CB>, CBC, and generally nonBpolar atomic bonds, suc$ as ABA and ot$ers) is retained longer

 because it is nonBinteracting Lit$ t$e Later structure. ?n t$e ot$er $and, analytes Lit$ $ig$er polar surface area (conferred by t$e presence of polar groups, suc$ as B?>, B=> -, C?? V  or B=> in t$eir structure) are less retained as t$ey are better integrated into Later. Auc$ interactions are subject to steric effects in t$at very large molecules may $ave only restricted access to t$e pores of t$e stationary p$ase, L$ere t$e interactions Lit$ surface ligands (alKyl c$ains) taKe place. Auc$ surface $indrance typically results in less retention. 2etention time increases Lit$ $ydrop$obic (nonBpolar) surface area. ;ranc$ed c$ain compounds elute more rapidly t$an t$eir corresponding linear isomers because t$e overall surface area is decreased. Aimilarly organic compounds Lit$ single CBCBbonds elute later t$an t$ose Lit$ a CEC or CBCBtriple bond, as t$e double or triple bond is s$orter t$an a single CBCBbond. side from mobile p$ase surface tension (organi&ational strengt$ in eluent structure), ot$er mobile p$ase modifiers can affect analyte retention. "or e*ample, t$e addition of inorganic salts causes a moderate linear increase in t$e surface tension of aqueous solutions (ca. +.1+6 G UFcm per 7ol for =aCl, -.1+6G UFcm per 7ol for (=>0)-A?0), and because t$e entropy of t$e analyteBsolvent interface is controlled by surface tension, t$e addition of salts tend to increase t$e retention time. !$is tec$nique is used for mild separation and recovery of proteins and protection of t$eir biological activity in protein analysis ($ydrop$obic interaction c$romatograp$y, >SC). not$er important factor is t$e mobile p$ase p> since it can c$ange t$e $ydrop$obic c$aracter of t$e analyte. "or t$is reason most met$ods use a  buffering agent, suc$ as sodium p$osp$ate, to control t$e p>. ;uffers serve multiple purposes control of p>, neutrali&e t$e c$arge on t$e silica surface of t$e stationary p$ase and act as ion pairing agents to neutrali&e analyte c$arge. mmonium formate is commonly added in mass spectrometry to improve detection of certain analytes by t$e formation of analyteB ammonium adducts.  volatile organic acid suc$ as acetic acid, or most commonly formic acid, is often added to t$e mobile p$ase if mass spectrometry is used to analy&e t$e column effluent. !rifluoroacetic acid is used infrequently in mass spectrometry applications due to its persistence in t$e detector and solvent delivery system, but can be effective in improving retention of analytes suc$ as carbo*ylic acids in applications utili&ing ot$er detectors, as it is a fairly strong organic acid. !$e effects of acids and  buffers vary by application but generally improve c$romatograp$ic resolution. 2eversed p$ase columns are quite difficult to damage compared Lit$ normal silica columns' $oLever, many reversed p$ase columns consist of alKyl derivati&ed silica  particles and s$ould never  be used Lit$ aqueous bases as t$ese Lill destroy t$e underlying silica particle. !$ey can be used Lit$ aqueous acid, but t$e column s$ould not be e*posed to t$e acid for too long, as it can corrode t$e metal parts of t$e >P#C equipment. 2PB>P#C columns s$ould be flus$ed Lit$ clean solvent after use to remove residual acids or buffers, and stored in an appropriate composition of solvent. !$e metal content of >P#C columns must be Kept loL if t$e best possible ability to separate substances is to be retained.  good test for t$e metal content of a column is to inject a sample L$ic$ is a mi*ture of -,-QB and 0,0QB bipyridine. ;ecause t$e -,-QBbipy can c$elate t$e metal, t$e s$ape of t$e peaK for t$e -,-QBbipy Lill be distorted (tailed) L$en metal ions are present on t$e surface of t$e silica._citation needed `..

