Corelatii Clinice - Liliana Foia.pdf

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI

Sub redactia LILIANA FOIA

Sub redactia LILIANA FOIA

EDITURA JUNIMEA IAŞI – 2010

EDITURA JUNIMEA IAŞI – 2010

Tehnoredactor: Marius Cristian Toma

Tehnoredactor: Marius Cristian Toma

Descrierea CIP a Bibliotecii Nationale A Romaniei Corelatii clinice in interpretarea parametrilor biochimici /red.: Liliana Foia-Iasi : Junimea,2010 ISBN 978-973-37-1483-5

Descrierea CIP a Bibliotecii Nationale A Romaniei Corelatii clinice in interpretarea parametrilor biochimici /red.: Liliana Foia-Iasi : Junimea,2010 ISBN 978-973-37-1483-5

Foia Liliana (red.)

Foia Liliana (red.)

616

616

© LILIANA FOIA © EDITURA JUNIMEA, IAŞI – ROMÂNIA

© LILIANA FOIA © EDITURA JUNIMEA, IAŞI – ROMÂNIA

EDITURA JUNIMEA ACREDITARE CNCSIS NR. 97/2010

EDITURA JUNIMEA ACREDITARE CNCSIS NR. 97/2010

AUTORI

AUTORI

Liliana FOIA Profesor universitar Disciplina Chimie şi Biochimie a Cavităţii Orale UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic primar Medicina de Laborator Doctor ȋn ştiinţe medicale

Liliana FOIA Profesor universitar Disciplina Chimie şi Biochimie a Cavităţii Orale UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic primar Medicina de Laborator Doctor ȋn ştiinţe medicale

Florina Mihaela FILIP-CIUBOTARU Şef lucrări Disciplina de Medicină de Familie Adulţi UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic primar Medicina Interna Medic primar Medicina Muncii Medic specialist Medicină de Familie Doctor ȋn ştiinţe medicale

Florina Mihaela FILIP-CIUBOTARU Şef lucrări Disciplina de Medicină de Familie Adulţi UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic primar Medicina Interna Medic primar Medicina Muncii Medic specialist Medicină de Familie Doctor ȋn ştiinţe medicale

Ancuta GORIUC Doctorand UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic in specialitatea Stomatologie generala

Ancuta GORIUC Doctorand UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic in specialitatea Stomatologie generala

Stefania RACOVITA Cercetator ştiinţific Institutul de Chimie Macromoleculară “Petru Poni” Iaşi Doctor ȋn chimie

Stefania RACOVITA Cercetator ştiinţific Institutul de Chimie Macromoleculară “Petru Poni” Iaşi Doctor ȋn chimie

Vasilica TOMA Şef lucrări Disciplina de Pedodonţie UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic primar Stomatologie generală Medic specialist Ortodonţie şi Ortopedie Facială Doctor ȋn ştiinţe medicale

Vasilica TOMA Şef lucrări Disciplina de Pedodonţie UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic primar Stomatologie generală Medic specialist Ortodonţie şi Ortopedie Facială Doctor ȋn ştiinţe medicale

Didona UNGUREANU Conferenţiar universitar Disciplina de Biochimie UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic primar Medicina de Laborator Doctor ȋn ştiinţe medicale

Didona UNGUREANU Conferenţiar universitar Disciplina de Biochimie UMF “Gr. T. Popa” Iaşi Medic primar Medicina de Laborator Doctor ȋn ştiinţe medicale

Colaboratori

Colaboratori

Alina ANDONE, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Monica BEJINARIU, Chimist Principal Laboratorul de Biochimie, Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Cristina CECATI, Chimist Principal Laboratorul de Biochimie, Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Ioana CHIULU, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Ancuţa LUPU, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Vlad PARASCHIV, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Alina VERINGU, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi

Alina ANDONE, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Monica BEJINARIU, Chimist Principal Laboratorul de Biochimie, Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Cristina CECATI, Chimist Principal Laboratorul de Biochimie, Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Ioana CHIULU, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Ancuţa LUPU, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Vlad PARASCHIV, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi Alina VERINGU, Medic rezident Medicină de laborator Spitalul „Sf. Spiridon” Iaşi

Cuvânt înainte

Cuvânt înainte

Biochimia, fie ea analitică, descriptivă sau clinică este doar una, cea aplicată, poate fi doar scrisă diferit după cum se adresează studenţilor, biochimiştilor, cercetătorilor sau medicilor curanţi şi de laborator. Pornind de la premize practice şi realiste, care atestă semnificaţia covârşitoare a rezultatelor analizelor de laborator, precum şi a interpretării corecte a acestora ȋn cadrul oricărui proces de diagnostic şi monitorizare a terapiei pacienţilor, lucrarea de faţă oferă celor interesaţi, date atât despre noţiuni fundamentale de biochimie cât şi tehnici de analiză a parametrilor de laborator ȋn scop diagnostic. Aspectul practic vine şi din capitolul în care sunt prezentate modalităţile de prelevare, prelucrare şi investigare a fluidelor biologice, extins nu doar la nivel sistemic, dar şi la nivelul cavităţii orale. In construirea acestui volum ne-am călăuzit după curricula de predare a Universităţii de Medicină şi Farmacie „Gr. T. Popa” Iaşi, cu extinderea orizontului de informaţie după domeniile actuale de interes medical, testele grilă special concepute la sfărşitul fiecărui capitol lărgind aria de recomandare a cărţii. Interpretările şi comentariile clinice respectă un tipar general, rezultat al corelării experienţei didactice şi profesionale a autorilor cu datele de referinţă din literatura de specialitate. Abordarea interdisciplinară a temelor prezentate a constituit suportul de bază, la realizarea acestei lucrări contribuind atât medici specialişti în medicină de laborator cât şi medici stomatologi, cercetători şi doctoranzi. Invităm cititorii să poposească şi să ostenească un strop de timp ȋntre paginile cărţii, pentru a cuprinde ȋn fapte, cuvintele aşternute de cei care s-au straduit să aşeze managementul diagnosticului de laborator, pe baze mai puţin empirice, clinice şi ştiinţifice.

Biochimia, fie ea analitică, descriptivă sau clinică este doar una, cea aplicată, poate fi doar scrisă diferit după cum se adresează studenţilor, biochimiştilor, cercetătorilor sau medicilor curanţi şi de laborator. Pornind de la premize practice şi realiste, care atestă semnificaţia covârşitoare a rezultatelor analizelor de laborator, precum şi a interpretării corecte a acestora ȋn cadrul oricărui proces de diagnostic şi monitorizare a terapiei pacienţilor, lucrarea de faţă oferă celor interesaţi, date atât despre noţiuni fundamentale de biochimie cât şi tehnici de analiză a parametrilor de laborator ȋn scop diagnostic. Aspectul practic vine şi din capitolul în care sunt prezentate modalităţile de prelevare, prelucrare şi investigare a fluidelor biologice, extins nu doar la nivel sistemic, dar şi la nivelul cavităţii orale. In construirea acestui volum ne-am călăuzit după curricula de predare a Universităţii de Medicină şi Farmacie „Gr. T. Popa” Iaşi, cu extinderea orizontului de informaţie după domeniile actuale de interes medical, testele grilă special concepute la sfărşitul fiecărui capitol lărgind aria de recomandare a cărţii. Interpretările şi comentariile clinice respectă un tipar general, rezultat al corelării experienţei didactice şi profesionale a autorilor cu datele de referinţă din literatura de specialitate. Abordarea interdisciplinară a temelor prezentate a constituit suportul de bază, la realizarea acestei lucrări contribuind atât medici specialişti în medicină de laborator cât şi medici stomatologi, cercetători şi doctoranzi. Invităm cititorii să poposească şi să ostenească un strop de timp ȋntre paginile cărţii, pentru a cuprinde ȋn fapte, cuvintele aşternute de cei care s-au straduit să aşeze managementul diagnosticului de laborator, pe baze mai puţin empirice, clinice şi ştiinţifice.

Autorii

Autorii

CUPRINS

CAPITOLUL 1 - Măsuri de protecţie ȋn laboratorul de biochimie (Liliana Foia, Ancuţa Goriuc) CAPITOLUL 2 - Cunoştinţe fundamentale de biochimie descriptivă şi biologie a fluidelor de investigaţie (Liliana Foia, Vasilica Toma) 2.1. Apa, pH, acizi, baze ............................................... 2.2. Hidroliza sărurilor ........................................................ 2.3. Sisteme tampon .................................................. 2.4. Prelevarea şi prelucrarea produselor biologice ........ o Sânge ....................................................................... o Urină ......................................................................... o Salivă ........................................................................ o Fluid gingival ............................................................. 2.5. MCQ ............................................................................. CAPITOLUL 3 - Tehnici de analiză a parametrilor biologici şi biochimici ȋn laborator (Ancuţa Goriuc, Ştefania Racoviţă) 3.1. Spectrofotometria ....................................................... 3.2. Electroforeza ............................................................... 3.3. ELISA ............................................................................ 3.4. Citometria ȋn flux (FCM) .............................................. CAPITOLUL 4 - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic (Liliana Foia, Vasilica Toma) 4.1. Dozarea amilazei serice – Amy ............................ 4.2. Dozarea transaminazelor: ALT si AST (GPT si GOT).. 4.3. Dozarea fosfatazei alcaline – ALP .......................... 4.4. Dozarea gamaglutamil transferazei – GGT .............. 4.5. Dozarea lactat dehidrogenazei – LDH .................... 4.6. Dozarea creatinkinazei – CK ..................................... CAPITOLUL 5 - Explorarea metabolismului glucidic (Liliana Foia, Didona Ungureanu) 5.1. Determinarea glicemiei ..........................................

CUPRINS

3

6 6 10 12 13 13 15 16 18 21 23 23 26 30 36 45

CAPITOLUL 1 - Măsuri de protecţie ȋn laboratorul de biochimie (Liliana Foia, Ancuţa Goriuc) CAPITOLUL 2 - Cunoştinţe fundamentale de biochimie descriptivă şi biologie a fluidelor de investigaţie (Liliana Foia, Vasilica Toma) 2.1. Apa, pH, acizi, baze ............................................... 2.2. Hidroliza sărurilor ........................................................ 2.3. Sisteme tampon .................................................. 2.4. Prelevarea şi prelucrarea produselor biologice ........ o Sânge ....................................................................... o Urină ......................................................................... o Salivă ........................................................................ o Fluid gingival ............................................................. 2.5. MCQ ............................................................................. CAPITOLUL 3 - Tehnici de analiză a parametrilor biologici şi biochimici ȋn laborator (Ancuţa Goriuc, Ştefania Racoviţă) 3.1. Spectrofotometria ....................................................... 3.2. Electroforeza ............................................................... 3.3. ELISA ............................................................................ 3.4. Citometria ȋn flux (FCM) ..............................................

45 52 70 77 84 91

CAPITOLUL 4 - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic (Liliana Foia, Vasilica Toma) 4.1. Dozarea amilazei serice – Amy ............................ 4.2. Dozarea transaminazelor: ALT si AST (GPT si GOT).. 4.3. Dozarea fosfatazei alcaline – ALP .......................... 4.4. Dozarea gamaglutamil transferazei – GGT .............. 4.5. Dozarea lactat dehidrogenazei – LDH .................... 4.6. Dozarea creatinkinazei – CK .....................................

99 99

CAPITOLUL 5 - Explorarea metabolismului glucidic (Liliana Foia, Didona Ungureanu) 5.1. Determinarea glicemiei ..........................................

3

6 6 10 12 13 13 15 16 18 21 23 23 26 30 36 45 45 52 70 77 84 91 99 99

5.2. Determinări calitative şi cantitative ale glucidelor ȋn urină ............................................. 5.3. Hemoglobina glicozilată – HbA1c ...........................

108 110

CAPITOLUL 6 - Explorarea metabolismului lipidic (Liliana Foia, Didona Ungureanu) 6.1. Determinări cantitative ale trigliceridelor .................. 6.2. Dozarea colesterolului ................................................ 6.3. Dozarea corpilor cetonici ȋn urină..............................

118

CAPITOLUL 7 - Explorarea metabolismului proteic (Florina Filip, Liliana Foia) 7.1.Analiza calitativă şi cantitativă a proteinelor ȋn ser; Disproteinemii ......................................................... 7.2. Dozarea ureei ȋn ser şi urină ..................................... 7.3. Dozarea creatininei ȋn ser şi urină ........................... 7.4. Dozarea acidului uric ȋn ser şi urină ......................... 7.5. Dozarea bilirubinei ......................................................

142

CAPITOLUL 8 - Explorarea homeostaziei minerale (Vasilica Toma, Ancuţa Goriuc) 8.1. Dozarea calciului (Ca) ȋn ser ..................................... 8.2. Dozarea magneziului (Mg) ȋn ser ............................. 8.3. Sideremia ................................................................... 8.4. Dozarea ionilor de sodiu, potasiu şi clor (Na, K, Cl)....

5.2. Determinări calitative şi cantitative ale glucidelor ȋn urină ............................................. 5.3. Hemoglobina glicozilată – HbA1c ...........................

108 110

CAPITOLUL 6 - Explorarea metabolismului lipidic (Liliana Foia, Didona Ungureanu) 6.1. Determinări cantitative ale trigliceridelor .................. 6.2. Dozarea colesterolului ................................................ 6.3. Dozarea corpilor cetonici ȋn urină..............................

118

142

142 151 159 168 177

CAPITOLUL 7 - Explorarea metabolismului proteic (Florina Filip, Liliana Foia) 7.1.Analiza calitativă şi cantitativă a proteinelor ȋn ser; Disproteinemii ......................................................... 7.2. Dozarea ureei ȋn ser şi urină ..................................... 7.3. Dozarea creatininei ȋn ser şi urină ........................... 7.4. Dozarea acidului uric ȋn ser şi urină ......................... 7.5. Dozarea bilirubinei ......................................................

188 195 201 208

CAPITOLUL 8 - Explorarea homeostaziei minerale (Vasilica Toma, Ancuţa Goriuc) 8.1. Dozarea calciului (Ca) ȋn ser ..................................... 8.2. Dozarea magneziului (Mg) ȋn ser ............................. 8.3. Sideremia ................................................................... 8.4. Dozarea ionilor de sodiu, potasiu şi clor (Na, K, Cl)....

118 126 136

CAPITOLUL 9 - Analiza biochimică a urinii (Liliana Foia, Florina Filip) 9.1. Recoltarea şi pregătirea urinii ..................................... 9.2. Examenul macroscopic................................................. 9.3. Sumarul de urină .......................................................... 9.4. Sedimentul urinar ........................................................

220

118 126 136

142 151 159 168 177

188 195 201 208 220

220 221 222 228

CAPITOLUL 9 - Analiza biochimică a urinii (Liliana Foia, Florina Filip) 9.1. Recoltarea şi pregătirea urinii ..................................... 9.2. Examenul macroscopic................................................. 9.3. Sumarul de urină .......................................................... 9.4. Sedimentul urinar ........................................................

CAPITOLUL 10 - Principalii parametri biochimici: valori de referinţă

236

CAPITOLUL 10 - Principalii parametri biochimici: valori de referinţă

236

Răspunsurile corecte ale testelor grilă de tip MCQ (“multiple choice question”)

240

Răspunsurile corecte ale testelor grilă de tip MCQ (“multiple choice question”)

240

Bibliografie selectivă

242

Bibliografie selectivă

242

220 221 222 228

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

CAPITOLUL 1

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

CAPITOLUL 1

MĂSURI DE PROTECTIE

MĂSURI DE PROTECTIE

ÎN LABORATORUL DE BIOCHIMIE

ÎN LABORATORUL DE BIOCHIMIE

Munca în laboratorul de biochimie presupune o cunoaştere aprofundată a regulilor de securitate de către întreg personalul şi studenţi. Pentru a asigura siguranţa experimentelor şi prevenirea accidentelor de muncă trebuie cunoscute şi respectate cu stricteţe unele reguli:

Munca în laboratorul de biochimie presupune o cunoaştere aprofundată a regulilor de securitate de către întreg personalul şi studenţi. Pentru a asigura siguranţa experimentelor şi prevenirea accidentelor de muncă trebuie cunoscute şi respectate cu stricteţe unele reguli:

o Întregul personal care lucrează în laboratorul de biochimie trebuie să poarte halat de protecţie. o Persoanele de sex feminin trebuie să poarte părul strâns. o Instrumentele electrice (ultracentrifugi, termostate, frigidere, spectrofotometre) trebuie să aibă prizele împământate şi izolare electrică perfectă. Fixarea lor în priză se face numai cu mâna uscată. o Încăperea unde se prepară acizi, apa de brom şi solvenţi organici trebuie să fie prevăzută cu coş de evacuare şi ventilaţie electrică. o Fiecare laborator trebuie să prezinte un extinctor şi periodic personalul trebuie să verifice funcţionalitatea lui. o La sfârşitul zilei, aparatura electrică trebuie verificată să fie scoasă din priză iar robinetele să fie închise. o Evaporarea solvenţilor inflamabili se va face deasupra unei băi de nisip sau băi electrice, sub nişe special amenajate. o Acizii minerali şi hidroxizii concentraţi, hârtiile şi eprubetele sparte nu trebuie aruncate în chiuvetă. o Pentru a lucra cu animale de laborator este necesar ca acestea să prezinte analize de laborator şi să fie ţinute în locuri izolate, special amenajate. o Pipetarea acizilor concentraţi şi bazelor se face cu pipetă automată sau cu pipetă cu volum mai mare decât volumul de pipetat şi prevăzute cu filtru de vată.

o Întregul personal care lucrează în laboratorul de biochimie trebuie să poarte halat de protecţie. o Persoanele de sex feminin trebuie să poarte părul strâns. o Instrumentele electrice (ultracentrifugi, termostate, frigidere, spectrofotometre) trebuie să aibă prizele împământate şi izolare electrică perfectă. Fixarea lor în priză se face numai cu mâna uscată. o Încăperea unde se prepară acizi, apa de brom şi solvenţi organici trebuie să fie prevăzută cu coş de evacuare şi ventilaţie electrică. o Fiecare laborator trebuie să prezinte un extinctor şi periodic personalul trebuie să verifice funcţionalitatea lui. o La sfârşitul zilei, aparatura electrică trebuie verificată să fie scoasă din priză iar robinetele să fie închise. o Evaporarea solvenţilor inflamabili se va face deasupra unei băi de nisip sau băi electrice, sub nişe special amenajate. o Acizii minerali şi hidroxizii concentraţi, hârtiile şi eprubetele sparte nu trebuie aruncate în chiuvetă. o Pentru a lucra cu animale de laborator este necesar ca acestea să prezinte analize de laborator şi să fie ţinute în locuri izolate, special amenajate. o Pipetarea acizilor concentraţi şi bazelor se face cu pipetă automată sau cu pipetă cu volum mai mare decât volumul de pipetat şi prevăzute cu filtru de vată.

3

3

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

o Pipetarea produselor biologice se face cu pipete automate sau prevăzute cu filtru de vată. o Bromul se măsoară numai sub nişă, cu pipete cu bulă, prevăzute cu o pară de cauciuc pentru aspirare. o Acidul sulfuric diluat se prepară prin turnarea acidului sulfuric concentrat în vasul cu apă şi nu invers. o Este interzisă păstrarea alimentelor în frigidere cu produse biologice, pentru a evita pericolul de infectare. o Tuburile de oxigen, bioxid de carbon şi azot lichid, se depozitează în afara laboratorului. Când sunt strict necesare anumitor operaţii în laborator ele se ancorează cu lanţ în locuri anume prevăzute. o Cromatografia şi electroforeza se efectuează în încăperi izolate de restul laboratorului şi prevăzute cu ventilatoare electrice. o Substanţele toxice se ţin sub cheie şi în borcane sau sticle prevăzute cu etichete speciale, semnalizate cu cap de mort. o Mirosirea substanţelor chimice nu se face prin apropierea nasului direct la gâtul sticlei cu reactivi, ci prin aducerea unui curent de aer care conţine vapori ai substanţelor de la gâtul sticlei cu ajutorul palmei în apropierea nasului. o Agitarea eprubetelor se face cu mare atenţie pentru a evita contactul agenţilor chimici cu pielea, ştiindu-se că mulţi dintre ei produc afecţiuni la acest nivel. o Inventarea şi asumarea de noi experimente pe cont propriu nu este permisă fără consultarea prealabilă a îndrumătorului de laborator.

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

o Pipetarea produselor biologice se face cu pipete automate sau prevăzute cu filtru de vată. o Bromul se măsoară numai sub nişă, cu pipete cu bulă, prevăzute cu o pară de cauciuc pentru aspirare. o Acidul sulfuric diluat se prepară prin turnarea acidului sulfuric concentrat în vasul cu apă şi nu invers. o Este interzisă păstrarea alimentelor în frigidere cu produse biologice, pentru a evita pericolul de infectare. o Tuburile de oxigen, bioxid de carbon şi azot lichid, se depozitează în afara laboratorului. Când sunt strict necesare anumitor operaţii în laborator ele se ancorează cu lanţ în locuri anume prevăzute. o Cromatografia şi electroforeza se efectuează în încăperi izolate de restul laboratorului şi prevăzute cu ventilatoare electrice. o Substanţele toxice se ţin sub cheie şi în borcane sau sticle prevăzute cu etichete speciale, semnalizate cu cap de mort. o Mirosirea substanţelor chimice nu se face prin apropierea nasului direct la gâtul sticlei cu reactivi, ci prin aducerea unui curent de aer care conţine vapori ai substanţelor de la gâtul sticlei cu ajutorul palmei în apropierea nasului. o Agitarea eprubetelor se face cu mare atenţie pentru a evita contactul agenţilor chimici cu pielea, ştiindu-se că mulţi dintre ei produc afecţiuni la acest nivel. o Inventarea şi asumarea de noi experimente pe cont propriu nu este permisă fără consultarea prealabilă a îndrumătorului de laborator.

Acordarea primului ajutor în laboratorul de biochimie

Acordarea primului ajutor în laboratorul de biochimie

Cele mai multe accidente care au loc în absenţa unui biochimist sau personal calificat de laborator sunt cauzate de soluţiile concentrate de acizi şi baze. În aceste situaţii, orice afectare trebuie raportată de urgenţă laborantului sau îndrumătorului pentru a ameliora situaţia. În caz de accidentare cu acizi puternici, trebuie urmate câteva reguli:  Pielea trebuie spălată urgent cu multă apă  În caz de accidentare cu acid sulfuric se spală zona cu multă apă şi apoi cu NaHCO3 2%  În caz de afectare oculară prin stropire cu un acid, se spală ochii cu apă călduţă, apoi se aplică o soluţie de borax 2% şi se consultă urgent un oftalmolog

Cele mai multe accidente care au loc în absenţa unui biochimist sau personal calificat de laborator sunt cauzate de soluţiile concentrate de acizi şi baze. În aceste situaţii, orice afectare trebuie raportată de urgenţă laborantului sau îndrumătorului pentru a ameliora situaţia. În caz de accidentare cu acizi puternici, trebuie urmate câteva reguli:  Pielea trebuie spălată urgent cu multă apă  În caz de accidentare cu acid sulfuric se spală zona cu multă apă şi apoi cu NaHCO3 2%  În caz de afectare oculară prin stropire cu un acid, se spală ochii cu apă călduţă, apoi se aplică o soluţie de borax 2% şi se consultă urgent un oftalmolog

4

4

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie



2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie



2010

În caz de ingerare a unui acid, persoana în cauză trebuie să clătească gura cu apă şi apoi să bea lapte (sau apă dacă nu există lapte la momentul respectiv). Accidentele produse de soluţiile alcaline (carbonaţi, amoniu, oxalat de calciu) sunt mult mai severe. Măsurile generale constau în:  Îndepărtarea hainelor, urmată de spălarea zonei cu apă timp de 15 minute ȋn cazul contaminării pielii, urmată de aplicarea locală a unui antibiotic pentru evitarea infecţiei  În caz de ingestie persoana trebuie să consume multă apă pentru a induce voma  Se pot administra oral agenţi neutralizanţi (acid acetic 1%, sau suc de lămâie) şi ouă sau lapte.  Durerea este calmată cu analgezice. Sunt şi alte posibile accidente severe care necesită primul ajutor în cadrul laboratorului:  În cazul intoxicaţiilor cu cloruri, dioxid de sulf, amoniu, acid hidrocianic sau alte gaze toxice, persoana trebuie mutată din zona contaminată. Dacă este posibil i se va administra oxigen şi ventilaţie artificială (dacă nu s-a instalat edemul pulmonar). Victima va fi transportată apoi la cel mai apropiat spital.  Intoxicaţii severe pot să apară prin inhalarea unor substanţe volatile (tetraclorura de carbon, anilină, benzen, toluen) care ajung rapid la nivelul sistemului nervos central. Primul ajutor în acest caz constă în mutarea persoanei în aer curat şi dacă este necesar administrarea de oxigen şi ventilaţie artificială. În cazuri grave se recomandă spitalizarea.

În caz de ingerare a unui acid, persoana în cauză trebuie să clătească gura cu apă şi apoi să bea lapte (sau apă dacă nu există lapte la momentul respectiv). Accidentele produse de soluţiile alcaline (carbonaţi, amoniu, oxalat de calciu) sunt mult mai severe. Măsurile generale constau în:  Îndepărtarea hainelor, urmată de spălarea zonei cu apă timp de 15 minute ȋn cazul contaminării pielii, urmată de aplicarea locală a unui antibiotic pentru evitarea infecţiei  În caz de ingestie persoana trebuie să consume multă apă pentru a induce voma  Se pot administra oral agenţi neutralizanţi (acid acetic 1%, sau suc de lămâie) şi ouă sau lapte.  Durerea este calmată cu analgezice. Sunt şi alte posibile accidente severe care necesită primul ajutor în cadrul laboratorului:  În cazul intoxicaţiilor cu cloruri, dioxid de sulf, amoniu, acid hidrocianic sau alte gaze toxice, persoana trebuie mutată din zona contaminată. Dacă este posibil i se va administra oxigen şi ventilaţie artificială (dacă nu s-a instalat edemul pulmonar). Victima va fi transportată apoi la cel mai apropiat spital.  Intoxicaţii severe pot să apară prin inhalarea unor substanţe volatile (tetraclorura de carbon, anilină, benzen, toluen) care ajung rapid la nivelul sistemului nervos central. Primul ajutor în acest caz constă în mutarea persoanei în aer curat şi dacă este necesar administrarea de oxigen şi ventilaţie artificială. În cazuri grave se recomandă spitalizarea.

5

5

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

CAPITOLUL 2

CAPITOLUL 2

CUNOSTINTE FUNDAMENTALE DE BIOCHIMIE DESCRIPTIVA SI BIOLOGIE A FLUIDELOR DE INVESTIGATIE

CUNOSTINTE FUNDAMENTALE DE BIOCHIMIE DESCRIPTIVA SI BIOLOGIE A FLUIDELOR DE INVESTIGATIE

2.1. Apa, pH, Acizi, Baze Toate organismele vii sunt dependente de apă. Apa este solventul pentru substanţele ionice şi polare şi este prezentă în toate celulele, unde participă la multe dintre reacţiile lor metabolice. Toate caracteristicile biochimice şi fiziologice ale moleculelor materiei vii depind de abilitatea biomoleculelor de a interacţiona cu apa. Datorită proprietăţilor sale de ionizare apa ia parte la reacţiile acido-bazice, ce afectează valoarea pH-ului. Reacţiile studiate în biochimie sunt cele din soluţii care trebuie să fie hidrolizate pentru a stimula pe cât posibil zona din jurul celulelor. Interacţiunile majore între biomolecule şi apă iau naştere prin formarea legăturilor de H, care reprezintă legături necovalente între molecule polare. Totuşi apa are un rol important în menţinerea pH-ului intra şi extracelular. De aceea una din funcţiile importante ale apei este cea de disociere a ionilor din moleculele biologice. De asemenea, esenţial pentru moleculele neutre, apa le va ioniza în molecule mai mici, lucru ce poate fi descris printr-o simplă reacţie de echilibru: H2O↔ H++ OH-

2010

2.1. Apa, pH, Acizi, Baze Toate organismele vii sunt dependente de apă. Apa este solventul pentru substanţele ionice şi polare şi este prezentă în toate celulele, unde participă la multe dintre reacţiile lor metabolice. Toate caracteristicile biochimice şi fiziologice ale moleculelor materiei vii depind de abilitatea biomoleculelor de a interacţiona cu apa. Datorită proprietăţilor sale de ionizare apa ia parte la reacţiile acido-bazice, ce afectează valoarea pH-ului. Reacţiile studiate în biochimie sunt cele din soluţii care trebuie să fie hidrolizate pentru a stimula pe cât posibil zona din jurul celulelor. Interacţiunile majore între biomolecule şi apă iau naştere prin formarea legăturilor de H, care reprezintă legături necovalente între molecule polare. Totuşi apa are un rol important în menţinerea pH-ului intra şi extracelular. De aceea una din funcţiile importante ale apei este cea de disociere a ionilor din moleculele biologice. De asemenea, esenţial pentru moleculele neutre, apa le va ioniza în molecule mai mici, lucru ce poate fi descris printr-o simplă reacţie de echilibru: H2O↔ H++ OH-

Constanta de echilibru, Keq, scrisă pentru reacţia de mai sus poate fi calculată astfel:

Constanta de echilibru, Keq, scrisă pentru reacţia de mai sus poate fi calculată astfel:

[H+] [OH-]

[H+] [OH-]

Keq=

Keq= [H2O]

[H2O]

6

6

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

La temperatura de 25°C apa se află ionizată în proporţie de o moleculă la 555 milioane de molecule. De aceea se consideră că, prin ionizare, concentraţia apei (de la numitor) rămâne practic constantă şi deci poate fi înmulţită cu constanta de aciditate.

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

La temperatura de 25°C apa se află ionizată în proporţie de o moleculă la 555 milioane de molecule. De aceea se consideră că, prin ionizare, concentraţia apei (de la numitor) rămâne practic constantă şi deci poate fi înmulţită cu constanta de aciditate.

Ka · [H2O]2 = Pi = [H3O+]·[OH-] Constanta Pi este numită produsul ionic al apei sau constanta de autoprotoliză a apei. Deoarece la temperatura de 25°C produsul ionic al apei are valoarea de 10-14 moli, înseamnă că în apa pură la 25°C concentraţia ionilor de hidroniu, egală cu cea a ionilor de hidroxil, este 10-7 moli/l.

2010

Ka · [H2O]2 = Pi = [H3O+]·[OH-] Constanta Pi este numită produsul ionic al apei sau constanta de autoprotoliză a apei. Deoarece la temperatura de 25°C produsul ionic al apei are valoarea de 10-14 moli, înseamnă că în apa pură la 25°C concentraţia ionilor de hidroniu, egală cu cea a ionilor de hidroxil, este 10-7 moli/l.

[H3O]+ = [OH-] = 10-7 moli/l

[H3O]+ = [OH-] = 10-7 moli/l

În soluţii diluate, acizii tari pot fi consideraţi practic ionizaţi complet.

În soluţii diluate, acizii tari pot fi consideraţi practic ionizaţi complet.

 Scala de pH a fost introdusă deoarece valoarea [H+] este foarte mică şi este mult mai convenabil să se exprime concentraţia [H+] dintr-o soluţie apoasă în formă logaritmică. Se numeşte exponent al concentraţiei [H+] sau pH, logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentraţiei [H+] din soluţie (Sørensen, 1909):

 Scala de pH a fost introdusă deoarece valoarea [H+] este foarte mică şi este mult mai convenabil să se exprime concentraţia [H+] dintr-o soluţie apoasă în formă logaritmică. Se numeşte exponent al concentraţiei [H+] sau pH, logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentraţiei [H+] din soluţie (Sørensen, 1909):

pH = - lg [H3O+]

pH = - lg [H3O+]

Punctul neutru: O soluţie apoasă este neutră când concentraţiile [H+] şi [OH-] sunt egale, conform ecuaţiei:

Punctul neutru: O soluţie apoasă este neutră când concentraţiile [H+] şi [OH-] sunt egale, conform ecuaţiei:

[H3O+] = [OH-] = 10-7 moli/l Punctul neutru, în soluţii apoase, este la pH = 7. O soluţie cu pH < 7 este acidă; o soluţie cu pH > 7 este bazică. Măsurarea pH-ului unei soluţii - se face cu: 

hârtie indicator: o hârtie impregnată cu substanţe a căror culoare se modifică în funcţie de concentraţia în ioni de H3O+ a mediului; este suficient să impregnăm hârtia indicator cu 1-2 picături din soluţia cu pH necunoscut şi apoi să comparăm culoarea hârtiei cu scala de pH (cu care fiecare tip de hârtie indicator este prevăzută)

7

[H3O+] = [OH-] = 10-7 moli/l Punctul neutru, în soluţii apoase, este la pH = 7. O soluţie cu pH < 7 este acidă; o soluţie cu pH > 7 este bazică. Măsurarea pH-ului unei soluţii - se face cu: 

hârtie indicator: o hârtie impregnată cu substanţe a căror culoare se modifică în funcţie de concentraţia în ioni de H3O+ a mediului; este suficient să impregnăm hârtia indicator cu 1-2 picături din soluţia cu pH necunoscut şi apoi să comparăm culoarea hârtiei cu scala de pH (cu care fiecare tip de hârtie indicator este prevăzută)

7

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie



2010

cu soluţii de indicatori acido – bazici de culoare: substanţe organice care pot exista în două forme, acid – bază conjugată, forme deosebite prin culoare (substanţele îşi schimbă culoarea în funcţie de pH-ul soluţiei). Acizii sunt substanţe care în soluţie apoasă pun în libertate protoni

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie



2010

cu soluţii de indicatori acido – bazici de culoare: substanţe organice care pot exista în două forme, acid – bază conjugată, forme deosebite prin culoare (substanţele îşi schimbă culoarea în funcţie de pH-ul soluţiei). Acizii sunt substanţe care în soluţie apoasă pun în libertate protoni

(H+).

(H+).

Bazele sunt substanţe care în soluţie apoasă pun în libertate ioni de hidroxil (OH-). Acizii şi bazele sunt clasificate ca donori şi respectiv acceptori de protoni. Când un proton disociază dintr-un acid în mediul înconjurător, molecula rezultantă este numită „perechea conjugată a acidului” .

Bazele sunt substanţe care în soluţie apoasă pun în libertate ioni de hidroxil (OH-). Acizii şi bazele sunt clasificate ca donori şi respectiv acceptori de protoni. Când un proton disociază dintr-un acid în mediul înconjurător, molecula rezultantă este numită „perechea conjugată a acidului” .

8

8

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

De exemplu, disocierea unui proton din acidul acetic va da o bază conjugată, ionul de acetat: CH3COO- + H+

CH3COOH

Acizii şi bazele sunt definite ca fiind tari dacă ionizează uşor în soluţii apoase, în timp ce acizii şi bazele slabe ionizează greu. În fluidele corpului există numeroşi compuşi care sunt acizi şi baze slabe, precum aminoacizi, nucleotide, acidul lactic, acidul piruvic, fosfolipidele etc. Acizii şi bazele slabe în soluţii nu disociază complet şi mai mult, există un echilibru între acid şi baza conjugată. Ca şi în cazul ionizării apei, constanta de echilibru Keq poate fi calculată şi pentru acizi şi baze slabe. În cazul acizilor şi bazelor slabe constanta de ionizare Keq, este identificată ca şi Ka. În cazul unui acid slab: HA

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

De exemplu, disocierea unui proton din acidul acetic va da o bază conjugată, ionul de acetat: CH3COO- + H+

CH3COOH

Acizii şi bazele sunt definite ca fiind tari dacă ionizează uşor în soluţii apoase, în timp ce acizii şi bazele slabe ionizează greu. În fluidele corpului există numeroşi compuşi care sunt acizi şi baze slabe, precum aminoacizi, nucleotide, acidul lactic, acidul piruvic, fosfolipidele etc. Acizii şi bazele slabe în soluţii nu disociază complet şi mai mult, există un echilibru între acid şi baza conjugată. Ca şi în cazul ionizării apei, constanta de echilibru Keq poate fi calculată şi pentru acizi şi baze slabe. În cazul acizilor şi bazelor slabe constanta de ionizare Keq, este identificată ca şi Ka. În cazul unui acid slab:

A- + H+

HA

A- + H+

Constanta de echilibru poate fi calculată din următoarea ecuaţie: [H+] [A-] Ka= [HA]

Constanta de echilibru poate fi calculată din următoarea ecuaţie: [H+] [A-] Ka= [HA]

Definiţia Ph-ului este obţinută prin utilizarea logaritmilor.

Definiţia Ph-ului este obţinută prin utilizarea logaritmilor.

pKa= - log Ka

pKa= - log Ka

Reacţia ionilor sărurilor dizolvate cu solventul (apa), în urma cărora se formează acizi slab disociaţi, baze slab disociate sau săruri acide sau bazice se numeşte hidroliză. Acest fenomen are în vedere numai modificările de pH, deoarece soluţia astfel obţinută are un caracter acid sau bazic. În reacţia dintre un acid AH şi o bază BOH, sensul spre dreapta este neutralizare, spre stânga este hidroliză.

Reacţia ionilor sărurilor dizolvate cu solventul (apa), în urma cărora se formează acizi slab disociaţi, baze slab disociate sau săruri acide sau bazice se numeşte hidroliză. Acest fenomen are în vedere numai modificările de pH, deoarece soluţia astfel obţinută are un caracter acid sau bazic. În reacţia dintre un acid AH şi o bază BOH, sensul spre dreapta este neutralizare, spre stânga este hidroliză.

neutralizare AH + BOH

2010

neutralizare -

+

[ A + B ] + H2O

AH + BOH

[ A- + B+] + H2O

hidroliză În cazul reacţiei de neutralizare, dintre un acid tare şi o bază tare echilibrul reacţiei de mai sus este mult deplasat spre dreapta, deoarece se formează sare (este un electrolit puternic) şi apă (electrolit foarte slab). În celelalte cazuri de neutralizare, în care acidul şi baza sunt de tărie redusă,

hidroliză În cazul reacţiei de neutralizare, dintre un acid tare şi o bază tare echilibrul reacţiei de mai sus este mult deplasat spre dreapta, deoarece se formează sare (este un electrolit puternic) şi apă (electrolit foarte slab). În celelalte cazuri de neutralizare, în care acidul şi baza sunt de tărie redusă,

9

9

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

echilibrul reacţiei de mai sus este determinat de gradul de ionizare al componentului de tărie redusă, iar sarea rezultată va hidroliza.

echilibrul reacţiei de mai sus este determinat de gradul de ionizare al componentului de tărie redusă, iar sarea rezultată va hidroliza.

2.2. Hidroliza sărurilor

2.2. Hidroliza sărurilor

 HIDROLIZA unei sări este procesul chimic invers neutralizării prin care moleculele sau ionii unei sări reacţionează cu moleculele de apă şi cu ionii apei (ioni H3O+ şi OH), rezultaţi în concentraţie mică, 10-7 ioni-g/l, prin ionizarea reversibilă a apei.

 HIDROLIZA unei sări este procesul chimic invers neutralizării prin care moleculele sau ionii unei sări reacţionează cu moleculele de apă şi cu ionii apei (ioni H3O+ şi OH), rezultaţi în concentraţie mică, 10-7 ioni-g/l, prin ionizarea reversibilă a apei.

Condiţiile pentru ca o sare să hidrolizeze sunt:

Condiţiile pentru ca o sare să hidrolizeze sunt:

o să fie solubilă în apă şi disociată în ioni o să provină prin neutralizarea: unui acid tare, (H3O+ + A- ) cu o bază slabă, BOH; a unui acid slab, HA cu o bază slabă, BOH; a unui acid slab, HA cu o bază tare, (B+ + OH-) Sărurile provenite din neutralizarea acizilor tari cu baze tari practic nu hidrolizează, ele ionizând total (dacă sunt solubile în apă) şi formează soluţii apoase neutre Soluţiile apoase ale sărurilor hidrolizate au caracter acid sau bazic deoarece acizii sau bazele rezultate ionizează (disociază) complet, ȋn timp ce acizii sau bazele slabe ionizează în măsură mai mică (sunt puţin disociate) în soluţii apoase; dacă între gradul de ionizare în apă a acidului sau bazei slabe care rezultă prin hidroliză există o diferenţă, are loc variaţia concentraţiei ionilor de hidroniu [H3O+] sau de hidroxil [OH-], respectiv o variaţie de pH. Constanta de hidroliză, se exprimă în funcţie de produsul ionic al apei, de constanta de aciditate a acidului slab, respectiv de bazicitate a bazei slabe, din care provine sarea care hidrolizează.

o să fie solubilă în apă şi disociată în ioni o să provină prin neutralizarea: unui acid tare, (H3O+ + A- ) cu o bază slabă, BOH; a unui acid slab, HA cu o bază slabă, BOH; a unui acid slab, HA cu o bază tare, (B+ + OH-) Sărurile provenite din neutralizarea acizilor tari cu baze tari practic nu hidrolizează, ele ionizând total (dacă sunt solubile în apă) şi formează soluţii apoase neutre Soluţiile apoase ale sărurilor hidrolizate au caracter acid sau bazic deoarece acizii sau bazele rezultate ionizează (disociază) complet, ȋn timp ce acizii sau bazele slabe ionizează în măsură mai mică (sunt puţin disociate) în soluţii apoase; dacă între gradul de ionizare în apă a acidului sau bazei slabe care rezultă prin hidroliză există o diferenţă, are loc variaţia concentraţiei ionilor de hidroniu [H3O+] sau de hidroxil [OH-], respectiv o variaţie de pH. Constanta de hidroliză, se exprimă în funcţie de produsul ionic al apei, de constanta de aciditate a acidului slab, respectiv de bazicitate a bazei slabe, din care provine sarea care hidrolizează.

Hidroliza sărurilor provenite din acid slab şi bază tare (de ex: CH3COONa)

Hidroliza sărurilor provenite din acid slab şi bază tare (de ex: CH3COONa)

La dizolvare în apă CH3COONa puternic disociat reacţionează cu apa:

La dizolvare în apă CH3COONa puternic disociat reacţionează cu apa:

[ CH3COO- + Na+] + H2O

CH3COOH + [Na+ + OH-] acid slab bază tare

Ionii sării se comportă astfel:

[ CH3COO- + Na+] + H2O

CH3COOH + [Na+ + OH-] acid slab bază tare

Ionii sării se comportă astfel:

+

o Na - acid Bronsted conjugat al unei baze tari nu reacţionează cu apa şi rămâne în soluţie

10

+

o Na - acid Bronsted conjugat al unei baze tari nu reacţionează cu apa şi rămâne în soluţie

10

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

-

o CH COO - baza conjugată a unei acid slab, are tendinţa de a 3

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

-

o CH COO - baza conjugată a unei acid slab, are tendinţa de a 3

accepta protoni de la apă formând acidul slab disociat.

accepta protoni de la apă formând acidul slab disociat.

-

-

În soluţie apar ioni OH , care imprimă soluţiei caracter bazic. Întrucât ionul acetat reacţionează cu apa, reacţia de hidroliză este:

În soluţie apar ioni OH , care imprimă soluţiei caracter bazic. Întrucât ionul acetat reacţionează cu apa, reacţia de hidroliză este:

CH3COO- + H2O

CH3COO- + H2O

A- + H2O

CH3COOH + OH- sau în general:

AH+ + OH-

A- + H2O

Hidroliza este cu atât mai pronunţată cu cât acidul este mai slab. Hidroliza sărurilor provenite din acid tare şi bază slabă (ex. FeCl ) 3

Reacţia de hidroliză : 3+

AH+ + OH-

Hidroliza este cu atât mai pronunţată cu cât acidul este mai slab. Hidroliza sărurilor provenite din acid tare şi bază slabă (ex. FeCl ) 3

Reacţia de hidroliză :

-

+

Fe + 3Cl + 3 H2O

Fe(OH)3 + 3 H3O + Cl bază slabă acid tare

-

Ionii sării se comportă astfel:

Fe3+ + 3Cl- + 3 H2O

Fe(OH)3 + 3 H3O+ + Clbază slabă acid tare

Ionii sării se comportă astfel:

-

Cl - baza conjugată a unui acid tare, nu reacţionează cu apa şi rămâne în soluţie; 3+

Fe - acid conjugat al unei baze slabe, are tendinţa de a ceda protonii apei formând baza slabă nedisociată. +

În soluţii apar ionii H O care imprimă caracter acid soluţiei. 3+

CH3COOH + OH- sau în general:

3

-

Cl - baza conjugată a unui acid tare, nu reacţionează cu apa şi rămâne în soluţie; 3+

Fe - acid conjugat al unei baze slabe, are tendinţa de a ceda protonii apei formând baza slabă nedisociată. +

În soluţii apar ionii H O care imprimă caracter acid soluţiei. 3+

3

Întrucât ionul Fe reacţionează cu apa, reacţia de hidroliză este:

Întrucât ionul Fe reacţionează cu apa, reacţia de hidroliză este:

Fe3+ + 3 H2O

Fe3+ + 3 H2O

B+ + H2O

Fe(OH)3 + 3 H3O+ sau în general B + H3O+

B+ + H2O

Hidroliza sărurilor provenite din acid slab şi bază slabă (Ex Pb(CH3COO)2) Ionii ce se formează prin ionizarea sării, stabilesc cu apa echilibre acid-bază: +2 H2O Pb2+ + 2 H2O Pb(OH)2 + 2 H3O+ CH3COO- + H2O

CH3COOH +OH- sau

2 CH3COO- + Pb2+ + 2 H2O

2CH3COOH + Pb(OH)2 11

Fe(OH)3 + 3 H3O+ sau în general B + H3O+

Hidroliza sărurilor provenite din acid slab şi bază slabă (Ex Pb(CH3COO)2) Ionii ce se formează prin ionizarea sării, stabilesc cu apa echilibre acid-bază: +2 H2O Pb2+ + 2 H2O Pb(OH)2 + 2 H3O+ CH3COO- + H2O

CH3COOH +OH- sau

2 CH3COO- + Pb2+ + 2 H2O

2CH3COOH + Pb(OH)2 11

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

Având în vedere că în orice soluţie apoasă echilibrul între moleculele de apă şi ionii săi este acelaşi, reacţia se poate scrie pentru cazul general: B+ + A- + H2O

BOH + HA

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

Având în vedere că în orice soluţie apoasă echilibrul între moleculele de apă şi ionii săi este acelaşi, reacţia se poate scrie pentru cazul general: B+ + A- + H2O

BOH + HA

În acest caz, soluţia va avea caracter slab acid sau slab bazic în funcţie de tăria relativă a celor doi componenţi. Sărurilor provenite din acid tare şi bază tare nu hidrolizează (Ex.NaCl, KCl)

În acest caz, soluţia va avea caracter slab acid sau slab bazic în funcţie de tăria relativă a celor doi componenţi. Sărurilor provenite din acid tare şi bază tare nu hidrolizează (Ex.NaCl, KCl)

2.3. SISTEME TAMPON

2.3. SISTEME TAMPON

Pentru a neutraliza produsul acid sau bazic al reacţiilor biologice in vitro şi a menţine un pH apropiat de cel fiziologic, se utilizează soluţiile tampon. O soluţie tampon este o soluţie care se opune variaţiei pH-ului unei soluţii prin adăugare de acid sau bază. Sângele şi alte fluide din organism conţin soluţii tampon şi în mare parte funcţionarea organismului depinde de menţinerea unei balanţe acizibaze dependentă de soluţiile tampon. Atât alcaloza cât şi acidoza sunt împiedicate şi uneori prevenite cu ajutorul soluţiilor tampon. Cele mai utilizate soluţii tampon sunt amestecuri de acizi slabi şi sărurile lor hidrolizabile. Acizii şi bazele slabe sunt soluţii tampon utile în cazul unui pH mai mare sau mai mic cu 1 decât pKa (pH= pKa 1). În afara acestei variaţii, concentraţia acidului sau a bazei conjugate este prea mică pentru a rezista la efectul administrării [H+] sau [OH-]. Exită două categorii de soluţii tampon: 1. Sisteme tampon (care conţin două componente diferite, una pentru neutralizarea [H+] şi alta pentru neutralizarea [OH-]) 2. Amfoliţii, molecule care conţin în structura lor două sau mai multe grupări funcţionale diferite. Sistemele tampon simple constau dintr-o soluţie a unui acid slab şi baza lor conjugată (de exemplu: acid acetic şi acetatul de sodiu) sau o bază slabă şi acidul conjugat (de exemplu: amoniacul şi clorura de amoniu). O soluţie tampon este selectată în funcţie de valoarea pKa şi natura chimică. Multe substanţe din natură conţin ambele grupări acidă şi bazică şi adesea se întâlnesc diferite tipuri ale acestor grupări în aceleaşi moleculă (aminoacizii din structura proteinelor prezintă ȋn structura lor două grupări funcţionale, putând astfel neutraliza atât excesul de acid cât şi excesul de bază). Moleculele care conţin mai mult de o grupare acidă sau bazică sunt

Pentru a neutraliza produsul acid sau bazic al reacţiilor biologice in vitro şi a menţine un pH apropiat de cel fiziologic, se utilizează soluţiile tampon. O soluţie tampon este o soluţie care se opune variaţiei pH-ului unei soluţii prin adăugare de acid sau bază. Sângele şi alte fluide din organism conţin soluţii tampon şi în mare parte funcţionarea organismului depinde de menţinerea unei balanţe acizibaze dependentă de soluţiile tampon. Atât alcaloza cât şi acidoza sunt împiedicate şi uneori prevenite cu ajutorul soluţiilor tampon. Cele mai utilizate soluţii tampon sunt amestecuri de acizi slabi şi sărurile lor hidrolizabile. Acizii şi bazele slabe sunt soluţii tampon utile în cazul unui pH mai mare sau mai mic cu 1 decât pKa (pH= pKa 1). În afara acestei variaţii, concentraţia acidului sau a bazei conjugate este prea mică pentru a rezista la efectul administrării [H+] sau [OH-]. Exită două categorii de soluţii tampon: 1. Sisteme tampon (care conţin două componente diferite, una pentru neutralizarea [H+] şi alta pentru neutralizarea [OH-]) 2. Amfoliţii, molecule care conţin în structura lor două sau mai multe grupări funcţionale diferite. Sistemele tampon simple constau dintr-o soluţie a unui acid slab şi baza lor conjugată (de exemplu: acid acetic şi acetatul de sodiu) sau o bază slabă şi acidul conjugat (de exemplu: amoniacul şi clorura de amoniu). O soluţie tampon este selectată în funcţie de valoarea pKa şi natura chimică. Multe substanţe din natură conţin ambele grupări acidă şi bazică şi adesea se întâlnesc diferite tipuri ale acestor grupări în aceleaşi moleculă (aminoacizii din structura proteinelor prezintă ȋn structura lor două grupări funcţionale, putând astfel neutraliza atât excesul de acid cât şi excesul de bază). Moleculele care conţin mai mult de o grupare acidă sau bazică sunt

12

12

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

numite amfoliţi (cu o grupare acidă şi una bazică) sau poliamfoliţi (numeroase grupări acide sau bazice). Pentru a descrie statusul ionic al amfoliţilor şi poliamfoliţilor se foloseşte termenul de punct izoelectric – pI, sau pH izoelectric). pI reprezintă pH-ul la care sarcina unei molecule este zero. Acest lucru apare de regulă când numărul grupărilor cu sarcini negative este egal cu numărul grupărilor sarcinilor pozitive. Natura chimică a soluţiilor tampon este importantă ȋn cadrul investigaţiilor biologice. Solubilitatea, stabilitatea, diferite interacţiuni cu alţi ioni din sistem, absorbţia luminii şi potenţialul inhibitor sau stimulator al funcţiilor sistemului biologic reprezintă criteriul de selecţie al soluţiilor tampon.

2.4. PRELEVAREA ŞI PRELUCRAREA PRODUSELOR BIOLOGICE ȊN VEDEREA ANALIZELOR DE LABORATOR

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

numite amfoliţi (cu o grupare acidă şi una bazică) sau poliamfoliţi (numeroase grupări acide sau bazice). Pentru a descrie statusul ionic al amfoliţilor şi poliamfoliţilor se foloseşte termenul de punct izoelectric – pI, sau pH izoelectric). pI reprezintă pH-ul la care sarcina unei molecule este zero. Acest lucru apare de regulă când numărul grupărilor cu sarcini negative este egal cu numărul grupărilor sarcinilor pozitive. Natura chimică a soluţiilor tampon este importantă ȋn cadrul investigaţiilor biologice. Solubilitatea, stabilitatea, diferite interacţiuni cu alţi ioni din sistem, absorbţia luminii şi potenţialul inhibitor sau stimulator al funcţiilor sistemului biologic reprezintă criteriul de selecţie al soluţiilor tampon.

2.4. PRELEVAREA ŞI PRELUCRAREA PRODUSELOR BIOLOGICE ȊN VEDEREA ANALIZELOR DE LABORATOR

Analizele biochimice ale constituenţilor anorganici şi organici sanguini se pot realiza pe sânge venos, capilar şi arterial (foarte rar). Ȋn unele ţări mulţi dintre parametrii biochimici se dozează ȋn alte fluide ale organismului, saliva fiind de exemplu oglinda modificărilor suferite de aceştia ȋn organism, ȋn paralel cu cele din sânge.

Analizele biochimice ale constituenţilor anorganici şi organici sanguini se pot realiza pe sânge venos, capilar şi arterial (foarte rar). Ȋn unele ţări mulţi dintre parametrii biochimici se dozează ȋn alte fluide ale organismului, saliva fiind de exemplu oglinda modificărilor suferite de aceştia ȋn organism, ȋn paralel cu cele din sânge.

Condiţii de recoltare a sângelui

Condiţii de recoltare a sângelui

În mod curent, recoltarea sângelui se efectuează dimineaţa, à jeun (pe nemâncate). Analizându-se influenţa micului dejun (masă uşoară) asupra concentraţiei unor constituenţi sanguini, s-a găsit că recoltarea sângelui à jeun nu este obligatorie în cazul dozării tuturor parametrilor.

În mod curent, recoltarea sângelui se efectuează dimineaţa, à jeun (pe nemâncate). Analizându-se influenţa micului dejun (masă uşoară) asupra concentraţiei unor constituenţi sanguini, s-a găsit că recoltarea sângelui à jeun nu este obligatorie în cazul dozării tuturor parametrilor.

2.4.1 Recoltarea sângelui capilar

2.4.1 Recoltarea sângelui capilar

Recoltarea sângelui capilar se face din pulpa degetului, din călcâi (la nou născuţi) sau din lobul urechii (la pacienţii în stare de şoc), după următoarea tehnică :  se spală locul cu eter se usucă, se înţeapă suficient de adânc cu un ac steril;  se lasă sângele să curgă spontan până când se formează o picătură apreciabil din care se recoltează cu ajutorul unei micropipete cantitatea de sânge necesară;

Recoltarea sângelui capilar se face din pulpa degetului, din călcâi (la nou născuţi) sau din lobul urechii (la pacienţii în stare de şoc), după următoarea tehnică :  se spală locul cu eter se usucă, se înţeapă suficient de adânc cu un ac steril;  se lasă sângele să curgă spontan până când se formează o picătură apreciabil din care se recoltează cu ajutorul unei micropipete cantitatea de sânge necesară;

13

13

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

 dacă sângele nu curge spontan în cantitate suficientă, se pot folosi manevre ajutătoare: frecarea degetului în cazul prelevării din pulpă, a gambei în cazul prelevării din călcâi sau aplicare de alcool 70° în cazul prelevării din lobul urechii; după prelevare se pune pe locul înţepăturii un tampon steril.

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

 dacă sângele nu curge spontan în cantitate suficientă, se pot folosi manevre ajutătoare: frecarea degetului în cazul prelevării din pulpă, a gambei în cazul prelevării din călcâi sau aplicare de alcool 70° în cazul prelevării din lobul urechii; după prelevare se pune pe locul înţepăturii un tampon steril.

2.4.2 Recoltarea sângelui venos

2.4.2 Recoltarea sângelui venos

Recoltarea sângelui venos se efectuează din venele plicii cotului (la adult şi copii mari), din fontanelă şi venele jugulare (la sugari şi copii mici). Recoltarea din venele plicii cotului se face după următoarea tehnică:  se fixează garoul deasupra cotului, se dezinfectează tegumentul în locul puncţionării cu alcool 70 %  se puncţionează vena şi se recoltează sângele prin ac fie direct în eprubetă prin scurgere liberă, fie prin aspirare în seringă  după recoltare se îndepărtează garoul şi se tamponează locul puncţionat cu un tampon de vata îmbibat în alcool. Se folosesc ace şi seringi de unică utilizare sau ace şi vase speciale pentru recoltarea sângelui (vacutainere), vasele în care se recoltează trebuie să fie în perfectă stare de curăţenie şi uscare întrucât urmele de alcool, apă etc. pot produce hemoliza sângelui, iar diferitele impurităţi pot falsifica rezultatele dozărilor. Poziţia corpului şi staza venoasă influenţează rezultatele obţinute în cazul determinării elementelor figurate (eritrocitele, etc.) şi a celor cu greutate moleculară mare (proteinele totale, fracţiunile proteice individuale, colesterolul din complexul lipoproteinelor).

Recoltarea sângelui venos se efectuează din venele plicii cotului (la adult şi copii mari), din fontanelă şi venele jugulare (la sugari şi copii mici). Recoltarea din venele plicii cotului se face după următoarea tehnică:  se fixează garoul deasupra cotului, se dezinfectează tegumentul în locul puncţionării cu alcool 70 %  se puncţionează vena şi se recoltează sângele prin ac fie direct în eprubetă prin scurgere liberă, fie prin aspirare în seringă  după recoltare se îndepărtează garoul şi se tamponează locul puncţionat cu un tampon de vata îmbibat în alcool. Se folosesc ace şi seringi de unică utilizare sau ace şi vase speciale pentru recoltarea sângelui (vacutainere), vasele în care se recoltează trebuie să fie în perfectă stare de curăţenie şi uscare întrucât urmele de alcool, apă etc. pot produce hemoliza sângelui, iar diferitele impurităţi pot falsifica rezultatele dozărilor. Poziţia corpului şi staza venoasă influenţează rezultatele obţinute în cazul determinării elementelor figurate (eritrocitele, etc.) şi a celor cu greutate moleculară mare (proteinele totale, fracţiunile proteice individuale, colesterolul din complexul lipoproteinelor).

2.4.3. Condiţiile de conservare a probelor recoltate

2.4.3. Condiţiile de conservare a probelor recoltate

Probele de sânge total recoltat pe heparină se păstrează la 4° C, iar dozările trebuie făcute în mai puţin de 4 ore de la recoltare. Păstrarea prea îndelungată (chiar la 4°C) este contraindicată. Conservarea probelor la temperatura camerei determină perturbări în compoziţia electroliţilor, enzimelor şi diferiţilor metaboliţi. În cazul plasmei sau serului, determinările metaboliţilor şi enzimelor trebuie realizate, de asemenea, în decurs de 4 ore de la recoltare, în condiţiile păstrării la temperatura camerei. Fără alterări importante, serul sau plasma pot fi păstrate la 4° C timp de 24 ore. În cazul dozărilor după 24 ore de la recoltare plasma sau serul trebuie congelat sau liofilizat, formă de conservare preferabilă adăugării de conservanţi (amestec timol-fluorură: 10 mg fluorură de sodiu + 1 mg timol/ml sânge sau streptomicină 1 mg/l0 ml sânge).

Probele de sânge total recoltat pe heparină se păstrează la 4° C, iar dozările trebuie făcute în mai puţin de 4 ore de la recoltare. Păstrarea prea îndelungată (chiar la 4°C) este contraindicată. Conservarea probelor la temperatura camerei determină perturbări în compoziţia electroliţilor, enzimelor şi diferiţilor metaboliţi. În cazul plasmei sau serului, determinările metaboliţilor şi enzimelor trebuie realizate, de asemenea, în decurs de 4 ore de la recoltare, în condiţiile păstrării la temperatura camerei. Fără alterări importante, serul sau plasma pot fi păstrate la 4° C timp de 24 ore. În cazul dozărilor după 24 ore de la recoltare plasma sau serul trebuie congelat sau liofilizat, formă de conservare preferabilă adăugării de conservanţi (amestec timol-fluorură: 10 mg fluorură de sodiu + 1 mg timol/ml sânge sau streptomicină 1 mg/l0 ml sânge).

14

14

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

2.4.4 Recoltarea urinei

2.4.4 Recoltarea urinei

Recoltarea urinei se poate face atât la nivelul laboratorului căt şi la domiciliu. În raport cu analiza solicitată se recoltează:  fie urina de dimineaţă  fie urina din 24 de ore

Recoltarea urinei se poate face atât la nivelul laboratorului căt şi la domiciliu. În raport cu analiza solicitată se recoltează:  fie urina de dimineaţă  fie urina din 24 de ore

Recoltarea urinei de dimineaţă

Recoltarea urinei de dimineaţă

Persoanele care recoltează urina la domiciliu, în vederea analizelor curente, trebuie să respecte următoarele indicaţii:

Persoanele care recoltează urina la domiciliu, în vederea analizelor curente, trebuie să respecte următoarele indicaţii:

 recipientul în care se recoltează urina să fie perfect curat;  se recoltează urina proaspată de dimineaţă, imediat după deşteptare, direct în recipient;  cantitatea minimă necesară de urină este de 100 ml; nu are importanţă faptul dacă persoana a mai urinat în timpul nopţii;  pe sticlă se lipeşte o etichetă cu numele bolnavului şi vârsta;  dacă medicul suspectează o infecţie urinară, recomandă bolnavului să facă o urocultură. În această ultimă situaţie, când trebuie prelevată urina pentru analiza microbiologică (urocultura), urina se va recolta tot dimineaţa în condiţii de sterilitate, într-un vas steril procurat de la laborator, iar în lipsa acestuia, într-o sticlă de 100 ml care a fost dezinfectată împreună cu dopul său prin fierbere timp de 30 minute. Înainte de urinare se va face o toaletă a organelor genitale cu apă şi săpun pentru îndepărtarea eventualilor microbi. Tot în acest scop se recomandă ca urina să se recolteze numai după ce prima parte a urinei, care a spălat canalul urinar, a fost ȋndepărtată.

 recipientul în care se recoltează urina să fie perfect curat;  se recoltează urina proaspată de dimineaţă, imediat după deşteptare, direct în recipient;  cantitatea minimă necesară de urină este de 100 ml; nu are importanţă faptul dacă persoana a mai urinat în timpul nopţii;  pe sticlă se lipeşte o etichetă cu numele bolnavului şi vârsta;  dacă medicul suspectează o infecţie urinară, recomandă bolnavului să facă o urocultură. În această ultimă situaţie, când trebuie prelevată urina pentru analiza microbiologică (urocultura), urina se va recolta tot dimineaţa în condiţii de sterilitate, într-un vas steril procurat de la laborator, iar în lipsa acestuia, într-o sticlă de 100 ml care a fost dezinfectată împreună cu dopul său prin fierbere timp de 30 minute. Înainte de urinare se va face o toaletă a organelor genitale cu apă şi săpun pentru îndepărtarea eventualilor microbi. Tot în acest scop se recomandă ca urina să se recolteze numai după ce prima parte a urinei, care a spălat canalul urinar, a fost ȋndepărtată.

Recoltarea urinei din 24 de ore

Recoltarea urinei din 24 de ore

În cazul în care este necesară recoltarea urinei din 24 ore se va proceda astfel:  se goleşte vezica urinară, dimineaţa la ora 6;  începând de la aceasta oră, se recoltează toată urina până a doua zi la ora 6. Pentru a nu se pierde din cantitatea de urină se recomandă să se urineze separat, înainte de scaun. Se măsoară apoi volumul urinei din 24 de ore şi se notează. Apoi se amestecă urina (în cazul în care a fost recoltată în mai multe sticle) se agită şi pentru laborator se opreşte numai o cantitate de 100-200 ml, iar restul se aruncă.

În cazul în care este necesară recoltarea urinei din 24 ore se va proceda astfel:  se goleşte vezica urinară, dimineaţa la ora 6;  începând de la aceasta oră, se recoltează toată urina până a doua zi la ora 6. Pentru a nu se pierde din cantitatea de urină se recomandă să se urineze separat, înainte de scaun. Se măsoară apoi volumul urinei din 24 de ore şi se notează. Apoi se amestecă urina (în cazul în care a fost recoltată în mai multe sticle) se agită şi pentru laborator se opreşte numai o cantitate de 100-200 ml, iar restul se aruncă.

15

15

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

2.4.5. Recoltarea salivei

2.4.5. Recoltarea salivei

Saliva este produsul de secreţie al glandelor salivare (parotide simetrice, submaxilare, linguale). Are rolul de a favoriza procesele fizice ale digestiei, mai puţin pe cele chimice. Saliva, serul şi fluidul gingival (GCF) au fost, pe rând, investigate ca micromedii de cercetare ȋndeosebi a activităţii bolii parodontale. Saliva versus sânge ȋnregistrează o serie de avantaje:  uşor de recoltat;  uşor de manipulat;  uşor de analizat;  lipseşte pacientul de disconfortul şi anxietatea caracteristice prelevărilor parenterale;  uşor de stocat şi transportat;  ieftină ȋn cantităţile necesare. De altfel, compoziţia salivei şi a celorlalte fluide orale reflectă nivelul lichidian şi tisular al moleculelor imunologice, tumorale, terapeutice, precum şi prezenta markerilor bolilor orale şi sistemice. Totuşi, analiza salivei prezintă şi o serie de disfuncţionalităţi, mai ales dacă luăm ȋn considerare faptul că, la nivelul ei sunt exprimate molecule derivate din surse multiple: glande salivare, ser, GCF (fluid gingival), celule epiteliale, bacterii şi substanţe străine ajunse ȋn cavitatea orală. Saliva reprezintă oglinda modificărilor sistemice, astfel ȋncât, analiza acestui fluid versus sânge ar fi extrem de utilă şi ȋn acelaşi timp mai puţin discomfortantă ȋn evaluarea diverşilor analiţi. Cel mai mare dezavantaj al analizei parametrilor biologici şi imunochimici ȋn salivă o reprezintă lipsa de standardizare a metodei. Există câteva precauţii ȋn prelevarea ȋn vederea analizei, a fluidului salivar:  Se evită o ingestia de alcool (cu 12 ore ȋnainte de colectare) o fumatul şi orice tip de alimente cu o oră ȋnainte o ingestia de cafea, alimente acide sau zaharoase ȋn perioada de dinaintea recoltării, acestea putând determina modificări (reduceri) ale pH-ului salivar precum şi favorizarea culturilor bacteriene  Se clăteşte cavitatea orală cu apă pentru a ȋndepărta eventualele detritusuri, cu ȋnghiţirea apoi a apei (pentru a favoriza hidratarea)

Saliva este produsul de secreţie al glandelor salivare (parotide simetrice, submaxilare, linguale). Are rolul de a favoriza procesele fizice ale digestiei, mai puţin pe cele chimice. Saliva, serul şi fluidul gingival (GCF) au fost, pe rând, investigate ca micromedii de cercetare ȋndeosebi a activităţii bolii parodontale. Saliva versus sânge ȋnregistrează o serie de avantaje:  uşor de recoltat;  uşor de manipulat;  uşor de analizat;  lipseşte pacientul de disconfortul şi anxietatea caracteristice prelevărilor parenterale;  uşor de stocat şi transportat;  ieftină ȋn cantităţile necesare. De altfel, compoziţia salivei şi a celorlalte fluide orale reflectă nivelul lichidian şi tisular al moleculelor imunologice, tumorale, terapeutice, precum şi prezenta markerilor bolilor orale şi sistemice. Totuşi, analiza salivei prezintă şi o serie de disfuncţionalităţi, mai ales dacă luăm ȋn considerare faptul că, la nivelul ei sunt exprimate molecule derivate din surse multiple: glande salivare, ser, GCF (fluid gingival), celule epiteliale, bacterii şi substanţe străine ajunse ȋn cavitatea orală. Saliva reprezintă oglinda modificărilor sistemice, astfel ȋncât, analiza acestui fluid versus sânge ar fi extrem de utilă şi ȋn acelaşi timp mai puţin discomfortantă ȋn evaluarea diverşilor analiţi. Cel mai mare dezavantaj al analizei parametrilor biologici şi imunochimici ȋn salivă o reprezintă lipsa de standardizare a metodei. Există câteva precauţii ȋn prelevarea ȋn vederea analizei, a fluidului salivar:  Se evită o ingestia de alcool (cu 12 ore ȋnainte de colectare) o fumatul şi orice tip de alimente cu o oră ȋnainte o ingestia de cafea, alimente acide sau zaharoase ȋn perioada de dinaintea recoltării, acestea putând determina modificări (reduceri) ale pH-ului salivar precum şi favorizarea culturilor bacteriene  Se clăteşte cavitatea orală cu apă pentru a ȋndepărta eventualele detritusuri, cu ȋnghiţirea apoi a apei (pentru a favoriza hidratarea)

16

16

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

 Se aşteaptă minimum 10 minute după clătire (pentru a evita diluţia fluidului). Recoltarea salivei se poate face cu sau fără stimulare. Stimularea se poate realiza prin masticaţie (gumă sau parafină), sau stimulare gustativă (aplicarea de acid citric pe limbă). În general se recomandă recoltarea salivei fără a stimula secreţia glandelor, pentru a evita atât interferarea agentului stimulant cât şi eventuala reducere a nivelului analiţilor dozaţi. Saliva nestimulată este afectată de gradul de hidratare, expunerea la lumină, poziţia corpului, momentul recoltării. Contaminarea cu sânge a salivei este deasemeni un inconvenient uneori ȋn analiza analiţilor la nivelul acestui fluid, mai ales dacă ţinem cont că nivelul celor mai mulţi parametri este mai mare ȋn fluidul sanguin comparativ cu fluidele orale (sângele poate contamina saliva din cauza, fie a unei igiene precare, fie a periajului abraziv). De aceea, pentru evitarea acestor evenimente, ȋn analiza fluidului salivar se ţine cont de unele recomandări:  Evitarea periajului dentar cu minimum 45 minute ȋnaintea prelevării salivei;  Evitarea tratamentelor stomatologice cu 48 de ore ȋnainte;  Prelevarea de la pacienţi care prezintă doar semne minime de afectare la nivel oral;  Îndepărtarea eventualelor probe contaminate cu sânge şi recolectarea. Cavitatea orală reprezintă aşadar un ecosistem distinctiv al organismului la nivelul căruia se desfăşoară o multitudine de funcţii biologice. Saliva, fluidul care scaldă acest ecosistem posedă un număr impresionant de componente, multe dintre acestea fiind identificate ca protectori, cu rol esenţial ȋn menţinerea homeostaziei orale şi sistemice, acţionând ca vector al agenţilor antimicrobieni, umectând şi lubrefiind suprafeţele dentare şi mucoasa bucală. Fluidul salivar este unic ȋn felul său, iar utilizarea sa ca lichid de diagnostic al numeroaselor afecţiuni orale şi sistemice, a devenit un real succes ȋn cercetare, mai ales ȋn ultimii zece ani. Tehnicile disponibile ȋn prezent permit nu numai diagnosticul de boală, dar şi predicţia şi monitorizarea evoluţiei unor afecţiuni prin prisma analizei parametrilor salivari. Dealtfel, unele state cum sunt SUA au inţeles necesitatea dezvoltării tehnologiilor de investigaţie a fluidului salivar, încât au derulat aceste acţiuni chiar prin planuri federale, conduse de la nivelul departamentelor de chirurgie generală şi NICDR (Institutul Naţional de Cercetare Dentară şi

 Se aşteaptă minimum 10 minute după clătire (pentru a evita diluţia fluidului). Recoltarea salivei se poate face cu sau fără stimulare. Stimularea se poate realiza prin masticaţie (gumă sau parafină), sau stimulare gustativă (aplicarea de acid citric pe limbă). În general se recomandă recoltarea salivei fără a stimula secreţia glandelor, pentru a evita atât interferarea agentului stimulant cât şi eventuala reducere a nivelului analiţilor dozaţi. Saliva nestimulată este afectată de gradul de hidratare, expunerea la lumină, poziţia corpului, momentul recoltării. Contaminarea cu sânge a salivei este deasemeni un inconvenient uneori ȋn analiza analiţilor la nivelul acestui fluid, mai ales dacă ţinem cont că nivelul celor mai mulţi parametri este mai mare ȋn fluidul sanguin comparativ cu fluidele orale (sângele poate contamina saliva din cauza, fie a unei igiene precare, fie a periajului abraziv). De aceea, pentru evitarea acestor evenimente, ȋn analiza fluidului salivar se ţine cont de unele recomandări:  Evitarea periajului dentar cu minimum 45 minute ȋnaintea prelevării salivei;  Evitarea tratamentelor stomatologice cu 48 de ore ȋnainte;  Prelevarea de la pacienţi care prezintă doar semne minime de afectare la nivel oral;  Îndepărtarea eventualelor probe contaminate cu sânge şi recolectarea. Cavitatea orală reprezintă aşadar un ecosistem distinctiv al organismului la nivelul căruia se desfăşoară o multitudine de funcţii biologice. Saliva, fluidul care scaldă acest ecosistem posedă un număr impresionant de componente, multe dintre acestea fiind identificate ca protectori, cu rol esenţial ȋn menţinerea homeostaziei orale şi sistemice, acţionând ca vector al agenţilor antimicrobieni, umectând şi lubrefiind suprafeţele dentare şi mucoasa bucală. Fluidul salivar este unic ȋn felul său, iar utilizarea sa ca lichid de diagnostic al numeroaselor afecţiuni orale şi sistemice, a devenit un real succes ȋn cercetare, mai ales ȋn ultimii zece ani. Tehnicile disponibile ȋn prezent permit nu numai diagnosticul de boală, dar şi predicţia şi monitorizarea evoluţiei unor afecţiuni prin prisma analizei parametrilor salivari. Dealtfel, unele state cum sunt SUA au inţeles necesitatea dezvoltării tehnologiilor de investigaţie a fluidului salivar, încât au derulat aceste acţiuni chiar prin planuri federale, conduse de la nivelul departamentelor de chirurgie generală şi NICDR (Institutul Naţional de Cercetare Dentară şi

17

17

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

Cranio-facială). Literatura de specialitate este continuu alimentată cu numeroase articole ȋn care, utilizarea salivei, a lichidului gingival şi a transudatelor mucoasei orale ȋn monitorizarea drogurilor şi detectarea numeroaselor afecţiuni sistemice şi orale, sunt relevate şi puse la dispoziţia cercetătorilor şi a medicilor practicieni.

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

Cranio-facială). Literatura de specialitate este continuu alimentată cu numeroase articole ȋn care, utilizarea salivei, a lichidului gingival şi a transudatelor mucoasei orale ȋn monitorizarea drogurilor şi detectarea numeroaselor afecţiuni sistemice şi orale, sunt relevate şi puse la dispoziţia cercetătorilor şi a medicilor practicieni.

Figura 1. Recoltarea salivei

Figura 1. Recoltarea salivei

2.4.6 Prelevarea fluidului gingival

2.4.6 Prelevarea fluidului gingival

În condiţii de normalitate fiziologică, fluidul gingival crevicular (GCF - gingival crevicular fluid) este un transudat seros, ce provine, în cantităţi mici, continuu, din venulele corionului gingival situat sub epiteliul sulcular. Sulcusul gingival este spaţiul virtual situat între suprafaţa dintelui şi versantul intern al gingiei marginale (de la marginea gingivală până la epiteliul joncţional) (figura 2).

În condiţii de normalitate fiziologică, fluidul gingival crevicular (GCF - gingival crevicular fluid) este un transudat seros, ce provine, în cantităţi mici, continuu, din venulele corionului gingival situat sub epiteliul sulcular. Sulcusul gingival este spaţiul virtual situat între suprafaţa dintelui şi versantul intern al gingiei marginale (de la marginea gingivală până la epiteliul joncţional) (figura 2).

18

18

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

Figura 2. Recoltarea fluidului gingival

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

Figura 2. Recoltarea fluidului gingival

Sulcusul gingival este delimitat de un peretele intern - dentar; perete extern-gingival; baza şanţului – conturul coronar al epiteliului joncţional. În cursul bolii, numeroşi produşi ai conflictului parazit – gazdă pătrund în fluid, fapt ce face ca acesta să devină un adevărat exudat. Pătrunderea în şanţul gingival a microbilor sau a unor corpi străini este urmată de creşterea fluxului de lichid crevicular şi de eliminarea acestora începând la câteva minute după insinuarea lor. Analiza GCF constituie o modalitate neagresivă de examinare a reacţiei gazdei la nivelul parodonţiului. O parte dintre aceste componente (enzime, prostaglandine, citokine) pot constitui markeri sensibili ai parodontitei distructive, a căror analiză în GCF prezintă numeroase avantaje deoarece, spre deosebire de ser şi salivă, se pot folosi mostre convenabile din situsuri specifice care conţin componente derivate atât de la gazdă (în forma plasmei, componentelor celulare, ţesuturi de legătură), cât şi din placa bacteriană, GCF putând fi considerat un adevărat „câmp de luptă” (focarul interacţiunii bolnavmicroorganism) între agresorii externi (ai plăcii bacteriene în special) şi cei interni (de la nivelul organismului gazdă). Astfel, înzestrat cu peste 50 de indicatori ai răspunsului imun şi inflamator ai gazdei, fluidul gingival crevicular prezintă capacitatea de a reflecta complexitatea interacţiunii bacterie –gazdă, şi de a oferi informaţii nu numai referitoare la echilibrul dintre acestea ci şi informaţii specifice mecanismelor patogenice.

Sulcusul gingival este delimitat de un peretele intern - dentar; perete extern-gingival; baza şanţului – conturul coronar al epiteliului joncţional. În cursul bolii, numeroşi produşi ai conflictului parazit – gazdă pătrund în fluid, fapt ce face ca acesta să devină un adevărat exudat. Pătrunderea în şanţul gingival a microbilor sau a unor corpi străini este urmată de creşterea fluxului de lichid crevicular şi de eliminarea acestora începând la câteva minute după insinuarea lor. Analiza GCF constituie o modalitate neagresivă de examinare a reacţiei gazdei la nivelul parodonţiului. O parte dintre aceste componente (enzime, prostaglandine, citokine) pot constitui markeri sensibili ai parodontitei distructive, a căror analiză în GCF prezintă numeroase avantaje deoarece, spre deosebire de ser şi salivă, se pot folosi mostre convenabile din situsuri specifice care conţin componente derivate atât de la gazdă (în forma plasmei, componentelor celulare, ţesuturi de legătură), cât şi din placa bacteriană, GCF putând fi considerat un adevărat „câmp de luptă” (focarul interacţiunii bolnavmicroorganism) între agresorii externi (ai plăcii bacteriene în special) şi cei interni (de la nivelul organismului gazdă). Astfel, înzestrat cu peste 50 de indicatori ai răspunsului imun şi inflamator ai gazdei, fluidul gingival crevicular prezintă capacitatea de a reflecta complexitatea interacţiunii bacterie –gazdă, şi de a oferi informaţii nu numai referitoare la echilibrul dintre acestea ci şi informaţii specifice mecanismelor patogenice.

19

19

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

Colectarea GCF: Fluidul crevicular gingival este de obicei colectat prin introducerea unei hârtii de filtru subţire cu dimensiuni standardizate pentru a pătrunde în spaţiul gingival, şi menţinerea acolo o perioadă de timp (de obicei 30 de secunde). Fluidul este absorbit de hârtia de filtru. Tehnica uzuală presupune inserţia subgingivală dinspre vestibular spre oral şi dinspre oral spre vestibular la nivelul feţei meziale a dinţilor. În prezent, volumul GCF colectat cu hârtia de filtru este determinat cu Periotron 8000, un aparat electronic ce măsoară modificarea capacitanţei în lungul hârtiei de filtru ude. Această modificare este transmisă unui dispozitiv digital care poate fi corelat cu volumul de fluid crevicular. O anumită sursă de potenţial de eroare este asociată cu utilizarea timpurie a modelului Periotron (rezultatele pot fi afectate de temperatura din cameră şi umiditate, iar plasarea hârtiei de filtru în interior trebuie standardizată). Totuşi metodele îmbunătăţite sunt în general recunoscute ca având rezultate exacte şi reproductibile. Noul Periotron 8000 presupune o calibrare automată a adevăratului volum, în relaţie cu un computer pentru stocare, salvare şi expunere a datei şi măsurarea volumului de fluid (până la 3 µl). Ȋn fluidul crevicular au fost identificate peste 100 de componente care pot fi clasificate ȋn elemente: celulare, electroliţi, compuşi organici, produşi bacterieni, produşi metabolici, enzime şi inhibitori enzimatici. Mai mult, există numeroase studii care atestă potenţialul enzimelor hidrolitice şi proteolitice din fluidul gingival, ca markeri de diagnostic ȋn boala parodontală. Dintre enzimele existente, majoritatea sunt secretate şi eliberate de către celulele gazdei: colagenaza, elastaza, fosfataza alcalină, beta glucuronidaza, AST-aspartat amino transferaza, LDH – lactat dehidrogenaza, catepsine (unele dintre acestea constituind markeri ai activităţii lizozomale din ţesutul gazdă). Acţiunea multora dintre aceste enzime poate fi modulată la rândul său de enzime specifice şi proteine, generate fie local fie la nivelul circulaţiei sistemice. Simpla prezenţă a acestor enzime ȋn anumite situsuri, nu echivalează cu boala, atât timp cât nu există o activitate biologică evidentă a acestora (multe dintre enzime sunt secretate sub formă inactivă şi devin active doar in condiţii de alterare biologică). Conţinutul său bogat ȋn produşi de reacţie asociaţi cu inflamaţia parodontală, disponibilitatea recoltării facile, cu investiţie minimă de timp, riscuri, capital şi materiale, sunt tot atâtea motive care acreditează fluidul crevicular ca un micromediu de analiză al potenţialilor markeri de alterare a teritoriilor orale, ȋndeosebi a celor parodontale.

Colectarea GCF: Fluidul crevicular gingival este de obicei colectat prin introducerea unei hârtii de filtru subţire cu dimensiuni standardizate pentru a pătrunde în spaţiul gingival, şi menţinerea acolo o perioadă de timp (de obicei 30 de secunde). Fluidul este absorbit de hârtia de filtru. Tehnica uzuală presupune inserţia subgingivală dinspre vestibular spre oral şi dinspre oral spre vestibular la nivelul feţei meziale a dinţilor. În prezent, volumul GCF colectat cu hârtia de filtru este determinat cu Periotron 8000, un aparat electronic ce măsoară modificarea capacitanţei în lungul hârtiei de filtru ude. Această modificare este transmisă unui dispozitiv digital care poate fi corelat cu volumul de fluid crevicular. O anumită sursă de potenţial de eroare este asociată cu utilizarea timpurie a modelului Periotron (rezultatele pot fi afectate de temperatura din cameră şi umiditate, iar plasarea hârtiei de filtru în interior trebuie standardizată). Totuşi metodele îmbunătăţite sunt în general recunoscute ca având rezultate exacte şi reproductibile. Noul Periotron 8000 presupune o calibrare automată a adevăratului volum, în relaţie cu un computer pentru stocare, salvare şi expunere a datei şi măsurarea volumului de fluid (până la 3 µl). Ȋn fluidul crevicular au fost identificate peste 100 de componente care pot fi clasificate ȋn elemente: celulare, electroliţi, compuşi organici, produşi bacterieni, produşi metabolici, enzime şi inhibitori enzimatici. Mai mult, există numeroase studii care atestă potenţialul enzimelor hidrolitice şi proteolitice din fluidul gingival, ca markeri de diagnostic ȋn boala parodontală. Dintre enzimele existente, majoritatea sunt secretate şi eliberate de către celulele gazdei: colagenaza, elastaza, fosfataza alcalină, beta glucuronidaza, AST-aspartat amino transferaza, LDH – lactat dehidrogenaza, catepsine (unele dintre acestea constituind markeri ai activităţii lizozomale din ţesutul gazdă). Acţiunea multora dintre aceste enzime poate fi modulată la rândul său de enzime specifice şi proteine, generate fie local fie la nivelul circulaţiei sistemice. Simpla prezenţă a acestor enzime ȋn anumite situsuri, nu echivalează cu boala, atât timp cât nu există o activitate biologică evidentă a acestora (multe dintre enzime sunt secretate sub formă inactivă şi devin active doar in condiţii de alterare biologică). Conţinutul său bogat ȋn produşi de reacţie asociaţi cu inflamaţia parodontală, disponibilitatea recoltării facile, cu investiţie minimă de timp, riscuri, capital şi materiale, sunt tot atâtea motive care acreditează fluidul crevicular ca un micromediu de analiză al potenţialilor markeri de alterare a teritoriilor orale, ȋndeosebi a celor parodontale.