ize2e$clusion c*romatograp*y "or more details on t$is topic, see si&eBe*clusion c$romatograp$y. Ai&eBe*clusion c$romatograp$y (A%C), also KnoLn as  gel permeation c'romatograp', or gel filtration c'romatograp',, separates particles on t$e basis of molecular si&e (actually by a particleQs AtoKes radius). St is generally a loL resolution c$romatograp$y and t$us it is often reserved for t$e final, ^polis$ing^ step of t$e purification. St is also useful for determining t$e tertiary structure and quaternary structure of purified  proteins. A%C is used primarily for t$e analysis of large molecules suc$ as proteins or  polymers. A%C LorKs by trapping t$ese smaller molecules in t$e pores of a particle. !$e larger molecules simply pass by t$e pores as t$ey are too large to enter t$e pores. #arger  molecules t$erefore floL t$roug$ t$e column quicKer t$an smaller molecules, t$at is, t$e smaller t$e molecule, t$e longer t$e retention time. !$is tec$nique is Lidely used for t$e molecular Leig$t determination of  polysacc$arides. A%C is t$e official tec$nique (suggested by %uropean p$armacopeia) for t$e molecular Leig$t comparison of different commercially available loLBmolecular  Leig$t $eparins.

%on2e$c*ange c*romatograp*y "or more details on t$is topic, see SonBe*c$ange c$romatograp$y. Sn ionBe*c$ange c$romatograp$y (SC), retention is based on t$e attraction betLeen solute ions and c$arged sites bound to t$e stationary p$ase. Aolute ions of t$e same c$arge as t$e c$arged sites on t$e column are e*cluded from binding, L$ile solute ions of t$e opposite c$arge of t$e c$arged sites of t$e column are retained on t$e column. Aolute ions t$at are retained on t$e column can be eluted from t$e column by c$anging t$e solvent conditions (e.g. increasing t$e ion effect of t$e solvent system by increasing t$e salt concentration of t$e solution, increasing t$e column temperature, c$anging t$e  p> of t$e solvent, etc...). !ypes of ion e*c$angers include •

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Polystyrene resins V !$ese alloL cross linKage L$ic$ increases t$e stability of t$e c$ain. >ig$er cross linKage reduces sLerving, L$ic$ increases t$e equilibration time and ultimately improves selectivity. Cellulose and de*tran ion e*c$angers (gels) V !$ese possess larger pore si&es and loL c$arge densities maKing t$em suitable for protein separation. ControlledBpore glass or porous silica

Sn general, ion e*c$angers favor t$e binding of ions of $ig$er c$arge and smaller radius. n increase in counter ion (Lit$ respect to t$e functional groups in resins) concentration reduces t$e retention time.  decrease in p> reduces t$e retention time in cation e*c$ange L$ile an increase in p> reduces t$e retention time in anion e*c$ange. ;y

loLering t$e p> of t$e solvent in a cation e*c$ange column, for instance, more $ydrogen ions are available to compete for positions on t$e anionic stationary p$ase, t$ereby eluting LeaKly bound cations. !$is form of c$romatograp$y is Lidely used in t$e folloLing applications Later  purification, preconcentration of trace components, ligandBe*c$ange c$romatograp$y, ionBe*c$ange c$romatograp$y of proteins, $ig$Bp> anionBe*c$ange c$romatograp$y of carbo$ydrates and oligosacc$arides, and ot$ers.

Bioaffinity c*romatograp*y "or more details on t$is topic, see ffinity c$romatograp$y. !$is c$romatograp$ic process relies on t$e property of biologically active substances to form stable, specific, and reversible comple*es. !$e formation of t$ese comple*es involves t$e participation of common molecular forces suc$ as t$e Dan der Oaals interaction, electrostatic interaction, dipoleBdipole interaction, $ydrop$obic interaction, and t$e $ydrogen bond. n efficient, biospecific bond is formed by a simultaneous and concerted action of several of t$ese forces in t$e complementary binding sites.

A!ueous normal2p*ase c*romatograp*y queous normalBp$ase c$romatograp$y (=P) is a c$romatograp$ic tec$nique L$ic$ encompasses t$e mobile p$ase region betLeen reversedBp$ase c$romatograp$y (2P) and organic normal p$ase c$romatograp$y (?=P). !$is tec$nique is used to ac$ieve unique selectivity for $ydrop$ilic compounds, s$oLing normal p$ase elution using reversedBp$ase solvents. _citation needed `