20

20

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2.5

2010

MCQ

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2.5

2010

MCQ

I1. Care dintre următoarele afirmaţii NU este corectă: A. Fiecare laborator trebuie să prezinte un extinctor şi periodic personalul trebuie să verifice funcţionalitatea lui B. Încăperea unde se prepară acizi, apa de brom şi solvenţi organici trebuie să fie prevăzută cu coş de evacuare şi ventilaţie electrică C. Evaporarea solvenţilor inflamabili se face deasupra unei chiuvete D. Acizii minerali şi hidroxizii concentraţi, hârtiile şi eprubetele sparte nu trebuie aruncate în chiuvetă. E. Pipetarea produselor biologice se face cu pipete automate sau prevăzute cu filtru de vată I2. Mirosirea substanţelor chimice se face: A. Apropiind nasul de gâtul sticlei B. De la distanţă C. Prin intermediul unei măşti speciale D. Prin aducerea unui curent de aer care conţine vapori ai substanţelor de la gâtul sticlei cu ajutorul palmei, în apropierea nasului E. Nici un răspuns corect I3. Recoltarea sângelui capilar se face: A. De la nivelul plicii cotului B. De pe faţa dorsală a mâinii C. De la nivelul fontanelei la copii mici D. Din pulpa degetului E. Nici un răspuns corect I4. Referitor la recoltarea sângelui venos NU este adevărat că: A. Se folosesc ace şi seringi de unică utilizare B. Se folosesc ace şi vase speciale pentru recoltarea sângelui C. Se efectuează din venele plicii cotului (la adult şi copii mari), din fontanelă şi venele jugulare (la sugari şi copii mici). D. Poziţia corpului şi staza venoasă nu influenţează rezultatele obţinute în cazul determinării elementelor figurate. E. Conservarea probelor la T camerei determină perturbări în compoziţia electroliţilor, enzimelor şi diferiţilor metaboliţi. I5. Fluidul crevicular A. Reprezintă fluidul predominant din cavitatea orală

I1. Care dintre următoarele afirmaţii NU este corectă: A. Fiecare laborator trebuie să prezinte un extinctor şi periodic personalul trebuie să verifice funcţionalitatea lui B. Încăperea unde se prepară acizi, apa de brom şi solvenţi organici trebuie să fie prevăzută cu coş de evacuare şi ventilaţie electrică C. Evaporarea solvenţilor inflamabili se face deasupra unei chiuvete D. Acizii minerali şi hidroxizii concentraţi, hârtiile şi eprubetele sparte nu trebuie aruncate în chiuvetă. E. Pipetarea produselor biologice se face cu pipete automate sau prevăzute cu filtru de vată I2. Mirosirea substanţelor chimice se face: A. Apropiind nasul de gâtul sticlei B. De la distanţă C. Prin intermediul unei măşti speciale D. Prin aducerea unui curent de aer care conţine vapori ai substanţelor de la gâtul sticlei cu ajutorul palmei, în apropierea nasului E. Nici un răspuns corect I3. Recoltarea sângelui capilar se face: A. De la nivelul plicii cotului B. De pe faţa dorsală a mâinii C. De la nivelul fontanelei la copii mici D. Din pulpa degetului E. Nici un răspuns corect I4. Referitor la recoltarea sângelui venos NU este adevărat că: A. Se folosesc ace şi seringi de unică utilizare B. Se folosesc ace şi vase speciale pentru recoltarea sângelui C. Se efectuează din venele plicii cotului (la adult şi copii mari), din fontanelă şi venele jugulare (la sugari şi copii mici). D. Poziţia corpului şi staza venoasă nu influenţează rezultatele obţinute în cazul determinării elementelor figurate. E. Conservarea probelor la T camerei determină perturbări în compoziţia electroliţilor, enzimelor şi diferiţilor metaboliţi. I5. Fluidul crevicular A. Reprezintă fluidul predominant din cavitatea orală

21

21

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Cunoştinţe fundamentale de biochimie

2010

B. Posedă un bogat echipament enzimatic provenit exclusiv din ţesuturile gazei C. Reprezintă o extensie a fluidului salivar la nivelul joncţiunii radiculare cu gingia D. Este ȋn mod normal inaparent şi devine un lichid inflamator E. Se exprimă ȋn cavitatea orală ȋn jurul dinţilor cariaţi I6. Recoltarea urinei ȋn vederea analizei biochimice: A. Se face doar dimineaţa la prima oră B. Se face doar în cadrul laboratoarelor C. Se realizează obligatoriu cu urina recoltată într-un vas steril D. Nu necesită toaleta zonei genitale înainte de recoltare E. Nici un răspuns corect I7. Acizii: A. Sunt donori de protoni B. Au pH>7 C. Acceptă protoni D. Cei tari ionizează greu în soluţie apoasă E. Cei slabi disociază complet în soluţii I8. Amfoliţii : A. Sunt acizi slabi B. Sunt baze tari C. Au pH-ul > 7 D. Pot funcţiona ca sisteme tampon E. Conţin doar grupări acide I9. Următoarele condiţii sunt necesare ca o sare să hidrolizeze, cu excepţia: A. Să fie solubilă în apă B. Să fie disociată în ioni C. Să provină prin neutralizarea unui acid tare cu o bază slabă D. Să provină din neutralizarea unui acid tare cu o bază tare E. Nici un răspuns corect I10. Analiza biochimică a salivei: A. Prezintă avantaje faţă de analiza fluidului gingival B. Prezintă riscul de a fi compromisă prin contaminare cu fluid gingival C. Se efectuează obligatoriu la pacienţii cu carie dentară D. Nu prezintă riscul contaminării cu sânge E. Nici un răspuns corect

B. Posedă un bogat echipament enzimatic provenit exclusiv din ţesuturile gazei C. Reprezintă o extensie a fluidului salivar la nivelul joncţiunii radiculare cu gingia D. Este ȋn mod normal inaparent şi devine un lichid inflamator E. Se exprimă ȋn cavitatea orală ȋn jurul dinţilor cariaţi I6. Recoltarea urinei ȋn vederea analizei biochimice: A. Se face doar dimineaţa la prima oră B. Se face doar în cadrul laboratoarelor C. Se realizează obligatoriu cu urina recoltată într-un vas steril D. Nu necesită toaleta zonei genitale înainte de recoltare E. Nici un răspuns corect I7. Acizii: A. Sunt donori de protoni B. Au pH>7 C. Acceptă protoni D. Cei tari ionizează greu în soluţie apoasă E. Cei slabi disociază complet în soluţii I8. Amfoliţii : A. Sunt acizi slabi B. Sunt baze tari C. Au pH-ul > 7 D. Pot funcţiona ca sisteme tampon E. Conţin doar grupări acide I9. Următoarele condiţii sunt necesare ca o sare să hidrolizeze, cu excepţia: A. Să fie solubilă în apă B. Să fie disociată în ioni C. Să provină prin neutralizarea unui acid tare cu o bază slabă D. Să provină din neutralizarea unui acid tare cu o bază tare E. Nici un răspuns corect I10. Analiza biochimică a salivei: A. Prezintă avantaje faţă de analiza fluidului gingival B. Prezintă riscul de a fi compromisă prin contaminare cu fluid gingival C. Se efectuează obligatoriu la pacienţii cu carie dentară D. Nu prezintă riscul contaminării cu sânge E. Nici un răspuns corect

22

22

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CAPITOLUL 3

CAPITOLUL 3

TEHNICI DE ANALIZA A PARAMETRILOR BIOLOGICI

TEHNICI DE ANALIZA A PARAMETRILOR BIOLOGICI

SI BIOCHIMICI IN LABORATOR

SI BIOCHIMICI IN LABORATOR

3.1. SPECTROFOTOMETRIA

3.1. SPECTROFOTOMETRIA

Spectrofotometria se bazează pe proprietatea substanţelor de a absorbi selectiv radiaţiile electromagnetice şi este folosită pentru identificarea şi determinarea cantitativă a acestora. Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicul de radiaţii continue prin substanţa de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbită este în funcţie de structura şi de numărul moleculelor sau al atomilor substanţei cu care interacţionează fasciculul de radiaţii. Spectrofotometrul diferă de colorimetru prin modul în care lumina este separată în lungimile de undă componente. Spectrofotometrul utilizează o prismă pentru separarea luminii, iar colorimetrul utilizează filtre. Ambele se bazează pe un model simplu de trecere a luminii de lungime de unda cunoscută printr-o probă şi măsurarea cantităţii de energie luminoasă care este transmisă. Aceasta se realizează prin plasarea unei fotocelule în partea opusă a probei respective. O rază de lumina este formată din fotoni; când un foton întâlneşte o moleculă de analit, există şanse ca analitul să absoarbă fotonul. Aceasta absorbţie reduce numărul de fotoni din raza de lumina, astfel reducând intensitatea luminoasă. Toate moleculele absorb energie radiantă la anumite lungimi de unda. Cele care absorb energie în spectrul vizibil sunt cunoscute ca pigmenţi. Proteinele şi acizii nucleici absorb lumina în domeniul ultraviolet. Un spectrofotometru implică o sursă de lumină, o prismă, un suport pentru probe şi o fotocelulă. Acestea sunt conectate la un sistem electric sau mecanic care controlează intensitatea luminii, lungimea de undă şi conversia energiei primite la nivelul fotocelulei în fluctuaţii voltmetrice. Fluctuaţiile

Spectrofotometria se bazează pe proprietatea substanţelor de a absorbi selectiv radiaţiile electromagnetice şi este folosită pentru identificarea şi determinarea cantitativă a acestora. Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicul de radiaţii continue prin substanţa de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbită este în funcţie de structura şi de numărul moleculelor sau al atomilor substanţei cu care interacţionează fasciculul de radiaţii. Spectrofotometrul diferă de colorimetru prin modul în care lumina este separată în lungimile de undă componente. Spectrofotometrul utilizează o prismă pentru separarea luminii, iar colorimetrul utilizează filtre. Ambele se bazează pe un model simplu de trecere a luminii de lungime de unda cunoscută printr-o probă şi măsurarea cantităţii de energie luminoasă care este transmisă. Aceasta se realizează prin plasarea unei fotocelule în partea opusă a probei respective. O rază de lumina este formată din fotoni; când un foton întâlneşte o moleculă de analit, există şanse ca analitul să absoarbă fotonul. Aceasta absorbţie reduce numărul de fotoni din raza de lumina, astfel reducând intensitatea luminoasă. Toate moleculele absorb energie radiantă la anumite lungimi de unda. Cele care absorb energie în spectrul vizibil sunt cunoscute ca pigmenţi. Proteinele şi acizii nucleici absorb lumina în domeniul ultraviolet. Un spectrofotometru implică o sursă de lumină, o prismă, un suport pentru probe şi o fotocelulă. Acestea sunt conectate la un sistem electric sau mecanic care controlează intensitatea luminii, lungimea de undă şi conversia energiei primite la nivelul fotocelulei în fluctuaţii voltmetrice. Fluctuaţiile

23

23

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

voltmetrice sunt apoi proiectate pe o scală metrică/digitală şi valorile sunt înregistrate într-un computer. Intensitatea culorii dintr-o probă depinde de cantitatea de soluţie din proba respectivă. Transmisia luminii nu este o funcţie liniară, ci mai degrabă exponenţială. Transmitanţa este procentul relativ de lumină care a trecut prin proba. Transmitanţa procentuală este transformată într-o funcţie logaritmică inversă cunoscută ca absorbanţă (sau densitate optică). Legea Bouguer-Lambert-Beer: descreşterea intensităţii fascisolului după ce a străbătut un strat absorbant este proporţională cu grosimea stratului şi concentraţia acestuia.

voltmetrice sunt apoi proiectate pe o scală metrică/digitală şi valorile sunt înregistrate într-un computer. Intensitatea culorii dintr-o probă depinde de cantitatea de soluţie din proba respectivă. Transmisia luminii nu este o funcţie liniară, ci mai degrabă exponenţială. Transmitanţa este procentul relativ de lumină care a trecut prin proba. Transmitanţa procentuală este transformată într-o funcţie logaritmică inversă cunoscută ca absorbanţă (sau densitate optică). Legea Bouguer-Lambert-Beer: descreşterea intensităţii fascisolului după ce a străbătut un strat absorbant este proporţională cu grosimea stratului şi concentraţia acestuia.

I / I 0  10  c l ; I  I 0  10  c l

I / I 0  10  c l ; I  I 0  10  c l

unde: I = intensitatea luminii transmise (ce părăseşte proba); I0 = intensitatea luminii incidente (ce pătrunde în probă); ε = coeficient molar de extincţie sau absorbtivitate molară; c = concentraţia soluţiei ce absoarbe (în mol/L); l = grosimea stratului absorbant (cm). I / I0 = T = transmitanţă sau transmisie - este deci raportul dintre intensitatea luminii transmise (I) şi intensitatea luminii incidente (I0). Aplicând logaritmul pentru Io / I rezultă:

unde: I = intensitatea luminii transmise (ce părăseşte proba); I0 = intensitatea luminii incidente (ce pătrunde în probă); ε = coeficient molar de extincţie sau absorbtivitate molară; c = concentraţia soluţiei ce absoarbe (în mol/L); l = grosimea stratului absorbant (cm). I / I0 = T = transmitanţă sau transmisie - este deci raportul dintre intensitatea luminii transmise (I) şi intensitatea luminii incidente (I0). Aplicând logaritmul pentru Io / I rezultă:

log (I0 / I) = log (1 / T) = εcl = A = E = D = absorbanţă (A), extincţie (E) sau densitate optică (D).

log (I0 / I) = log (1 / T) = εcl = A = E = D = absorbanţă (A), extincţie (E) sau densitate optică (D).

Deci, legea care stă la baza spectrofotometriei se exprimă simplu:A= ε.c.l Conform legii de bază a spectrofotometriei, absorbanţa (extincţia) este proporţională cu concentraţia şi cu grosimea stratului absorbant. Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesară stabilirea unei serii cunoscute de diluţii a unor cantităţi cunoscute de soluţii. Una din acestea nu conţine soluţie si este cunoscută ca “blank”. Este utilizată pentru ajustarea instrumentului să citească 100% transmitanţa pentru absorbanţă 0. O valoare a transmitanţei de 0% (absorbanţa infinită) este stabilită prin plasarea unei bariere între sursa de lumină şi fotocelulă. Toate celelalte măsurători sunt apoi efectuate prin simpla plasare a probelor în calea luminii. După înregistrarea absorbanţei pentru o serie de probe standard este efectuat un grafic absorbanţă versus concentraţie. Panta dreptei reprezintă coeficientul de extincţie. Aceasta valoare este o constantă şi este utilizată pentru conversia oricărei absorbanţe măsurate în concentraţia corespunzatoare (C = A/ε).

Deci, legea care stă la baza spectrofotometriei se exprimă simplu:A= ε.c.l Conform legii de bază a spectrofotometriei, absorbanţa (extincţia) este proporţională cu concentraţia şi cu grosimea stratului absorbant. Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesară stabilirea unei serii cunoscute de diluţii a unor cantităţi cunoscute de soluţii. Una din acestea nu conţine soluţie si este cunoscută ca “blank”. Este utilizată pentru ajustarea instrumentului să citească 100% transmitanţa pentru absorbanţă 0. O valoare a transmitanţei de 0% (absorbanţa infinită) este stabilită prin plasarea unei bariere între sursa de lumină şi fotocelulă. Toate celelalte măsurători sunt apoi efectuate prin simpla plasare a probelor în calea luminii. După înregistrarea absorbanţei pentru o serie de probe standard este efectuat un grafic absorbanţă versus concentraţie. Panta dreptei reprezintă coeficientul de extincţie. Aceasta valoare este o constantă şi este utilizată pentru conversia oricărei absorbanţe măsurate în concentraţia corespunzatoare (C = A/ε).

24

24

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Un spectrofotometru poate utiliza atât lumina vizibilă (de obicei având ca sursă de lumină o lampă cu tugsten/halogen, 400-800 nm), cât şi lumina UV (180-400nm). Singura modificare necesară este înlocuirea tuburilor de sticlă cu cuvete de quartz (sticla absoarbe lumina UV şi nu este potrivită pentru un spectrofotometru UV). Radiaţia electromagnetică ce constituie lumina este caracterizată (ca de altfel toate radiaţiile electromagnetice) prin lungime de undă (λ), frecvenţă (ν), respectiv energie (Є) corelate prin expresia: Є = hν. Sub numele de absorbţiometrie sau spectrofotometrie prin absorbţie a luminii se înţeleg toate metodele ce au la bază următorul principiu: un fascicol luminos, de o anumită lungime de undă, străbate proba de analizat şi după proporţia în care este absorbită radiaţia luminoasă, se determină cantitatea de substanţă absorbantă. Metoda se numeşte absorbţiometrie fotometrică sau spectrofotometrie prin absorbţie sau încă spectrocolorimetrie; denumirea de colorimetrie este improprie, acesta definind în realitate metodele de analiză pentru specificarea şi descrierea culorilor. Domenii de aplicare şi avantaje

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Un spectrofotometru poate utiliza atât lumina vizibilă (de obicei având ca sursă de lumină o lampă cu tugsten/halogen, 400-800 nm), cât şi lumina UV (180-400nm). Singura modificare necesară este înlocuirea tuburilor de sticlă cu cuvete de quartz (sticla absoarbe lumina UV şi nu este potrivită pentru un spectrofotometru UV). Radiaţia electromagnetică ce constituie lumina este caracterizată (ca de altfel toate radiaţiile electromagnetice) prin lungime de undă (λ), frecvenţă (ν), respectiv energie (Є) corelate prin expresia: Є = hν. Sub numele de absorbţiometrie sau spectrofotometrie prin absorbţie a luminii se înţeleg toate metodele ce au la bază următorul principiu: un fascicol luminos, de o anumită lungime de undă, străbate proba de analizat şi după proporţia în care este absorbită radiaţia luminoasă, se determină cantitatea de substanţă absorbantă. Metoda se numeşte absorbţiometrie fotometrică sau spectrofotometrie prin absorbţie sau încă spectrocolorimetrie; denumirea de colorimetrie este improprie, acesta definind în realitate metodele de analiză pentru specificarea şi descrierea culorilor. Domenii de aplicare şi avantaje

Datorită perfecţionării aparaturii şi metodelor de lucru, spectrofotometria UV-VIS a devenit o metodă performantă, cu o eroare mică = 0,25 - 0,5%, comparabilă cu a metodelor titrimetrice. (la început mai ales în cazul analizei urmelor precizia lăsa de dorit. Principalele avantaje:  se pot aplica pentru dozarea majorităţii substanţelor. În cazul în care compusul nu absoarbe lumina, poate fi transformat printr-o reacţie chimică adecvată într-un compus colorat ce absoarbe lumina.  folosirea reactivilor organici a condus la realizarea unor metode de determinare a urmelor de substanţă.  sunt metode rapide, prin măsurarea directă, fără a fi necesară adăugarea de soluţie titrată. În multe cazuri se poate evita separarea altor componente, iar prin folosirea unor reactivi specifici şi prin controlul strict al reacţiei se poate elimina interferenţa ionilor străini (controlul pH-ului, lungime de undă convenabil aleasă, utilizarea solvenţilor organici pentru extragerea complecşilor coloraţi, utilizarea unor reacţii redox).  prin metodele spectrofotometrice se poate pune în evidenţă punctul de echivalenţă într-o metodă titrimetrică (titrare spectrofotometrică).

Datorită perfecţionării aparaturii şi metodelor de lucru, spectrofotometria UV-VIS a devenit o metodă performantă, cu o eroare mică = 0,25 - 0,5%, comparabilă cu a metodelor titrimetrice. (la început mai ales în cazul analizei urmelor precizia lăsa de dorit. Principalele avantaje:  se pot aplica pentru dozarea majorităţii substanţelor. În cazul în care compusul nu absoarbe lumina, poate fi transformat printr-o reacţie chimică adecvată într-un compus colorat ce absoarbe lumina.  folosirea reactivilor organici a condus la realizarea unor metode de determinare a urmelor de substanţă.  sunt metode rapide, prin măsurarea directă, fără a fi necesară adăugarea de soluţie titrată. În multe cazuri se poate evita separarea altor componente, iar prin folosirea unor reactivi specifici şi prin controlul strict al reacţiei se poate elimina interferenţa ionilor străini (controlul pH-ului, lungime de undă convenabil aleasă, utilizarea solvenţilor organici pentru extragerea complecşilor coloraţi, utilizarea unor reacţii redox).  prin metodele spectrofotometrice se poate pune în evidenţă punctul de echivalenţă într-o metodă titrimetrică (titrare spectrofotometrică).

25

25

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

3.2. ELECTROFOREZA

3.2. ELECTROFOREZA

-Metodă de analiză calitativă a proteinelor-

-Metodă de analiză calitativă a proteinelor-

Electroforeza este o metodă de separare a proteinelor din ser sau urină, ce permite separarea ȋn câmp electric a proteinelor serice în 5 fracţiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la pH 9.2 sau în 6 fracţiuni, cu subîmpărţirea grupului beta (albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la un pH de 8.5. Albumina este produsă în ficat şi reprezintă aproape 60% din proteinele din sânge, globulinele constituind restul de 40%. În afara imunoglobulinelor şi a câtorva proteine complementare, majoritatea globulinelor sunt produse în ficat. Analiza electroforezei este utilizată pentru a identifica prezenţa sau absenţa proteinelor anormale, a proteinelor monoclonale-producerea excesivă a imunoglobulinei specifice şi pentru a determina când diferite grupe de proteine au valorile crescute sau scăzute în ser. Electroforeza proteinelor şi cea cu imunofixare sunt utile ȋn determinarea, diagnosticul şi monitorizarea cursului şi tratamentului unor afecţiuni asociate cu proteinele anormale. Proteinele, în mod normal nu sunt excretate în urină, iar când se prezintă în cantităţi prea mari poate indica existenţa unor probleme renale şi/sau producerea anormală de proteine.

Electroforeza este o metodă de separare a proteinelor din ser sau urină, ce permite separarea ȋn câmp electric a proteinelor serice în 5 fracţiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la pH 9.2 sau în 6 fracţiuni, cu subîmpărţirea grupului beta (albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la un pH de 8.5. Albumina este produsă în ficat şi reprezintă aproape 60% din proteinele din sânge, globulinele constituind restul de 40%. În afara imunoglobulinelor şi a câtorva proteine complementare, majoritatea globulinelor sunt produse în ficat. Analiza electroforezei este utilizată pentru a identifica prezenţa sau absenţa proteinelor anormale, a proteinelor monoclonale-producerea excesivă a imunoglobulinei specifice şi pentru a determina când diferite grupe de proteine au valorile crescute sau scăzute în ser. Electroforeza proteinelor şi cea cu imunofixare sunt utile ȋn determinarea, diagnosticul şi monitorizarea cursului şi tratamentului unor afecţiuni asociate cu proteinele anormale. Proteinele, în mod normal nu sunt excretate în urină, iar când se prezintă în cantităţi prea mari poate indica existenţa unor probleme renale şi/sau producerea anormală de proteine.

Figura 1. Relevarea pe un gel de agaroză a migrării diferite a fracţiilor proteice serice; cu roşu este figurat un aspect normal de expresie a nivelului fracţiunilor.

Figura 1. Relevarea pe un gel de agaroză a migrării diferite a fracţiilor proteice serice; cu roşu este figurat un aspect normal de expresie a nivelului fracţiunilor.

26

26

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Tehnica constă ȋn depunerea câtorva microlitri de ser pe un suport pe suprafaţa căruia este aplicat un gel de agaroză, cu pH 8,6. La acest pH, proteinele sunt sub formă de anioni (ioni negativi), având tendinţa să migreze spre anod. Se folosesc diverse aparate care prezintă două sectoare: unul pentru migrarea proteinelor şi celălalt pentru relevarea migrării prin colorarea gelului ȋn care a avut loc migrarea. Gelul se aşează în câmp electric ȋn cuva de migrare. Se acoperă cuva, pentru inchiderea circuitului, şi se aplică un curent de 100 V, timp de 20 de minute. După migrare, gelul se imersează ȋn soluţia de fixare (alcool etilic 96% + acid acetic + apă distilată), timp de 15 minute, ȋn poziţie verticală. Se usucă apoi gelul cu un curent de aer de 80C. După uscarea completaă, se imersează ȋn soluţia de colorare amidoblack, 10 minute, apoi se decolorează, se spală şi se usucă. Vizualizarea se face cu ajutorul unui densitometru. Electroforeza furnizează valori procentuale ale celor cinci fracţii proteice, concentraţia absolută a acestora calculându-se ȋn funcţie de nivelul proteinelor serice totale. După ȋncărcătura electrică şi masă moleculară, fracţiunile proteice migrează diferit - cel mai departe migrează albuminele, urmate apoi de alfa1 globulinele, alfa 2 globulinele, beta globulinele şi gama globulinele. Euproteinemie se numeşte situaţia normală ȋn care nivelul fracţiilor proteice separate prin electroforeză ȋnregistrează valori fiziologice, situate ȋn limite normale. Disproteinemiile sunt modificări ȋn nivelul fracţiilor proteice, cele mai frecvente constând ȋn scăderea serumalbuminelor şi creşterea globulinelor. Disproteinemiile interesând globulinele sunt foarte des intâlnite, creşterile pot fi globale sau interesează doar anumite fracţiuni.

Tehnica constă ȋn depunerea câtorva microlitri de ser pe un suport pe suprafaţa căruia este aplicat un gel de agaroză, cu pH 8,6. La acest pH, proteinele sunt sub formă de anioni (ioni negativi), având tendinţa să migreze spre anod. Se folosesc diverse aparate care prezintă două sectoare: unul pentru migrarea proteinelor şi celălalt pentru relevarea migrării prin colorarea gelului ȋn care a avut loc migrarea. Gelul se aşează în câmp electric ȋn cuva de migrare. Se acoperă cuva, pentru inchiderea circuitului, şi se aplică un curent de 100 V, timp de 20 de minute. După migrare, gelul se imersează ȋn soluţia de fixare (alcool etilic 96% + acid acetic + apă distilată), timp de 15 minute, ȋn poziţie verticală. Se usucă apoi gelul cu un curent de aer de 80C. După uscarea completaă, se imersează ȋn soluţia de colorare amidoblack, 10 minute, apoi se decolorează, se spală şi se usucă. Vizualizarea se face cu ajutorul unui densitometru. Electroforeza furnizează valori procentuale ale celor cinci fracţii proteice, concentraţia absolută a acestora calculându-se ȋn funcţie de nivelul proteinelor serice totale. După ȋncărcătura electrică şi masă moleculară, fracţiunile proteice migrează diferit - cel mai departe migrează albuminele, urmate apoi de alfa1 globulinele, alfa 2 globulinele, beta globulinele şi gama globulinele. Euproteinemie se numeşte situaţia normală ȋn care nivelul fracţiilor proteice separate prin electroforeză ȋnregistrează valori fiziologice, situate ȋn limite normale. Disproteinemiile sunt modificări ȋn nivelul fracţiilor proteice, cele mai frecvente constând ȋn scăderea serumalbuminelor şi creşterea globulinelor. Disproteinemiile interesând globulinele sunt foarte des intâlnite, creşterile pot fi globale sau interesează doar anumite fracţiuni.

27

27

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Figura 2. Domeniul de migrare al proteinelor serice prin electroforeză Prezentăm pe scurt, variaţiile fracţiilor proteice serice: Albumina  nivel scăzut în: o insuficienţa aportului albuminelor în alimentaţie (malnutriţie cronică severă) o diminuarea sintezei: insuficienţă hepatică (ciroze, hepatite) şi inflamaţii o pierderea lor accentuată pe cale urinară (sindrom nefrotic), digestivă (gastroenteropatie exudativă) sau cutanată(arsuri) o hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse (tireotoxicoza, sindrom Cushing) o analbuminemie congenitală 28

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Figura 2. Domeniul de migrare al proteinelor serice prin electroforeză Prezentăm pe scurt, variaţiile fracţiilor proteice serice: Albumina  nivel scăzut în: o insuficienţa aportului albuminelor în alimentaţie (malnutriţie cronică severă) o diminuarea sintezei: insuficienţă hepatică (ciroze, hepatite) şi inflamaţii o pierderea lor accentuată pe cale urinară (sindrom nefrotic), digestivă (gastroenteropatie exudativă) sau cutanată(arsuri) o hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse (tireotoxicoza, sindrom Cushing) o analbuminemie congenitală 28

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

 nivelul crescut este de regulă fără semnificaţie patologică importantă, apărând frecvent la pacienţii cu hemoconcentraţie locală sau sistemică sau la cei cărora li se adminstrează albumină ȋn perfuzie.

 nivelul crescut este de regulă fără semnificaţie patologică importantă, apărând frecvent la pacienţii cu hemoconcentraţie locală sau sistemică sau la cei cărora li se adminstrează albumină ȋn perfuzie.

Alfa 1 Globulinele  nivel scăzut: boli cronice ale ficatului, deficit congenital de alfa-1 antitripsina  nivel crescut: diabet zaharat, boli inflamatoare acute sau cronice (endocardită, reumatism, hepatită cronică) reacţii de fază acută însoţite de hemoliză, terapie cu estrogeni, sarcină

Alfa 1 Globulinele  nivel scăzut: boli cronice ale ficatului, deficit congenital de alfa-1 antitripsina  nivel crescut: diabet zaharat, boli inflamatoare acute sau cronice (endocardită, reumatism, hepatită cronică) reacţii de fază acută însoţite de hemoliză, terapie cu estrogeni, sarcină

Alfa 2 Globulinele  nivel scăzut: hipertiroidism, boli severe ale ficatului, hemoliză  nivel crescut: boli renale, boli inflamatoare acute sau cronice (poliartrită reumatoidă, boli cu complexe imune circulante)

Alfa 2 Globulinele  nivel scăzut: hipertiroidism, boli severe ale ficatului, hemoliză  nivel crescut: boli renale, boli inflamatoare acute sau cronice (poliartrită reumatoidă, boli cu complexe imune circulante)

Beta Globulinele  nivel scăzut – malnutriţie, insuficienţă hepatică, ciroză, scăderea fracţiunii C3 a complementului, asociată cu o scădere a fracţiunii beta-2  nivel crescut- hipercolesterolemie, anemie feriprivă, dislipidemii, sindrom Cushing, gamapatii monoclonale, hepatite toxice, ciroza, sindrom nefrotic

Beta Globulinele  nivel scăzut – malnutriţie, insuficienţă hepatică, ciroză, scăderea fracţiunii C3 a complementului, asociată cu o scădere a fracţiunii beta-2  nivel crescut- hipercolesterolemie, anemie feriprivă, dislipidemii, sindrom Cushing, gamapatii monoclonale, hepatite toxice, ciroza, sindrom nefrotic

Gama Globulinele  nivel scăzut – anumite disfuncţionalităţi imunogenetice şi deficienţă imună secundară  nivel crescut a) policlonal în: afecţiuni inflamatoare cronice (artrită reumatoidă, colagenoze, parazitoze, infecţii bacteriene); b) monoclonal în macroglobulinemie, mielom multiplu, alte gamapatii  estomparea sau absenţa benzii gama sugerează un deficit imun (hipo- sau agamaglobulinemie). Electroforeza proteinelor se efectuează aşadar când se doreşte investigarea nu doar a nivelului total al proteinelor serice, ci şi vizualizarea fracţiilor acestora, mai ales ȋn contextul unor simptome asociate (dureri articulare, oboseală, fracturi, infecţii repetate) ce pot sugera boli mieloproliferative cu producţie de proteine anormale (paraproteine). De asemenea, cunoaşterea nivelului fracţiilor proteice din ser poate aduce

Gama Globulinele  nivel scăzut – anumite disfuncţionalităţi imunogenetice şi deficienţă imună secundară  nivel crescut a) policlonal în: afecţiuni inflamatoare cronice (artrită reumatoidă, colagenoze, parazitoze, infecţii bacteriene); b) monoclonal în macroglobulinemie, mielom multiplu, alte gamapatii  estomparea sau absenţa benzii gama sugerează un deficit imun (hipo- sau agamaglobulinemie). Electroforeza proteinelor se efectuează aşadar când se doreşte investigarea nu doar a nivelului total al proteinelor serice, ci şi vizualizarea fracţiilor acestora, mai ales ȋn contextul unor simptome asociate (dureri articulare, oboseală, fracturi, infecţii repetate) ce pot sugera boli mieloproliferative cu producţie de proteine anormale (paraproteine). De asemenea, cunoaşterea nivelului fracţiilor proteice din ser poate aduce

29

29

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

elemente importante ȋn diagnosticul unor maladii care se asociază cu creşteri sau reduceri semnificative ale nivelului unora dintre acestea.

elemente importante ȋn diagnosticul unor maladii care se asociază cu creşteri sau reduceri semnificative ale nivelului unora dintre acestea.

3.3. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

3.3. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Consideraţii generale asupra tehnicii ELISA

Consideraţii generale asupra tehnicii ELISA

Testele imunoenzimatice de tip ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) sunt concepute pentru detectarea şi cuantificarea de substanţe precum peptide, proteine, anticorpi şi hormoni. Tehnica ELISA, constă ȋn imobilizarea unui antigen la o suprafaţă solidă şi apoi complexarea cu un anticorp care este legat la o enzimă. Detectarea se efectuează prin evaluarea activităţii enzimei conjugat, prin incubare cu un substrat, pentru a realiza o cuantificare a produsului. Elementul cel mai important al strategiei de detectare ȋl constituie specificitatea ȋnaltă a interacţiunii anticorp-antigen. Protocolul de detectare cantitativă ELISA este de obicei efectuat în plăci de polistiren cu 96 de godeuri care vor lega pasiv anticorpi si proteine. Existenţa reactanţilor ELISA imobilizaţi la suprafaţa microplăcilor facilitează separarea materialului legat de material nelegat în timpul testului. Detecţia se va realiza printr-o enzimă legată direct la nivelul anticorpului primar, sau printr-un anticorp secundar care recunoaşte anticorpul primar. De asemenea, enzima poate fi legată de o proteină, cum ar fi streptavidina, mai ales ȋn cazul ȋn care anticorpul primar este marcat cu biotină. Cele mai frecvent utilizate enzime sunt peroxidaza din hrean (HRP) şi fosfataza alcalină (AP), alte enzime fiind doar cu utilizare restrictivă având ȋn vedere opţiunile limitate pentru substrat (β-galactozidaza, acetilcolinesteraza, catalaza). O gamă largă de substrate este disponibilă pentru efectuarea ELISA cu un HRP sau conjugat AP. Alegerea substratului depinde de sensibilitatea analizei şi a instrumentelor disponibile pentru detectarea şi ȋnregistrarea semnalului (spectrofotometru, fluorimetru sau luminometru). Protocoalele ELISA pot fi modificate, prin completări la procedura de bază, momentul cheie, de imobilizare a antigenului de interes, putând fi realizat direct prin adsorbţie la placă sau indirect, prin intermediul unui anticorp de captare, care a fost ataşat la placă (plăcile sunt deja impregnate cu acest anticorp). Antigenul este apoi detectat fie direct (anticorpi primari) sau indirect (anticorpi secundari). Cel mai sensibil procedeu ELISA este aşa

Testele imunoenzimatice de tip ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) sunt concepute pentru detectarea şi cuantificarea de substanţe precum peptide, proteine, anticorpi şi hormoni. Tehnica ELISA, constă ȋn imobilizarea unui antigen la o suprafaţă solidă şi apoi complexarea cu un anticorp care este legat la o enzimă. Detectarea se efectuează prin evaluarea activităţii enzimei conjugat, prin incubare cu un substrat, pentru a realiza o cuantificare a produsului. Elementul cel mai important al strategiei de detectare ȋl constituie specificitatea ȋnaltă a interacţiunii anticorp-antigen. Protocolul de detectare cantitativă ELISA este de obicei efectuat în plăci de polistiren cu 96 de godeuri care vor lega pasiv anticorpi si proteine. Existenţa reactanţilor ELISA imobilizaţi la suprafaţa microplăcilor facilitează separarea materialului legat de material nelegat în timpul testului. Detecţia se va realiza printr-o enzimă legată direct la nivelul anticorpului primar, sau printr-un anticorp secundar care recunoaşte anticorpul primar. De asemenea, enzima poate fi legată de o proteină, cum ar fi streptavidina, mai ales ȋn cazul ȋn care anticorpul primar este marcat cu biotină. Cele mai frecvent utilizate enzime sunt peroxidaza din hrean (HRP) şi fosfataza alcalină (AP), alte enzime fiind doar cu utilizare restrictivă având ȋn vedere opţiunile limitate pentru substrat (β-galactozidaza, acetilcolinesteraza, catalaza). O gamă largă de substrate este disponibilă pentru efectuarea ELISA cu un HRP sau conjugat AP. Alegerea substratului depinde de sensibilitatea analizei şi a instrumentelor disponibile pentru detectarea şi ȋnregistrarea semnalului (spectrofotometru, fluorimetru sau luminometru). Protocoalele ELISA pot fi modificate, prin completări la procedura de bază, momentul cheie, de imobilizare a antigenului de interes, putând fi realizat direct prin adsorbţie la placă sau indirect, prin intermediul unui anticorp de captare, care a fost ataşat la placă (plăcile sunt deja impregnate cu acest anticorp). Antigenul este apoi detectat fie direct (anticorpi primari) sau indirect (anticorpi secundari). Cel mai sensibil procedeu ELISA este aşa

30

30

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

numitul test „sandwich” numit astfel, datorită faptului că analitul care urmează să fie măsurat este legat între doi anticorpi: de captare şi de detectare. ELISA poate fi efectuat de asemenea şi ca un test competitiv, mai ales ȋn cazul antigenelor de talie mică şi care prezintă un singur epitop sau situs de legare al anticorpului. Una din variantele acestei metode constă în marcarea cu antigen purificat în loc de anticorp, ȋn care, antigenul nemarcat (din probă) şi antigenul marcat intră în competiţie pentru legarea la anticorpul de captare. O scădere a semnalului pentru antigen purificat indică prezenţa antigenului în probe, cuantificarea semnalului fiind realizată comparativ cu nivelul din godeurile ce prezintă doar antigenul marcat. Substanţele fluorescente reprezintă de asemeni o alternativă la detecţia dependentă de enzime ȋn cadrul determinărilor cantitative ale analiţilor. Metoda directă de detectare ELISA utilizează un anticorp primar marcat care reacţionează direct cu antigenul. Detectarea directă poate fi efectuată cu antigen imobilizat direct pe placă sau prin testul de captare. Modalitatea directă de analiză nu este utilizată pe scară largă în ELISA, dar este destul de comună pentru coloraţia imunohistochimică de ţesuturi şi celule. Metoda de detecţie indirectă, mai populară ȋntre procedeele ELISA utilizează un anticorp secundar marcat specific pentru anticorpul primar (nu şi pentru anticorpul de captură, ȋn general acest lucru fiind realizat prin utilizarea de anticorpi primari şi de captare din specii diferite). Modelul sandwich măsoară cantitatea de antigen între două straturi de anticorpi. Antigenele ce urmează să fie măsurate trebuie să conţină cel puţin două situsuri antigenice, capabile de legare a anticorpilor, având ȋn vedere utilizarea celor doi anticorpi în sandwich. Acest procedeu este aşadar limitat la cuantificarea de antigene multivalente, cum ar fi proteine sau polizaharide. Etapa finală în toate sistemele ELISA este aceea de detectare, realizată de regulă cu ajutorul enzimelor care vor transforma substratul ȋntrun produs detectabil (cu excepţia cazului în care se folosesc markeri radioactivi sau fluorescenţi). Un procedeu ELISA corect implementat, va asigura o proporţionalitate directă şi corectă a intensităţii semnalului ȋnregistrat (odată cu adăugarea substratului) cu cantitatea de antigen capturat şi legat de reactivi de detectare. Anticorpii enzimă-conjugat (în special care implică peroxidaza HRP) oferă cea mai mare flexibilitate în metodele de detecţie ELISA. Aceasta se datorează existenţei unei palete largi şi variate

numitul test „sandwich” numit astfel, datorită faptului că analitul care urmează să fie măsurat este legat între doi anticorpi: de captare şi de detectare. ELISA poate fi efectuat de asemenea şi ca un test competitiv, mai ales ȋn cazul antigenelor de talie mică şi care prezintă un singur epitop sau situs de legare al anticorpului. Una din variantele acestei metode constă în marcarea cu antigen purificat în loc de anticorp, ȋn care, antigenul nemarcat (din probă) şi antigenul marcat intră în competiţie pentru legarea la anticorpul de captare. O scădere a semnalului pentru antigen purificat indică prezenţa antigenului în probe, cuantificarea semnalului fiind realizată comparativ cu nivelul din godeurile ce prezintă doar antigenul marcat. Substanţele fluorescente reprezintă de asemeni o alternativă la detecţia dependentă de enzime ȋn cadrul determinărilor cantitative ale analiţilor. Metoda directă de detectare ELISA utilizează un anticorp primar marcat care reacţionează direct cu antigenul. Detectarea directă poate fi efectuată cu antigen imobilizat direct pe placă sau prin testul de captare. Modalitatea directă de analiză nu este utilizată pe scară largă în ELISA, dar este destul de comună pentru coloraţia imunohistochimică de ţesuturi şi celule. Metoda de detecţie indirectă, mai populară ȋntre procedeele ELISA utilizează un anticorp secundar marcat specific pentru anticorpul primar (nu şi pentru anticorpul de captură, ȋn general acest lucru fiind realizat prin utilizarea de anticorpi primari şi de captare din specii diferite). Modelul sandwich măsoară cantitatea de antigen între două straturi de anticorpi. Antigenele ce urmează să fie măsurate trebuie să conţină cel puţin două situsuri antigenice, capabile de legare a anticorpilor, având ȋn vedere utilizarea celor doi anticorpi în sandwich. Acest procedeu este aşadar limitat la cuantificarea de antigene multivalente, cum ar fi proteine sau polizaharide. Etapa finală în toate sistemele ELISA este aceea de detectare, realizată de regulă cu ajutorul enzimelor care vor transforma substratul ȋntrun produs detectabil (cu excepţia cazului în care se folosesc markeri radioactivi sau fluorescenţi). Un procedeu ELISA corect implementat, va asigura o proporţionalitate directă şi corectă a intensităţii semnalului ȋnregistrat (odată cu adăugarea substratului) cu cantitatea de antigen capturat şi legat de reactivi de detectare. Anticorpii enzimă-conjugat (în special care implică peroxidaza HRP) oferă cea mai mare flexibilitate în metodele de detecţie ELISA. Aceasta se datorează existenţei unei palete largi şi variate

31

31

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

de substrate disponibile pentru detectări cromogenice, chemifluorescente şi chemiluminiscente. Deşi nu la fel de sensibile ca cele fluorescente sau chemiluminiscente, substratele cromogenice ELISA permit vizualizarea directă şi permit efectuarea de studii cinetice. Substratele fluorescente ELISA nu sunt la fel de comune şi necesită un fluorometru care produce un fasciculul de excitaţie corespunzător, capabil de a provoca emisia semnalului generat de agentul fluorescent.

de substrate disponibile pentru detectări cromogenice, chemifluorescente şi chemiluminiscente. Deşi nu la fel de sensibile ca cele fluorescente sau chemiluminiscente, substratele cromogenice ELISA permit vizualizarea directă şi permit efectuarea de studii cinetice. Substratele fluorescente ELISA nu sunt la fel de comune şi necesită un fluorometru care produce un fasciculul de excitaţie corespunzător, capabil de a provoca emisia semnalului generat de agentul fluorescent.

Comparaţie ȋntre metoda ELISA directă şi indirectă

Comparaţie ȋntre metoda ELISA directă şi indirectă

 Rapidă, deoarece sunt folosite doar un anticorp şi mai Avantaje

 Rapidă, deoarece sunt folosite doar un anticorp şi mai

puţini paşi

Avantaje

 Nu există posibilitatea de reactivitate încrucişată cu

puţini paşi

 Nu există posibilitatea de reactivitate încrucişată cu

anticorpul secundar

Metoda Directă Dezavantaje

 Imunoreactivitatea anticorpului primar ar putea fi afectată negativ prin marcarea cu enzime sau alţi agenţi de marcare  Marcarea anticorpilor primari pentru fiecare sistem specific ELISA este laborioasă ca timp şi costisitoare.  Lipsa de flexibilitate în alegerea agentului de marcare pentru anticorpul primar de la un experiment la altul  Amplificarea semnalului este minimă  

Avantaje



Metoda Indirectă

 

Dezavantaje 

Varietate de anticorpi secundari marcaţi Imunoreactivitatea maximală a anticorpilor primari este conservată deoarece nu este marcat Sensibilitate crescută, deoarece fiecare anticorp primar conţine mai mulţi epitopi care pot fi legaţi de către anticorpii secundari marcaţi, permiţând amplificarea semnalului. Pot fi folosiţi markeri de vizualizare diferiţi pentru acelaşi anticorp primar Posibilitate de ȋnregistrare a unor semnale nespecifice datorită probabilităţii reacţiilor încrucişate cu anticorpi secundari Necesită o etapă suplimentară de incubare

32

anticorpul secundar

Metoda Directă Dezavantaje

 Imunoreactivitatea anticorpului primar ar putea fi afectată negativ prin marcarea cu enzime sau alţi agenţi de marcare  Marcarea anticorpilor primari pentru fiecare sistem specific ELISA este laborioasă ca timp şi costisitoare.  Lipsa de flexibilitate în alegerea agentului de marcare pentru anticorpul primar de la un experiment la altul  Amplificarea semnalului este minimă  

Avantaje



Metoda Indirectă

 

Dezavantaje 

Varietate de anticorpi secundari marcaţi Imunoreactivitatea maximală a anticorpilor primari este conservată deoarece nu este marcat Sensibilitate crescută, deoarece fiecare anticorp primar conţine mai mulţi epitopi care pot fi legaţi de către anticorpii secundari marcaţi, permiţând amplificarea semnalului. Pot fi folosiţi markeri de vizualizare diferiţi pentru acelaşi anticorp primar Posibilitate de ȋnregistrare a unor semnale nespecifice datorită probabilităţii reacţiilor încrucişate cu anticorpi secundari Necesită o etapă suplimentară de incubare

32

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Tehnica ELISA

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Tehnica ELISA

1. Anticorpul de captare este mai ȋntâi diluat în 0.1M tampon bicarbonat, pH 9.2 şi se adaugă apoi câte 50 μl în fiecare godeu al plăcii. 2. Placa coafată cu anticorpi se acoperă cu parafină şi se incubează peste noapte la rece, într-o cutie care conţine hârtie umedă sau, la temperatura camerei şi umiditate timp de două ore. 3. Placa este golită şi locurile neocupate sunt blocate cu 100 µl de tampon de blocare conţinând 100 mM tampon fosfat, pH 7,2, 1% BSA (albumină bovină serică), 0,5% Tween-20 şi Thimerosol 0,02% pentru 30 min la temperatura camerei. 4. Placa este golită şi spălată de trei ori cu tampon de spălare (100 mM tampon fosfat, 150 mM NaCl, BSA 0,2% şi 0,5% Tween 20). 5. Soluţia de antigen este mai ȋntâi diluată în tampon (100 mM tampon fosfat, 150mM NaCl) şi apoi adaugată ȋn placă într-un volum de 50 μl pe godeu. Placa se incubează la temperatura camerei timp de 45 de minute (până la o oră). 6. Se goleşte placa din nou şi se spală de trei ori cu tampon de spălare. 7. Enzima marcată cu anticorp (împotriva antigenului specific) este diluată în mod corespunzător în 0.1M tampon bicarbonat, pH 9.2, după care câte 50 μl se adaugă în fiecare godeu, cu incubare la temperatura camerei timp de 30 min. 8. Placa este golită din nou şi spălată de trei ori cu tampon de spălare. 9. Se măsoară intensitatea culorii obţinute după adăugarea sistemului de dezvoltare a reacţiei de culoare.

1. Anticorpul de captare este mai ȋntâi diluat în 0.1M tampon bicarbonat, pH 9.2 şi se adaugă apoi câte 50 μl în fiecare godeu al plăcii. 2. Placa coafată cu anticorpi se acoperă cu parafină şi se incubează peste noapte la rece, într-o cutie care conţine hârtie umedă sau, la temperatura camerei şi umiditate timp de două ore. 3. Placa este golită şi locurile neocupate sunt blocate cu 100 µl de tampon de blocare conţinând 100 mM tampon fosfat, pH 7,2, 1% BSA (albumină bovină serică), 0,5% Tween-20 şi Thimerosol 0,02% pentru 30 min la temperatura camerei. 4. Placa este golită şi spălată de trei ori cu tampon de spălare (100 mM tampon fosfat, 150 mM NaCl, BSA 0,2% şi 0,5% Tween 20). 5. Soluţia de antigen este mai ȋntâi diluată în tampon (100 mM tampon fosfat, 150mM NaCl) şi apoi adaugată ȋn placă într-un volum de 50 μl pe godeu. Placa se incubează la temperatura camerei timp de 45 de minute (până la o oră). 6. Se goleşte placa din nou şi se spală de trei ori cu tampon de spălare. 7. Enzima marcată cu anticorp (împotriva antigenului specific) este diluată în mod corespunzător în 0.1M tampon bicarbonat, pH 9.2, după care câte 50 μl se adaugă în fiecare godeu, cu incubare la temperatura camerei timp de 30 min. 8. Placa este golită din nou şi spălată de trei ori cu tampon de spălare. 9. Se măsoară intensitatea culorii obţinute după adăugarea sistemului de dezvoltare a reacţiei de culoare.

Model de evaluare a concentraţiei IL-1 ȋn fluidul gingival (GCF)

Model de evaluare a concentraţiei IL-1 ȋn fluidul gingival (GCF)

Metoda imunoenzimatică ELISA de determinre a nivelelor IL-1B se bazează pe reacţia dintre enzima streptavidin-peroxidază şi substratul tetrametilbenzidină (TMB), iar ca şi conjugant biotina. Testul este foarte specific, neprezentând reactivitate încrucişată cu IL-1A, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, SCF, IFN-, TNF- sau TNF-β umane.

Metoda imunoenzimatică ELISA de determinre a nivelelor IL-1B se bazează pe reacţia dintre enzima streptavidin-peroxidază şi substratul tetrametilbenzidină (TMB), iar ca şi conjugant biotina. Testul este foarte specific, neprezentând reactivitate încrucişată cu IL-1A, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, SCF, IFN-, TNF- sau TNF-β umane.

Metoda ELISA utilizată pentru determinarea IL-1β include un cititor de plăci ELISA şi un kit ELISA “Human Interleukin-1β (hIL-1β)”.

Metoda ELISA utilizată pentru determinarea IL-1β include un cititor de plăci ELISA şi un kit ELISA “Human Interleukin-1β (hIL-1β)”.

33

33

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Metoda de determinare se bazează pe reacţia dintre enzima streptavidin-peroxidază şi substratul tetrametilbenzidină (TMB), iar ca şi conjugant biotina. Pe scurt, protocolul de lucru, respectând strict toate indicaţiile producătorului de utilizare a kitului, constă ȋn următorii paşi:

Metoda de determinare se bazează pe reacţia dintre enzima streptavidin-peroxidază şi substratul tetrametilbenzidină (TMB), iar ca şi conjugant biotina. Pe scurt, protocolul de lucru, respectând strict toate indicaţiile producătorului de utilizare a kitului, constă ȋn următorii paşi:

1. Se adaugă câte 50 l din standarde, probe şi controale în godeurile plăcilor de test, în acord cu indicaţiile de utilizare. Fracţiunile de 50 l ale probelor se scot de la congelator (-70o C) cu extrem de puţin timp înainte de utilizare. 2. Se adaugă câte 50 l de anticorpi specifici anti-IL-1β, conjugaţi cu biotină în fiecare godeu. 3. Se incubează la temperatura camerei timp de 1 oră. 4. Se aspiră şi se spală godeurile de 4 ori cu tamponul de spălare din kit. 5. Se adaugă câte 100 l de conjugat streptavidină-HRP în fiecare godeu. 6. Se incubează 30 minute la temperatura camerei. 7. Se aspiră şi se spală godeurile de 4 ori cu tamponul de spălare din kit. 8. Se adaugă câte 100 l de cromogen stabilizat în fiecare godeu. 9. Se incubează 25 minute la temperatura camerei şi la întuneric. 10. Se adaugă câte 100 l de tampon “stop” în fiecare godeu. 11. Se citeşte absorbanţa la 450 nm. Drept standard se foloseşte o soluţie din cromogen şi tampon “stop”. Citirea se realizează în cel mult 2 ore de la adăugarea tamponului “stop”. 12. Se construieşte (utilizând un soft) curba standard, respectiv absorbanţa standardelor (densitatea optică, O.D.) versus concentraţia standard. 13. Se determină, utilizând curba standard optimă, valorile hIL-1β din probe şi controale.

1. Se adaugă câte 50 l din standarde, probe şi controale în godeurile plăcilor de test, în acord cu indicaţiile de utilizare. Fracţiunile de 50 l ale probelor se scot de la congelator (-70o C) cu extrem de puţin timp înainte de utilizare. 2. Se adaugă câte 50 l de anticorpi specifici anti-IL-1β, conjugaţi cu biotină în fiecare godeu. 3. Se incubează la temperatura camerei timp de 1 oră. 4. Se aspiră şi se spală godeurile de 4 ori cu tamponul de spălare din kit. 5. Se adaugă câte 100 l de conjugat streptavidină-HRP în fiecare godeu. 6. Se incubează 30 minute la temperatura camerei. 7. Se aspiră şi se spală godeurile de 4 ori cu tamponul de spălare din kit. 8. Se adaugă câte 100 l de cromogen stabilizat în fiecare godeu. 9. Se incubează 25 minute la temperatura camerei şi la întuneric. 10. Se adaugă câte 100 l de tampon “stop” în fiecare godeu. 11. Se citeşte absorbanţa la 450 nm. Drept standard se foloseşte o soluţie din cromogen şi tampon “stop”. Citirea se realizează în cel mult 2 ore de la adăugarea tamponului “stop”. 12. Se construieşte (utilizând un soft) curba standard, respectiv absorbanţa standardelor (densitatea optică, O.D.) versus concentraţia standard. 13. Se determină, utilizând curba standard optimă, valorile hIL-1β din probe şi controale.

34

34

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Figura 3. Curba standard pentru testul ELISA hIL-1β

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Figura 3. Curba standard pentru testul ELISA hIL-1β

O privire sintetică asupra testului ELISA hIL-1β este redată ȋn schema:

O privire sintetică asupra testului ELISA hIL-1β este redată ȋn schema:

Figura 4. Privire sintetică asupra protocolului ELISA de determinare a hIL-1β

Figura 4. Privire sintetică asupra protocolului ELISA de determinare a hIL-1β

35

35

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

3.4. TEHNICA DE CITOMETRIE ÎN FLUX (FCM) Principii teoretice şi practice

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

3.4. TEHNICA DE CITOMETRIE ÎN FLUX (FCM) Principii teoretice şi practice

Citometria în flux (flow-citometria) permite analiza multiparametrică, rapidă, a celulelor marcate fluorescent. Tehnica se bazează pe capacitatea substanţelor fluorescente (fluorocromi) de a emite semnale luminoase cu lungimi de undă particulare, consecutiv excitării lor cu fascicule laser. Determinarea intensităţii semnalelor optice emise este realizată prin intermediul unui citometru, sistem analizor complex ce combină componente optice, fluidice şi electronice pentru corelarea semnalelor optice emise de celule cu parametrii celulari de interes (Zola, 2000).

Citometria în flux (flow-citometria) permite analiza multiparametrică, rapidă, a celulelor marcate fluorescent. Tehnica se bazează pe capacitatea substanţelor fluorescente (fluorocromi) de a emite semnale luminoase cu lungimi de undă particulare, consecutiv excitării lor cu fascicule laser. Determinarea intensităţii semnalelor optice emise este realizată prin intermediul unui citometru, sistem analizor complex ce combină componente optice, fluidice şi electronice pentru corelarea semnalelor optice emise de celule cu parametrii celulari de interes (Zola, 2000).

Aplicaţiile citometriei în flux - sunt vaste: Metode semicantitative (procente de pozitivitate):  imunofenotipare  viabilitate celulară/ apoptoză  proliferare celulară  detecţie de citokine intra-celulare  ciclu celular Metode cantitative, similare tehnicii ELISA  măsurarea nivelelor de factori solubili prezenţi în plasmă/ ser  măsurarea proteinelor fosforilate prezente în lizate celulare Substanţele fluorescente folosite pentru marcare diferă în funcţie de două caracteristici majore: lungimea de undă la care pot fi excitate şi lungimea de undă a semnalului optic emis (tabelul 1). Cele mai frecvent utilizate citometre sunt prevăzut cu două lasere, un laser de Argon, ce emite la 488 nm şi o fotodiodă cu emisie la 635 nm. Existenţa celor două lasere, precum şi a unui ansamblu de filtre optice şi detectori, permite analiza concomitentă a 6 parametri: parametrii morfologici (volumul şi granularitatea celulelor) şi patru markeri celulari distincţi legaţi de tipul de fluorescenţă emisă (fluorescenţa FL 1, FL 2, FL 3, FL 4). Parametrii celulari pot fi afişati ulterior pe coordonate lineare sau logaritmice, în grafice mono – parametrice (histograme) sau bi – parametrice.

Aplicaţiile citometriei în flux - sunt vaste: Metode semicantitative (procente de pozitivitate):  imunofenotipare  viabilitate celulară/ apoptoză  proliferare celulară  detecţie de citokine intra-celulare  ciclu celular Metode cantitative, similare tehnicii ELISA  măsurarea nivelelor de factori solubili prezenţi în plasmă/ ser  măsurarea proteinelor fosforilate prezente în lizate celulare Substanţele fluorescente folosite pentru marcare diferă în funcţie de două caracteristici majore: lungimea de undă la care pot fi excitate şi lungimea de undă a semnalului optic emis (tabelul 1). Cele mai frecvent utilizate citometre sunt prevăzut cu două lasere, un laser de Argon, ce emite la 488 nm şi o fotodiodă cu emisie la 635 nm. Existenţa celor două lasere, precum şi a unui ansamblu de filtre optice şi detectori, permite analiza concomitentă a 6 parametri: parametrii morfologici (volumul şi granularitatea celulelor) şi patru markeri celulari distincţi legaţi de tipul de fluorescenţă emisă (fluorescenţa FL 1, FL 2, FL 3, FL 4). Parametrii celulari pot fi afişati ulterior pe coordonate lineare sau logaritmice, în grafice mono – parametrice (histograme) sau bi – parametrice.

36

36

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

Fluorocrom

Excitatie

Emisie

Fluorocrom

Excitatie

Emisie

FITC (izotiocianat de fluoresceina)

488 nm

517 nm

FITC (izotiocianat de fluoresceina)

488 nm

517 nm

PE (ficoeritrina)

488 nm

578 nm

PE (ficoeritrina)

488 nm

578 nm

CyCr (cianat de crom)

488 nm

675 nm

CyCr (cianat de crom)

488 nm

675 nm

APC* (aloficocianina)

635 nm

655-660 nm

APC* (aloficocianina)

635 nm

655-660 nm

Calcein-AM

490nm

520nm

Calcein-AM

490nm

520nm

JC1

490nm

530-590nm

JC1

490nm

530-590nm

Tabelul 1. Substanţele fluorescente folosite pentru marcarea anticorpilor monoclonali si caracteristicile lor optice Principiul citometriei în flux continuu

2010

Tabelul 1. Substanţele fluorescente folosite pentru marcarea anticorpilor monoclonali si caracteristicile lor optice Principiul citometriei în flux continuu

Un fascicul de lumină (lumina laser, de obicei) dintr-o singură lungime de undă este direcţionat pe un flux de lichid concentrat hidrodinamic. O serie de detectori sunt îndreptaţi înspre punctul în care fluxul trece prin fascicul de lumină: unul, în conformitate cu fascicul de lumină cu dispersia pe direcţia înainte (Forward Scatter) şi fasciculul de lumină cu dispersia perpendiculară (Side Scatter). Fiecare particulă de dimensiuni de la 0.2 - 150 micrometri ce trece prin fasciculul de lumină si substanţele chimice fluorescente găsite în particule sau ataşate de particule pot fi excitate să emită lumină la o lungime de undă mai mare decât sursa de lumină. Această combinaţie de lumină fluorescentă şi lumină dispersată este preluată de către detectoare şi prin analizarea fluctuaţiilor de luminozitate, la fiecare detector, după care este posibilă obţinerea diferitelor tipuri de informaţii despre structura fizică şi chimică a fiecărei particule individuale. FSC este corelat cu volumul celulelor si SSC depinde de complexitatea interioară a particulei (Givan A. 2001).

Un fascicul de lumină (lumina laser, de obicei) dintr-o singură lungime de undă este direcţionat pe un flux de lichid concentrat hidrodinamic. O serie de detectori sunt îndreptaţi înspre punctul în care fluxul trece prin fascicul de lumină: unul, în conformitate cu fascicul de lumină cu dispersia pe direcţia înainte (Forward Scatter) şi fasciculul de lumină cu dispersia perpendiculară (Side Scatter). Fiecare particulă de dimensiuni de la 0.2 - 150 micrometri ce trece prin fasciculul de lumină si substanţele chimice fluorescente găsite în particule sau ataşate de particule pot fi excitate să emită lumină la o lungime de undă mai mare decât sursa de lumină. Această combinaţie de lumină fluorescentă şi lumină dispersată este preluată de către detectoare şi prin analizarea fluctuaţiilor de luminozitate, la fiecare detector, după care este posibilă obţinerea diferitelor tipuri de informaţii despre structura fizică şi chimică a fiecărei particule individuale. FSC este corelat cu volumul celulelor si SSC depinde de complexitatea interioară a particulei (Givan A. 2001).

37

37

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Figura 5 ilustrează segregarea semnalelor optice provenite de la celule marcate fluorescent, iar în figura 6 este reprezentat principiul general al tehnicii şi modul de prelucrare a informaţiilor sub formă de histograme sau grafice bi-parametrice.

Figura 5 ilustrează segregarea semnalelor optice provenite de la celule marcate fluorescent, iar în figura 6 este reprezentat principiul general al tehnicii şi modul de prelucrare a informaţiilor sub formă de histograme sau grafice bi-parametrice.

Figura 5. Tehnica de citometrie în flux: segregarea semnalelor optice provenite de la moleculele marcate fluorescent, pentru detectarea lor separată (dupa Zola, 2000) (SSC = detector de granularitate celulara, FSC = detector de volum celular, FL = detector de fluorescente; LP = filtre “long pass” – transparente pentru lungimi de undă mai mari de “x” nm; SP = filtre “short pass” – transparente pentru lungimi de undă mai mici de “y” nm).

Figura 5. Tehnica de citometrie în flux: segregarea semnalelor optice provenite de la moleculele marcate fluorescent, pentru detectarea lor separată (dupa Zola, 2000) (SSC = detector de granularitate celulara, FSC = detector de volum celular, FL = detector de fluorescente; LP = filtre “long pass” – transparente pentru lungimi de undă mai mari de “x” nm; SP = filtre “short pass” – transparente pentru lungimi de undă mai mici de “y” nm).

38

38

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Figura 6. Tehnica de citometrie ȋn flux: principiul general al metodei şi prelucrarea informaţiilor sub formă de grafice; (dupa Abbas şi colab., 2000). SSC = detector de granularitate celulară, FSC = detector de volum celular, FL = detector de fluorescente Determinarea flow-citometrică a celulelor ȋn apoptoză

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Figura 6. Tehnica de citometrie ȋn flux: principiul general al metodei şi prelucrarea informaţiilor sub formă de grafice; (dupa Abbas şi colab., 2000). SSC = detector de granularitate celulară, FSC = detector de volum celular, FL = detector de fluorescente Determinarea flow-citometrică a celulelor ȋn apoptoză

Studiul apoptozei, sau morţii celulare programate, reprezintă una dintre cele mai actuale arii de cercetare ale biologiei moderne. Apoptoza reprezintă un proces multistadial caracterizat printr-o cascadă de evenimente ce duc la înmugurirea membranei celulare, diminuarea volumului celular, fragmentarea proteinelor celulare, condensarea cromatinei şi clivajul ADNlui (Vermes şi colab., 2000). Evidenţierea celulelor apoptotice poate fi realizată în oricare din aceste stadii. Una dintre etapele cele mai timpurii ale

Studiul apoptozei, sau morţii celulare programate, reprezintă una dintre cele mai actuale arii de cercetare ale biologiei moderne. Apoptoza reprezintă un proces multistadial caracterizat printr-o cascadă de evenimente ce duc la înmugurirea membranei celulare, diminuarea volumului celular, fragmentarea proteinelor celulare, condensarea cromatinei şi clivajul ADNlui (Vermes şi colab., 2000). Evidenţierea celulelor apoptotice poate fi realizată în oricare din aceste stadii. Una dintre etapele cele mai timpurii ale

39

39

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

procesului de apoptoză este pierderea integrităţii membranare, ceea ce duce la translocarea unor grupări de fosfatidil serină de pe suprafaţa citoplasmatică a membranei, la exterior. Apoptoza poate fi definită ca ansamblul reacţiilor biochimice care au loc la nivelul celulei culminând cu moartea acesteia, într-o formă ordonată si silenţioasă. Celula apoptotică suferă o serie de modificări morfologice: alterarea membranei plasmatice cu apariţia fenomenului de pustulizare (blebbing), reducerea considerabilă a volumului celular, condensarea citoplasmei. De asemenea au loc modificări la nivel nuclear: cromatina se condensează şi în final se împarte în mai multe fragmente sferice. Celula apoptotică este fagocitată de către macrofage sau de către celule învecinate, fiind astfel evitat răspunsul inflamator local care apare în cazul producerii necrozei, când celula îşi eliberează conţinutul în mediu.

procesului de apoptoză este pierderea integrităţii membranare, ceea ce duce la translocarea unor grupări de fosfatidil serină de pe suprafaţa citoplasmatică a membranei, la exterior. Apoptoza poate fi definită ca ansamblul reacţiilor biochimice care au loc la nivelul celulei culminând cu moartea acesteia, într-o formă ordonată si silenţioasă. Celula apoptotică suferă o serie de modificări morfologice: alterarea membranei plasmatice cu apariţia fenomenului de pustulizare (blebbing), reducerea considerabilă a volumului celular, condensarea citoplasmei. De asemenea au loc modificări la nivel nuclear: cromatina se condensează şi în final se împarte în mai multe fragmente sferice. Celula apoptotică este fagocitată de către macrofage sau de către celule învecinate, fiind astfel evitat răspunsul inflamator local care apare în cazul producerii necrozei, când celula îşi eliberează conţinutul în mediu.

Detecţia apoptozei prin marcarea celulelor cu anexina V/ iodura de propidiu

Detecţia apoptozei prin marcarea celulelor cu anexina V/ iodura de propidiu

Calceina-AM (acetoximetil esterul calceinei) este un marker fluorescent cu emisie în verde, utilizat pe scară largă pentru evidenţierea deschiderii porului de permeabilitate tranzitorie mitocondrială (PTM). Calceina-AM (o moleculă nefluorescentă) difuzează pasiv prin membrana celulelor vii, acumulându-se în compartimentele citosolice, inclusiv în mitocondrii. Datorită acestei proprietăţi, calceina-AM reprezintă un instrument foarte util pentru studiul integrităţii membranelor celulare, iar toxicitatea sa foarte redusă face din acest fluorofor opţiunea de elecţie pentru experimentele de lungă durată. La nivel intracelular acetoximetil esterii sunt hidrolizaţi prin acţiunea esterazelor endogene, eliberând calceina polarizată negativ, intens fluorescentă (emisie în verde), care este reţinută în compartimentele citoplasmatice ale celulelor vii. Pentru a estompa semnalul fluorescent citoplasmatic celulele se incubează cu CoCl2, care nu însă nu afectează intensitatea semnalului de la nivel mitocondrial. Viabilitatea celulară poate fi evaluată fie prin modificări morfologice, fie prin modificări ale permeabilităţii membranei plasmatice sau a statusului fiziologic, relevate prin excluderea anumitori fluorofori sau acumularea şi retenţia altora. Marcarea celulelor cu iodură de propidiu (IP) este o metodă de evaluare a viabilităţii, bazată pe excluderea fluoroforului din celulele vii, fapt ce indică păstrarea integrităţii membranei plasmatice. Colorarea celulelor neviabile cu iodură de propidiu (IP) este aplicabilă la majoritatea

Calceina-AM (acetoximetil esterul calceinei) este un marker fluorescent cu emisie în verde, utilizat pe scară largă pentru evidenţierea deschiderii porului de permeabilitate tranzitorie mitocondrială (PTM). Calceina-AM (o moleculă nefluorescentă) difuzează pasiv prin membrana celulelor vii, acumulându-se în compartimentele citosolice, inclusiv în mitocondrii. Datorită acestei proprietăţi, calceina-AM reprezintă un instrument foarte util pentru studiul integrităţii membranelor celulare, iar toxicitatea sa foarte redusă face din acest fluorofor opţiunea de elecţie pentru experimentele de lungă durată. La nivel intracelular acetoximetil esterii sunt hidrolizaţi prin acţiunea esterazelor endogene, eliberând calceina polarizată negativ, intens fluorescentă (emisie în verde), care este reţinută în compartimentele citoplasmatice ale celulelor vii. Pentru a estompa semnalul fluorescent citoplasmatic celulele se incubează cu CoCl2, care nu însă nu afectează intensitatea semnalului de la nivel mitocondrial. Viabilitatea celulară poate fi evaluată fie prin modificări morfologice, fie prin modificări ale permeabilităţii membranei plasmatice sau a statusului fiziologic, relevate prin excluderea anumitori fluorofori sau acumularea şi retenţia altora. Marcarea celulelor cu iodură de propidiu (IP) este o metodă de evaluare a viabilităţii, bazată pe excluderea fluoroforului din celulele vii, fapt ce indică păstrarea integrităţii membranei plasmatice. Colorarea celulelor neviabile cu iodură de propidiu (IP) este aplicabilă la majoritatea

40

40

2010

FL 2- Iodură de propidiu (PI)

tipurilor celulare, fiind o procedură simplă. Rezultatele sunt uşor de interpretat: celulele moarte sunt identificate rapid, fiind colorate în roşu fluorescent (IP penetrează membrana celulelor moarte, legându-se de acizii nucleici şi emiţând în roşu). Celule viabile cu membrana mitocondrială intactă exclud PI, în timp ce membranele celulelor moarte şi deteriorate sunt permeabile pentru PI. De exemplu celule care sunt considerate viabile sunt FITC anexina V şi PI negative; celulele care sunt în apoptoza timpurie sunt FITC anexina V pozitive şi PI negative şi celulele care sunt în apoptoza târzie sau sunt deja moarte sunt atât FITC anexina V şi PI pozitive. Evidenţierea anexinei V se face datorită conjugatului său fluorescent – FITC. Anexina V este capabilă să lege grupările de fosfatidil serină Concomitent, celulele investigate sunt marcate cu iodură de propidiu (PI), un fluorocrom cu afinitate pentru acizii nucleici, prin care se face distincţia între celulele vii şi cele moarte. Pentru marcare: se recoltează celulele din placa de cultură, se resuspensionează în 2 mL soluţie tampon de legare a anexinei V, se centrifughează la 300xg, 5 minute, apoi, la temperatura camerei, se resuspensionează în 500 μL soluţie tampon de legare a anexinei, se adaugă 5 μL anexină V-FITC şi 2,5 μL PI. Se incubează 10 minute la frigider şi se analizează la flow-citometru (FACS Calibur, Becton Dickinson). Interpretarea rezultatelor se face ţinând cont de distribuţia fiecărei categorii celulare în cadranele delimitate pe coordonatele de fluorescenţă FL1 (anexină-FITC) versus FL2 (PI) (figura 7).

Celule în apoptoz ă tar di vă

Celule vii

Celule în apoptoz ă timpurie

FL 1-Anexină V - FITC

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

tipurilor celulare, fiind o procedură simplă. Rezultatele sunt uşor de interpretat: celulele moarte sunt identificate rapid, fiind colorate în roşu fluorescent (IP penetrează membrana celulelor moarte, legându-se de acizii nucleici şi emiţând în roşu). Celule viabile cu membrana mitocondrială intactă exclud PI, în timp ce membranele celulelor moarte şi deteriorate sunt permeabile pentru PI. De exemplu celule care sunt considerate viabile sunt FITC anexina V şi PI negative; celulele care sunt în apoptoza timpurie sunt FITC anexina V pozitive şi PI negative şi celulele care sunt în apoptoza târzie sau sunt deja moarte sunt atât FITC anexina V şi PI pozitive. Evidenţierea anexinei V se face datorită conjugatului său fluorescent – FITC. Anexina V este capabilă să lege grupările de fosfatidil serină Concomitent, celulele investigate sunt marcate cu iodură de propidiu (PI), un fluorocrom cu afinitate pentru acizii nucleici, prin care se face distincţia între celulele vii şi cele moarte. Pentru marcare: se recoltează celulele din placa de cultură, se resuspensionează în 2 mL soluţie tampon de legare a anexinei V, se centrifughează la 300xg, 5 minute, apoi, la temperatura camerei, se resuspensionează în 500 μL soluţie tampon de legare a anexinei, se adaugă 5 μL anexină V-FITC şi 2,5 μL PI. Se incubează 10 minute la frigider şi se analizează la flow-citometru (FACS Calibur, Becton Dickinson). Interpretarea rezultatelor se face ţinând cont de distribuţia fiecărei categorii celulare în cadranele delimitate pe coordonatele de fluorescenţă FL1 (anexină-FITC) versus FL2 (PI) (figura 7).

FL 2- Iodură de propidiu (PI)

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

Celule în apoptoz ă tar di vă

Celule vii

Celule în apoptoz ă timpurie

FL 1-Anexină V - FITC

Figura 7. Interpretarea testului de detecţie a celulelor apoptotice pe baza utilizării trusei comerciale furnizată de Becton Dickinson

41

Figura 7. Interpretarea testului de detecţie a celulelor apoptotice pe baza utilizării trusei comerciale furnizată de Becton Dickinson

41

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

Figura 8. Imagine FACS reprezentativă pentru martor negativ calceină/IP (calceină-/IP).

Figura 8. Imagine FACS reprezentativă pentru martor negativ calceină/IP (calceină-/IP).

Figura 9. Imagini FACS reprezentative pentru martor calceină 24 h (stânga) şi 48 h (dreapta) (calceină+/IP-)

Figura 9. Imagini FACS reprezentative pentru martor calceină 24 h (stânga) şi 48 h (dreapta) (calceină+/IP-)

Evidenţierea potenţialului mitocondrial transmembranar prin utilizarea JC-1

Evidenţierea potenţialului mitocondrial transmembranar prin utilizarea JC-1

Pentru detectarea variaţiilor potenţialului electric transmembranar (ΔΨ) la nivel de celulă sau de mitocondrie se poate utiliza cationul lipofilic iodură de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolil-carbocianină (numit simplu JC-1). Această moleculă este capabilă să pătrundă selectiv în membrana mitocondriilor şi îşi modifică reversibil culoarea de la verde la

Pentru detectarea variaţiilor potenţialului electric transmembranar (ΔΨ) la nivel de celulă sau de mitocondrie se poate utiliza cationul lipofilic iodură de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolil-carbocianină (numit simplu JC-1). Această moleculă este capabilă să pătrundă selectiv în membrana mitocondriilor şi îşi modifică reversibil culoarea de la verde la

42

42

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

oranj, odată cu creşterea ΔΨm peste valori de aproximativ 80-100 mV. Această proprietate se datorează formării reversibile a agregatelor JC-1 în condiţiile polarizării membranei mitocondriale, care determină modificarea emisiei luminii de la 530 nm (emisia JC-1 sub formă de monomer) la 590 nm (emisia JC-1 sub formă de agregate), când fluoroforul este excitat la 490 nm. Pe măsură ce membrana mitocondrială devine mai polarizată, culoarea fluoroforului se modifică de la verde la oranj. Ambele culori pot fi detectate cu ajutorul filtrelor montate pe majoritatea citometrelor de flux, astfel că emisia verde (JC-1 monomer) poate fi analizată în canalul de fluorescenţă 1 (FL1), iar emisia oranj (JC-1 agregate), în FL2. Avantajul folosirii JC-1 este că analiza probei se poate face atât calitativ, prin observarea modificării fluorescenţei de la verde la oranj, cât şi cantitativ, considerând intensitatea fluorescenţei pure detectate atât în FL1, cât şi în FL2 (Cossarizza & Salvioli, 1998). JC-1 poate fi folosit pentru a indica iniţierea fenomenului de apoptoză. Celulele supuse apoptozei suferă o scădere a potenţialului mitocondrial membranar observată prin schimbarea fluorescenţei JC-1 de la portocaliu la verde.

oranj, odată cu creşterea ΔΨm peste valori de aproximativ 80-100 mV. Această proprietate se datorează formării reversibile a agregatelor JC-1 în condiţiile polarizării membranei mitocondriale, care determină modificarea emisiei luminii de la 530 nm (emisia JC-1 sub formă de monomer) la 590 nm (emisia JC-1 sub formă de agregate), când fluoroforul este excitat la 490 nm. Pe măsură ce membrana mitocondrială devine mai polarizată, culoarea fluoroforului se modifică de la verde la oranj. Ambele culori pot fi detectate cu ajutorul filtrelor montate pe majoritatea citometrelor de flux, astfel că emisia verde (JC-1 monomer) poate fi analizată în canalul de fluorescenţă 1 (FL1), iar emisia oranj (JC-1 agregate), în FL2. Avantajul folosirii JC-1 este că analiza probei se poate face atât calitativ, prin observarea modificării fluorescenţei de la verde la oranj, cât şi cantitativ, considerând intensitatea fluorescenţei pure detectate atât în FL1, cât şi în FL2 (Cossarizza & Salvioli, 1998). JC-1 poate fi folosit pentru a indica iniţierea fenomenului de apoptoză. Celulele supuse apoptozei suferă o scădere a potenţialului mitocondrial membranar observată prin schimbarea fluorescenţei JC-1 de la portocaliu la verde.

Figura 10. FACS reprezentativ pentru distribuţia raportului agregate/monomer pentru martorul de JC-1 la 24 h (prima) şi 48 h (a doua)

Figura 10. FACS reprezentativ pentru distribuţia raportului agregate/monomer pentru martorul de JC-1 la 24 h (prima) şi 48 h (a doua)

Înainte de a începe orice studiu al apoptozei prin citometrie în flux, ar trebui, ori de câte ori este posibil, să se stabilească în primul rând prezenţa acestor celule vizual. Celulele apoptotice au fost identificate iniţial datorită modificărilor caracteristice în nucleele lor, aceasta fiind în continuare cea

Înainte de a începe orice studiu al apoptozei prin citometrie în flux, ar trebui, ori de câte ori este posibil, să se stabilească în primul rând prezenţa acestor celule vizual. Celulele apoptotice au fost identificate iniţial datorită modificărilor caracteristice în nucleele lor, aceasta fiind în continuare cea

43

43

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Tehnici de analiză a parametrilor biologici

2010

mai bună metodă de evidenţiere a acestor celule. Modificările nucleare pot fi observate cu un microscop cu fluorescenţă, prin colorarea cu un colorant a ADN-ului (fig.11).

mai bună metodă de evidenţiere a acestor celule. Modificările nucleare pot fi observate cu un microscop cu fluorescenţă, prin colorarea cu un colorant a ADN-ului (fig.11).

Figura 11. Celule normale (rândul de sus) şi HL60 apoptotice (linie celulară normală promielocitară), colorate cu PI şi vizualizate prin microscopie confocală.

Figura 11. Celule normale (rândul de sus) şi HL60 apoptotice (linie celulară normală promielocitară), colorate cu PI şi vizualizate prin microscopie confocală.

Caracteristicile cascadei apoptotice ce pot fi observate prin citometrie de flux sunt: o Exprimarea de proteine implicate în apoptoză o Activarea de caspaze o Modificări în potenţialul de membrană mitocondrial o Modificări în membrana plasmatică o Contracţia celulară o Modificări ale cromatinei o Degradarea ADN-ului În concluzie, aplicaţiile citometriei ȋn flux sunt multiple, cu nenumărate avantaje ȋn realizarea fidelă şi extrem de rapidă a unor teste, care astăzi au devenit analize de rutină ȋn anumite sectoare de diagnostic şi cercetare: imunofenotiparea, numărătoarea absolută, enumerarea celulelor albe reziduale, analiza celulelor stem, a ADN-ului şi izolarea prin sortare a celulelor. Prin sistemele superioare de analiză multicoloră şi sortare, flow citometrele devin instrumente extrem de eficace şi sensibile care furnizează laboratoarelor avataje tehnologice esenţiale pentru operaţii celulare şi moleculare de avangardă în domeniile biochimiei, geneticii, analizei multicolore şi imunologiei.

Caracteristicile cascadei apoptotice ce pot fi observate prin citometrie de flux sunt: o Exprimarea de proteine implicate în apoptoză o Activarea de caspaze o Modificări în potenţialul de membrană mitocondrial o Modificări în membrana plasmatică o Contracţia celulară o Modificări ale cromatinei o Degradarea ADN-ului În concluzie, aplicaţiile citometriei ȋn flux sunt multiple, cu nenumărate avantaje ȋn realizarea fidelă şi extrem de rapidă a unor teste, care astăzi au devenit analize de rutină ȋn anumite sectoare de diagnostic şi cercetare: imunofenotiparea, numărătoarea absolută, enumerarea celulelor albe reziduale, analiza celulelor stem, a ADN-ului şi izolarea prin sortare a celulelor. Prin sistemele superioare de analiză multicoloră şi sortare, flow citometrele devin instrumente extrem de eficace şi sensibile care furnizează laboratoarelor avataje tehnologice esenţiale pentru operaţii celulare şi moleculare de avangardă în domeniile biochimiei, geneticii, analizei multicolore şi imunologiei.

44

44

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CAPITOLUL 4 ENZIME PLASMATICE CU ROL IN DIAGNOSTICUL CLINIC

4.1. DOZAREA AMILAZEI

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CAPITOLUL 4 ENZIME PLASMATICE CU ROL IN DIAGNOSTICUL CLINIC

4.1. DOZAREA AMILAZEI

1. Consideraţii generale

1. Consideraţii generale

 α Amilaza serică este o hidrolază, enzimă ce catalizează degradarea hidrolitică a amidonului, a poli- si oligozaharidelor, cu formare de glucoză;  Amilaza se sintetizează major ȋn pancreas, glandele salivare,dar ȋn cantităţi mici şi ȋn ficat, trompele uterine, suc duodenal, intestin, muşchi scheletici;  Este excretată ȋn cantităţi mici prin urină, amilaza fiind o 1-4 glucozidază, enzimă cu greutate moleculară mică, ce filtrează prin membrana glomerulară, nefiind reabsorbită, cu excepţia situaţiilor când, prin legare complexă cu Ig (imunoglobulinele), formează macroamilaza.  Macroamilaza, formă moleculară rară, este o izoenzimă anormală care, datorită dimensiunii sale mari, nu se elimină la nivel renal;  α Amilaza este o enzimă de secreţie exocrină, ce prezentă ȋn mod normal două izoenzime principale: • pancreatică (40% din amilaza serică totală) • salivară (60% din amilaza serică totală)  Inflamaţia pancreasului (pancreatită) sau a glandelor salivare (de ex. ȋn parotidită), determină creşterea permeabilităţii membranei celulelor acestor ţesuturi, enzima „se scurge” din celula producătoare ȋn sânge ȋn cantităţi mari, astfel ȋnregistrându-se nivele mult crescute faţă de normal ale amilazei serice;

 α Amilaza serică este o hidrolază, enzimă ce catalizează degradarea hidrolitică a amidonului, a poli- si oligozaharidelor, cu formare de glucoză;  Amilaza se sintetizează major ȋn pancreas, glandele salivare,dar ȋn cantităţi mici şi ȋn ficat, trompele uterine, suc duodenal, intestin, muşchi scheletici;  Este excretată ȋn cantităţi mici prin urină, amilaza fiind o 1-4 glucozidază, enzimă cu greutate moleculară mică, ce filtrează prin membrana glomerulară, nefiind reabsorbită, cu excepţia situaţiilor când, prin legare complexă cu Ig (imunoglobulinele), formează macroamilaza.  Macroamilaza, formă moleculară rară, este o izoenzimă anormală care, datorită dimensiunii sale mari, nu se elimină la nivel renal;  α Amilaza este o enzimă de secreţie exocrină, ce prezentă ȋn mod normal două izoenzime principale: • pancreatică (40% din amilaza serică totală) • salivară (60% din amilaza serică totală)  Inflamaţia pancreasului (pancreatită) sau a glandelor salivare (de ex. ȋn parotidită), determină creşterea permeabilităţii membranei celulelor acestor ţesuturi, enzima „se scurge” din celula producătoare ȋn sânge ȋn cantităţi mari, astfel ȋnregistrându-se nivele mult crescute faţă de normal ale amilazei serice;

45

45

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

 Ȋn pancreatita acută, amilaza serică creşte semnificativ in decurs de 24 ore de la debutul simptomatologiei.  Amilaza urinară creşte ȋntotdeauna ȋn paralel cu valoarea amilazemiei.  Ȋn pancreatita acută amilaza urinară creşte după 6-10 ore de la creşterea amilazei serice dar se menţine crescută mai mult timp decât aceasta (valorile crescute persistă mai mult timp, după revenirea la normal a valorilor serice ale amilazei). Există ȋnsă şi situaţii când amilaza urinară poate fi crescută, cu valori normale ale amilazemiei şi invers.  Creşterea amilazei serice asociată cu niveluri scăzute ale amilazei urinare se ȋntâlneşte ȋn insuficienţa renală şi ȋn macroamilazemie (macroamilaza nu se poate elimina prin urină).

 Ȋn pancreatita acută, amilaza serică creşte semnificativ in decurs de 24 ore de la debutul simptomatologiei.  Amilaza urinară creşte ȋntotdeauna ȋn paralel cu valoarea amilazemiei.  Ȋn pancreatita acută amilaza urinară creşte după 6-10 ore de la creşterea amilazei serice dar se menţine crescută mai mult timp decât aceasta (valorile crescute persistă mai mult timp, după revenirea la normal a valorilor serice ale amilazei). Există ȋnsă şi situaţii când amilaza urinară poate fi crescută, cu valori normale ale amilazemiei şi invers.  Creşterea amilazei serice asociată cu niveluri scăzute ale amilazei urinare se ȋntâlneşte ȋn insuficienţa renală şi ȋn macroamilazemie (macroamilaza nu se poate elimina prin urină).

Recomandări pentru determinarea amilazei A) ȋn ser o diagnosticul şi monitorizarea tratamentului ȋn pancreatita acută; o evaluarea ȋn urgenţă a cazurilor de abdomen acut B) ȋn urină o diferenţierea pancreatitei acute de alte cauze de abdomen acut; o diagnosticul pseudochistului de pancreas (amilaza urinară persistă mai multe saptamâni după normalizarea amilazei serice)

Recomandări pentru determinarea amilazei A) ȋn ser o diagnosticul şi monitorizarea tratamentului ȋn pancreatita acută; o evaluarea ȋn urgenţă a cazurilor de abdomen acut B) ȋn urină o diferenţierea pancreatitei acute de alte cauze de abdomen acut; o diagnosticul pseudochistului de pancreas (amilaza urinară persistă mai multe saptamâni după normalizarea amilazei serice)

2.Principiul metodei

2.Principiul metodei

Reactivul conţine substrat de maltoheptaozidă complexată cu etilidena la care se leagă p-nitrofenol (pNP). Alfa-amilaza conţinută de proba analizată divizează molecula de polizaharid ȋn unităţi mai mici, care vor fi transformate ȋn glucoză, de către alfa-glucozidaza din reactiv. Cantitatea de p-nitrofenol rezultat in urma reacţiei este proporţională cu activitatea alfa-amilazei din probă.

Reactivul conţine substrat de maltoheptaozidă complexată cu etilidena la care se leagă p-nitrofenol (pNP). Alfa-amilaza conţinută de proba analizată divizează molecula de polizaharid ȋn unităţi mai mici, care vor fi transformate ȋn glucoză, de către alfa-glucozidaza din reactiv. Cantitatea de p-nitrofenol rezultat in urma reacţiei este proporţională cu activitatea alfa-amilazei din probă.

5 pNG7

5 pNG7

pNG4 +2 pNG3 + 2 pNG2 + 2G5 + 2 G4 + G3

pNG4 + 2 pNG3 + 2 pNG2 + 14 H2O

5 pNP + 14 G

46

pNG4 +2 pNG3 + 2 pNG2 + 2G5 + 2 G4 + G3

pNG4 + 2 pNG3 + 2 pNG2 + 14 H2O

5 pNP + 14 G

46

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

3. Reactivi

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

3. Reactivi

P-nitrofenol-maltoheptaozida (complexata) Alfa-glicozidază Clorură de calciu Clorura de sodiu Tampon, conservanţi, stabilizatori

1,47 mmol 2,7KU/L 6,8 mmol 50mmol

P-nitrofenol-maltoheptaozida (complexata) Alfa-glicozidază Clorură de calciu Clorura de sodiu Tampon, conservanţi, stabilizatori

1,47 mmol 2,7KU/L 6,8 mmol 50mmol

ATENŢIE! Reactivul este limpede, incolor sau gălbui. Dacă absorbanţa măsurată la 405nm depaşeşte 0,9 reactivul nu mai este utilizabil. Reactivul este TOXIC, se va utiliza IN VITRO.

ATENŢIE! Reactivul este limpede, incolor sau gălbui. Dacă absorbanţa măsurată la 405nm depaşeşte 0,9 reactivul nu mai este utilizabil. Reactivul este TOXIC, se va utiliza IN VITRO.

4. Modul de lucru

4. Modul de lucru

Proba: Ser nehemolizat/ Plasmă heparinizată/ Urină (colectata in vase uscate, pastrata la 2-8°C cu pH optim 7). Intr-o eprubetă se introduc:  Reactiv: 1000 µL  Proba 25 µL După amestecare şi incubare 2 minute la 37°C, se citeşte absorbanţa la 405 nm timp de 2 minute, din 30 in 30 de secunde (ȋn dinamică). Se calculează variaţia absorbanţei pe minut (ΔA/min).

Proba: Ser nehemolizat/ Plasmă heparinizată/ Urină (colectata in vase uscate, pastrata la 2-8°C cu pH optim 7). Intr-o eprubetă se introduc:  Reactiv: 1000 µL  Proba 25 µL După amestecare şi incubare 2 minute la 37°C, se citeşte absorbanţa la 405 nm timp de 2 minute, din 30 in 30 de secunde (ȋn dinamică). Se calculează variaţia absorbanţei pe minut (ΔA/min).