%socratic and gradient elution  separation in L$ic$ t$e mobile p$ase composition remains constant t$roug$out t$e  procedure is termed isocratic (meaning constant composition). !$e Lord Las coined by Csaba >orvat$ L$o Las one of t$e pioneers of >P#C. _citation needed `, !$e mobile p$ase composition does not $ave to remain constant.  separation in L$ic$ t$e mobile p$ase composition is c$anged during t$e separation process is described as a  gradient elution._0` ?ne e*ample is a gradient starting at +64 met$anol and ending at M64 met$anol after -6 minutes. !$e tLo components of t$e mobile p$ase are typically termed ^^ and ^;^' A is t$e ^LeaK^ solvent L$ic$ alloLs t$e solute to elute only sloLly, L$ile 0 is t$e ^strong^ solvent L$ic$ rapidly elutes t$e solutes from t$e column. Sn reversedBp$ase c$romatograp$y, solvent A is often Later or an aqueous buffer, L$ile  0 is an organic solvent miscible Lit$ Later, suc$ as acetonitrile, met$anol, !>", or isopropanol. Sn isocratic elution, peaK Lidt$ increases Lit$ retention time linearly according to t$e equation for =, t$e number of t$eoretical plates. !$is leads to t$e disadvantage t$at lateB eluting peaKs get very flat and broad. !$eir s$ape and Lidt$ may Keep t$em from being recogni&ed as peaKs.

@radient elution decreases t$e retention of t$e laterBeluting components so t$at t$ey elute faster, giving narroLer (and taller) peaKs for most components. !$is also improves t$e peaK s$ape for tailed peaKs, as t$e increasing concentration of t$e organic eluent  pus$es t$e tailing part of a peaK forLard. !$is also increases t$e peaK $eig$t (t$e peaK looKs ^s$arper^), L$ic$ is important in trace analysis. !$e gradient program may include sudden ^step^ increases in t$e percentage of t$e organic component, or different slopes at different times V all according to t$e desire for optimum separation in minimum time. Sn isocratic elution, t$e selectivity does not c$ange if t$e column dimensions (lengt$ and inner diameter) c$ange V t$at is, t$e peaKs elute in t$e same order. Sn gradient elution, t$e elution order may c$ange as t$e dimensions or floL rate c$ange. _citation needed ` !$e driving force in reversed p$ase c$romatograp$y originates in t$e $ig$ order of t$e Later structure. !$e role of t$e organic component of t'e mo+ile p'ase is to reduce t$is $ig$ order and t$us reduce t'e retarding strengt' of t'e a*ueous component.

1arameters '*eoretical >P#C separations $ave t$eoretical parameters and equations to describe t$e separation of components into signal peaKs L$en detected by instrumentation suc$ as by a 8D detector or a mass spectrometer. !$e parameters are largely derived from tLo sets of c$romatagrap$ic t$eory plate t$eory (as part of Partition c$romatograp$y), and t$e rate t$eory of c$romatograp$y F 1an "eemter e*uation. ?f course, t$ey can be put in  practice t$roug$ analysis of >P#C c$romatograms, alt$oug$ rate t$eory is considered t$e more accurate t$eory. !$ey are analogous to t$e calculation of retention factor for a paper c$romatograp$y separation, but describes $oL Lell >P#C separates a mi*ture into tLo or more components t$at are detected as peaKs (bands) on a c$romatogram. !$e >P#C  parameters are t$e efficiency factor( N ), t$e retention factor (Kappa prime), and t$e separation factor (alp$a). !oget$er t$e factors are variables in a resolution equation, L$ic$ describes $oL Lell tLo componentsQ peaKs separated or overlapped eac$ ot$er. !$ese parameters are mostly only used for describing >P#C reversed p$ase and >P#C normal p$ase separations, since t$ose separations tend to be more subtle t$an ot$er >P#C modes (e.g. ion e*c$ange and si&e e*clusion). •

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Doid volume is t$e amount of space in a column t$at is occupied by solvent. St is t$e space Lit$in t$e column t$at is outside of t$e columnQs internal pacKing material. Doid volume is measured on a c$romatogram as t$e first component  peaK detected, L$ic$ is usually t$e solvent t$at Las present in t$e sample mi*ture' ideally t$e sample solvent floLs t$roug$ t$e column Lit$out interacting Lit$ t$e column, but is still detectable as distinct from t$e >P#C solvent. !$e void volume is used as a correction factor. %fficiency factor ( N ) practically measures $oL s$arp component peaKs on t$e c$romatogram are, as ratio of t$e component peaKQs area (^retention time^)

relative to t$e Lidt$ of t$e peaKs at t$eir Lidest point (at t$e baseline). PeaKs t$at are tall, s$arp, and relatively narroL indicate t$at separation met$od efficiently removed a component from a mi*ture' $ig$ efficiency. %fficiency is very dependent upon t$e >P#C column and t$e >P#C met$od used. %fficiency factor is synonymous Lit$ plate number, and t$e Qnumber of t$eoretical platesQ. •