Calcul:

ΔA/min x 5000 = U/L

5. Valori de referinţă

Calcul:

ΔA/min x 5000 = U/L

5. Valori de referinţă

 Ser

28-120 U/L

 Ser

28-120 U/L

 Urină

≤ 460 U/L (spontană) ≤ 410 U/24h (pe 24de ore)

 Urină

≤ 460 U/L (spontană) ≤ 410 U/24h (pe 24de ore)

6. Variaţii fiziologice şi patologice

6. Variaţii fiziologice şi patologice

A) Amilaza serică - Amilazemia

A) Amilaza serică - Amilazemia

 VALORI CRESCUTE (fiziologic, ȋn sarcină, valori moderat crescute), iar patologic, ȋn: a. afecţiuni pancreatice  Pancreatita acută (valorile cresc semnificativ după 3-6 ore de la debutul durerii, şi pot depăşi 8000U)

 VALORI CRESCUTE (fiziologic, ȋn sarcină, valori moderat crescute), iar patologic, ȋn: a. afecţiuni pancreatice  Pancreatita acută (valorile cresc semnificativ după 3-6 ore de la debutul durerii, şi pot depăşi 8000U)

47

47

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

   

2010

Pancreatita cronică Pancreatita indusă medicamentos Obstructia ductelor pancreatice (compresia prin calculi, tumori - carcinom, spasmul oddian indus medicamentos) Traumatism pancreatic

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

   

2010

Pancreatita cronică Pancreatita indusă medicamentos Obstructia ductelor pancreatice (compresia prin calculi, tumori - carcinom, spasmul oddian indus medicamentos) Traumatism pancreatic

b. afecţiuni non-pancreatice  Afecţiuni ale tractului biliar (obstrucţia căilor biliare principale, colecistita acută)  Alterarea permeabilităţii tractului gastro-intestinal: ulcer perforat, postoperator, gastrectomie partiala  Alcoolism  Afectiuni ale glandelor salivare (inflamaţie-parotidita epidemica, obstrucţie ductală prin litiază, postiradiere)  Tumori metastatice cu secreţie ectopică de amilază (valori foarte mari)  Traumatisme cerebrale  Macroamilazemie  Arsuri si şoc traumatic  Apendicita acută  Insuficienţa renală  Cetoacidoza diabetică (datorită creşterii izoenzimei salivare)

b. afecţiuni non-pancreatice  Afecţiuni ale tractului biliar (obstrucţia căilor biliare principale, colecistita acută)  Alterarea permeabilităţii tractului gastro-intestinal: ulcer perforat, postoperator, gastrectomie partiala  Alcoolism  Afectiuni ale glandelor salivare (inflamaţie-parotidita epidemica, obstrucţie ductală prin litiază, postiradiere)  Tumori metastatice cu secreţie ectopică de amilază (valori foarte mari)  Traumatisme cerebrale  Macroamilazemie  Arsuri si şoc traumatic  Apendicita acută  Insuficienţa renală  Cetoacidoza diabetică (datorită creşterii izoenzimei salivare)

 VALORI SCĂZUTE o distrucţie marcată şi extinsă a pancreasului (pancreatita acută fulminantă, pancreatita cronică severă, fibroza chistică severă) o pancreatectomie o afectare hepatică severă (unele forme de hepatită) o medicamente: steroizi anabolizanti, unele cefalosporine

 VALORI SCĂZUTE o distrucţie marcată şi extinsă a pancreasului (pancreatita acută fulminantă, pancreatita cronică severă, fibroza chistică severă) o pancreatectomie o afectare hepatică severă (unele forme de hepatită) o medicamente: steroizi anabolizanti, unele cefalosporine

B.) Amilaza urinară – Amilazuria ■ VALORI CRESCUTE o Afecţiuni pancreatice: pancreatita acută (creşte dupa 6-10 ore de la creşterea amilazei serice dar se menţine crescută mai mult timp decât aceasta), pseudochistul de pancreas (amilaza urinară persistă mai multe saptamani după normalizarea amilazei serice), cancer pancreatic, traumatism de pancreas 48

B.) Amilaza urinară – Amilazuria ■ VALORI CRESCUTE o Afecţiuni pancreatice: pancreatita acută (creşte dupa 6-10 ore de la creşterea amilazei serice dar se menţine crescută mai mult timp decât aceasta), pseudochistul de pancreas (amilaza urinară persistă mai multe saptamani după normalizarea amilazei serice), cancer pancreatic, traumatism de pancreas 48

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

o Afecţiuni ale glandelor salivare: parotidită (oreion) o Afecţiuni ale căilor biliare: colecistita acută, obstrucţie canal cistic, litiaza coledocului; o Boli intestinale grave, prin perforare, ştrangulare, necroză: ulcer perforat, ocluzie intestinală, perforaţie intestinală, infarct intestinal; o Boli inflamatorii abdominale: peritonita, apendicita acută; o Sarcina extrauterină, ruptură de chist ovarian; o Cetoacidoza diabetică ■ VALORI SCĂZUTE o Insuficienţa pancreatică o Boli hepatice severe: hepatită, ciroză, cancer, alcoolism o Insuficienţa renală o Macroamilazemie 7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE Amilaza serică, se gaseşte sub două forme izoenzimatice principale: pancreatică şi salivară O formă moleculară rară este macroamilaza, izoenzima care, datorită dimensiunii sale mari, nu se elimină la nivel renal. Pacienţii cu pancreatită acută prezintă valori crescute ale amilazei serice ȋn decurs de 24 ore de la debutul simptomatologiei (durerii). Amilaza urinară creşte paralel cu valoarea amilazemiei. Ȋn pancreatita acută amilaza urinară creşte după 6-10 ore de la creşterea amilazei serice şi se menţine crescută mai mult timp decât aceasta. Amilaza serică şi ȋn paralel amilaza urinară ȋnregistrează valori mari de regulă ȋn afecţiunile pancreatice şi ale glandelor salivare, de natură ♠inflamatorie, ♠traumatică, ♠neoplazică; In insuficienţa pancreatică (cu reducerea – scleroza - volumului glandular), amilaza ȋnregistrează valori scăzute atât ȋn ser cât şi ȋn urină. Amilaza serică ↑ asociată cu amilaza urinară ↓ se intalneşte in ♠insuficienţa renală şi ȋn ♠macroamilazemie.

49

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

o Afecţiuni ale glandelor salivare: parotidită (oreion) o Afecţiuni ale căilor biliare: colecistita acută, obstrucţie canal cistic, litiaza coledocului; o Boli intestinale grave, prin perforare, ştrangulare, necroză: ulcer perforat, ocluzie intestinală, perforaţie intestinală, infarct intestinal; o Boli inflamatorii abdominale: peritonita, apendicita acută; o Sarcina extrauterină, ruptură de chist ovarian; o Cetoacidoza diabetică ■ VALORI SCĂZUTE o Insuficienţa pancreatică o Boli hepatice severe: hepatită, ciroză, cancer, alcoolism o Insuficienţa renală o Macroamilazemie 7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE Amilaza serică, se gaseşte sub două forme izoenzimatice principale: pancreatică şi salivară O formă moleculară rară este macroamilaza, izoenzima care, datorită dimensiunii sale mari, nu se elimină la nivel renal. Pacienţii cu pancreatită acută prezintă valori crescute ale amilazei serice ȋn decurs de 24 ore de la debutul simptomatologiei (durerii). Amilaza urinară creşte paralel cu valoarea amilazemiei. Ȋn pancreatita acută amilaza urinară creşte după 6-10 ore de la creşterea amilazei serice şi se menţine crescută mai mult timp decât aceasta. Amilaza serică şi ȋn paralel amilaza urinară ȋnregistrează valori mari de regulă ȋn afecţiunile pancreatice şi ale glandelor salivare, de natură ♠inflamatorie, ♠traumatică, ♠neoplazică; In insuficienţa pancreatică (cu reducerea – scleroza - volumului glandular), amilaza ȋnregistrează valori scăzute atât ȋn ser cât şi ȋn urină. Amilaza serică ↑ asociată cu amilaza urinară ↓ se intalneşte in ♠insuficienţa renală şi ȋn ♠macroamilazemie.

49

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

8. MCQ

8. MCQ

A1 Amilaza serică A. este o fosfatază B. catalizează degradarea acizilor graşi, cu formare de corpi cetonici C. este o enzimă de secreţie endocrină D. este prezentă sub forma a două izoenzime principale: intestinală şi musculară E. este prezentă ȋn cantităţi foarte mici ȋn ficat, sucul duodenal, trompele uterine

A1 Amilaza serică A. este o fosfatază B. catalizează degradarea acizilor graşi, cu formare de corpi cetonici C. este o enzimă de secreţie endocrină D. este prezentă sub forma a două izoenzime principale: intestinală şi musculară E. este prezentă ȋn cantităţi foarte mici ȋn ficat, sucul duodenal, trompele uterine

A2 Amilaza urinară A. creşte de regulă ȋn paralel cu valoarea amilazemiei B. ȋn pancreatită, creşte ȋnaintea amilazei serice cu 6-8h C. ȋn pancreatită, se menţine crescută mai puţin timp decat amilaza serică D. este scazută si asociată cu amilaza serică crescută ȋn insuficienţa renală si macroamilazemie E. nu ȋnregistrează creşteri ȋn paralel cu cele ale amilazei serice

A2 Amilaza urinară A. creşte de regulă ȋn paralel cu valoarea amilazemiei B. ȋn pancreatită, creşte ȋnaintea amilazei serice cu 6-8h C. ȋn pancreatită, se menţine crescută mai puţin timp decat amilaza serică D. este scazută si asociată cu amilaza serică crescută ȋn insuficienţa renală si macroamilazemie E. nu ȋnregistrează creşteri ȋn paralel cu cele ale amilazei serice

A3 Care din următoarele afirmaţii, NU este adevarată: A. una dintre cele două izoenzime principale ale α amilazei este macroamilaza care, datorita dimensiunii mari, nu se elimina la nivel renal B. pacienţii cu pancreatită acută prezintă valori crescute ale amilazei serice ȋn decurs de 24 ore de la debutul simptomatologiei C. ȋn pancreatita acută amilaza urinară ȋnregistrează valori crescute, după un interval de 6-10 ore de la creşterea amilazei serice D. amilaza urinară se menţine la valori crescute mai mult timp decât cea serică, la bolnavii cu pancreatită acută E. bolnavii cu pancreatită acută prezintă mai ȋntâi o creştere a amilazei urinare şi ulterior a celei serice

A3 Care din următoarele afirmaţii, NU este adevarată: A. una dintre cele două izoenzime principale ale α amilazei este macroamilaza care, datorita dimensiunii mari, nu se elimina la nivel renal B. pacienţii cu pancreatită acută prezintă valori crescute ale amilazei serice ȋn decurs de 24 ore de la debutul simptomatologiei C. ȋn pancreatita acută amilaza urinară ȋnregistrează valori crescute, după un interval de 6-10 ore de la creşterea amilazei serice D. amilaza urinară se menţine la valori crescute mai mult timp decât cea serică, la bolnavii cu pancreatită acută E. bolnavii cu pancreatită acută prezintă mai ȋntâi o creştere a amilazei urinare şi ulterior a celei serice

A4 Valorile normale ale amilazei serice sunt: A. 460U/L B. 28-120U/L C. 150mg/dL D. 200U/L E. nici un raspuns corect

A4 Valorile normale ale amilazei serice sunt: A. 460U/L B. 28-120U/L C. 150mg/dL D. 200U/L E. nici un raspuns corect

50

50

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

A5 Determinarea amilazei NU este recomandată pentru: A. diagnosticul şi monitorizarea tratamentului ȋn pancreatita acută B. evaluarea ȋn urgenţă a cazurilor de abdomen acut C. diferenţierea pancreatitei acute de alte cauze de abdomen acut D. diagnosticul şi tratamentul diabetului zaharat E. diagnosticul pseudochistului de pancreas

A5 Determinarea amilazei NU este recomandată pentru: A. diagnosticul şi monitorizarea tratamentului ȋn pancreatita acută B. evaluarea ȋn urgenţă a cazurilor de abdomen acut C. diferenţierea pancreatitei acute de alte cauze de abdomen acut D. diagnosticul şi tratamentul diabetului zaharat E. diagnosticul pseudochistului de pancreas

A6 Amilaza serică creşte ȋn următoarele situaţii, CU EXCEPŢIA: A. afecţiuni pancreatice: pancreatita acută, pancreatita cronică B. pancreatectomie C. afecţiuni ale tractului biliar D. ingestie acută de alcool E. afecţiuni ale glandelor salivare

A6 Amilaza serică creşte ȋn următoarele situaţii, CU EXCEPŢIA: A. afecţiuni pancreatice: pancreatita acută, pancreatita cronică B. pancreatectomie C. afecţiuni ale tractului biliar D. ingestie acută de alcool E. afecţiuni ale glandelor salivare

A7 Amilaza serică poate ȋnregistra valori scăzute la pacienţi cu: A. distrucţie marcată şi extinsă a pancreasului B. tumori metastatice cu secreţie ectopică de amilază C. macroamilazemie D. leziuni hepatice severe E. ȋn nici unul din aceste cazuri

A7 Amilaza serică poate ȋnregistra valori scăzute la pacienţi cu: A. distrucţie marcată şi extinsă a pancreasului B. tumori metastatice cu secreţie ectopică de amilază C. macroamilazemie D. leziuni hepatice severe E. ȋn nici unul din aceste cazuri

A8 Amilaza urinară creşte ȋn următoarele cazuri, CU EXCEPŢIA: A. pancreatita acută B. obstrucţia căilor biliare C. traumatism de pancreas şi glande salivare D. pseudochist de pancreas E. afecţiuni hepatice severe

A8 Amilaza urinară creşte ȋn următoarele cazuri, CU EXCEPŢIA: A. pancreatita acută B. obstrucţia căilor biliare C. traumatism de pancreas şi glande salivare D. pseudochist de pancreas E. afecţiuni hepatice severe

A9 Amilaza urinară scade ȋn următoarele situaţii, CU EXCEPŢIA: A. hepatite cronice B. ciroza hepatică C. carcinom hepatic D. alcoolism cronic E. pancreatita acută

A9 Amilaza urinară scade ȋn următoarele situaţii, CU EXCEPŢIA: A. hepatite cronice B. ciroza hepatică C. carcinom hepatic D. alcoolism cronic E. pancreatita acută

A10 Amilaza serică: A. poate creşte moderat in sarcina normală B. este o liază care desface legăturile 1-4 glicozidice C. nu este influenţată de ingestia acută sau cronică de alcool D. este principalul test ȋn diagnosticul insuficienţei renale E. scade ȋn apendicita acută

A10 Amilaza serică: A. poate creşte moderat in sarcina normală B. este o liază care desface legăturile 1-4 glicozidice C. nu este influenţată de ingestia acută sau cronică de alcool D. este principalul test ȋn diagnosticul insuficienţei renale E. scade ȋn apendicita acută

51

51

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

4.2. DOZAREA TRANSAMINAZELOR

4.2. DOZAREA TRANSAMINAZELOR

GLUTAMIC PIRUVIC TRANSAMINAZA

GLUTAMIC PIRUVIC TRANSAMINAZA

(Alanin Transaminaza) - (GPT, ALT)

(Alanin Transaminaza) - (GPT, ALT)

2010

1. Consideraţii generale

1. Consideraţii generale

ALT cunoaşte o distribuţie destul de largă, găsindu-se în special în:  ficat (de trei ori mai mult decât în alte ţesuturi)  ţesutul miocardic  muschii scheletici  rinichi  pancreas La nivel hepatic, ALT se află mai ales în hepatocitele de la periferia lobulului hepatic şi este localizat exclusiv citoplasmatic (în timp ce glutamic oxalacetic transaminaza – GOT, cunoscuta si sub numele de aspartat transaminaza - AST, cunoaşte o distribuţie bimodală, putând fi gasită şi la nivel mitocondrial). Odată cu alterarea metabolismului energetic al celulei hepatice, indusă fie de agenţi infecţioşi (cum sunt virusurile hepatice de exemplu) sau toxici, se produce o creştere a permeabilităţii membranei celulare hepatice, cu eliberarea în ser a componentelor citoplasmatice (citoliză). În acest fel, o creştere semnificativă în ser a nivelului acestei enzime (şi nu numai, citoliza antrenând scurgerea către torentul circulator şi a altor enzime, precum AST, LDH), reprezintă indicator fidel pentru instalarea unei suferinţe hepatice. Factorii care influenţează nivelul seric al acestor enzime marker de distrucţie intracelulară sunt:  severitatea afectării şi numărul de hepatocite lezate  viteza cu care s-au produs leziunile  viteza de excreţie în ser a enzimelor respective ALT este indicatorul de citoliză cel mai frecvent explorat, majoritatea autorilor considerându-l cel mai relevant pentru detectarea chiar şi a leziunilor hepatice minime. În plus, ALT este specifică pentru afecţiunile hepatice (cealaltă transaminază - AST, deşi ȋnregistrează valori crescute ȋn leziuni ale ficatului, nu este specifică la acest nivel, modificări

ALT cunoaşte o distribuţie destul de largă, găsindu-se în special în:  ficat (de trei ori mai mult decât în alte ţesuturi)  ţesutul miocardic  muschii scheletici  rinichi  pancreas La nivel hepatic, ALT se află mai ales în hepatocitele de la periferia lobulului hepatic şi este localizat exclusiv citoplasmatic (în timp ce glutamic oxalacetic transaminaza – GOT, cunoscuta si sub numele de aspartat transaminaza - AST, cunoaşte o distribuţie bimodală, putând fi gasită şi la nivel mitocondrial). Odată cu alterarea metabolismului energetic al celulei hepatice, indusă fie de agenţi infecţioşi (cum sunt virusurile hepatice de exemplu) sau toxici, se produce o creştere a permeabilităţii membranei celulare hepatice, cu eliberarea în ser a componentelor citoplasmatice (citoliză). În acest fel, o creştere semnificativă în ser a nivelului acestei enzime (şi nu numai, citoliza antrenând scurgerea către torentul circulator şi a altor enzime, precum AST, LDH), reprezintă indicator fidel pentru instalarea unei suferinţe hepatice. Factorii care influenţează nivelul seric al acestor enzime marker de distrucţie intracelulară sunt:  severitatea afectării şi numărul de hepatocite lezate  viteza cu care s-au produs leziunile  viteza de excreţie în ser a enzimelor respective ALT este indicatorul de citoliză cel mai frecvent explorat, majoritatea autorilor considerându-l cel mai relevant pentru detectarea chiar şi a leziunilor hepatice minime. În plus, ALT este specifică pentru afecţiunile hepatice (cealaltă transaminază - AST, deşi ȋnregistrează valori crescute ȋn leziuni ale ficatului, nu este specifică la acest nivel, modificări

52

52

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

spectaculoase ale acesteia din urmă ȋnregistrându-se ȋn cazul alterărilor ţesutului miocardic, spre exemplu, ȋn infarctul de miocard). Valorile absolute ale ALT nu se corelează totuşi direct cu severitatea afectării ficatului şi cu prognosticul, de aceea se recomandă explorarea în dinamică a acestui parametru, atunci când valorile sale sunt modificate faţă de normal. Recomandări pentru determinarea ALT Cunoaşterea nivelului acestei transaminaze ȋn sânge este util: - atunci când pacientul prezintă unele din semnele caracteristice unei disfuncţionalităţi hepatice precum: ameţeli, stare de vomă, dureri abdominale, oboseală continuă, colorarea în galben a tegumentelor (icter), sau urini închise la culoare; - asociat cu alţi parametri de laborator, putând fi relevant în depistarea alterărilor hepatice în cazul consumatorilor cronici de alcool; - la cei cu istoric de boala hepatica familială, sau - cei care urmează un tratament cu formule medicamentoase ce pot interfera funcţia normală hepatică (iar medicamentele în acest sens, adică cele care au efecte adverse ce se răsfrâng asupra funcţiei ficatului, sunt foarte numeroase). În esenţă, dozarea ALT este utilă in: 1. Diagnosticul bolilor hepatice; 2. Monitorizarea evoluţiei şi a tratamentului hepatitei virale; 3. Diagnosticul diferenţial al bolilor hepatobiliare şi pancreatice; 4. Diagnosticul diferenţial între forme variate de icter.

spectaculoase ale acesteia din urmă ȋnregistrându-se ȋn cazul alterărilor ţesutului miocardic, spre exemplu, ȋn infarctul de miocard). Valorile absolute ale ALT nu se corelează totuşi direct cu severitatea afectării ficatului şi cu prognosticul, de aceea se recomandă explorarea în dinamică a acestui parametru, atunci când valorile sale sunt modificate faţă de normal. Recomandări pentru determinarea ALT Cunoaşterea nivelului acestei transaminaze ȋn sânge este util: - atunci când pacientul prezintă unele din semnele caracteristice unei disfuncţionalităţi hepatice precum: ameţeli, stare de vomă, dureri abdominale, oboseală continuă, colorarea în galben a tegumentelor (icter), sau urini închise la culoare; - asociat cu alţi parametri de laborator, putând fi relevant în depistarea alterărilor hepatice în cazul consumatorilor cronici de alcool; - la cei cu istoric de boala hepatica familială, sau - cei care urmează un tratament cu formule medicamentoase ce pot interfera funcţia normală hepatică (iar medicamentele în acest sens, adică cele care au efecte adverse ce se răsfrâng asupra funcţiei ficatului, sunt foarte numeroase). În esenţă, dozarea ALT este utilă in: 1. Diagnosticul bolilor hepatice; 2. Monitorizarea evoluţiei şi a tratamentului hepatitei virale; 3. Diagnosticul diferenţial al bolilor hepatobiliare şi pancreatice; 4. Diagnosticul diferenţial între forme variate de icter.

2. Principiul metodei

2. Principiul metodei

Transaminazele catalizează transferul de grupare amino de la un aminoacid la un cetoacid, cu interconversia substratelor specifice: aminoacid şi cetoacid, ȋntr-o nouă pereche de aminoacid şi cetoacid. Enzima ALT (GPT) catalizează interconversia substratelor specifice: alanina – Ala (aminoacid) si alfacetoglutaratul (cetoacid). Piruvatul format în această reacţie (prin transaminarea alaninei) este supus acţiunii lactat dehidrogenazei – LDH, cu conversia consecutivă a coenzimei reduse a acesteia (NADH + H+) în forma oxidată (NAD+) şi formare de lactat. Variaţia absorbanţei NADH măsurată la 340 nm este proporţională cu activitatea ALT.

Transaminazele catalizează transferul de grupare amino de la un aminoacid la un cetoacid, cu interconversia substratelor specifice: aminoacid şi cetoacid, ȋntr-o nouă pereche de aminoacid şi cetoacid. Enzima ALT (GPT) catalizează interconversia substratelor specifice: alanina – Ala (aminoacid) si alfacetoglutaratul (cetoacid). Piruvatul format în această reacţie (prin transaminarea alaninei) este supus acţiunii lactat dehidrogenazei – LDH, cu conversia consecutivă a coenzimei reduse a acesteia (NADH + H+) în forma oxidată (NAD+) şi formare de lactat. Variaţia absorbanţei NADH măsurată la 340 nm este proporţională cu activitatea ALT.

53

53

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

Ala +  cetoglutarat

TGP  

Piruvat + NADH+H+

2010

piruvat + Glu (glutamat)

LDH  

lactat + NAD+

3. Reactivi

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

Ala +  cetoglutarat

TGP  

Piruvat + NADH+H+

2010

piruvat + Glu (glutamat)

LDH  

lactat + NAD+

3. Reactivi

Reactiv 1 (R1): Tampon TRIS, pH=7,5 L-alanină Reactiv 2 (R2): LDH NADH + H+  - cetoglutarat

110 mmol/L 550 mmol/L

Reactiv 1 (R1): Tampon TRIS, pH=7,5 L-alanină

110 mmol/L 550 mmol/L

1200 mmol/L 0,2 mmol/L 16 mmol/L

Reactiv 2 (R2): LDH NADH + H+  - cetoglutarat

1200 mmol/L 0,2 mmol/L 16 mmol/L

4. Modul de lucru

4. Modul de lucru

Proba: Ser nehemolizat / Plasmă Se pregăteşte amestecul de reactivi (soluţia stoc-R): se dizolvă conţinutul unui flacon de R2 în cantitatea corespunzătoare de reactiv 1 (R1). Într-o eprubetă se introduc:  Amestec de reactivi (R) 1000 μL  Proba 100 μL

Proba: Ser nehemolizat / Plasmă Se pregăteşte amestecul de reactivi (soluţia stoc-R): se dizolvă conţinutul unui flacon de R2 în cantitatea corespunzătoare de reactiv 1 (R1). Într-o eprubetă se introduc:  Amestec de reactivi (R) 1000 μL  Proba 100 μL

După amestecare şi o incubare de 1 minut la 37ºC se citeşte valoarea absorbanţei (A) la 340 nm, în cuve de 1cm, faţă de apă distilata. Se va urmări variaţia absorbanţei pe minut (ΔA/min) timp de 3 minute. Mod de măsurare: cinetic (descrescător).

După amestecare şi o incubare de 1 minut la 37ºC se citeşte valoarea absorbanţei (A) la 340 nm, în cuve de 1cm, faţă de apă distilata. Se va urmări variaţia absorbanţei pe minut (ΔA/min) timp de 3 minute. Mod de măsurare: cinetic (descrescător).

Calcul: U/L = (  A/min) × 1750

Calcul: U/L = (  A/min) × 1750

5. Valori de referinţă < 40 U/L

5. Valori de referinţă < 40 U/L

6. Variaţii patologice

6. Variaţii patologice

ALT reprezintă un indicator precoce în afectarea acută hepatică. Timpul de înjumătăţire (T1/2) al ALT este mai prelungit, astfel încât aceasta enzimă persistă mai mult în ser decât AST al carei timp de înjumătăţire este mai scurt.

ALT reprezintă un indicator precoce în afectarea acută hepatică. Timpul de înjumătăţire (T1/2) al ALT este mai prelungit, astfel încât aceasta enzimă persistă mai mult în ser decât AST al carei timp de înjumătăţire este mai scurt.

54

54

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

 VALORI CRESCUTE

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

 VALORI CRESCUTE

Creşterea valorilor TGP (enzimă intracelulară) se ȋnregistrează ȋn situaţia deversării ȋn cantitate mai mare decât cea fiziologică (normală) a enzimei ȋn torentul circulator, cauzat fie de creşterea permeabilităţii celulare (hepatice ȋn principal sau miocardice) consecutiv fenomenelor inflamatorii, cronice, toxice sau neoplazice, fie de liza acestor celule (determinată de reducerea duratei de viaţă ca ȋn cazul alterărilor canceroase, sau de agenţi infecţioşi. alterări ale irigaţiei şi deci ale vitalităţii ȋn teritoriile tisulare afectate). Cele mai importante şi mai rapide creşteri în ser ale enzimelor celulare survin în leziunile toxice ale ficatului (provocate ȋndeosebi de intoxicaţia cu ciuperci, tetraclorura de carbon). Valorile aminotransferazelor pot depăşi ȋn aceste situaţii, de 100 de ori limita superioară a normalului. Nivelul ALT este modificat în ser, în principal în următoarele cazuri:  Afecţiuni hepatice, de natură: o inflamatorie - hepatită (cu valori semnificativ mai mari în procesele acute); o cronică - ciroză o neoplazică - cancer (cu afectare primară - hepatom sau secundară - metastaze); o mecanică (obstruc|ie) - colestază intrahepatică;  Inflamaţia altor ţesuturi: o colecistită (inflamaţia vezicii biliare) o pancreatită acută (inflamaţia pancreasului),  Distrucţii severe celulare (citoliză) - infarct miocardic acut, insuficienţă cardiacă;  Infecţii severe (mononucleoza infecţioasă)  Şoc, arsuri, eclampsie  În hepatita virală acută: survine o lezare destul de rapidă a unui număr mare de hepatocite; creşterea aminotransferazelor depăşeşte de 10-100 de ori limita superioară a normalului. o În hepatita acută cu virus A, creşterea ALT precede cu două săptămâni instalarea icterului, cu revenirea la normal a valorilor ALT în decurs de aproximativ 3 saptămâni. Markerii de laborator sunt primele semne pozitive care apar cu mult înaintea semnelor clinice evidente, parametrii biologici fiind „primii care apar şi ultimii care dispar”, ei

Creşterea valorilor TGP (enzimă intracelulară) se ȋnregistrează ȋn situaţia deversării ȋn cantitate mai mare decât cea fiziologică (normală) a enzimei ȋn torentul circulator, cauzat fie de creşterea permeabilităţii celulare (hepatice ȋn principal sau miocardice) consecutiv fenomenelor inflamatorii, cronice, toxice sau neoplazice, fie de liza acestor celule (determinată de reducerea duratei de viaţă ca ȋn cazul alterărilor canceroase, sau de agenţi infecţioşi. alterări ale irigaţiei şi deci ale vitalităţii ȋn teritoriile tisulare afectate). Cele mai importante şi mai rapide creşteri în ser ale enzimelor celulare survin în leziunile toxice ale ficatului (provocate ȋndeosebi de intoxicaţia cu ciuperci, tetraclorura de carbon). Valorile aminotransferazelor pot depăşi ȋn aceste situaţii, de 100 de ori limita superioară a normalului. Nivelul ALT este modificat în ser, în principal în următoarele cazuri:  Afecţiuni hepatice, de natură: o inflamatorie - hepatită (cu valori semnificativ mai mari în procesele acute); o cronică - ciroză o neoplazică - cancer (cu afectare primară - hepatom sau secundară - metastaze); o mecanică (obstruc|ie) - colestază intrahepatică;  Inflamaţia altor ţesuturi: o colecistită (inflamaţia vezicii biliare) o pancreatită acută (inflamaţia pancreasului),  Distrucţii severe celulare (citoliză) - infarct miocardic acut, insuficienţă cardiacă;  Infecţii severe (mononucleoza infecţioasă)  Şoc, arsuri, eclampsie  În hepatita virală acută: survine o lezare destul de rapidă a unui număr mare de hepatocite; creşterea aminotransferazelor depăşeşte de 10-100 de ori limita superioară a normalului. o În hepatita acută cu virus A, creşterea ALT precede cu două săptămâni instalarea icterului, cu revenirea la normal a valorilor ALT în decurs de aproximativ 3 saptămâni. Markerii de laborator sunt primele semne pozitive care apar cu mult înaintea semnelor clinice evidente, parametrii biologici fiind „primii care apar şi ultimii care dispar”, ei

55

55

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic



  

 

   

2010

ramânând pentru un timp pozitivi chiar după dispariţia semnelor clinice de boală (icter). o În cazul hepatitelor virale cu virus B sau C, valoarea ALT prezintă creşteri şi scăderi imprevizibile, revenind la valori aproape normale. În icterele obstructive creşterile pot fi mici şi tardive; creşterea rapidă şi marcată (>600 U/l) urmată de o scădere abruptă în decurs de 12-72 ore este considerată caracteristică pentru obstrucţia acută a ductelor bilare. În hepatita cronică persistentă, valorile transaminazelor apar intermitent crescute; în hepatita cronică activată apar creşteri ale ALT, dar nu la nivelul celor din hepatita acută; În hepatita cronică progresivă valoarea transaminazelor creşte cu până la 20 de ordine de mărime faţă de limita superioară a normalului. Hepatita cronică stabilizată, în care procesul inflamator este cantonat în spaţiile portale, se insoţeşte de regulă de creşteri mai puţin exprimate ale acestor enzime (2-3 ori limita superioară a normalului) şi de obicei, ALT>AST. Hepatopatia alcoolică acută duce la creşteri relativ mai importante ale aminotransferazelor (5-10 ori limita superioară a normalului), iar AST>ALT. În cirozele hepatice decompensate parenchimatos (când parenchimul hepatic este în parte înlocuit cu ţesut fibros) creşterile enzimatice sunt reduse, accentuându-se în puseele evolutive necrotice, când AST>ALT. În procesele neoplazice ale ficatului, când lezarea celulelor hepatice se produce pe arii limitate, în jurul infiltratului malign, apar creşteri moderate ale aminotransferazelor, deşi lezarea celulelor este severă. În metastazele hepatice se observă uneori creşteri moderate ale ALT, iar în hepatomul primar nu se produc modificări remarcabile. În steatoza hepatică - creşteri ale ALT de 2-3 ori faţă de valorile fiziologice. Creşteri moderate ale ALT se observă şi în stările de şoc, arsuri severe, mononucleoza infecţioasă, leucemia limfoblastică acută (copii), infarctul miocardic, insuficienţa cardiacă, eclampsie, hepatotoxice, pancreatita acută.

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic



  

 

   

2010

ramânând pentru un timp pozitivi chiar după dispariţia semnelor clinice de boală (icter). o În cazul hepatitelor virale cu virus B sau C, valoarea ALT prezintă creşteri şi scăderi imprevizibile, revenind la valori aproape normale. În icterele obstructive creşterile pot fi mici şi tardive; creşterea rapidă şi marcată (>600 U/l) urmată de o scădere abruptă în decurs de 12-72 ore este considerată caracteristică pentru obstrucţia acută a ductelor bilare. În hepatita cronică persistentă, valorile transaminazelor apar intermitent crescute; în hepatita cronică activată apar creşteri ale ALT, dar nu la nivelul celor din hepatita acută; În hepatita cronică progresivă valoarea transaminazelor creşte cu până la 20 de ordine de mărime faţă de limita superioară a normalului. Hepatita cronică stabilizată, în care procesul inflamator este cantonat în spaţiile portale, se insoţeşte de regulă de creşteri mai puţin exprimate ale acestor enzime (2-3 ori limita superioară a normalului) şi de obicei, ALT>AST. Hepatopatia alcoolică acută duce la creşteri relativ mai importante ale aminotransferazelor (5-10 ori limita superioară a normalului), iar AST>ALT. În cirozele hepatice decompensate parenchimatos (când parenchimul hepatic este în parte înlocuit cu ţesut fibros) creşterile enzimatice sunt reduse, accentuându-se în puseele evolutive necrotice, când AST>ALT. În procesele neoplazice ale ficatului, când lezarea celulelor hepatice se produce pe arii limitate, în jurul infiltratului malign, apar creşteri moderate ale aminotransferazelor, deşi lezarea celulelor este severă. În metastazele hepatice se observă uneori creşteri moderate ale ALT, iar în hepatomul primar nu se produc modificări remarcabile. În steatoza hepatică - creşteri ale ALT de 2-3 ori faţă de valorile fiziologice. Creşteri moderate ale ALT se observă şi în stările de şoc, arsuri severe, mononucleoza infecţioasă, leucemia limfoblastică acută (copii), infarctul miocardic, insuficienţa cardiacă, eclampsie, hepatotoxice, pancreatita acută.

La subiecţii sănătoşi, raportul De Rittis, (AST/ALT) este aproximativ 1,15-1,3.

La subiecţii sănătoşi, raportul De Rittis, (AST/ALT) este aproximativ 1,15-1,3.

56

56

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

Valorile diminuate (subunitare) ale raportului De Rittis în diversele afecţiuni hepatice apar: in cazul unei leziuni moderate care afectează doar permeabilitatea membranei hepatocitelor, scurgerea din celule interesând mai ales enzimele cu localizare citosolică aşa cum este ALT; fie datorită creşterii nivelului circulant al ALT (prin „scurgerea” predominantă în sânge a acestei transaminaze care se află în cantitate mai mare în celulele de la periferia lobulilor hepatici, mai rapid afectate de procesele inflamatorii). Valori crescute ale raportului se înregistrează la: *aloolici (hepatitele alcoolice prin deficit de vitamina B6) *tranzitoriu la gravide *ciroza hepatică *metastazele hepatice Valori critice: sindromul alcool-acetaminofen: valori >9000 U/L (nivelele extreme pot distinge acest sindrom de hepatita virală sau alcoolică).

Valorile diminuate (subunitare) ale raportului De Rittis în diversele afecţiuni hepatice apar: in cazul unei leziuni moderate care afectează doar permeabilitatea membranei hepatocitelor, scurgerea din celule interesând mai ales enzimele cu localizare citosolică aşa cum este ALT; fie datorită creşterii nivelului circulant al ALT (prin „scurgerea” predominantă în sânge a acestei transaminaze care se află în cantitate mai mare în celulele de la periferia lobulilor hepatici, mai rapid afectate de procesele inflamatorii). Valori crescute ale raportului se înregistrează la: *aloolici (hepatitele alcoolice prin deficit de vitamina B6) *tranzitoriu la gravide *ciroza hepatică *metastazele hepatice Valori critice: sindromul alcool-acetaminofen: valori >9000 U/L (nivelele extreme pot distinge acest sindrom de hepatita virală sau alcoolică).

 VALORI SCĂZUTE  infecţii urinare  neoplazii  deficit de vitamină B6 (ȋn malnutriţie, consum de alcool): piridoxalul – vitamina B6 – intervine ca şi coenzimă a transaminazelor, de aceea, în deficitul vitaminic se va înregistra consecutiv un deficit coenzimatic şi deci o reducere a activităţii transaminazelor.

 VALORI SCĂZUTE  infecţii urinare  neoplazii  deficit de vitamină B6 (ȋn malnutriţie, consum de alcool): piridoxalul – vitamina B6 – intervine ca şi coenzimă a transaminazelor, de aceea, în deficitul vitaminic se va înregistra consecutiv un deficit coenzimatic şi deci o reducere a activităţii transaminazelor.

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE ALT este o enzimă care face parte din clasa transferazelor şi catalizează transferul reversibil al grupării amino (NH2) de la un aminoacid (alanină), la  cetoglutarat, cu formarea de acid piruvic şi glutamat. Cantităţile cele mai ridicate de ALT se află la nivelul citosolului celulei hepatice, urmate în ordine descrescătoare de cantităţi semnificative la nivelul rinichiului, miocardului, muşchilor scheletici şi pancreasului. Creşterea nivelului plasmatic al ALT are două cauze principale (determinate de multiple situaţii): 1. Creşterea permeabilităţii celulare 57

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE ALT este o enzimă care face parte din clasa transferazelor şi catalizează transferul reversibil al grupării amino (NH2) de la un aminoacid (alanină), la  cetoglutarat, cu formarea de acid piruvic şi glutamat. Cantităţile cele mai ridicate de ALT se află la nivelul citosolului celulei hepatice, urmate în ordine descrescătoare de cantităţi semnificative la nivelul rinichiului, miocardului, muşchilor scheletici şi pancreasului. Creşterea nivelului plasmatic al ALT are două cauze principale (determinate de multiple situaţii): 1. Creşterea permeabilităţii celulare 57

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

2. Liza celulară Dacă metabolismul energetic al celulei hepatice este alterat de agenţi infecţioşi (virusurile hepatice) sau toxici, se produce o creştere a premeabilităţii membranei celulare, având ca urmare trecerea în ser a componentelor citoplasmatice, şi deci şi a enzimelor intracelulare (hepatită, ciroză, colecistită, pancreatită). Liza acestor celule (determinată de reducerea duratei de viaţă a acestora, ca ȋn cazul modificărilor de natură canceroasă, sau de alterări ale irigaţiei şi deci ale vitalităţii ȋn teritoriile tisulare afectate) – citoliză– se ȋnsoţeşte de asemeni de eliberarea conţinutului acestor celule ȋn circulaţie şi deci nivele serice enzimatice crescute (♠cancer, ♠insuficienţă cardiacă). ALT este indicatorul de citoliză cel mai frecvent utilizat, detectând chiar şi leziunile hepatice minime, fiind mai specific decât aspartat aminotransferaza (AST). Totuşi, valorile absolute ale ALT nu se corelează direct cu severitatea lezarii hepatice şi cu prognosticul, din acest motiv fiind mai folositoare determinările seriate.

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

2. Liza celulară Dacă metabolismul energetic al celulei hepatice este alterat de agenţi infecţioşi (virusurile hepatice) sau toxici, se produce o creştere a premeabilităţii membranei celulare, având ca urmare trecerea în ser a componentelor citoplasmatice, şi deci şi a enzimelor intracelulare (hepatită, ciroză, colecistită, pancreatită). Liza acestor celule (determinată de reducerea duratei de viaţă a acestora, ca ȋn cazul modificărilor de natură canceroasă, sau de alterări ale irigaţiei şi deci ale vitalităţii ȋn teritoriile tisulare afectate) – citoliză– se ȋnsoţeşte de asemeni de eliberarea conţinutului acestor celule ȋn circulaţie şi deci nivele serice enzimatice crescute (♠cancer, ♠insuficienţă cardiacă). ALT este indicatorul de citoliză cel mai frecvent utilizat, detectând chiar şi leziunile hepatice minime, fiind mai specific decât aspartat aminotransferaza (AST). Totuşi, valorile absolute ale ALT nu se corelează direct cu severitatea lezarii hepatice şi cu prognosticul, din acest motiv fiind mai folositoare determinările seriate.

8. MCQ

8. MCQ

1. Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la ALT este adevărată: A. Se găseşte preponderant la nivelul miocardului B. Valorile absolute ale ALT se corelează direct cu severitatea afectării hepatice C. Are specificitate mai înaltă decât AST în evaluarea afecţiunilor ficatului D. Valorile ALT în cazul hepatitelor virale (B, C) , NU prezintă creşteri constante E. În cazul consumului de alcool înregistrează valori ridicate

1. Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la ALT este adevărată: A. Se găseşte preponderant la nivelul miocardului B. Valorile absolute ale ALT se corelează direct cu severitatea afectării hepatice C. Are specificitate mai înaltă decât AST în evaluarea afecţiunilor ficatului D. Valorile ALT în cazul hepatitelor virale (B, C) , NU prezintă creşteri constante E. În cazul consumului de alcool înregistrează valori ridicate

2. ALT (alanin transaminaza, sau GPT): A. Timpul său de înjumătăţire este jumătate faţă de cel al AST B. În icterele obstructive, după o creştere semnificativă, suferă în decurs de 12-72 ore o scădere bruscă C. Infarctul miocardic este caracterizat de valori impresionante ale acestei enzime D. Modul de măsurare al concentraţiei sale este cinetic (crescător) E. Nu se află in concentraţie mai mare la nivelul centrului lobulului hepatic

2. ALT (alanin transaminaza, sau GPT): A. Timpul său de înjumătăţire este jumătate faţă de cel al AST B. În icterele obstructive, după o creştere semnificativă, suferă în decurs de 12-72 ore o scădere bruscă C. Infarctul miocardic este caracterizat de valori impresionante ale acestei enzime D. Modul de măsurare al concentraţiei sale este cinetic (crescător) E. Nu se află in concentraţie mai mare la nivelul centrului lobulului hepatic

58

58

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

3. Raportul de Rittis: A. Reprezintă raportul dintre ALT/AST B. La subiecţii normali are valori cuprinse între 2,3-2,5 C. Valori crescute ale acestui raport apar în leziunile moderate hepatice, cu interesarea doar a permeabilităţii celulare D. În cazul sarcinii acest raport poate avea valori supraunitare E. La subiecţii cu afectare hepatică are valori cuprinse între1,15-1,3

3. Raportul de Rittis: A. Reprezintă raportul dintre ALT/AST B. La subiecţii normali are valori cuprinse între 2,3-2,5 C. Valori crescute ale acestui raport apar în leziunile moderate hepatice, cu interesarea doar a permeabilităţii celulare D. În cazul sarcinii acest raport poate avea valori supraunitare E. La subiecţii cu afectare hepatică are valori cuprinse între1,15-1,3

4. Care dintre afirmaţiile următoare referitoare la activitatea alanin transaminazei NU este adevărată? A. ALT catalizează transferul ireversibil al grupării amino între alanină şi  cetoglutarat B. În cadrul sindromului alcool-acetaminofen ALT înregistrează valori >9000U/L C. Deficitul de piridoxal fosfat ( vitamina B6) determină o creştere a ALT D. În hepatita cu virus A, icterul este precedat cu aproximativ 2 săptămâni de valori ridicate ale ALT E. La gravide de obicei raportul de Rittis are valori crescute

4. Care dintre afirmaţiile următoare referitoare la activitatea alanin transaminazei NU este adevărată? A. ALT catalizează transferul ireversibil al grupării amino între alanină şi  cetoglutarat B. În cadrul sindromului alcool-acetaminofen ALT înregistrează valori >9000U/L C. Deficitul de piridoxal fosfat ( vitamina B6) determină o creştere a ALT D. În hepatita cu virus A, icterul este precedat cu aproximativ 2 săptămâni de valori ridicate ale ALT E. La gravide de obicei raportul de Rittis are valori crescute

5. Cele mai importante şi mai rapide creşteri în ser ale ALT apar în:

5. Cele mai importante şi mai rapide creşteri în ser ale ALT apar în:

A. Neoplazii B. Intoxicaţia cu tetraclorură de carbon C. Infecţii urinare D. Intoxicaţia cu ciuperci E. Malnutriţie

A. Neoplazii B. Intoxicaţia cu tetraclorură de carbon C. Infecţii urinare D. Intoxicaţia cu ciuperci E. Malnutriţie

6. Despre ALT se pot afirma următoarele: A. Este singurul parametru util în evaluarea consumatorilor cronici de alcool B. Este indicatorul de citoliză cel mai frecvent utilizat

6. Despre ALT se pot afirma următoarele: A. Este singurul parametru util în evaluarea consumatorilor cronici de alcool B. Este indicatorul de citoliză cel mai frecvent utilizat

C. Creşterea nivelului său plasmatic poate fi declanşat de injecţiile intramusculare D. Este mai specifică decât AST (aspartat aminotransferaza) în evaluarea afectării hepatice E. Valorile sale absolute se corelează cu prognosticul bolilor hepatice

C. Creşterea nivelului său plasmatic poate fi declanşat de injecţiile intramusculare D. Este mai specifică decât AST (aspartat aminotransferaza) în evaluarea afectării hepatice E. Valorile sale absolute se corelează cu prognosticul bolilor hepatice

7. Dintre afirmaţiile următoare cu privire la activitatea alanin transaminazei, sunt adevărate: A. În icterele obstructive nivelele ALT se menţin constant ridicate B. În leucemia limfoblastică acută la copil valorile ALT sunt moderat crescute 59

7. Dintre afirmaţiile următoare cu privire la activitatea alanin transaminazei, sunt adevărate: A. În icterele obstructive nivelele ALT se menţin constant ridicate B. În leucemia limfoblastică acută la copil valorile ALT sunt moderat crescute 59

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

C. În procesele neoplazice ale ficatului, cu lezare importantă dar limitată în jurul ariilor de infiltrare a hepatocitelor, apar creşteri importante ale ALT D. În hepatitele virale (B, C) ALT are valori constant ridicate E. Malnutriţia determină nivele scăzute de ALT

C. În procesele neoplazice ale ficatului, cu lezare importantă dar limitată în jurul ariilor de infiltrare a hepatocitelor, apar creşteri importante ale ALT D. În hepatitele virale (B, C) ALT are valori constant ridicate E. Malnutriţia determină nivele scăzute de ALT

8.Valori subunitare ale raportului de Rittis se ȋnregistrează ȋn: A. Leziuni moderate care afectează permeabilitatea membranei hepatocitelor B. Leziuni inflamatorii care afectează periferia lobulilor hepatici C. Ciroza hepatică decompensată parenchimatos D. Sarcină E. Metastaze hepatice

8.Valori subunitare ale raportului de Rittis se ȋnregistrează ȋn: A. Leziuni moderate care afectează permeabilitatea membranei hepatocitelor B. Leziuni inflamatorii care afectează periferia lobulilor hepatici C. Ciroza hepatică decompensată parenchimatos D. Sarcină E. Metastaze hepatice

9.Care dintre afirmaţii este adevărată? A. ALT se găseşte preponderent în muşchiul scheletic B. Viteza de excreţie în ser a ALT nu influenţează concentraţia sa C. În cadrul monitorizării evoluţiei hepatitelor virale B, C determinarea ALT nu este neapărat necesară D. Numărul de hepatocite lezate influenţează concentraţia serică a ALT E. Nici un răspuns corect

9.Care dintre afirmaţii este adevărată? A. ALT se găseşte preponderent în muşchiul scheletic B. Viteza de excreţie în ser a ALT nu influenţează concentraţia sa C. În cadrul monitorizării evoluţiei hepatitelor virale B, C determinarea ALT nu este neapărat necesară D. Numărul de hepatocite lezate influenţează concentraţia serică a ALT E. Nici un răspuns corect

10.Dozarea ALT: A. Este esenţială in prognosticul bolilor hepatice B. Presupune utilizarea de ser hemolizat sau plasmă C. Este un indicator relativ tardiv în cadrul suferinţelor acute hepatice D. Este mai puţin specifică decât dozarea AST ȋn aprecierea alterărilor hepatice E. Este utilă ȋn diagnosticul diferenţial al bolilor hepatobiliare şi pancreatice

10.Dozarea ALT: A. Este esenţială in prognosticul bolilor hepatice B. Presupune utilizarea de ser hemolizat sau plasmă C. Este un indicator relativ tardiv în cadrul suferinţelor acute hepatice D. Este mai puţin specifică decât dozarea AST ȋn aprecierea alterărilor hepatice E. Este utilă ȋn diagnosticul diferenţial al bolilor hepatobiliare şi pancreatice

60

60

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

GLUTAMIC OXALACETIC TRANSAMINAZA

GLUTAMIC OXALACETIC TRANSAMINAZA

(Aspartat Transaminaza) - (GOT, AST)

(Aspartat Transaminaza) - (GOT, AST)

2010

1. Consideraţii generale

1. Consideraţii generale

Transaminazele catalizeaza reacţia reversibilă, de transfer a unei grupari amino de la un α aminoacid la un α cetoacid. AST (TGO) – aspartataminotransferaza este o enzimă ce face parte din clasa transaminazelor şi catalizează transferul grupării amino de la acidul aspartic la acidul α cetoglutaric cu formare de acid oxalacetic şi acid glutamic.

Transaminazele catalizeaza reacţia reversibilă, de transfer a unei grupari amino de la un α aminoacid la un α cetoacid. AST (TGO) – aspartataminotransferaza este o enzimă ce face parte din clasa transaminazelor şi catalizează transferul grupării amino de la acidul aspartic la acidul α cetoglutaric cu formare de acid oxalacetic şi acid glutamic.

61

61

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

Spre deosebire de ALT care se găseşte în principal la nivelul ficatului, AST este întâlnită în mai multe ţesuturi: miocard, ficat, muşchi scheletici, rinichi, pancreas, ţesut cerebral, splină, plăman, eritrocite, fiind astfel un indicator mai puţin specific al funcţiei hepatice. La nivelul celulei hepatice, izoenzimele AST se găsesc atât în citosol, cât şi în mitocondrii. Concentraţia serică a AST variază în funcţie de:  numărul de celule afectate  gravitatea lezării fiecărei celule  viteza cu care s-au produs leziunile  viteza de eliminare în ser În situaţiile de afectare a unor celule, alături de creşterea în ser a enzimelor celulare, se produc şi modificări ale raporturilor dintre activităţile diverselor enzime. Astfel, la subiecţii sănătoşi raportul AST/ ALT (raportul De Rittis) este aproximativ de 1,3, în timp ce în cazurile de hepatită virală acest raport este subunitar datorită creşterii cu predominanţă a ALT. Mai mult, odată cu necrozarea teritoriului afectat, raportul de Rittis se modifică în sensul creşterii valorii, pe seama creşterii ALT asociată însă cu o creştere şi mai exprimata a AST. Recomandări pentru determinarea AST Valorile AST şi ALT cresc în aproape toate hepatopatiile, dar creşterea nivelului seric al AST poate fi întâlnită şi în numeroase afecţiuni extrahepatice, cu precădere în infarctul miocardic şi în boli ale muşchiului striat. 2. Principiul metodei

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

Spre deosebire de ALT care se găseşte în principal la nivelul ficatului, AST este întâlnită în mai multe ţesuturi: miocard, ficat, muşchi scheletici, rinichi, pancreas, ţesut cerebral, splină, plăman, eritrocite, fiind astfel un indicator mai puţin specific al funcţiei hepatice. La nivelul celulei hepatice, izoenzimele AST se găsesc atât în citosol, cât şi în mitocondrii. Concentraţia serică a AST variază în funcţie de:  numărul de celule afectate  gravitatea lezării fiecărei celule  viteza cu care s-au produs leziunile  viteza de eliminare în ser În situaţiile de afectare a unor celule, alături de creşterea în ser a enzimelor celulare, se produc şi modificări ale raporturilor dintre activităţile diverselor enzime. Astfel, la subiecţii sănătoşi raportul AST/ ALT (raportul De Rittis) este aproximativ de 1,3, în timp ce în cazurile de hepatită virală acest raport este subunitar datorită creşterii cu predominanţă a ALT. Mai mult, odată cu necrozarea teritoriului afectat, raportul de Rittis se modifică în sensul creşterii valorii, pe seama creşterii ALT asociată însă cu o creştere şi mai exprimata a AST. Recomandări pentru determinarea AST Valorile AST şi ALT cresc în aproape toate hepatopatiile, dar creşterea nivelului seric al AST poate fi întâlnită şi în numeroase afecţiuni extrahepatice, cu precădere în infarctul miocardic şi în boli ale muşchiului striat. 2. Principiul metodei

Se utilizează metoda cinetică UV recomandată de Federaţia Internaţională de Chimie Clinică (IFCC). AST prezent in probă catalizează transferul gruparii amino de la L-aspartat la α cetoglutarat (2-oxoglutarat) cu formare de oxaloacetat şi L-glutamat. Oxaloacetatul reacţionează cu NADH ȋn prezenţa malatdehidrogenazei (MDH) formând NAD şi L-malat. Rata de oxidare a NADH este direct proporţională cu activitatea catalitică a AST măsurată fotometric la 340nm.

Se utilizează metoda cinetică UV recomandată de Federaţia Internaţională de Chimie Clinică (IFCC). AST prezent in probă catalizează transferul gruparii amino de la L-aspartat la α cetoglutarat (2-oxoglutarat) cu formare de oxaloacetat şi L-glutamat. Oxaloacetatul reacţionează cu NADH ȋn prezenţa malatdehidrogenazei (MDH) formând NAD şi L-malat. Rata de oxidare a NADH este direct proporţională cu activitatea catalitică a AST măsurată fotometric la 340nm.

AST L  aspartat  2  oxoglutara t   oxaloaceta t  L  glutamat

AST L  aspartat  2  oxoglutara t   oxaloaceta t  L  glutamat

MDH Oxaloaceta t  NADH  H    L  malat  NAD 

MDH Oxaloaceta t  NADH  H    L  malat  NAD 

62

62

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

3. Reactivi

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

3. Reactivi

Reactiv 1 (R1) Tampon TRIS, pH=7,8 L-aspartat Reactiv 2 (R2): MDH LDH NADH α-Cetoglutarat

Reactiv 1 (R1) Tampon TRIS, pH=7,8 L-aspartat

88 mmol/L 260 mmol/L

Reactiv 2 (R2): MDH LDH NADH α-Cetoglutarat

 600 U/L  900 U/L 0.22 mmol/L 12 mmol/L

88 mmol/L 260 mmol/L

 600 U/L  900 U/L 0.22 mmol/L 12 mmol/L

4. Modul de lucru

4. Modul de lucru

Proba: Ser, plasmă fără hemoliză. Plasma poate fi colectată pe heparină sau EDTA. Pregatirea amestecului de lucru: se dizolvă conţinutul unui flacon de reactiv 2 (R2) sub formă de pulbere, in cantitatea corespunzătoare de reactiv 1 (R1). Se utilizează două eprubete (cuvete) – probă si martor (blank): P, M, ȋn care se pipeteaza:

Proba: Ser, plasmă fără hemoliză. Plasma poate fi colectată pe heparină sau EDTA. Pregatirea amestecului de lucru: se dizolvă conţinutul unui flacon de reactiv 2 (R2) sub formă de pulbere, in cantitatea corespunzătoare de reactiv 1 (R1). Se utilizează două eprubete (cuvete) – probă si martor (blank): P, M, ȋn care se pipeteaza:

Reactiv Amestec de lucru Proba Apă distilată (AD)

P (µl) 1000 100 -

M (µl) 1000 100

Dupa agitare amestecul se incubează la 37°C. Absorbanţa iniţială se citeşte dupa 1min, la 340 nm. Se repetă citirea absorbanţei la 2 şi 3 min la aceeaşi lungime de undă ȋn cuve de 1cm faţă de martor (citire in trei puncte) Se determina modificarea medie a absorbanţei per minut ΔA/min, care se foloseşte ȋn calcul. Citirea se poate efectua la 340 nm, 334 nm sau 365 nm. Calcul:

U / L  A / min xFactor Masurarea la F

Reactiv Amestec de lucru Proba Apă distilată (AD)

P (µl) 1000 100 -

M (µl) 1000 100

Dupa agitare amestecul se incubează la 37°C. Absorbanţa iniţială se citeşte dupa 1min, la 340 nm. Se repetă citirea absorbanţei la 2 şi 3 min la aceeaşi lungime de undă ȋn cuve de 1cm faţă de martor (citire in trei puncte) Se determina modificarea medie a absorbanţei per minut ΔA/min, care se foloseşte ȋn calcul. Citirea se poate efectua la 340 nm, 334 nm sau 365 nm. Calcul:

U / L  A / min xFactor

334 nm 1780

340 nm 1746

365 nm 3235

Masurarea la F

334 nm 1780

5. Valori de referinţă

5. Valori de referinţă

TGO < 40 U/L

TGO < 40 U/L 63

340 nm 1746

63

365 nm 3235

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

6. Variaţii patologice

6. Variaţii patologice

Această enzimă prezintă două izoenzime : AST 1 (GOT 1) izoenzimă situată în citosol şi care provine în circulaţie în mare parte de la nivelul globulelor roşii şi miocard şi AST 2 (GOT 2) – izoenzima mitocondrială, prezentă în cea mai mare parte în ficat. AST este crescută cu precădere în afectările hepatice severe. De asemenea creşteri ale ei se întâlnesc în afectări ale muşchiului cardiac (indicator destul de fidel al leziunilor din infarctul miocardic).

Această enzimă prezintă două izoenzime : AST 1 (GOT 1) izoenzimă situată în citosol şi care provine în circulaţie în mare parte de la nivelul globulelor roşii şi miocard şi AST 2 (GOT 2) – izoenzima mitocondrială, prezentă în cea mai mare parte în ficat. AST este crescută cu precădere în afectările hepatice severe. De asemenea creşteri ale ei se întâlnesc în afectări ale muşchiului cardiac (indicator destul de fidel al leziunilor din infarctul miocardic).

 VALORI CRESCUTE  cele mai ridicate valori (de 10 – 100 ori valorile normale) sunt întâlnite în: afecţiunile însoţite de necroză hepatică extinsă: hepatită virală, hepatită toxică, intoxicaţii cu tetraclorură de carbon, dar şi in infarctul de miocard, şoc de diferite origini stări septice intervenţii pe cord  în cazul infarctului miocardic eliberarea enzimei din celule are loc la 6-12 ore de la instalare, creşterea continuă fiind de regulă expresia extinderii leziunilor necrotice; nivelul maxim se înregistrează cel mai frecvent la 48 de ore de la apariţia leziunilor necrotice, după care revinerea la normal se întinde pe parcursul a 3-5 zile;  valori ale AST de 1000-9000 U/l, care scad la 50% în următoarele 3 zile sugerează ficat de şoc cu necroză centrolobulară (insuficienţă cardiacă congestivă, aritmii, sepsis, hemoragii); o creştere bruscă poate apărea şi în hepatita virală acută fulminantă (rar >4000 U/l);  creşterea şi scăderea rapidă sugerează obstrucţia biliară extrahepatică;  valori marcat crescute mai pot apărea în cazul agresiunilor şi alterărilor hepatice de natură traumatică sau neoplazică (cel mai frecvent metastaze) şi a celor musculare masive (de tipul rabdomiolizei, de exemplu);  valori moderat crescute apar în: o formele uşoare de hepatită virală acută

 VALORI CRESCUTE  cele mai ridicate valori (de 10 – 100 ori valorile normale) sunt întâlnite în: afecţiunile însoţite de necroză hepatică extinsă: hepatită virală, hepatită toxică, intoxicaţii cu tetraclorură de carbon, dar şi in infarctul de miocard, şoc de diferite origini stări septice intervenţii pe cord  în cazul infarctului miocardic eliberarea enzimei din celule are loc la 6-12 ore de la instalare, creşterea continuă fiind de regulă expresia extinderii leziunilor necrotice; nivelul maxim se înregistrează cel mai frecvent la 48 de ore de la apariţia leziunilor necrotice, după care revinerea la normal se întinde pe parcursul a 3-5 zile;  valori ale AST de 1000-9000 U/l, care scad la 50% în următoarele 3 zile sugerează ficat de şoc cu necroză centrolobulară (insuficienţă cardiacă congestivă, aritmii, sepsis, hemoragii); o creştere bruscă poate apărea şi în hepatita virală acută fulminantă (rar >4000 U/l);  creşterea şi scăderea rapidă sugerează obstrucţia biliară extrahepatică;  valori marcat crescute mai pot apărea în cazul agresiunilor şi alterărilor hepatice de natură traumatică sau neoplazică (cel mai frecvent metastaze) şi a celor musculare masive (de tipul rabdomiolizei, de exemplu);  valori moderat crescute apar în: o formele uşoare de hepatită virală acută

64

64

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

o hepatopatii cronice (hepatita cronică activă, ciroză), hepatită din cadrul alcoolismului, dar rareori depăşesc 300U/l (în hepatopatii alcoolice, ciroză: AST>ALT); o icter obstructiv o unele afecţiuni ale muşchilor scheletici o anemia hemolitică severă o mononucleoza infecţioasă, unde creşterea nivelului AST este proporţională cu afectarea hepatică o administrarea de opiacee la pacienţi cu afecţiuni ale tractului biliar (valori de 2-6 ori mai mari decât normal)

o hepatopatii cronice (hepatita cronică activă, ciroză), hepatită din cadrul alcoolismului, dar rareori depăşesc 300U/l (în hepatopatii alcoolice, ciroză: AST>ALT); o icter obstructiv o unele afecţiuni ale muşchilor scheletici o anemia hemolitică severă o mononucleoza infecţioasă, unde creşterea nivelului AST este proporţională cu afectarea hepatică o administrarea de opiacee la pacienţi cu afecţiuni ale tractului biliar (valori de 2-6 ori mai mari decât normal)

Limite şi interferenţe  Condiţii fiziologice - în sarcină pot să apară valori scăzute 6; o în ciroza hepatică – creşterile sunt în medie de 2 ori în ciroza posthepatitică şi în jur de 10 ori în ciroza alcoolică; o în ciroza biliară primitivă – GGT creşte paralel cu fosfataza alcalină, înaintea apariţiei icterului, creşterile putând ajunge până la de 13 ori limita superioară a normalului;

79

79

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

o în ficatul gras – de etiologie alcoolică GGT este aproximativ dublu şi persistă crescut mult timp după întreruperea consumului; în ficatul gras non-alcoolic predomină creşterea uşoară a aminotransferazelor, mai frecvent decât GGT; o în sindromul de colestază – GGT şi fosfataza alcalină cresc aproximativ în aceeaşi proporţie în colestaza mecanică şi virală, spre deosebire de colestaza indusă medicamentos în care GGT creşte mult mai mult decât fosfataza alcalină; în medie creşterile depăşesc de 6 ori normalul; în colestaza extrahepatică GGT creşte de >10 ori, GGT/TGO=3-6 în obstrucţia recentă şi >6 în obstrucţia de lungă durată; în colestaza intrahepatică (hepatita acută, sarcina, medicamente, boala Hodgkin, nutriţie parenterală, atrezia ductelor biliare etc.) creşterile GGT sunt mai mici; în sarcină GGT nu creşte la fel de mult ca fosfataza alcalină; o în tumorile hepatice primitive, metastazele hepatice – evoluţia este paralelă cu cea a fosfatazei alcaline şi creşterile pot depăşi de 14 ori valoarea normală; GGT este crescut la 90% din pacienţii cu metastaze, nivelurile normale excluzând practic prezenţa acestora, iar determinările seriate pot monitoriza răspunsul la chimioterapie; o în congestia hepatică – cronica GGT poate creşte de până la 5 ori, iar în cea acută (ex.: tromboza de vena portă), creşterea este mică comparativ cu cea a transaminazelor şi LDH.  Creşteri ale GGT se întâlnesc mereu în pancreatita acută. În cea cronică se observă creşteri doar când este implicat tractul biliar sau când este prezentă inflamaţia acută.  Abuzul de alcool sau alcoolismul ocult pot fi descoperite cu ajutorul GGT care este crescut.  VALORI SCĂZUTE GGT poate fi scăzut în următoarele cazuri: o Hipotiroidie o Consum de anticoncepţionale orale

80

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

o în ficatul gras – de etiologie alcoolică GGT este aproximativ dublu şi persistă crescut mult timp după întreruperea consumului; în ficatul gras non-alcoolic predomină creşterea uşoară a aminotransferazelor, mai frecvent decât GGT; o în sindromul de colestază – GGT şi fosfataza alcalină cresc aproximativ în aceeaşi proporţie în colestaza mecanică şi virală, spre deosebire de colestaza indusă medicamentos în care GGT creşte mult mai mult decât fosfataza alcalină; în medie creşterile depăşesc de 6 ori normalul; în colestaza extrahepatică GGT creşte de >10 ori, GGT/TGO=3-6 în obstrucţia recentă şi >6 în obstrucţia de lungă durată; în colestaza intrahepatică (hepatita acută, sarcina, medicamente, boala Hodgkin, nutriţie parenterală, atrezia ductelor biliare etc.) creşterile GGT sunt mai mici; în sarcină GGT nu creşte la fel de mult ca fosfataza alcalină; o în tumorile hepatice primitive, metastazele hepatice – evoluţia este paralelă cu cea a fosfatazei alcaline şi creşterile pot depăşi de 14 ori valoarea normală; GGT este crescut la 90% din pacienţii cu metastaze, nivelurile normale excluzând practic prezenţa acestora, iar determinările seriate pot monitoriza răspunsul la chimioterapie; o în congestia hepatică – cronica GGT poate creşte de până la 5 ori, iar în cea acută (ex.: tromboza de vena portă), creşterea este mică comparativ cu cea a transaminazelor şi LDH.  Creşteri ale GGT se întâlnesc mereu în pancreatita acută. În cea cronică se observă creşteri doar când este implicat tractul biliar sau când este prezentă inflamaţia acută.  Abuzul de alcool sau alcoolismul ocult pot fi descoperite cu ajutorul GGT care este crescut.  VALORI SCĂZUTE GGT poate fi scăzut în următoarele cazuri: o Hipotiroidie o Consum de anticoncepţionale orale

80

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

Diagnosticul diferenţial al afecţiunilor cu GGT crescut: GGT ↑

ALT 200U/L

Boli hepatice (hepatite, infecţii cu virus Epstein-Barr, toxice hepaticealcool/medicamente, steatoză nonalcoolică) Afecţiuni hepatocelulare concomitent cu boli colestatice (hepatită acută, hepatită cronică activă, toxice hepatice, neoplazii, abcese hepatice, chisturi)

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE Gama-glutamiltransferaza (GGT) este enzima ce catalizează tranferul grupării γ-glutamil de la un peptid donor la un aminoacid acceptor GGT măsurat în ser provine în principal din ficat, ea fiind prezentă şi în alte ţesuturi, cum ar fi tubii renali proximali, pancreas sau intestin Este singura enzimă ce poate cliva Glutationul (GSH) sau conjugaţi ai acestuia, în cadrul ciclului γ-glutamil. GGT este cel mai sensibil indicator al alcoolismului, deoarece valoarea ei creşte mult peste valorile celorlate enzime dozate în mod curent. Este folosită de asemenea şi pentru monitorizarea abstinenţei la alcool. GGT prezinta creşteri patologice în special în: 81

Inducţie enzimatică hepatică Exces de alcool Medicamente (barbiturice, benzodiazepine) Obezitate Diabet zaharat Steatoză hepatică Hipertrigliceridemie

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE Gama-glutamiltransferaza (GGT) este enzima ce catalizează tranferul grupării γ-glutamil de la un peptid donor la un aminoacid acceptor GGT măsurat în ser provine în principal din ficat, ea fiind prezentă şi în alte ţesuturi, cum ar fi tubii renali proximali, pancreas sau intestin Este singura enzimă ce poate cliva Glutationul (GSH) sau conjugaţi ai acestuia, în cadrul ciclului γ-glutamil. GGT este cel mai sensibil indicator al alcoolismului, deoarece valoarea ei creşte mult peste valorile celorlate enzime dozate în mod curent. Este folosită de asemenea şi pentru monitorizarea abstinenţei la alcool. GGT prezinta creşteri patologice în special în: 81

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

- afecţiuni hepatice, unde necesită corelarea cu enzimele specifice ficatului (TGP si TGO) şi cu enzimele de colestază, în special fosfataza alcalină - afecţiuni pancreatice acute excreţia se face în principal prin bilă, unde activitatea enzimei este de 10 ori mai mare decât cea plasmatică, iar o mica parte este degradată de rinichi şi eliminată prin urină.

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

- afecţiuni hepatice, unde necesită corelarea cu enzimele specifice ficatului (TGP si TGO) şi cu enzimele de colestază, în special fosfataza alcalină - afecţiuni pancreatice acute excreţia se face în principal prin bilă, unde activitatea enzimei este de 10 ori mai mare decât cea plasmatică, iar o mica parte este degradată de rinichi şi eliminată prin urină.

8. MCQ

8. MCQ

GGT1 Creşterile patologice ale GGT se întâlnesc cel mai frecvent in: A. Afecţuni renale B. Afecţiuni pancreatice C. Afecţiuni osoase D. Afecţiuni cardiace E. Afecţiuni hepatice

GGT1 Creşterile patologice ale GGT se întâlnesc cel mai frecvent in: A. Afecţuni renale B. Afecţiuni pancreatice C. Afecţiuni osoase D. Afecţiuni cardiace E. Afecţiuni hepatice

GGT2 Principala cale de excreţie a GGT-ului este: A. plasmă B. ser C. bilă D. urină E. LCR

GGT2 Principala cale de excreţie a GGT-ului este: A. plasmă B. ser C. bilă D. urină E. LCR

GGT3 Valori scăzute ale GGT se pot întâlni în urmatoarele situaţii: A. Hipotiroidism B. Guşa multinodulară C. Consum de anticoncepţionale orale D. Infarct miocardic acut E. Hepatita virală

GGT3 Valori scăzute ale GGT se pot întâlni în urmatoarele situaţii: A. Hipotiroidism B. Guşa multinodulară C. Consum de anticoncepţionale orale D. Infarct miocardic acut E. Hepatita virală

GGT4 Principala enzimă de colestază a cărei activitate trebuie corelată cu valoarea GGT pentru interpretarea valorilor patologice este: A. TGO B. TGP C. Fosfataza alcalină D. Feritina E. Bilirubina

GGT4 Principala enzimă de colestază a cărei activitate trebuie corelată cu valoarea GGT pentru interpretarea valorilor patologice este: A. TGO B. TGP C. Fosfataza alcalină D. Feritina E. Bilirubina

82

82

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

GGT5 Principala condiţie patologică diagnosticată prin valoarea crescuta a GGT este: A.hepatita virală B. alcoolismul C. hepatita autoimună D. infarctul miocardic acut E. litiaza renală GGT6 GGT-ul măsurat în ser poate proveni din urmatoarele surse: A. ficat B. creier C. inimă D. tubii renali proximali E. pancreas GGT7 Care din fracţiunile lipoproteice pot lega GGT pentru a-l transporta în plasmă: A. IDL B. HDL C. VLDL D. LDL E. chilomicroni GGT8 GGT este o enzimă ce transferă urmatoarea grupare proteică: A. gruparea amino B. gruparea carboxil C. gruparea γ-glutamil D. gruparea hidroxil E. gruparea tiol GGT9 GGT are o importanţă deosebită deoarece are capacitatea de a cliva cantităţi importante de: A. hemoglobină B. bilirubină C. amoniac D. glutation E. gastrină GGT10 GGT este prezent în următoarele ţesuturi, CU EXCEPŢIA: A. tubii renali proximali B. creier C. ficat D. muşchi E. pancreas

GGT5 Principala condiţie patologică diagnosticată prin valoarea crescuta a GGT este: A.hepatita virală B. alcoolismul C. hepatita autoimună D. infarctul miocardic acut E. litiaza renală GGT6 GGT-ul măsurat în ser poate proveni din urmatoarele surse: A. ficat B. creier C. inimă D. tubii renali proximali E. pancreas GGT7 Care din fracţiunile lipoproteice pot lega GGT pentru a-l transporta în plasmă: A. IDL B. HDL C. VLDL D. LDL E. chilomicroni GGT8 GGT este o enzimă ce transferă urmatoarea grupare proteică: A. gruparea amino B. gruparea carboxil C. gruparea γ-glutamil D. gruparea hidroxil E. gruparea tiol GGT9 GGT are o importanţă deosebită deoarece are capacitatea de a cliva cantităţi importante de: A. hemoglobină B. bilirubină C. amoniac D. glutation E. gastrină GGT10 GGT este prezent în următoarele ţesuturi, CU EXCEPŢIA: A. tubii renali proximali B. creier C. ficat D. muşchi E. pancreas

83

83

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

4.5. LACTAT DEHIDROGENAZA

4.5. LACTAT DEHIDROGENAZA

- LDH -

- LDH -

1. Consideraţii generale

2010

1. Consideraţii generale

 LDH este o enzimă care face parte din categoria oxidoreductazelor (implicate în transferul protonilor între substrate), şi care catalizează interconversia piruvatului în lactat. Este o dehidrogenază NAD-dependentă, citoplasmatică, ce se eliberează în condiţii fiziologice în cantităţi reduse, din paleta enzimatică deosebit de bogată a celulelor variatelor organe şi ţesuturi.  LDH este o enzimă intracelulară larg distribuită în organism, fiind întâlnită cu precădere în rinichi, miocard, musculatura scheletică, creier, ficat şi plămâni.  Investigarea acestei enzime este utilă pentru confirmarea diagnosticului de infarct miocardic sau pulmonar. În infarctul miocardic persistenţa nivelului LDH crescut este mai îndelungată decât a celorlalte enzime asociate, fiind astfel un element sugestiv în aprecierea diagnosticului de alterare miocardică.  LDH este o enzimă tetramerică ce prezintă două tipuri de lanţuri: de tip H (heart) si M (muscle), combinarea diferită a acestora conducând la existenţa a 5 izoenzime: LDH1 (H4) / LDH2 (H3M) / LDH3 (H2M2) / LDH4 (HM3) / LDH5 (M4).  Aceste izoenzime au origine diferită iar prezenţa lor ȋn cantităţi anormale ȋn sânge poate orienta diagnosticul, cunoscut fiind faptul că necroza ţesutului de origine conduce la eliberarea excesivă a enzimei ȋn circulaţie:  LDH1 si LDH2 –în miocard şi eritrocite  LDH3 – plămâni, splină, pancreas, placentă  LDH4 - ficat şi muşchi scheletici  LDH5 – ficat şi muşchi scheletici.  Inima conţine variantele bogate în monomerul H: LDH1 şi LDH2, iar ficatul -izoenzima lentă - LDH5. Cele 5 izoenzime ale LDH au mobilitate electroforetică diferită, izoenzimele cardiace fiind cele mai rapide, iar cele musculare/ hepatice cele mai lente. 84

 LDH este o enzimă care face parte din categoria oxidoreductazelor (implicate în transferul protonilor între substrate), şi care catalizează interconversia piruvatului în lactat. Este o dehidrogenază NAD-dependentă, citoplasmatică, ce se eliberează în condiţii fiziologice în cantităţi reduse, din paleta enzimatică deosebit de bogată a celulelor variatelor organe şi ţesuturi.  LDH este o enzimă intracelulară larg distribuită în organism, fiind întâlnită cu precădere în rinichi, miocard, musculatura scheletică, creier, ficat şi plămâni.  Investigarea acestei enzime este utilă pentru confirmarea diagnosticului de infarct miocardic sau pulmonar. În infarctul miocardic persistenţa nivelului LDH crescut este mai îndelungată decât a celorlalte enzime asociate, fiind astfel un element sugestiv în aprecierea diagnosticului de alterare miocardică.  LDH este o enzimă tetramerică ce prezintă două tipuri de lanţuri: de tip H (heart) si M (muscle), combinarea diferită a acestora conducând la existenţa a 5 izoenzime: LDH1 (H4) / LDH2 (H3M) / LDH3 (H2M2) / LDH4 (HM3) / LDH5 (M4).  Aceste izoenzime au origine diferită iar prezenţa lor ȋn cantităţi anormale ȋn sânge poate orienta diagnosticul, cunoscut fiind faptul că necroza ţesutului de origine conduce la eliberarea excesivă a enzimei ȋn circulaţie:  LDH1 si LDH2 –în miocard şi eritrocite  LDH3 – plămâni, splină, pancreas, placentă  LDH4 - ficat şi muşchi scheletici  LDH5 – ficat şi muşchi scheletici.  Inima conţine variantele bogate în monomerul H: LDH1 şi LDH2, iar ficatul -izoenzima lentă - LDH5. Cele 5 izoenzime ale LDH au mobilitate electroforetică diferită, izoenzimele cardiace fiind cele mai rapide, iar cele musculare/ hepatice cele mai lente. 84

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

 Modificarea ratei intrării LDH în sânge este determinată de amploarea leziunii ţesutului, iar rata de îndepărtare a LDH din sange depinde de:  timpul de injumătăţire diferit al enzimelor plasmatice (LDH1-113 ore, LDH5-10ore)  modul diferit de eliminare

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

 Modificarea ratei intrării LDH în sânge este determinată de amploarea leziunii ţesutului, iar rata de îndepărtare a LDH din sange depinde de:  timpul de injumătăţire diferit al enzimelor plasmatice (LDH1-113 ore, LDH5-10ore)  modul diferit de eliminare

CH3 CH3 | LDH | C=O =============== CH-OH | NADH+H+ ¬>NAD+ | COOH COOH

CH3 CH3 | LDH | C=O =============== CH-OH | NADH+H+ ¬>NAD+ | COOH COOH

piruvat

piruvat

lactat

2010

lactat

2. Principiul determinării

2. Principiul determinării

Metoda cinetică pentru determinarea LDH este recomandată de Societatea Germană de Chimie Clinică (DGKC). LDH catalizează conversia piruvatului la L-lactat în prezenţa NADH care se oxidează la NAD+. Rata de oxidare a NADH este proporţională cu activitatea catalitică a LDH.

Metoda cinetică pentru determinarea LDH este recomandată de Societatea Germană de Chimie Clinică (DGKC). LDH catalizează conversia piruvatului la L-lactat în prezenţa NADH care se oxidează la NAD+. Rata de oxidare a NADH este proporţională cu activitatea catalitică a LDH.

LDH Piruvat  NADH  H    L  Lactat  NAD 

3. Reactivi Reactiv 1 (R1) Tampon fosfat, pH 7,5 Piruvat Reactiv 2 (R2) NADH

LDH Piruvat  NADH  H    L  Lactat  NAD 

3. Reactivi 56 mmol/L 1,6 mmol/L

Reactiv 1 (R1) Tampon fosfat, pH 7,5 Piruvat

56 mmol/L 1,6 mmol/L

240 µmol/L

Reactiv 2 (R2) NADH

240 µmol/L

4. Modul de lucru

4. Modul de lucru

Proba: Ser nehemolizat Temperatura de incubare: 37oC. Lungimea de undă: 340 nm (334nm, 365 nm)

Proba: Ser nehemolizat Temperatura de incubare: 37oC. Lungimea de undă: 340 nm (334nm, 365 nm)

85

85

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

Pregătirea amestecului de lucru: se amestecă 1 volum reactiv 1 (R1) cu 1 volum reactiv 2 (R2). Se omogenizează amestecul prin agitare uşoară. Pentru lucru se utilizează două cuvete – probă (P) şi martor (M) în care se pipetează: Reactiv Amestec de lucru Proba Apă distilată (AD)

P (µl) 1000 25 -

M (µl) 1000 25

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

Pregătirea amestecului de lucru: se amestecă 1 volum reactiv 1 (R1) cu 1 volum reactiv 2 (R2). Se omogenizează amestecul prin agitare uşoară. Pentru lucru se utilizează două cuvete – probă (P) şi martor (M) în care se pipetează: Reactiv Amestec de lucru Proba Apă distilată (AD)

P (µl) 1000 25 -

M (µl) 1000 25

După omogenizarea amestecurilor prin agitare uşoară se incubează la 37°C timp de 1 min. După incubare se citeşte absorbanţa iniţială la 340 nm a martorului şi probei apoi se repetă citirea absorbanţei la 1, 2, 3 min la aceeaşi lungime de undă. Se determină valoarea medie a absorbanţei per minut ΔA/min, care se foloseşte în calcul. Citirea se poate efectua la 340 nm, 334 nm sau 365 nm.

După omogenizarea amestecurilor prin agitare uşoară se incubează la 37°C timp de 1 min. După incubare se citeşte absorbanţa iniţială la 340 nm a martorului şi probei apoi se repetă citirea absorbanţei la 1, 2, 3 min la aceeaşi lungime de undă. Se determină valoarea medie a absorbanţei per minut ΔA/min, care se foloseşte în calcul. Citirea se poate efectua la 340 nm, 334 nm sau 365 nm.

Calcul: Valoarea activităţii enzimatice a LDH ȋn probă se calculează utilizând formula: Activitatea LDH U / L  A / min xFactor Valoarea factorului F depinde de lungimea de unda utilizata. Astfel, pentru:

Calcul: Valoarea activităţii enzimatice a LDH ȋn probă se calculează utilizând formula: Activitatea LDH U / L  A / min xFactor Valoarea factorului F depinde de lungimea de unda utilizata. Astfel, pentru:

 F

 F

334 nm 8252

340 nm 8450

365 nm 15000

334 nm 8252

340 nm 8450

365 nm 15000

5. Valori de referinţă

5. Valori de referinţă

125 – 250 U/L (valorile de referinţă variază ȋn funcţie de metoda folosită)

125 – 250 U/L (valorile de referinţă variază ȋn funcţie de metoda folosită)

6. VARIAŢII PATOLOGICE

6. VARIAŢII PATOLOGICE

 Valori crescute

 Valori crescute

Valoarea totală modificată a acestei enzime în sânge poate apare în orice situaţie patologică caracterizată prin degradarea citosolică, cel mai frecvent în:

Valoarea totală modificată a acestei enzime în sânge poate apare în orice situaţie patologică caracterizată prin degradarea citosolică, cel mai frecvent în:

86

86

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

 boli cardiovasculare, în special în cazul Infarctului miocardic (IMA), insuficienţa cardiacă  unele afecţiuni musculare (distrofii, traumatisme)  cancer (leucemii, limfoame – datorită diviziunii celulare aberante a celulelor tumorale, cu citoliza consecutivă şi eliberarea conţinutului celular ȋn sânge)  boli hematologice (Anemii megaloblastice şi hemolitice)  boli hepatice (hepatita acută virală, ciroză, alcoolism)  boli pulmonare (infarct pulmonar)  necroză tisulară sau cei care au suferit şocuri calorice  eforturi fizice mari  sarcină  postoperator (datorită acţiunii agenţilor anestezici, sau a unor preparate anticoagulante cum este dicumarolul)  hipotiroidism  convulsii, delirium tremens  şoc, hipoxie, hipotensiune  hipertermie  infarct renal  pancreatită acută Efortul fizic susţinut precum şi efortul din cursul travaliului pot determina creşteri ale LDH. Afecţiunile cutanate pot produce false creşteri ale LDH. De menţionat de asemeni, este şi faptul că o probă de sânge hemolizat poate aduce rezutate fals crescute ale activităţii acestei enzime.

 boli cardiovasculare, în special în cazul Infarctului miocardic (IMA), insuficienţa cardiacă  unele afecţiuni musculare (distrofii, traumatisme)  cancer (leucemii, limfoame – datorită diviziunii celulare aberante a celulelor tumorale, cu citoliza consecutivă şi eliberarea conţinutului celular ȋn sânge)  boli hematologice (Anemii megaloblastice şi hemolitice)  boli hepatice (hepatita acută virală, ciroză, alcoolism)  boli pulmonare (infarct pulmonar)  necroză tisulară sau cei care au suferit şocuri calorice  eforturi fizice mari  sarcină  postoperator (datorită acţiunii agenţilor anestezici, sau a unor preparate anticoagulante cum este dicumarolul)  hipotiroidism  convulsii, delirium tremens  şoc, hipoxie, hipotensiune  hipertermie  infarct renal  pancreatită acută Efortul fizic susţinut precum şi efortul din cursul travaliului pot determina creşteri ale LDH. Afecţiunile cutanate pot produce false creşteri ale LDH. De menţionat de asemeni, este şi faptul că o probă de sânge hemolizat poate aduce rezutate fals crescute ale activităţii acestei enzime.

 Valori scăzute Scăderea valorilor LDH poate fi ȋntâlnită ȋn terapia antineoplazică (cancer) şi indică evoluţia optimă a terapiei şi răspuns bun la acţiunea agenţilor farmacologici.

 Valori scăzute Scăderea valorilor LDH poate fi ȋntâlnită ȋn terapia antineoplazică (cancer) şi indică evoluţia optimă a terapiei şi răspuns bun la acţiunea agenţilor farmacologici.