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2etention factor  (%appa prime) measures $oL long a component of t$e mi*ture stucK to t$e column, measured by t$e area under t$e curve of its peaK in a c$romatogram (since >P#C c$romatograms are a function of time). %ac$ c$romatogram peaK Lill $ave its oLn retention factor (e.g. %appa+ for t$e retention factor of t$e first peaK). !$is factor may be corrected for by t$e void volume of t$e column. Aeparation factor (alp'a) is a relative comparison on $oL Lell tLo neig$boring components of t$e mi*ture Lere separated (i.e. tLo neig$boring bands on a c$romatogram). !$is factor is defined in terms of a ratio of t$e retention factors of a pair of neig$boring c$romatogram peaKs, and may also be corrected for by t$e void volume of t$e column. !$e greater t$e separation factor value is over +.6, t$e better t$e separation, until about -.6 beyond L$ic$ an >P#C met$od is  probably not needed for separation.

2esolution equations relate t$e t$ree factors suc$ t$at $ig$ efficiency and separation factors improve t$e resolution of component peaKs in a >P#C separation.

%nternal diameter !$e internal diameter (S/) of an >P#C column is an important parameter t$at influences t$e detection sensitivity and separation selectivity in gradient elution. St also determines t$e quantity of analyte t$at can be loaded onto t$e column. #arger columns are usually seen in industrial applications, suc$ as t$e purification of a drug product for later use. #oLBS/ columns $ave improved sensitivity and loLer solvent consumption at t$e e*pense of loading capacity. •

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#arger S/ columns (over +6 mm) are used to purify usable amounts of material  because of t$eir large loading capacity. nalytical scale columns (0.N mm) $ave been t$e most common type of columns, t$oug$ smaller columns are rapidly gaining in popularity. !$ey are used in traditional quantitative analysis of samples and often use a 8DBDis absorbance detector .  =arroLBbore columns (+V- mm) are used for applications L$en more sensitivity is desired eit$er Lit$ special 8DBvis detectors, fluorescence detection or Lit$ ot$er detection met$ods liKe liquid c$romatograp$yBmass spectrometry Capillary columns (under 6. mm) are used almost e*clusively Lit$ alternative detection means suc$ as mass spectrometry. !$ey are usually made from fused silica capillaries, rat$er t$an t$e stainless steel tubing t$at larger columns employ.

1article size 7ost traditional >P#C is performed Lit$ t$e stationary p$ase attac$ed to t$e outside of small sp$erical silica particles (very small beads). !$ese particles come in a variety of si&es Lit$ 1 5m beads being t$e most common. Amaller particles generally provide more surface area and better separations, but t$e pressure required for optimum linear velocity increases by t$e inverse of t$e particle diameter squared. _1`_N`_G` !$is means t$at c$anging to particles t$at are $alf as big, Keeping t$e si&e of t$e column t$e same, Lill double t$e performance, but increase t$e required pressure by a factor of four. #arger particles are used in preparative >P#C (column diameters 1 cm up to T6 cm) and for nonB>P#C applications suc$ as solidBp$ase e*traction.

1ore size 7any stationary p$ases are porous to provide greater surface area. Amall pores provide greater surface area L$ile larger pore si&e $as better Kinetics, especially for larger analytes. "or e*ample, a protein L$ic$ is only slig$tly smaller t$an a pore mig$t enter t$e pore but does not easily leave once inside.

1ump pressure Pumps vary in pressure capacity, but t$eir performance is measured on t$eir ability to yield a consistent and reproducible floL rate. Pressure may reac$ as $ig$ as 06 7Pa (N666 lbfFin -), or about 066 atmosp$eres. 7odern >P#C systems $ave been improved to LorK at muc$ $ig$er pressures, and t$erefore are able to use muc$ smaller particle si&es in t$e columns (- m). !$ese ^8ltra >ig$ Performance #iquid C$romatograp$y^ systems or 2A#CF8>P#Cs can LorK at up to +66 7Pa (+1,666 lbfFin -), or about +666 atmosp$eres. !$e term ^8P#C^ is a trademarK of t$e Oaters Corporation, but is sometimes used to refer to t$e more general tec$nique.

ee also •

>istory of c$romatograp$y

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Csaba >orvát$

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Son c$romatograp$y

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Column c$romatograp$y

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Capillary electroc$romatograp$y

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7icellar liquid c$romatograp$y

"eferences

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