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE

LDH este o enzimă din clasa oxidoreductazelor, o dehidrogenază NAD-dependentă, citoplasmatică, ce se eliberează în condiţii fiziologice în cantităţi reduse, din garnitura enzimatică deosebit de bogată a celulelor variatelor organe şi ţesuturi. LDH este o enzimă tetramerică ce prezintă două tipuri de lanţuri: de tip H (heart) si M (muscle), şi de aceea se prezintă sub forma a 5 izoenzime: 87

LDH este o enzimă din clasa oxidoreductazelor, o dehidrogenază NAD-dependentă, citoplasmatică, ce se eliberează în condiţii fiziologice în cantităţi reduse, din garnitura enzimatică deosebit de bogată a celulelor variatelor organe şi ţesuturi. LDH este o enzimă tetramerică ce prezintă două tipuri de lanţuri: de tip H (heart) si M (muscle), şi de aceea se prezintă sub forma a 5 izoenzime: 87

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

LDH1 si LDH2 –în miocard, eritrocite  LDH3 – plămâni, splină, placentă, pancreas  LDH4 - ficat şi muşchi scheletici  LDH5 – ficat şi muşchi scheletici LDH se găseşte în aproape toate ţesuturile organismului, de aceea creşterea nivelului LDH are o valoare diagnostică limitată în absenţa corelării cu datele clinice şi alte investigaţii de laborator. Analiza LDH şi a izoenzimelor sale este utilă ȋn:  diagnosticul retroactiv al infarctului miocardic  stabilirea gradului de activitate al bolii în alveolita fibrozantă  diagnosticul hemolizei in vivo (anemii hemolitice) sau in vitro  diagnosticul diferenţial ȋn IMA, Anemia megaloblastică, Anemia hemolitică  monitorizarea terapiei citostatice în diverse tumori Unele medicamentele pot interfera cu valoarea serică a acestei enzime,determinând false creşteri ale enzimei serice: anestezice, aspirină, azitromicină, cefalosporine, heparină, antiinflamatoare nesteroidiene 

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

LDH1 si LDH2 –în miocard, eritrocite  LDH3 – plămâni, splină, placentă, pancreas  LDH4 - ficat şi muşchi scheletici  LDH5 – ficat şi muşchi scheletici LDH se găseşte în aproape toate ţesuturile organismului, de aceea creşterea nivelului LDH are o valoare diagnostică limitată în absenţa corelării cu datele clinice şi alte investigaţii de laborator. Analiza LDH şi a izoenzimelor sale este utilă ȋn:  diagnosticul retroactiv al infarctului miocardic  stabilirea gradului de activitate al bolii în alveolita fibrozantă  diagnosticul hemolizei in vivo (anemii hemolitice) sau in vitro  diagnosticul diferenţial ȋn IMA, Anemia megaloblastică, Anemia hemolitică  monitorizarea terapiei citostatice în diverse tumori Unele medicamentele pot interfera cu valoarea serică a acestei enzime,determinând false creşteri ale enzimei serice: anestezice, aspirină, azitromicină, cefalosporine, heparină, antiinflamatoare nesteroidiene 

8. MCQ

8. MCQ

LDH 1. LDH este o enzimă din clasa: A. Hidrolazelor B. Oxidoreductazelor C. Transferazelor D. Mutazelor E. Nici un răspuns correct

LDH 1. LDH este o enzimă din clasa: A. Hidrolazelor B. Oxidoreductazelor C. Transferazelor D. Mutazelor E. Nici un răspuns correct

LDH 2. LDH este o enzimă ce catalizează: A. Transformarea etanolaminei în colină B. Trecerea piruvatului în α cetoglutarat C. Interconversia piruvatului în lactat D. Interconversia piruvatului în OAA E. Transformarea piruvatului în acetil CoA

LDH 2. LDH este o enzimă ce catalizează: A. Transformarea etanolaminei în colină B. Trecerea piruvatului în α cetoglutarat C. Interconversia piruvatului în lactat D. Interconversia piruvatului în OAA E. Transformarea piruvatului în acetil CoA

88

2010

88

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

LDH 3. Distribuţia în organism a enzimei LDH o reprezintă următoarele organe, CU EXCEPŢIA: A. Creier B. Miocard C. Intestin D. Muşchi scheletic E. Ficat

LDH 3. Distribuţia în organism a enzimei LDH o reprezintă următoarele organe, CU EXCEPŢIA: A. Creier B. Miocard C. Intestin D. Muşchi scheletic E. Ficat

LDH 4. Investigarea enzimei LDH este utilă în confirmarea diagnosticului de: A. Hepatită B. Infarctul pulmonar C. Pancreatită D. Infarct miocardic E. Peritonită

LDH 4. Investigarea enzimei LDH este utilă în confirmarea diagnosticului de: A. Hepatită B. Infarctul pulmonar C. Pancreatită D. Infarct miocardic E. Peritonită

LDH 5. Valorile de referinţă ale LDH în ser sunt: A. 200-500UI/L B. 35- 130 UI/L C. 125-250 U/L D. 80-340 UI/L E. Nici un răspuns corect

LDH 5. Valorile de referinţă ale LDH în ser sunt: A. 200-500UI/L B. 35- 130 UI/L C. 125-250 U/L D. 80-340 UI/L E. Nici un răspuns corect

LDH 6. Valori crescute ale enzimei LDH pot apare în: A. Infarct miocardic B. Hepatite C. Pancreatite D. Ocluzie intestinală E. Efort muscular prelungit

LDH 6. Valori crescute ale enzimei LDH pot apare în: A. Infarct miocardic B. Hepatite C. Pancreatite D. Ocluzie intestinală E. Efort muscular prelungit

LDH 7.Una dintre următoarele afecţiuni este caracterizată de creşteri ale nivelului LDH: A. Gastrită B. Anemia hemolitică C. Hipertiroidie D. Diabet E. Nici un răspuns corect

LDH 7.Una dintre următoarele afecţiuni este caracterizată de creşteri ale nivelului LDH: A. Gastrită B. Anemia hemolitică C. Hipertiroidie D. Diabet E. Nici un răspuns corect

LDH 8. Analiza LDH este utilă în : A. Diagnosticul retroactiv al infarctului miocardic

LDH 8. Analiza LDH este utilă în : A. Diagnosticul retroactiv al infarctului miocardic

89

89

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

B. Diagnosticul precoce al rahitismului C. Monitorizarea terapiei citostatice în diverse tumori D. Evaluarea răspunsului la tratament în tetanie E. Diagnosticul diferenţial al anemiilor

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

B. Diagnosticul precoce al rahitismului C. Monitorizarea terapiei citostatice în diverse tumori D. Evaluarea răspunsului la tratament în tetanie E. Diagnosticul diferenţial al anemiilor

LDH 9. Fiziologic întâlnim valori crescute ale LDH în: A. Sarcină B. Efort musculat prelungit C. Efort intelectual susţinut D. Menopauză E. La sugar în primele luni de viaţă

LDH 9. Fiziologic întâlnim valori crescute ale LDH în: A. Sarcină B. Efort musculat prelungit C. Efort intelectual susţinut D. Menopauză E. La sugar în primele luni de viaţă

LDH 10. Următoarele afecţiuni pot fi caracterizate de o creştere a LDH-ului CU EXCEPŢIA: A. Pancreatita B. Infarctul miocardic C. Anemia megaloblastică D. Hipotiroidism E. Nici un răspuns corect

LDH 10. Următoarele afecţiuni pot fi caracterizate de o creştere a LDH-ului CU EXCEPŢIA: A. Pancreatita B. Infarctul miocardic C. Anemia megaloblastică D. Hipotiroidism E. Nici un răspuns corect

90

90

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

4.6. CREATINKINAZA 1. Consideraţii generale

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

4.6. CREATINKINAZA 1. Consideraţii generale

 Creatinkinaza (CK) – cunoscută şi sub numele de creatinfosfokinaza, este o enzimă care catalizează interconversia creatinei în creatin fosfat (compus macroergic, adevarată rezervă energetică a muşchiului), printr-o reacţie reversibilă, cu consum (şi respectiv descompunere) de ATP.  Creatinkinaza se găseşte în concentraţii crescute în miocard şi muşchii scheletici şi, în concentraţii mult mai mici, la nivelul creierului; la nivel muscular aceasta catalizează reacţia reversibilă de sinteză şi utilizare a creatinfosfatului.  Creatinkinaza are o structură dimerică, cu lanţuri de aminoacizi de tip M (muscle) şi B (brain), prin a căror combinare se formeaza cele trei izoenzime (forme moleculare distincte ale aceleiaşi enzime):  CK-MM (musculară)  CK-MB (miocardică)  CK-BB (cerebrală)  CK-BB este localizată în creier, plămâni, tub digestiv, pancreas, rinichi, uter, prostată (în ser, în mod normal, nu este detectată CK-BB);  CK-MM este localizată predominant în musculatura striată şi în miocard şi reprezintă 95-100% din creatinkinaza serică; are trei izoforme (CK-MM1, CK-MM2 şi CK-MM3).  CK-MB este prezentă în miocard, musculatura striată, uter şi prostată; ea are două izoforme (CK-MB1 şi CK-MB2); în ser, reprezintă 0-5% din creatinkinaza totală.  Aproximativ 80% din activitatea creatinkinazei în miocard e reprezentată de izoenzima CK-MM, CK-MB reprezentând doar 20% (este relativ specifică miocardului). Creşterea CK la valori de peste două ori mai mari peste dublul limitei superioare a normalului şi o activitate CK-MB de peste 5% din activitatea totală a CK sunt sugestive pentru infarct miocardic. Mai mult, o creştere succesivă cu 50% a valorilor CK, pe probe de sânge recoltate la interval de 4-12 h, sunt extrem de sugestive pentru confirmarea diagnosticului de IMA (infarct miocardic acut). 91

 Creatinkinaza (CK) – cunoscută şi sub numele de creatinfosfokinaza, este o enzimă care catalizează interconversia creatinei în creatin fosfat (compus macroergic, adevarată rezervă energetică a muşchiului), printr-o reacţie reversibilă, cu consum (şi respectiv descompunere) de ATP.  Creatinkinaza se găseşte în concentraţii crescute în miocard şi muşchii scheletici şi, în concentraţii mult mai mici, la nivelul creierului; la nivel muscular aceasta catalizează reacţia reversibilă de sinteză şi utilizare a creatinfosfatului.  Creatinkinaza are o structură dimerică, cu lanţuri de aminoacizi de tip M (muscle) şi B (brain), prin a căror combinare se formeaza cele trei izoenzime (forme moleculare distincte ale aceleiaşi enzime):  CK-MM (musculară)  CK-MB (miocardică)  CK-BB (cerebrală)  CK-BB este localizată în creier, plămâni, tub digestiv, pancreas, rinichi, uter, prostată (în ser, în mod normal, nu este detectată CK-BB);  CK-MM este localizată predominant în musculatura striată şi în miocard şi reprezintă 95-100% din creatinkinaza serică; are trei izoforme (CK-MM1, CK-MM2 şi CK-MM3).  CK-MB este prezentă în miocard, musculatura striată, uter şi prostată; ea are două izoforme (CK-MB1 şi CK-MB2); în ser, reprezintă 0-5% din creatinkinaza totală.  Aproximativ 80% din activitatea creatinkinazei în miocard e reprezentată de izoenzima CK-MM, CK-MB reprezentând doar 20% (este relativ specifică miocardului). Creşterea CK la valori de peste două ori mai mari peste dublul limitei superioare a normalului şi o activitate CK-MB de peste 5% din activitatea totală a CK sunt sugestive pentru infarct miocardic. Mai mult, o creştere succesivă cu 50% a valorilor CK, pe probe de sânge recoltate la interval de 4-12 h, sunt extrem de sugestive pentru confirmarea diagnosticului de IMA (infarct miocardic acut). 91

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

 Evidenţierea modificărilor izoenzimei CK-MM este independentă de cantitatea de ţesut lezat, in timp ce activitatea CK totală depinde de dimensiunile zonei de infarct. La indivizii sănătoşi, nivelul creatinkinazei totale este dat, aproape în totalitate, de izoenzima MM.  În cazul lezării cerebrale, a miocardului sau a muşchilor scheletici, CK ȋnregistrează creşteri semnificative în primele 6 ore, cu un maxim în 15-20 de ore de la debut, şi revenirea la valorile normale în 48-72 de ore.  Raportul izoenzimelor MM-3/MM-1 poate fi sugestiv ȋn cazurile de alterare necrotică a ţesutului miocardic, nivelul normal al acestuia oscilând în jurul valorii de 1,3. În cazul pacienţilor cu IMA, valoarea acestui raport poate creşte de câteva ori, uneori la valori de peste 14 (MM-1 este continuu eliminată în sânge).  Mai mult, valoarea raportului dintre cele doua izoforme ale CK are valoare semnificativă în aprecierea eficienţei terapeutice, un eşec al tratamentului fibrinolitic fiind asociat cu maximizarea valorilor acestui raport după 12 ore de la începerea tratamentului (în loc de 4 ore, cât durează atingerea maximului, în cazul unui succes terapeutic).

 Evidenţierea modificărilor izoenzimei CK-MM este independentă de cantitatea de ţesut lezat, in timp ce activitatea CK totală depinde de dimensiunile zonei de infarct. La indivizii sănătoşi, nivelul creatinkinazei totale este dat, aproape în totalitate, de izoenzima MM.  În cazul lezării cerebrale, a miocardului sau a muşchilor scheletici, CK ȋnregistrează creşteri semnificative în primele 6 ore, cu un maxim în 15-20 de ore de la debut, şi revenirea la valorile normale în 48-72 de ore.  Raportul izoenzimelor MM-3/MM-1 poate fi sugestiv ȋn cazurile de alterare necrotică a ţesutului miocardic, nivelul normal al acestuia oscilând în jurul valorii de 1,3. În cazul pacienţilor cu IMA, valoarea acestui raport poate creşte de câteva ori, uneori la valori de peste 14 (MM-1 este continuu eliminată în sânge).  Mai mult, valoarea raportului dintre cele doua izoforme ale CK are valoare semnificativă în aprecierea eficienţei terapeutice, un eşec al tratamentului fibrinolitic fiind asociat cu maximizarea valorilor acestui raport după 12 ore de la începerea tratamentului (în loc de 4 ore, cât durează atingerea maximului, în cazul unui succes terapeutic).

Recomandări pentru determinarea creatinkinazei Dozarea CK-MB asociat cu CK total este intens recomandată în cazul pacienţilor care acuză durere toracică. Valoarea anormală a CK sugerează o alterare fie la nivelul muşchiului inimii, fie al altor muşchi, nivelul CK-MB putând orienta asupra diferenţierii celor două surse. Nivelul seric al izoenzimei CK-MB oferă medicului clinician o dublă imagine, atât asupra dimensiunii zonei infarctizate din miocard (ȋntrucât este singura izoenzimă care are origine numai la acest nivel), precum şi asupra succesului terapeutic, prin urmărirea în dinamică a valorilor. Limite şi interferenţe Rezultatele fals negative pot fi urmarea unei necoordonări în timp a recoltărilor (de exemplu recoltarea la 72 ore de la producerea IMA), în timp ce nivelul enzimei poate înregistra valori crescute tranzitoriu, în urmatoarele situaţii: efortul fizic susţinut, travaliu, injecţii intramusculare,  răni grave la nivelul muşchilor scheletici, administrarea unor medicamente (amfotericină B, captopril, clorpromazină, clofibrat, clonidină, diclofenac, digoxin, lovastatin, insulină, propranolol, trimetroprim).

Recomandări pentru determinarea creatinkinazei Dozarea CK-MB asociat cu CK total este intens recomandată în cazul pacienţilor care acuză durere toracică. Valoarea anormală a CK sugerează o alterare fie la nivelul muşchiului inimii, fie al altor muşchi, nivelul CK-MB putând orienta asupra diferenţierii celor două surse. Nivelul seric al izoenzimei CK-MB oferă medicului clinician o dublă imagine, atât asupra dimensiunii zonei infarctizate din miocard (ȋntrucât este singura izoenzimă care are origine numai la acest nivel), precum şi asupra succesului terapeutic, prin urmărirea în dinamică a valorilor. Limite şi interferenţe Rezultatele fals negative pot fi urmarea unei necoordonări în timp a recoltărilor (de exemplu recoltarea la 72 ore de la producerea IMA), în timp ce nivelul enzimei poate înregistra valori crescute tranzitoriu, în urmatoarele situaţii: efortul fizic susţinut, travaliu, injecţii intramusculare,  răni grave la nivelul muşchilor scheletici, administrarea unor medicamente (amfotericină B, captopril, clorpromazină, clofibrat, clonidină, diclofenac, digoxin, lovastatin, insulină, propranolol, trimetroprim).

92

92

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

2. Principiul metodei

2. Principiul metodei

Metoda cinetica pentru determinarea CK in prezenta N-acetil-Lcisteinei (NAC) este recomandată de Federaţia Internaţională de Chimie Clinică (IFCC) şi Societatea Germană de Chimie Clinică (DGKC). CK activată de NAC, catalizează transferul grupării fosfat de la creatin fosfat la ADP cu formare de ATP şi creatină. ATP-ul participă la fosforilarea glucozei ȋn prezenţa HK cu formare de glucoza-6-fosfat (G-6P), care in prezenţa NADP şi G-6-P-DH este oxidată la D-6-fosfogluconat. Concomitent are loc reducerea NADP la NADPH. Rata de formare a NADPH monitorizată la 340 nm este direct proporţională cu activitatea catalitică a CK. Schema de reacţii este redată mai jos:

Metoda cinetica pentru determinarea CK in prezenta N-acetil-Lcisteinei (NAC) este recomandată de Federaţia Internaţională de Chimie Clinică (IFCC) şi Societatea Germană de Chimie Clinică (DGKC). CK activată de NAC, catalizează transferul grupării fosfat de la creatin fosfat la ADP cu formare de ATP şi creatină. ATP-ul participă la fosforilarea glucozei ȋn prezenţa HK cu formare de glucoza-6-fosfat (G-6P), care in prezenţa NADP şi G-6-P-DH este oxidată la D-6-fosfogluconat. Concomitent are loc reducerea NADP la NADPH. Rata de formare a NADPH monitorizată la 340 nm este direct proporţională cu activitatea catalitică a CK. Schema de reacţii este redată mai jos:

CK Creatinosf at  ADP  Creatina  ATP

CK Creatinosf at  ADP  Creatina  ATP

ATP  D  glucoza HK  ADP  G  6  P

ATP  D  glucoza HK  ADP  G  6  P

 6  P  DH G  6  P  NADP  G   6  PG  NADPH  H 

 6  P  DH G  6  P  NADP  G   6  PG  NADPH  H 

3. Reactivi

3. Reactivi

Reactiv 1 (R1): Tampon imidazol, pH 6,7 Reactiv 2 (R2): Creatin fosfat D-glucoza NAC Acetat de magneziu EDTA ADP NADP AMP Diadenozin pentafosfat G-6-P-DH HK

100 mmol/L

Reactiv 1 (R1): Tampon imidazol, pH 6,7

100 mmol/L

30 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L 10 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L 5 mmol/L 10 µmol/L > 1500 U/L > 2500 U/L

Reactiv 2 (R2): Creatin fosfat D-glucoza NAC Acetat de magneziu EDTA ADP NADP AMP Diadenozin pentafosfat G-6-P-DH HK

30 mmol/L 20 mmol/L 20 mmol/L 10 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L 5 mmol/L 10 µmol/L > 1500 U/L > 2500 U/L

4. Mod de lucru Proba: Ser nehemolizat/ Plasmă. Plasma poate fi colectată pe heparinat de sodiu sau heparinat de litiu.

4. Mod de lucru Proba: Ser nehemolizat/ Plasmă. Plasma poate fi colectată pe heparinat de sodiu sau heparinat de litiu.

93

93

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

Temperatura de incubare: 37oC. Lungimea de undă: 340 nm (334nm - 365 nm) Pregătirea amestecului de lucru: se amestecă 4 volume de Reactiv 1 (R1) cu un volum Reactiv 2 (R2) (Ex.: 4 ml R1 + 1 ml R2). Se omogenizează amestecul prin agitare uşoară. Pentru lucru se utilizează doua cuvete de 1 cm (eprubete) – probă (P) şi martor (M) ȋn care se pipetează: Reactiv Amestec de lucru Proba Apă distilată (AD)

P (µl) 1000 40 -

M (µl) 1000 40

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

Temperatura de incubare: 37oC. Lungimea de undă: 340 nm (334nm - 365 nm) Pregătirea amestecului de lucru: se amestecă 4 volume de Reactiv 1 (R1) cu un volum Reactiv 2 (R2) (Ex.: 4 ml R1 + 1 ml R2). Se omogenizează amestecul prin agitare uşoară. Pentru lucru se utilizează doua cuvete de 1 cm (eprubete) – probă (P) şi martor (M) ȋn care se pipetează: Reactiv Amestec de lucru Proba Apă distilată (AD)

P (µl) 1000 40 -

M (µl) 1000 40

Dupa omogenizarea amestecurilor prin agitare uşoară se incubează la 37°C timp de 3 min. Dupa incubare se citeşte absorbanţa iniţială la 340 nm a martorului şi probei apoi se repetă citirea absorbanţei la 1, 2, 3 min la aceeaşi lungime de undă.Se determină valoarea medie a absorbanţei per minut ΔA/min, care se foloseşte ȋn calcul. Citirea se poate efectua la 340 nm, 334 nm sau 365 nm. Calcul:

Dupa omogenizarea amestecurilor prin agitare uşoară se incubează la 37°C timp de 3 min. Dupa incubare se citeşte absorbanţa iniţială la 340 nm a martorului şi probei apoi se repetă citirea absorbanţei la 1, 2, 3 min la aceeaşi lungime de undă.Se determină valoarea medie a absorbanţei per minut ΔA/min, care se foloseşte ȋn calcul. Citirea se poate efectua la 340 nm, 334 nm sau 365 nm. Calcul:

Valoarea activităţii enzimatice a CK ȋn probă se calculează utilizând formula:

Valoarea activităţii enzimatice a CK ȋn probă se calculează utilizând formula:

Activitatea CK U / L  A / min xFactor Valoarea factorului F depinde de lungimea de undă utilizată. Astfel, pentru:  F

334 nm 4207

340 nm 4127

365 nm 7429

Activitatea CK U / L  A / min xFactor Valoarea factorului F depinde de lungimea de undă utilizată. Astfel, pentru:  F

334 nm 4207

340 nm 4127

5. Valori de referinţă  Bărbaţi: 30 - 200 U/L  Femei: 26 - 165 U/L

5. Valori de referinţă  Bărbaţi: 30 - 200 U/L  Femei: 26 - 165 U/L

6. Variaţii patologice

6. Variaţii patologice

 VALORI CRESCUTE  infarct miocardic acut (la 4-6 ore de la debut, datorită eliberării ȋn cantitate crescută ȋn circulaţie a enzimelor din celulele miocardice) 94

365 nm 7429

 VALORI CRESCUTE  infarct miocardic acut (la 4-6 ore de la debut, datorită eliberării ȋn cantitate crescută ȋn circulaţie a enzimelor din celulele miocardice) 94

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

 miocardita severă  acidoza diabetică  afecţiuni autoimune: dermatomiozită, polimiozită  boala Addison  convulsii  distrofie musculară Duchenne  după intervenţie chirurgicală deschisă pe cord şi defribilare electrică  hipertermie malignă  post-biopsii musculare, post-injecţii intramusculare, hipertermia malignă post-operatorie  miopatii diverse gen: paralizia paroxistică hipokalemică din disfuncţiile tiroidiene  rabdomioliză în cadrul intoxicaţiei cu cocaină  traumatisme musculare

 miocardita severă  acidoza diabetică  afecţiuni autoimune: dermatomiozită, polimiozită  boala Addison  convulsii  distrofie musculară Duchenne  după intervenţie chirurgicală deschisă pe cord şi defribilare electrică  hipertermie malignă  post-biopsii musculare, post-injecţii intramusculare, hipertermia malignă post-operatorie  miopatii diverse gen: paralizia paroxistică hipokalemică din disfuncţiile tiroidiene  rabdomioliză în cadrul intoxicaţiei cu cocaină  traumatisme musculare

 VALORI SCĂZUTE Valori scăzute ale enzimei se asociază de regulă cu reducerea masei musculare indusă de: o metastaze o corticoterapie o boala alcoolică a ficatului o modificări ale colagenului o artrita reumatoidă

 VALORI SCĂZUTE Valori scăzute ale enzimei se asociază de regulă cu reducerea masei musculare indusă de: o metastaze o corticoterapie o boala alcoolică a ficatului o modificări ale colagenului o artrita reumatoidă

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE

Creatinkinaza (CK sau CPK) este o enzimă care catalizează interconversia creatinei în creatin fosfat (compus macroergic format şi ulterior descompus ȋn muşchi) Principalele localizări intracelulare ale creatinkinazei sunt: miocardul, muşchii scheletici şi creierul (aici ȋnsă ȋn concentraţii net inferioare celor din celelalte două ţesuturi) Este o enzimă dimer, formată din două lanţuri de aminoacizi, de tip M (muscular) şi B (cerebral – „brain”), asociate astfel ȋncât pot forma trei izoenzime: o CK-MM (musculară) o CK-MB (miocardică) o CK-BB (cerebrală) 95

Creatinkinaza (CK sau CPK) este o enzimă care catalizează interconversia creatinei în creatin fosfat (compus macroergic format şi ulterior descompus ȋn muşchi) Principalele localizări intracelulare ale creatinkinazei sunt: miocardul, muşchii scheletici şi creierul (aici ȋnsă ȋn concentraţii net inferioare celor din celelalte două ţesuturi) Este o enzimă dimer, formată din două lanţuri de aminoacizi, de tip M (muscular) şi B (cerebral – „brain”), asociate astfel ȋncât pot forma trei izoenzime: o CK-MM (musculară) o CK-MB (miocardică) o CK-BB (cerebrală) 95

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

Izoenzima CK-MM este responsabilă de aproximativ 80% din activitatea creatinkinazei la nivelul miocardului, restul fiind reprezentat de activitatea CK-MB (este relativ specifică miocardului) În IMA (infarct miocardic acut) se ȋntâlnesc de regulă valori duble sau chiar mai mari ale CK total, dar şi valori specific mai mari ale izoenzimei CK-MB. În IMA activitatea CK depinde de dimensiunile ariei miocardice necrozate (zonei de infarct). La indivizii sănătoşi, nivelul creatinkinazei totale este dat, aproape în totalitate, de izoenzima CK-MM. Dozarea CK-MB asociat cu CK total este recomandată îndeosebi pacienţilor care acuză durere toracică. Analiza ulterioară a valorilor CK-MB ȋn dinamică poate aduce o imagine atât asupra ȋntinderii ariei de necroză, cat şi asupra eficienţei terapiei IMA.

2010

Izoenzima CK-MM este responsabilă de aproximativ 80% din activitatea creatinkinazei la nivelul miocardului, restul fiind reprezentat de activitatea CK-MB (este relativ specifică miocardului) În IMA (infarct miocardic acut) se ȋntâlnesc de regulă valori duble sau chiar mai mari ale CK total, dar şi valori specific mai mari ale izoenzimei CK-MB. În IMA activitatea CK depinde de dimensiunile ariei miocardice necrozate (zonei de infarct). La indivizii sănătoşi, nivelul creatinkinazei totale este dat, aproape în totalitate, de izoenzima CK-MM. Dozarea CK-MB asociat cu CK total este recomandată îndeosebi pacienţilor care acuză durere toracică. Analiza ulterioară a valorilor CK-MB ȋn dinamică poate aduce o imagine atât asupra ȋntinderii ariei de necroză, cat şi asupra eficienţei terapiei IMA.

8. MCQ

8. MCQ

CK 1 Creatinkinaza se găseşte predominant la nivelul următoarelor ţesuturi: A. Miocard B. Rinichi C. Intestin D. Ficat E. Muşchi scheletici

CK 1 Creatinkinaza se găseşte predominant la nivelul următoarelor ţesuturi: A. Miocard B. Rinichi C. Intestin D. Ficat E. Muşchi scheletici

CK 2 Care dintre următoarele afirmaţii privind activitatea creatinkinazei este FALSĂ? A. Dozarea acestei enzime se recomandă la pacienţii cu dureri toracice B. Este o enzimă care se găseşte ȋn cantităţi mari ȋn muşchii scheletici C. Este o enzimă tetramerică D. Este o enzimă dimerică, prezentând lanţuri de tip H şi M E. Catalizează reacţia de descompunere a creatinei

CK 2 Care dintre următoarele afirmaţii privind activitatea creatinkinazei este FALSĂ? A. Dozarea acestei enzime se recomandă la pacienţii cu dureri toracice B. Este o enzimă care se găseşte ȋn cantităţi mari ȋn muşchii scheletici C. Este o enzimă tetramerică D. Este o enzimă dimerică, prezentând lanţuri de tip H şi M E. Catalizează reacţia de descompunere a creatinei

CK 3 Dozarea izoenzimei CK-MB este utilă ȋn: A. Monitorizarea pancreatitei acute

CK 3 Dozarea izoenzimei CK-MB este utilă ȋn: A. Monitorizarea pancreatitei acute

96

96

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

B. Evaluarea succesului terapeutic la pacienţii cu infarct miocardic C. Aprecierea extinderii zonei de infarct cerebral D. Diagnosticarea infarctului cerebral E. Aprecierea ȋntinderii zonei de infarct miocardic

B. Evaluarea succesului terapeutic la pacienţii cu infarct miocardic C. Aprecierea extinderii zonei de infarct cerebral D. Diagnosticarea infarctului cerebral E. Aprecierea ȋntinderii zonei de infarct miocardic

CK 4 Nivelul seric al creatinkinazei poate creşte ȋn următoarele circumstanţe: A. Pancreatită B. Distrofie musculară C. Convulsii D. Colecistită E. Injecţii intramusculare

CK 4 Nivelul seric al creatinkinazei poate creşte ȋn următoarele circumstanţe: A. Pancreatită B. Distrofie musculară C. Convulsii D. Colecistită E. Injecţii intramusculare

CK 5 In infarctul miocardic: A. Creşte nivelul total al creatinkinazei B. Scade nivelul CK-MB C. Intinderea zonei de necroză poate fi apreciată prin dozarea CK-MM D. Nivelul seric al creatinkinazei creşte in primele patru ore de la debut E. Nici un răspuns corect

CK 5 In infarctul miocardic: A. Creşte nivelul total al creatinkinazei B. Scade nivelul CK-MB C. Intinderea zonei de necroză poate fi apreciată prin dozarea CK-MM D. Nivelul seric al creatinkinazei creşte in primele patru ore de la debut E. Nici un răspuns corect

CK 6 Creatinkinaza, izoenzima cerebrală: A. Nu este de regulă detectată ȋn ser B. Reprezintă 80% din activitatea totală a creatinkinazei C. Reprezintă 20% din activitatea creatinkinazei totale D. Este reprezentată de izoenzima CK-MB E. Se găseşte predominant la nivelul ţesutului muscular şi cerebral

CK 6 Creatinkinaza, izoenzima cerebrală: A. Nu este de regulă detectată ȋn ser B. Reprezintă 80% din activitatea totală a creatinkinazei C. Reprezintă 20% din activitatea creatinkinazei totale D. Este reprezentată de izoenzima CK-MB E. Se găseşte predominant la nivelul ţesutului muscular şi cerebral

CK 7 Valorile normale ale creatinkinazei serice: A. Pot fi mai mari la bărbaţi comparativ cuf emei, datorită diferenţelor ȋn masa musculară B. Sunt cuprinse ȋntre 30 – 200 U/l C. Pot fi reduse ȋn cursul distrucţiilor musculare D. Pot fi influenţate de corticoterapie E. Sunt cuprinse ȋntre 10 – 40 UI/l

CK 7 Valorile normale ale creatinkinazei serice: A. Pot fi mai mari la bărbaţi comparativ cuf emei, datorită diferenţelor ȋn masa musculară B. Sunt cuprinse ȋntre 30 – 200 U/l C. Pot fi reduse ȋn cursul distrucţiilor musculare D. Pot fi influenţate de corticoterapie E. Sunt cuprinse ȋntre 10 – 40 UI/l

97

97

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI - Enzime plasmatice cu rol in diagnosticul clinic

2010

CK 8 Alterările cerebrale, miocardice sau ale muşchilor scheletici antrenează: A. O creştere a nivelului seric al creatinkinazei B. Modificări semnificative ale nivelului creatinkinazei ȋn primele şase ore C. Creşteri ale CK cu revenirea la valorile de repaus după 24 de ore D. Diminuarea nivelului CK-MM E. Nici un răspuns corect

CK 8 Alterările cerebrale, miocardice sau ale muşchilor scheletici antrenează: A. O creştere a nivelului seric al creatinkinazei B. Modificări semnificative ale nivelului creatinkinazei ȋn primele şase ore C. Creşteri ale CK cu revenirea la valorile de repaus după 24 de ore D. Diminuarea nivelului CK-MM E. Nici un răspuns corect

CK 9 Care dintre următoarele enzime poate fi sugestivă ȋn diagnosticarea unui infarct miocardic? A. Fosfataza alcalină B. Amilaza C. AST (TGO) D. CK E. LDH

CK 9 Care dintre următoarele enzime poate fi sugestivă ȋn diagnosticarea unui infarct miocardic? A. Fosfataza alcalină B. Amilaza C. AST (TGO) D. CK E. LDH

CK 10 Izoenzima CK-MB A. Este una dintre cele două izoenzime ale creatinkinazei B. Se dozează alături de LDH ȋn suspiciunea de infarct miocardic C. Inregistrează valori scăzute ȋn distrofiile musculare D. Poate diferenţia ȋntre alterările muşchilor scheletici şi ale miocardului E. Prin dozare ȋn dinamică este utilă ȋn aprecierea extinderii zonei miocardice necrozate

CK 10 Izoenzima CK-MB A. Este una dintre cele două izoenzime ale creatinkinazei B. Se dozează alături de LDH ȋn suspiciunea de infarct miocardic C. Inregistrează valori scăzute ȋn distrofiile musculare D. Poate diferenţia ȋntre alterările muşchilor scheletici şi ale miocardului E. Prin dozare ȋn dinamică este utilă ȋn aprecierea extinderii zonei miocardice necrozate

98

98

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

CAPITOLUL 5

CAPITOLUL 5

EXPLORAREA METABOLISMULUI GLUCIDIC

EXPLORAREA METABOLISMULUI GLUCIDIC

5.1. DOZAREA GLICEMIEI

5.1. DOZAREA GLICEMIEI

1. Consideraţii generale

1. Consideraţii generale

 Glicemia reprezintă cantitatea de glucoză din sânge.  Există numeroase substanţe care intră în categoria zaharurilor: fructoza, lactoza, galactoza, zaharoza, dar glucoza constituie cea mai importanta sursa de energie pentru organismul uman.  Glucoza provine din dietă (zahăr şi produse zaharoase, miere, cartofi, făină, cerealele), dar poate fi sintetizată şi la nivelul ţesuturilor, din orice tip de constituent (inclusiv grăsimi şi proteine, prin procesul de gluconeogeneza).  Glucoza rezultată în urma procesului de digestie a alimentelor (proces strict coordonat de enzimele digestive) şi ulterior de absorbţie în intestin, este transportată prin torentul circulator, către celulele care o consumă.  Pentru a pătrunde din sânge la nivel celular, glucoza trebuie să străbată membrana celulară, proces mediat de insulină, hormon secretat la nivel pancreatic. Glucoza care nu se foloseşte imediat de către organism este stocată în ficat, şi muşchi sub forma de glicogen (polizaharid). În momentul în care organismul are nevoie de glucoză pentru producerea de energie, glicogenul este eliberat de către ţesuturi şi transformat în glucoză, echilibrând în acest fel nivelul glicemiei.  Nivelul glicemiei este variabil, în funcţie de dietă, activitate fizică, prezenţa unor afecţiuni, medicamente, stres şi chiar de momentul din zi la care se măsoară.

99

 Glicemia reprezintă cantitatea de glucoză din sânge.  Există numeroase substanţe care intră în categoria zaharurilor: fructoza, lactoza, galactoza, zaharoza, dar glucoza constituie cea mai importanta sursa de energie pentru organismul uman.  Glucoza provine din dietă (zahăr şi produse zaharoase, miere, cartofi, făină, cerealele), dar poate fi sintetizată şi la nivelul ţesuturilor, din orice tip de constituent (inclusiv grăsimi şi proteine, prin procesul de gluconeogeneza).  Glucoza rezultată în urma procesului de digestie a alimentelor (proces strict coordonat de enzimele digestive) şi ulterior de absorbţie în intestin, este transportată prin torentul circulator, către celulele care o consumă.  Pentru a pătrunde din sânge la nivel celular, glucoza trebuie să străbată membrana celulară, proces mediat de insulină, hormon secretat la nivel pancreatic. Glucoza care nu se foloseşte imediat de către organism este stocată în ficat, şi muşchi sub forma de glicogen (polizaharid). În momentul în care organismul are nevoie de glucoză pentru producerea de energie, glicogenul este eliberat de către ţesuturi şi transformat în glucoză, echilibrând în acest fel nivelul glicemiei.  Nivelul glicemiei este variabil, în funcţie de dietă, activitate fizică, prezenţa unor afecţiuni, medicamente, stres şi chiar de momentul din zi la care se măsoară.

99

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

 Variaţiile ample ale glicemiei pot conduce la grave tulburări, iar glicoreglarea care în mod normal are susţinere atât hormonală cât şi fizico-chimică, nu mai are eficienţă.  REGLAREA HORMONALĂ a glicemiei este mediată preponderent de două grupe de hormoni: hipoglicemianţi şi hiperglicemianţi. Insulina este factorul hipoglicemiant, iar ceilalţi hormoni acţionează prin hiperglicemie (glucagonul, hormonul somatotrop hipofizar, ACTH-ul, hormonii glucocorticoizi şi catecolaminele - adrenalina şi noradrenalina).  Insulina, hormon polipeptidic care circulă în sânge fixată de unele globuline, poate fi inactivată la nivelul ficatului. Acţiunea sa hipoglicemiantă se realizează pe mai multe planuri: ▲ accelerarea şi transportul glucozei prin membranele celulare, ▲stimularea glicogenogenezei hepatice şi musculare, ▲inhibarea gluconeogenezei. Insulina acţionează şi prin ▲favorizarea conversiei proteinelor către forma de depozit a excesului de zahăr - glicogenul, ▲favorizarea neolipogenezei din glucide sub formă de grăsimi de depozit, ▲având şi o acţiune antagonistă faţă de hormonul contrainsular al hipofizei.  Aprecierea nivelului gucozei în sânge şi a metabolismului acesteia poate fi realizat prin multiple teste: o Glicemia determinata à jeun (pe nemâncate) o Testul de toleranţă la glucoza administrată oral o Glicemia spontană o Glicemia capilară

 Variaţiile ample ale glicemiei pot conduce la grave tulburări, iar glicoreglarea care în mod normal are susţinere atât hormonală cât şi fizico-chimică, nu mai are eficienţă.  REGLAREA HORMONALĂ a glicemiei este mediată preponderent de două grupe de hormoni: hipoglicemianţi şi hiperglicemianţi. Insulina este factorul hipoglicemiant, iar ceilalţi hormoni acţionează prin hiperglicemie (glucagonul, hormonul somatotrop hipofizar, ACTH-ul, hormonii glucocorticoizi şi catecolaminele - adrenalina şi noradrenalina).  Insulina, hormon polipeptidic care circulă în sânge fixată de unele globuline, poate fi inactivată la nivelul ficatului. Acţiunea sa hipoglicemiantă se realizează pe mai multe planuri: ▲ accelerarea şi transportul glucozei prin membranele celulare, ▲stimularea glicogenogenezei hepatice şi musculare, ▲inhibarea gluconeogenezei. Insulina acţionează şi prin ▲favorizarea conversiei proteinelor către forma de depozit a excesului de zahăr - glicogenul, ▲favorizarea neolipogenezei din glucide sub formă de grăsimi de depozit, ▲având şi o acţiune antagonistă faţă de hormonul contrainsular al hipofizei.  Aprecierea nivelului gucozei în sânge şi a metabolismului acesteia poate fi realizat prin multiple teste: o Glicemia determinata à jeun (pe nemâncate) o Testul de toleranţă la glucoza administrată oral o Glicemia spontană o Glicemia capilară

 Modalităţi de apreciere a glicemiei Glicemia à jeun se referă la determinarea cantităţii glucozei din plasmă după un repaos alimentar de cel puţin 8 ore, şi se analizează pe probele recoltate prin puncţie venoasă - prin metode enzimatice Glicemia capilară - măsoară valoarea glucozei la nivel capilar, prin înţeparea pulpei degetului, şi măsurarea cu ajutorul unui aparat numit glucometru (e recomandat la pacienţii diabetici ȋn scopul monitorizării valorilor glicemiei). Testul de toleranţa la glucoză administrată oral/TTGO este un test de provocare ce măsoară capacitatea organismului de a “reacţiona” la o cantitate standard de glucoză; acest test evaluează nivelul glicemiei după un

 Modalităţi de apreciere a glicemiei Glicemia à jeun se referă la determinarea cantităţii glucozei din plasmă după un repaos alimentar de cel puţin 8 ore, şi se analizează pe probele recoltate prin puncţie venoasă - prin metode enzimatice Glicemia capilară - măsoară valoarea glucozei la nivel capilar, prin înţeparea pulpei degetului, şi măsurarea cu ajutorul unui aparat numit glucometru (e recomandat la pacienţii diabetici ȋn scopul monitorizării valorilor glicemiei). Testul de toleranţa la glucoză administrată oral/TTGO este un test de provocare ce măsoară capacitatea organismului de a “reacţiona” la o cantitate standard de glucoză; acest test evaluează nivelul glicemiei după un

100

100

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

post alimentar de minim 8 ore, înainte şi la 2 ore de la administrarea unei soluţii de 75 de grame de glucoză. Este mai sensibil şi puţin mai specific decat glicemia à jeun ȋn diagnosticarea diabetului zaharat, ȋnsă este mai dificil de realizat, fiind folosit uzual ȋn determinarea diabetului gestaţional (de sarcină) şi toleranţei alterate la glucoză sau prediabet.

2010

post alimentar de minim 8 ore, înainte şi la 2 ore de la administrarea unei soluţii de 75 de grame de glucoză. Este mai sensibil şi puţin mai specific decat glicemia à jeun ȋn diagnosticarea diabetului zaharat, ȋnsă este mai dificil de realizat, fiind folosit uzual ȋn determinarea diabetului gestaţional (de sarcină) şi toleranţei alterate la glucoză sau prediabet.

2. Principiul determinării - metoda cu glucozoxidază

2. Principiul determinării - metoda cu glucozoxidază

Glucozoxidaza (catalizează oxidarea glucozei)

Glucozoxidaza (catalizează oxidarea glucozei)

Glucoză + O2 + H2OAcid gluconic + H2O2

Glucoză + O2 + H2OAcid gluconic + H2O2

Peroxidul de hidrogen format reacţionează cu 4- amino-antipirina şi fenolul, în prezenţa peroxidazei şi formează chinonimina. Intensitatea culorii produsului rezultat este proporţională cu concentraţia de glucoză din proba de analizat.

Peroxidul de hidrogen format reacţionează cu 4- amino-antipirina şi fenolul, în prezenţa peroxidazei şi formează chinonimina. Intensitatea culorii produsului rezultat este proporţională cu concentraţia de glucoză din proba de analizat.

2H2O2 + fenol + 4-amino-antipirina chinonimina +4H2O

2H2O2 + fenol + 4-amino-antipirina chinonimina +4H2O

3. Reactivi

3. Reactivi

Reactiv 1 (tampon-fenol) Tampon fosfat pH = 7,4…100 mmol/l Fenol ……………………..24 mmol/l

Reactiv 1 (tampon-fenol) Tampon fosfat pH = 7,4…100 mmol/l Fenol ……………………..24 mmol/l

Reactiv 2 (amestec enzime) Glucoz-oxidaza…………..12.000 U/l Peroxidaza ……….…………700 U/l 4-amino-antipirina……….0,4 mmol/l

Reactiv 2 (amestec enzime) Glucoz-oxidaza…………..12.000 U/l Peroxidaza ……….…………700 U/l 4-amino-antipirina……….0,4 mmol/l

Reactiv 3 (standard glucoză)…100mg%

Reactiv 3 (standard glucoză)…100mg%

4. Mod de lucru

4. Mod de lucru

Proba: Ser nehemolizat / Plasmă (fără hemoliză): Se pregăteşte reactivul enzimatic de lucru – amestecul de reactivi prin dizolvarea reactivului 2 în reactivul 1. Se folosesc trei eprubete – probă, standard (etalon) şi martor (blank) P, S, M:

Proba: Ser nehemolizat / Plasmă (fără hemoliză): Se pregăteşte reactivul enzimatic de lucru – amestecul de reactivi prin dizolvarea reactivului 2 în reactivul 1. Se folosesc trei eprubete – probă, standard (etalon) şi martor (blank) P, S, M:

101

101

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

PROBA

STANDARD MARTOR

Reactiv enzimatic de lucru

1000 µl

1000 µl

1000 µl

Proba

10 µl

-

Standard

-

10 µl

  

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

PROBA

STANDARD MARTOR

Reactiv enzimatic de lucru

1000 µl

1000 µl

1000 µl

-

Proba

10 µl

-

-

-

Standard

-

10 µl

-

se agită eprubetele se incubează 15min la 37o C se citesc absorbanţele probei (Ap) şi standardului (As) faţă de martor la 500 nm (492-550 nm), în cuva de 1cm.

  

se agită eprubetele se incubează 15min la 37o C se citesc absorbanţele probei (Ap) şi standardului (As) faţă de martor la 500 nm (492-550 nm), în cuva de 1cm.

Calcul: Glicemie (mg%) = (Ap/As) x 100 (sau) Glicemie (mmol/l = (Ap/As) x 5,5

Calcul: Glicemie (mg%) = (Ap/As) x 100 (sau) Glicemie (mmol/l = (Ap/As) x 5,5

5. Valori de referinţă

5. Valori de referinţă

65 - 110 mg/dl

65 - 110 mg/dl

Glicemia se poate exprima în mg/dl sau în mmol/l. Unitatea de masură în Sistemul Internaţional este milimol/litru (mmol/l), însă mai des folosită este exprimarea în miligram/decilitru (mg/dl). Conversia mg/dl la mmol/l se face prin împărţirea la 18.

Glicemia se poate exprima în mg/dl sau în mmol/l. Unitatea de masură în Sistemul Internaţional este milimol/litru (mmol/l), însă mai des folosită este exprimarea în miligram/decilitru (mg/dl). Conversia mg/dl la mmol/l se face prin împărţirea la 18.

6. Variaţii fiziologice şi patologice ale glicemiei

6. Variaţii fiziologice şi patologice ale glicemiei

Variaţii fiziologice o Postprandrial o In timpul sarcinii (glicemia scade datorită necesităţilor energetice ale fătului) o Excesul ponderal este unul dintre factorii care alterează testul de toleranţă la glucoză o Repausul alimentar (voluntar sau involuntar) influenţează nivelul glicemiei, în special la obezi şi la femeile gravide o Stresul psihic face să crească nivelul glicemiei, datorită descărcării de adrenalină

102

Variaţii fiziologice o Postprandrial o In timpul sarcinii (glicemia scade datorită necesităţilor energetice ale fătului) o Excesul ponderal este unul dintre factorii care alterează testul de toleranţă la glucoză o Repausul alimentar (voluntar sau involuntar) influenţează nivelul glicemiei, în special la obezi şi la femeile gravide o Stresul psihic face să crească nivelul glicemiei, datorită descărcării de adrenalină

102

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

o Efortul fizic susţinut (poate scade glicemia prin consum exagerat al rezervelor glucidice ȋn scopul obţinerii energiei necesare efortului fizic) Variaţii patologice

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

o Efortul fizic susţinut (poate scade glicemia prin consum exagerat al rezervelor glucidice ȋn scopul obţinerii energiei necesare efortului fizic) Variaţii patologice

 VALORI CRESCUTE

 VALORI CRESCUTE

Hiperglicemia defineşte prezenţa glucozei în sânge la nivele mai mari decât limita ei normală superioară (110 mg%), şi este înregistrată de regulă în: 1. Boli ale glandelor endocrine cu rol în reglarea nivelului sanguin al glucozei – pancreas, hipofiză, tiroidă, suprarenalele. Se pot distinge aşadar origini diferite ale afectării metabolismului glucidic, iar instalarea diabetului zaharat poate fi determinat de modificări, cel mai frecvent ale activităţii anormale insulare a pancreasului, dar uneori prin dereglări la nivelul hipofizei, suprarenalelor sau a tiroidei. 2. Infecţii 3. Intoxicaţii cu CO, organofosforice 4. Accidente cerebro-vasculare. Un parametru sugestiv pentru diagnosticul unei alterări a metabolismului glucozei, în context diabetic, îl reprezintă hemoglobina glicozilata - HbA1c. Această proteină reprezintă rezultatul procesului de glicozilare al hemoglobinei, proces ce se desfăşoară la nivelul sângelui, proporţional cu valoarea glicemiei. În mod normal 5% din hemoglobina este glicozilată, HbA1c fiind un parametru foarte util datorită timpului de înjumătăţire lung al hemoglobinei (90-100 zile), astfel încât poate da informaţii asupra controlului glicemiei pentru o perioadă anterioară mai lungă de timp (spre deosebire de valoarea glicemiei, care reflectă doar situaţia din momentul recoltării). Testul Hb A1c oferă o estimare a nivelului mediu de glucoză din sânge pe o perioadă de 30- 90 de zile. Determinarea Hb A1c constituie un test de evaluare şi monitorizare pe termen lung al controlului glicemic la pacienţii cu diabet zaharat, si are rol predictiv în ceea ce priveşte riscul complicaţiilor diabetului: cetoacidoza, nefropatia, retinopatia.

Hiperglicemia defineşte prezenţa glucozei în sânge la nivele mai mari decât limita ei normală superioară (110 mg%), şi este înregistrată de regulă în: 1. Boli ale glandelor endocrine cu rol în reglarea nivelului sanguin al glucozei – pancreas, hipofiză, tiroidă, suprarenalele. Se pot distinge aşadar origini diferite ale afectării metabolismului glucidic, iar instalarea diabetului zaharat poate fi determinat de modificări, cel mai frecvent ale activităţii anormale insulare a pancreasului, dar uneori prin dereglări la nivelul hipofizei, suprarenalelor sau a tiroidei. 2. Infecţii 3. Intoxicaţii cu CO, organofosforice 4. Accidente cerebro-vasculare. Un parametru sugestiv pentru diagnosticul unei alterări a metabolismului glucozei, în context diabetic, îl reprezintă hemoglobina glicozilata - HbA1c. Această proteină reprezintă rezultatul procesului de glicozilare al hemoglobinei, proces ce se desfăşoară la nivelul sângelui, proporţional cu valoarea glicemiei. În mod normal 5% din hemoglobina este glicozilată, HbA1c fiind un parametru foarte util datorită timpului de înjumătăţire lung al hemoglobinei (90-100 zile), astfel încât poate da informaţii asupra controlului glicemiei pentru o perioadă anterioară mai lungă de timp (spre deosebire de valoarea glicemiei, care reflectă doar situaţia din momentul recoltării). Testul Hb A1c oferă o estimare a nivelului mediu de glucoză din sânge pe o perioadă de 30- 90 de zile. Determinarea Hb A1c constituie un test de evaluare şi monitorizare pe termen lung al controlului glicemic la pacienţii cu diabet zaharat, si are rol predictiv în ceea ce priveşte riscul complicaţiilor diabetului: cetoacidoza, nefropatia, retinopatia.

 VALORI SCĂZUTE Hipoglicemia, adică o cantitate mai scăzută decât valoarea limită inferioară a glucozei în sânge, poate fi cauzată de diferite ♠boli metabolice, endocrinopatii (boli ale glandelor endocrine, care secretă hormoni) sau ♠boli

 VALORI SCĂZUTE Hipoglicemia, adică o cantitate mai scăzută decât valoarea limită inferioară a glucozei în sânge, poate fi cauzată de diferite ♠boli metabolice, endocrinopatii (boli ale glandelor endocrine, care secretă hormoni) sau ♠boli

103

103

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

hepatice. Valori reduse sub limita inferioară normală a glicemiei se pot decela şi ♠la bolnavii diabetici, în lipsa unui tratament individualizat corespunzător (administrare de doze necorespunzatoare de insulină, care în loc să echilibreze nivelul glicemiei, determină conversia între valorile extreme, de la hiperglicemie la hipoglicemie). Hipoglicemia (tradusă clinic prin slabiciune, tremurături, transpiraţii si chiar pierderea conştienţei), se înregistrează în anumite situaţii patologice: 1. Inaniţie, malabsorbţie 2. Insulinom (adenom langerhansian - tumoră a insulelor langerhans ale pancreasului) 3. Defect de gluconeogeneză sau de mobilizare a glicogenului din rezerve 4. Insuficienţa cortico-suprarenală (boala Addison) 5. Insuficienţa tiroidiană 6. Insuficienţa hepatică gravă 7. Insuficieţa hipofizei anterioare 8. Intoleranţa ereditară la fructoză (prin defect de fructokinază)

hepatice. Valori reduse sub limita inferioară normală a glicemiei se pot decela şi ♠la bolnavii diabetici, în lipsa unui tratament individualizat corespunzător (administrare de doze necorespunzatoare de insulină, care în loc să echilibreze nivelul glicemiei, determină conversia între valorile extreme, de la hiperglicemie la hipoglicemie). Hipoglicemia (tradusă clinic prin slabiciune, tremurături, transpiraţii si chiar pierderea conştienţei), se înregistrează în anumite situaţii patologice: 1. Inaniţie, malabsorbţie 2. Insulinom (adenom langerhansian - tumoră a insulelor langerhans ale pancreasului) 3. Defect de gluconeogeneză sau de mobilizare a glicogenului din rezerve 4. Insuficienţa cortico-suprarenală (boala Addison) 5. Insuficienţa tiroidiană 6. Insuficienţa hepatică gravă 7. Insuficieţa hipofizei anterioare 8. Intoleranţa ereditară la fructoză (prin defect de fructokinază)

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE

Dozarea glicemiei este un test care se efectuează de rutină în laboratoarele de analize medicale, dereglarea acestui parametru fiind o expresie a posibilei alterări a mai multor metabolisme, nu numai a celui glucidic. Valoarea modificată a glicemiei exprimă de regulă alterări în funcţia unor glande endocrine care intervin în reglarea metabolismului glucidic (pancreas, hipofiză, suprarenale). Principala condiţie pentru ca glucoza să se metabolizeze, este ca aceasta să patrundă ȋn celulă, proces mediat de insulină, hormon secretat la nivel pancreatic. Defectul de insulină va antrena creşterea nivelului plasmatic al glucozei – hiperglicemie – prin defectul acesteia de a se angaja ȋn interiorul celulelor (şi deci imposibilitatea metabolizării normale a glucozei). Prinipalii parametri biochimici la bolnavii cu diabet sunt: o Hiperglicemie o Glucozurie (dacă nivelul glicemiei depăşeşte pragul renal) o Cetonurie (eliminare de corpi cetonici ȋn urină, compuşi sintetizaţi datorită degradării ȋn exces a lipidelor din cauza 104

Dozarea glicemiei este un test care se efectuează de rutină în laboratoarele de analize medicale, dereglarea acestui parametru fiind o expresie a posibilei alterări a mai multor metabolisme, nu numai a celui glucidic. Valoarea modificată a glicemiei exprimă de regulă alterări în funcţia unor glande endocrine care intervin în reglarea metabolismului glucidic (pancreas, hipofiză, suprarenale). Principala condiţie pentru ca glucoza să se metabolizeze, este ca aceasta să patrundă ȋn celulă, proces mediat de insulină, hormon secretat la nivel pancreatic. Defectul de insulină va antrena creşterea nivelului plasmatic al glucozei – hiperglicemie – prin defectul acesteia de a se angaja ȋn interiorul celulelor (şi deci imposibilitatea metabolizării normale a glucozei). Prinipalii parametri biochimici la bolnavii cu diabet sunt: o Hiperglicemie o Glucozurie (dacă nivelul glicemiei depăşeşte pragul renal) o Cetonurie (eliminare de corpi cetonici ȋn urină, compuşi sintetizaţi datorită degradării ȋn exces a lipidelor din cauza 104

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

defectului de utilizare celulară a glucidelor); aceasta conferă un miros specific urinii („mere verzi”); corpii cetonici au o structură carbonilică şi odată cu eliminarea prin urină, atrag şi substanţe alcaline, spoliind organismul de compuşi bazici, ceea ce poate antrena, ȋn unele circumstanţe instalarea unui pH acid (coma acidotică) o Hiperamonemie (prin degradarea excesivă şi a proteinelor – nu numai a lipidelor - ȋn ȋncercarea organismului de a compensa lipsa energiei care ȋn mod normal se eliberează din metabolizarea glucozei) Ţesuturile cu rol semnificativ în menţinerea homeostaziei glucidice sunt în mod special ficatul şi rinichiul. Ficatul contribuie la menţinerea normală a glicemiei prin medierea acţiunilor sale în cadrul metabolismului glucidic prin două enzime principale: GK şi G-6-P-aza, care asigură consumul şi respectiv formarea glucozei în organism, astfel încât, acest organ poate funcţiona, în funcţie de necesităţile organismului, ca şi consumator, respectiv donator de glucoză. Rinichiul intervine în reglarea homeostaziei glicemice prin reabsorbţia totală, prin tubii renali, a glucozei filtrate la acest nivel, astfel încât, doar excepţional, când pragul renal de eliminare a glucozei în urină (170 mg%) este depăşit, o parte din glucoză se elimină prin urină, apărând astfel glucozuria.

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

defectului de utilizare celulară a glucidelor); aceasta conferă un miros specific urinii („mere verzi”); corpii cetonici au o structură carbonilică şi odată cu eliminarea prin urină, atrag şi substanţe alcaline, spoliind organismul de compuşi bazici, ceea ce poate antrena, ȋn unele circumstanţe instalarea unui pH acid (coma acidotică) o Hiperamonemie (prin degradarea excesivă şi a proteinelor – nu numai a lipidelor - ȋn ȋncercarea organismului de a compensa lipsa energiei care ȋn mod normal se eliberează din metabolizarea glucozei) Ţesuturile cu rol semnificativ în menţinerea homeostaziei glucidice sunt în mod special ficatul şi rinichiul. Ficatul contribuie la menţinerea normală a glicemiei prin medierea acţiunilor sale în cadrul metabolismului glucidic prin două enzime principale: GK şi G-6-P-aza, care asigură consumul şi respectiv formarea glucozei în organism, astfel încât, acest organ poate funcţiona, în funcţie de necesităţile organismului, ca şi consumator, respectiv donator de glucoză. Rinichiul intervine în reglarea homeostaziei glicemice prin reabsorbţia totală, prin tubii renali, a glucozei filtrate la acest nivel, astfel încât, doar excepţional, când pragul renal de eliminare a glucozei în urină (170 mg%) este depăşit, o parte din glucoză se elimină prin urină, apărând astfel glucozuria.

8. MCQ

8. MCQ

1. Hormonul insulină: A. are o acţiune hiperglicemiantă B. contribuie la metabolizarea glucozei C. inhibă conumul glucozei odată cu angajarea intracelulară a acesteia D. favorizează procesul de gluconeogeneză E. are o acţiune inhibitoare asupra procesului de degradare de glicogen

1. Hormonul insulină: A. are o acţiune hiperglicemiantă B. contribuie la metabolizarea glucozei C. inhibă conumul glucozei odată cu angajarea intracelulară a acesteia D. favorizează procesul de gluconeogeneză E. are o acţiune inhibitoare asupra procesului de degradare de glicogen

2. In care dintre următoarele situaţii se poate instala hiperglicemia? A. infecţii severe B. diabet zaharat

2. In care dintre următoarele situaţii se poate instala hiperglicemia? A. infecţii severe B. diabet zaharat

105

105

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

C. adenom hipofizar D. accident vascular cerebral E. hepatită

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

C. adenom hipofizar D. accident vascular cerebral E. hepatită

3. Care din următorii parametri biochimici, sunt utili ȋn diagnosticul şi monitorizarea diabeticului? A. glicemia B. analiza de urină C. LDH D. TGO E. HbA1c

3. Care din următorii parametri biochimici, sunt utili ȋn diagnosticul şi monitorizarea diabeticului? A. glicemia B. analiza de urină C. LDH D. TGO E. HbA1c

4. Corpii cetonici: A. pot apare ȋn urină la pacienţii cu diabet B. prezenţa lor ȋn urina bolnavilor diabetici sugerează alterarea metabolismului proteic C. nu se elimină ȋn urină la pacienţii cu glucozurie D. prezenţi ȋn urina pacienţilor imprimă acesteia un miros specific E. formaţi ȋn exces pot determina instalarea comei acidotice

4. Corpii cetonici: A. pot apare ȋn urină la pacienţii cu diabet B. prezenţa lor ȋn urina bolnavilor diabetici sugerează alterarea metabolismului proteic C. nu se elimină ȋn urină la pacienţii cu glucozurie D. prezenţi ȋn urina pacienţilor imprimă acesteia un miros specific E. formaţi ȋn exces pot determina instalarea comei acidotice

5. Glicemia: A. reprezintă prezenţa glucozei ȋn sânge B. poate fi scăzută la bolnavii diabetici incorect trataţi C. este crescută la pacienţii diabetici D. se poate modifica tranzitoriu ȋn cursul sarcinii E. poate varia fiziologic la sportivii de performanţă

5. Glicemia: A. reprezintă prezenţa glucozei ȋn sânge B. poate fi scăzută la bolnavii diabetici incorect trataţi C. este crescută la pacienţii diabetici D. se poate modifica tranzitoriu ȋn cursul sarcinii E. poate varia fiziologic la sportivii de performanţă

6. Hiperglicemia: A. reprezintă valori ale glicemiei peste 180 mg/dl B. se poate ȋntâlni la pacienţii cu insulinom C. este caracteristică la indivizii cu intoleranţă ereditară la fructoză D. este prezentă ȋntotdeauna la pacienţii cu diabet renal E. nici un răspuns corect

6. Hiperglicemia: A. reprezintă valori ale glicemiei peste 180 mg/dl B. se poate ȋntâlni la pacienţii cu insulinom C. este caracteristică la indivizii cu intoleranţă ereditară la fructoză D. este prezentă ȋntotdeauna la pacienţii cu diabet renal E. nici un răspuns corect

7. Precizaţi care dintre următoarele afirmaţii referitoare la glicemie sunt adevărate: A. creşte la pacienţii cu defect de mobilizare a glucozei din depozite B. se modifică ȋntotdeauna la pacienţii cu glucozurie

7. Precizaţi care dintre următoarele afirmaţii referitoare la glicemie sunt adevărate: A. creşte la pacienţii cu defect de mobilizare a glucozei din depozite B. se modifică ȋntotdeauna la pacienţii cu glucozurie

106

106

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

C. este crescută atunci când nivelul glucozei ȋn urină depăşeşte 180 mg/dl D. este scăzută atunci când valorile sunt mai mici de 65 mg/dl E. creşterea glicemiei se asociază ȋntotdeauna cu glucozurie

2010

C. este crescută atunci când nivelul glucozei ȋn urină depăşeşte 180 mg/dl D. este scăzută atunci când valorile sunt mai mici de 65 mg/dl E. creşterea glicemiei se asociază ȋntotdeauna cu glucozurie

8. Alături de rinichi, ficatul este unul din organele cu acţiune majoră ȋn reglarea glicemiei prin: A. acţiunea GK (glucokinazei) atunci când ȋn organism există un deficit de glucoză B. reabsorbţia totală a glucozei din sange C. eliberarea de glucoză din esterii acesteia sub acţiunea G-6Fosfatazei D. consumul cantităţilor excesive de zahăr E. nici un raspuns corect

8. Alături de rinichi, ficatul este unul din organele cu acţiune majoră ȋn reglarea glicemiei prin: A. acţiunea GK (glucokinazei) atunci când ȋn organism există un deficit de glucoză B. reabsorbţia totală a glucozei din sange C. eliberarea de glucoză din esterii acesteia sub acţiunea G-6Fosfatazei D. consumul cantităţilor excesive de zahăr E. nici un raspuns corect

9.

9.

Boala diabetică nu este exclusiv o dereglare a metabolismului glucidic, ci şi a celui lipidic. Acest lucru, la pacienţii diabetici se traduce prin: A. posibilitatea instalării alcalozei metabolice B. eliminarea acizilor biliari ȋn urină C. apariţia hipoamoniemiei D. formarea şi eliberarea de corpi cetonici prin urină E. glucozurie

10. Care dintre parametrii biochimici urmatori NU este caracteristic bolnavilor diabetici ? A. Hiperglicemie B. Fenilcetonurie C. Eliminare de corpi cetonici ȋn urină D. Cantitate mare de amoniac ȋn sange E. Glucozurie

107

Boala diabetică nu este exclusiv o dereglare a metabolismului glucidic, ci şi a celui lipidic. Acest lucru, la pacienţii diabetici se traduce prin: A. posibilitatea instalării alcalozei metabolice B. eliminarea acizilor biliari ȋn urină C. apariţia hipoamoniemiei D. formarea şi eliberarea de corpi cetonici prin urină E. glucozurie

10. Care dintre parametrii biochimici urmatori NU este caracteristic bolnavilor diabetici ? A. Hiperglicemie B. Fenilcetonurie C. Eliminare de corpi cetonici ȋn urină D. Cantitate mare de amoniac ȋn sange E. Glucozurie

107

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

5.2. DETERMINARI CALITATIVE ŞI CANTITATIVE ALE GLUCIDELOR IN URINA

1. Consideraţii generale

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

5.2. DETERMINARI CALITATIVE ŞI CANTITATIVE ALE GLUCIDELOR IN URINA

1. Consideraţii generale

 În condiţii normale, aproape toată glucoza filtrată este reabsorbită prin tubii renali, fiind absentă ȋn urină. În condiţii de hiperglicemie, când este depăşită valoarea prag de eliminare a glucozei ȋn urină, tubii renali nu pot reabsorbi ȋntreaga cantitate de glucoză, aceasta fiind astfel eliminată în urină. Pragul renal de eliminare a glucozei în urină este de 180 mg/dL.  Glicozuria apare în mod specific asociat cu hiperglicemie, în diabet zaharat, acromegalie, hipertiroidism, boli hepatice şi pancreatice, boli SNC.  Prezenţa glucozei în urină când concentraţia glucozei sangvine este în limite normale indică un defect tubular în reabsorbţia glucozei, care se exprimă prin scăderea pragului renal de eliminare a glucozei şi este caracteristică diabetului renal (glicozurie renală).

 În condiţii normale, aproape toată glucoza filtrată este reabsorbită prin tubii renali, fiind absentă ȋn urină. În condiţii de hiperglicemie, când este depăşită valoarea prag de eliminare a glucozei ȋn urină, tubii renali nu pot reabsorbi ȋntreaga cantitate de glucoză, aceasta fiind astfel eliminată în urină. Pragul renal de eliminare a glucozei în urină este de 180 mg/dL.  Glicozuria apare în mod specific asociat cu hiperglicemie, în diabet zaharat, acromegalie, hipertiroidism, boli hepatice şi pancreatice, boli SNC.  Prezenţa glucozei în urină când concentraţia glucozei sangvine este în limite normale indică un defect tubular în reabsorbţia glucozei, care se exprimă prin scăderea pragului renal de eliminare a glucozei şi este caracteristică diabetului renal (glicozurie renală).

2. Principiul determinării şi modul de lucru

2. Principiul determinării şi modul de lucru

Determinarea calitativă Testul se bazează pe formarea unui compus colorat care determină o schimbare de culoare a zonei de pe strip, de la galben la verde.

Determinarea calitativă Testul se bazează pe formarea unui compus colorat care determină o schimbare de culoare a zonei de pe strip, de la galben la verde.

Determinarea cantitativă

Determinarea cantitativă

Proba: Urină Principiul de determinare a cantităţii de glucoză din urină este acelaşi cu cel din sânge, folosind amestecul de reactivi - prin dizolvarea reactivului 2 în reactivul 1. Se folosesc trei eprubete – probă, standard (etalon) şi martor (blank) P, S, M:

Proba: Urină Principiul de determinare a cantităţii de glucoză din urină este acelaşi cu cel din sânge, folosind amestecul de reactivi - prin dizolvarea reactivului 2 în reactivul 1. Se folosesc trei eprubete – probă, standard (etalon) şi martor (blank) P, S, M:

108

108

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

PROBA

2010

STANDARD

MARTOR

Reactiv enzimatic de lucru 1000 µl

1000 µl

1000 µl

Proba

10 µl

-

Standard

-

10 µl

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

PROBA

2010

STANDARD

MARTOR

Reactiv enzimatic de lucru 1000 µl

1000 µl

1000 µl

-

Proba

10 µl

-

-

-

Standard

-

10 µl

-

După agitare şi incubare 15min la 37o C, se citesc absorbanţele probei (Ap) şi standardului (As) faţă de martor la 500 nm (492-550 nm), în cuva de 1cm.

După agitare şi incubare 15min la 37o C, se citesc absorbanţele probei (Ap) şi standardului (As) faţă de martor la 500 nm (492-550 nm), în cuva de 1cm.

Calcul: Glucozurie (mg%) = (Ap/As) x Cst Cst = concentraţia standardului

Calcul: Glucozurie (mg%) = (Ap/As) x Cst Cst = concentraţia standardului

3. Valori de referinţă: absentă

3. Valori de referinţă: absentă

4. Variaţii patologice

4. Variaţii patologice

În mod normal, toată glucoza filtrată este reabsorbită prin tubii renali, fiind absentă ȋn urină (doar canttăţi extrem de mici, de ordinul a câtorva miligrame se pot elimina prin urină ȋn mod fiziologic, dar aceste cantităţi extrem de mici, nu sunt puse ȋn evidenţă cu testele uzuale de detectare, astfel ȋncât, spunem ca glucoza este ȋn mod normal absentă ȋn urină). Acest lucru este posibil datorită capacităţii rinichilor de a reabsorbi ȋn mod fiziologic toată glucoza prin tubii renali, conservând astfel nivelul glicemiei (care ar diminua dacă rinichii ar absorbi doar parţial glucoza, lasând o parte să se elimine prin urină). Rinichii au ȋnsă o capacitate limitată de reabsorbţie a glucozei, valoare numită prag renal de eliminare a glucozei ȋn urină. Acest prag are o valoare de aproximativ 180 mg/dl, şi reprezintă nivelul glicemiei până la care rinichiul face faţă ȋn ceea ce priveşte funcţia lui normală de a reabsorbi ȋntreaga cantitate de glucoză filtrată; ȋn schimb, depăşirea nivelului acestui prag (deci o glicemie cu valori peste 180 mg/dl), atrage după sine imposibilitatea rinichiului de a reabsorbi complet glucoza, cu eliminarea ȋn parte a acesteia prin urină. Glicozurie semnifică eliminarea de glucoză prin urină, este o situaţie patologică, ce poate apare fie necorelat cu nivelul crescut al glicemiei, fie ȋn condiţii de hiperglicemie, când este depăşită valoarea prag de eliminare a

În mod normal, toată glucoza filtrată este reabsorbită prin tubii renali, fiind absentă ȋn urină (doar canttăţi extrem de mici, de ordinul a câtorva miligrame se pot elimina prin urină ȋn mod fiziologic, dar aceste cantităţi extrem de mici, nu sunt puse ȋn evidenţă cu testele uzuale de detectare, astfel ȋncât, spunem ca glucoza este ȋn mod normal absentă ȋn urină). Acest lucru este posibil datorită capacităţii rinichilor de a reabsorbi ȋn mod fiziologic toată glucoza prin tubii renali, conservând astfel nivelul glicemiei (care ar diminua dacă rinichii ar absorbi doar parţial glucoza, lasând o parte să se elimine prin urină). Rinichii au ȋnsă o capacitate limitată de reabsorbţie a glucozei, valoare numită prag renal de eliminare a glucozei ȋn urină. Acest prag are o valoare de aproximativ 180 mg/dl, şi reprezintă nivelul glicemiei până la care rinichiul face faţă ȋn ceea ce priveşte funcţia lui normală de a reabsorbi ȋntreaga cantitate de glucoză filtrată; ȋn schimb, depăşirea nivelului acestui prag (deci o glicemie cu valori peste 180 mg/dl), atrage după sine imposibilitatea rinichiului de a reabsorbi complet glucoza, cu eliminarea ȋn parte a acesteia prin urină. Glicozurie semnifică eliminarea de glucoză prin urină, este o situaţie patologică, ce poate apare fie necorelat cu nivelul crescut al glicemiei, fie ȋn condiţii de hiperglicemie, când este depăşită valoarea prag de eliminare a

109

109

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

glucozei ȋn urină, tubii renali nemaiputând reabsorbi ȋntreaga cantitate de glucoză. Glicozuria poate apare asociat cu hiperglicemie în:  afecţiuni endocrine: hipertiroidism, acromegalie, boala Cushing, feocromocitom  boli hepatice şi pancreatice  boli SNC: traumatisme cerebrale, AVC (accident vascular cerebral) Glicozuria fără hiperglicemie - Prezenţa glucozei în urină când concentraţia glucozei sangvine este în limite normale indică:  un defect tubular în reabsorbţia glucozei, care se exprimă prin scăderea pragului renal de eliminare a glucozei şi este caracteristică diabetului renal (glicozurie renală).  alterarea reabsorbţiei tubulare a glucozei din sindromul ToniDebre-Fanconi, boli tubulare renale avansate  diabet gestaţional.

glucozei ȋn urină, tubii renali nemaiputând reabsorbi ȋntreaga cantitate de glucoză. Glicozuria poate apare asociat cu hiperglicemie în:  afecţiuni endocrine: hipertiroidism, acromegalie, boala Cushing, feocromocitom  boli hepatice şi pancreatice  boli SNC: traumatisme cerebrale, AVC (accident vascular cerebral) Glicozuria fără hiperglicemie - Prezenţa glucozei în urină când concentraţia glucozei sangvine este în limite normale indică:  un defect tubular în reabsorbţia glucozei, care se exprimă prin scăderea pragului renal de eliminare a glucozei şi este caracteristică diabetului renal (glicozurie renală).  alterarea reabsorbţiei tubulare a glucozei din sindromul ToniDebre-Fanconi, boli tubulare renale avansate  diabet gestaţional.

5.3. HEMOGLOBINA GLICOZILATA

5.3. HEMOGLOBINA GLICOZILATA

(HbA1c)

(HbA1c)

1. Consideraţii generale

1. Consideraţii generale

 Hemoglobina glicozilată - HbA1c, reprezintă un mic procent din hemoglobina A (5-7%, în sânge distingându-se trei componente ale HbA1 - HbA1a, HbA1b şi HbA1c), rezultată prin legarea continuă şi ireversibilă a glucozei din sânge pe durata de viaţă a eritrocitelor (de aproximativ 100-120 zile).  Folosirea hemoglobinei A1c pentru monitorizarea metabolismului glucozei la pacienţii diabetici a fost propusă în 1976 de Koenig şi colaboratorii săi.  Diabetul zaharat se caracterizează prin hiperglicemie determinată de incapacitatea organismului de a utiliza glucoza pentru producerea de energie.

110

 Hemoglobina glicozilată - HbA1c, reprezintă un mic procent din hemoglobina A (5-7%, în sânge distingându-se trei componente ale HbA1 - HbA1a, HbA1b şi HbA1c), rezultată prin legarea continuă şi ireversibilă a glucozei din sânge pe durata de viaţă a eritrocitelor (de aproximativ 100-120 zile).  Folosirea hemoglobinei A1c pentru monitorizarea metabolismului glucozei la pacienţii diabetici a fost propusă în 1976 de Koenig şi colaboratorii săi.  Diabetul zaharat se caracterizează prin hiperglicemie determinată de incapacitatea organismului de a utiliza glucoza pentru producerea de energie.

110

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

 Tratamentul diabetului presupune menţinerea pe termen lung a nivelului glucozei din sânge (glicemia), cât mai aproape posibil de nivelul normal, reducând riscul consecinţelor cardiovasculare.  Efectuarea glicemiei permite evaluarea statusului curent al metabolismului carbohidraţilor la pacienţii diabetici în momentul recoltării probei de sânge, dar nu reprezintă o reflectare reală a statusului glicemic.  Spre deosebire de aceasta, determinarea hemoglobinei glicozilate oferă o estimare retrospectivă a statusului glicemic, independentă de ritmul circadian, dietă şi alte fluctuaţii tranzitorii ale concentraţiei glucozei în sânge.  Hemoglobina glicozilată HbA1c reprezintă aşadar un mic procent din hemoglobina A şi reflectă legarea continuă şi ireversibilă a glucozei din sânge pe durata de viaţă a eritrocitelor. În acest fel, creşterea valorilor Hb A1c este proporţională cu nivelul mediu al glucozei sanguine în cursul ultimelor 2-3 luni anterioare testării.  Glicozilarea se desfaşoară în două etape, prin reacţii nonenzimatice, fiind dependentă de cantitatea de glucoză din sânge. Glicozilarea implică şi alte proteine şi este principalul mecanism prin care apare glucotoxicitatea.  Alte mecanisme implicate sunt: o stressul oxidativ o activarea căii poliol o activarea proteinkinazei C o distrucţia endotelială o schimbări hemodinamice şi de coagulare  Alte proteine care pot glicozila sunt componente cu timp de injumatăţire scurt, fiind glicozilate într-o proporţie mult mai scazută decât Hb. De exemplu, albumina are timpul de înjumătăţire de 20 de zile. Altele însă, precum actina, mielina, colagenul, fibronectina, nucleoproteinele, spectrina, pot fi şi ele glicozilate şi au un timp de înjumătăţire lung. Ele trec printr-un proces de rearanjare complex şi ireversibil, cu formarea produşilor finali avansaţi de glicozilare (advanced glycocosylation end products - AGEs).  AGEs formează o mare familie cu numeroase componente, parţial identificate. Acumularea lor ȋn structura proteinelor le modifică funcţionarea. Ele au capacitatea de a se leaga de receptorii specifici pentru macrofage şi induc eliberarea enzimelor hidrolitice, a citokinelor şi factorilor de creştere capabili să iniţieze sinteza 111

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

 Tratamentul diabetului presupune menţinerea pe termen lung a nivelului glucozei din sânge (glicemia), cât mai aproape posibil de nivelul normal, reducând riscul consecinţelor cardiovasculare.  Efectuarea glicemiei permite evaluarea statusului curent al metabolismului carbohidraţilor la pacienţii diabetici în momentul recoltării probei de sânge, dar nu reprezintă o reflectare reală a statusului glicemic.  Spre deosebire de aceasta, determinarea hemoglobinei glicozilate oferă o estimare retrospectivă a statusului glicemic, independentă de ritmul circadian, dietă şi alte fluctuaţii tranzitorii ale concentraţiei glucozei în sânge.  Hemoglobina glicozilată HbA1c reprezintă aşadar un mic procent din hemoglobina A şi reflectă legarea continuă şi ireversibilă a glucozei din sânge pe durata de viaţă a eritrocitelor. În acest fel, creşterea valorilor Hb A1c este proporţională cu nivelul mediu al glucozei sanguine în cursul ultimelor 2-3 luni anterioare testării.  Glicozilarea se desfaşoară în două etape, prin reacţii nonenzimatice, fiind dependentă de cantitatea de glucoză din sânge. Glicozilarea implică şi alte proteine şi este principalul mecanism prin care apare glucotoxicitatea.  Alte mecanisme implicate sunt: o stressul oxidativ o activarea căii poliol o activarea proteinkinazei C o distrucţia endotelială o schimbări hemodinamice şi de coagulare  Alte proteine care pot glicozila sunt componente cu timp de injumatăţire scurt, fiind glicozilate într-o proporţie mult mai scazută decât Hb. De exemplu, albumina are timpul de înjumătăţire de 20 de zile. Altele însă, precum actina, mielina, colagenul, fibronectina, nucleoproteinele, spectrina, pot fi şi ele glicozilate şi au un timp de înjumătăţire lung. Ele trec printr-un proces de rearanjare complex şi ireversibil, cu formarea produşilor finali avansaţi de glicozilare (advanced glycocosylation end products - AGEs).  AGEs formează o mare familie cu numeroase componente, parţial identificate. Acumularea lor ȋn structura proteinelor le modifică funcţionarea. Ele au capacitatea de a se leaga de receptorii specifici pentru macrofage şi induc eliberarea enzimelor hidrolitice, a citokinelor şi factorilor de creştere capabili să iniţieze sinteza 111

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

 





2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

substanţelor fundamentale şi, acţionând la nivel intracelular pot conduce la degradări ale acizilor nucleici.

substanţelor fundamentale şi, acţionând la nivel intracelular pot conduce la degradări ale acizilor nucleici.

Recomandări pentru determinarea HbA1c Determinarea Hb A1c constituie un test de evaluare şi monitorizare pe termen lung al controlului glicemic la pacienţii cu diabet zaharat. Mai mult, are un rol predictiv în ceea ce priveşte riscul complicaţiilor diabetului: cetoacidoza, nefropatia, retinopatia şi asigură discernământ în alegerea metodei terapeutice de elecţie la pacienţii diabetici, pe criteriul eficienţei: antidiabetice orale sau insulină Recomandări pentru determinarea HbA1c: o diabet zaharat de tip I instabil, cu modificări mari ale glicemiei de la o zi la alta o diabetul copilului o diabetul la bolnavii cu prag renal al glucozei anormal o diabetul zaharat de tip II, la paciente însărcinate sau pacienţi care şi-au modificat recent dieta, stilul obişnuit de viaţă sau medicaţia, astfel încât controlul lor metabolic pare mai bun decât este în realitate o diabet gestaţional tip 2. Testul se execută la interval de : o 3-4 luni la pacienţii cu diabet zaharat tip I; o 6 luni la pacienţi cu diabet zaharat de tip II (excepţie: sarcină – unde controlul este indicat la 2 luni.

Recomandări pentru determinarea HbA1c Determinarea Hb A1c constituie un test de evaluare şi monitorizare pe termen lung al controlului glicemic la pacienţii cu diabet zaharat. Mai mult, are un rol predictiv în ceea ce priveşte riscul complicaţiilor diabetului: cetoacidoza, nefropatia, retinopatia şi asigură discernământ în alegerea metodei terapeutice de elecţie la pacienţii diabetici, pe criteriul eficienţei: antidiabetice orale sau insulină Recomandări pentru determinarea HbA1c: o diabet zaharat de tip I instabil, cu modificări mari ale glicemiei de la o zi la alta o diabetul copilului o diabetul la bolnavii cu prag renal al glucozei anormal o diabetul zaharat de tip II, la paciente însărcinate sau pacienţi care şi-au modificat recent dieta, stilul obişnuit de viaţă sau medicaţia, astfel încât controlul lor metabolic pare mai bun decât este în realitate o diabet gestaţional tip 2. Testul se execută la interval de : o 3-4 luni la pacienţii cu diabet zaharat tip I; o 6 luni la pacienţi cu diabet zaharat de tip II (excepţie: sarcină – unde controlul este indicat la 2 luni.

2. Principiul metodei

 





2. Principiul metodei

Adiţia fructozei pe molecula de hemoglobină schimbă unele dintre proprietăţile sale fizico-chimice iar aceste proprietăţi sunt utilizate pentru metoda electroforetică şi cromatografică de dozare a Hb A1c. Mai exact, Hb A1c diferă de hemoglobina nativă prin încărcătura electrică totală, regiunea electrică pentru care are afinitate gruparea fructozei şi proprietăţile antigenice.

Adiţia fructozei pe molecula de hemoglobină schimbă unele dintre proprietăţile sale fizico-chimice iar aceste proprietăţi sunt utilizate pentru metoda electroforetică şi cromatografică de dozare a Hb A1c. Mai exact, Hb A1c diferă de hemoglobina nativă prin încărcătura electrică totală, regiunea electrică pentru care are afinitate gruparea fructozei şi proprietăţile antigenice.

3. Modul de lucru

3. Modul de lucru

Proba: Sânge total Metodele de dozare sunt multiple: 1. Cromatografie (prin schimb ionic) 2. Metoda electroforetică 3. Metoda imunologică

Proba: Sânge total Metodele de dozare sunt multiple: 1. Cromatografie (prin schimb ionic) 2. Metoda electroforetică 3. Metoda imunologică

112

112

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

Metoda de elecţie este considerată cromatografia de schimb ionic de înaltă performanţă (HPLC). Probele sunt diluate automat ȋn aparat, transmise circuitului şi încărcate în cartuşul analitic. Aparatul distribuie ȋn cartuş un tampon cu gradient programabil de tărie ionică crescătoare, unde hemoglobinele sunt separate pe baza interacţunilor ionice cu materialul conţinut de cartuş. Hemoglobinele separate vor trece apoi prin filtrul fotometric unde sunt măsurate schimbările de absorbţie la 415 nm. Programul analizorului realizează prelucrarea datelor brute obţinute pentru fiecare probă. Pentru cuantificarea valorilor HbA1c sunt utilizate două nivele de calibrare. Pentru fiecare probă este generat un raport şi o cromatogramă. Aria HbA1c se calculează utilizând un algoritm exponenţial gaussian modificat (care exclude din ara pick-urilor de HbA1c aria pickurilor de HbA1c labilă şi carbamilată). Se aduc eprubetele cu probe la temperatura camerei ȋnainte de a incepe testarea. La temperatura camerei probele sunt stabile timp de 3 zile. Nu este necesară pregatirea anterioară a probelor şi nici omogenizarea acestora înainte de încărcare. Eprubetele cu probe sunt puse în suportul special şi încărcate direct în aparat. Aparatul este un sistem închis de dozare a acestui parametru.

Metoda de elecţie este considerată cromatografia de schimb ionic de înaltă performanţă (HPLC). Probele sunt diluate automat ȋn aparat, transmise circuitului şi încărcate în cartuşul analitic. Aparatul distribuie ȋn cartuş un tampon cu gradient programabil de tărie ionică crescătoare, unde hemoglobinele sunt separate pe baza interacţunilor ionice cu materialul conţinut de cartuş. Hemoglobinele separate vor trece apoi prin filtrul fotometric unde sunt măsurate schimbările de absorbţie la 415 nm. Programul analizorului realizează prelucrarea datelor brute obţinute pentru fiecare probă. Pentru cuantificarea valorilor HbA1c sunt utilizate două nivele de calibrare. Pentru fiecare probă este generat un raport şi o cromatogramă. Aria HbA1c se calculează utilizând un algoritm exponenţial gaussian modificat (care exclude din ara pick-urilor de HbA1c aria pickurilor de HbA1c labilă şi carbamilată). Se aduc eprubetele cu probe la temperatura camerei ȋnainte de a incepe testarea. La temperatura camerei probele sunt stabile timp de 3 zile. Nu este necesară pregatirea anterioară a probelor şi nici omogenizarea acestora înainte de încărcare. Eprubetele cu probe sunt puse în suportul special şi încărcate direct în aparat. Aparatul este un sistem închis de dozare a acestui parametru.

4. Valori de referinţă

4. Valori de referinţă

HBA1C = 4 – 6%

HBA1C = 4 – 6%

5. Variaţii patologice

5. Variaţii patologice

 VALORI CRESCUTE  diabet zaharat  splenectomie  intoxicaţii cu plumb  consumul de alcool  anemie feriprivă  după unele medicamente: lovastatin, propranolol  VALORI SCĂZUTE  sarcină  pierderi cronice de sânge  post-transfuzional 113

aspirină,

betablocante,

 VALORI CRESCUTE  diabet zaharat  splenectomie  intoxicaţii cu plumb  consumul de alcool  anemie feriprivă  după unele medicamente: lovastatin, propranolol  VALORI SCĂZUTE  sarcină  pierderi cronice de sânge  post-transfuzional 113

aspirină,

betablocante,

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

 insuficienţă renală cronică  defect al enzimei Glucozo-6-fosfat dehidrogenază  anemiile hemolitice (datorită scăderii duratei de viaţă a hematiilor)  post administrare a unor agenţi farmacologici: enalapril, insulina, verapamil. Limite şi interferenţe: o Testul HbA1c nu se recomandă ȋn diagnosticul diabetului zaharat pentru că sensibilitatea sa este scăzută în comparaţie cu testul de toleranţă la glucoză o La pacienţii cu gamapatii monoclonale, în special de tip IgM (boala Waldenström) rezultatele obţinute pot fi uneori neconcludente o Prezenţa hemoglobinelor patologice interferă cu testul pentru determinare a HbA1c (Hb F şi Hb H determina valori fals crescute, Hb S din sicklemie, C, E, D, şi Lepore determină valori fals scăzute) 6. FUNDAMENTE BIOCHIMICE Hemoglobina glicozilată este formată continuu în eritrocite ca produs al reacţiei non-enzimatice dintre glucoză şi hemoglobină (proteina roşie din sânge responsabilă de transportul gazelor respiratorii, O2 şi CO2). Legătura dintre glucoză şi hemoglobină este foarte stabilă, astfel hemoglobina rămâne glicată pe toata durata vieţii eritrocitelor; aproximativ 110 +/- 23 zile. Testul Hb A1c oferă o estimare a nivelului mediu de glucoză din sânge pe o perioadă de 30 - 90 de zile. Nivelul mediu normal al Hb A1c este < 6%. Valorile crescute ale Hb A1c se corelează cu dezvoltarea complicaţiilor diabetice şi pot reprezenta o modalitate eficientă în monitorizarea ulterioară a diabetului. În condiţii de hiperglicemie, şi alte proteine din ser în afară de hemoglobină sunt glicozilate. Măsurarea acestor proteine glicate poate fi o alternativă a HbA1c pentru evaluarea nivelului glicemic. La pacienţii cu diabet, testarea hemoglobinei glicozilate (HbA1c) este curent utilizată pentru a monitoriza controlul glicemic general al pacientului. 114

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

 insuficienţă renală cronică  defect al enzimei Glucozo-6-fosfat dehidrogenază  anemiile hemolitice (datorită scăderii duratei de viaţă a hematiilor)  post administrare a unor agenţi farmacologici: enalapril, insulina, verapamil. Limite şi interferenţe: o Testul HbA1c nu se recomandă ȋn diagnosticul diabetului zaharat pentru că sensibilitatea sa este scăzută în comparaţie cu testul de toleranţă la glucoză o La pacienţii cu gamapatii monoclonale, în special de tip IgM (boala Waldenström) rezultatele obţinute pot fi uneori neconcludente o Prezenţa hemoglobinelor patologice interferă cu testul pentru determinare a HbA1c (Hb F şi Hb H determina valori fals crescute, Hb S din sicklemie, C, E, D, şi Lepore determină valori fals scăzute) 6. FUNDAMENTE BIOCHIMICE Hemoglobina glicozilată este formată continuu în eritrocite ca produs al reacţiei non-enzimatice dintre glucoză şi hemoglobină (proteina roşie din sânge responsabilă de transportul gazelor respiratorii, O2 şi CO2). Legătura dintre glucoză şi hemoglobină este foarte stabilă, astfel hemoglobina rămâne glicată pe toata durata vieţii eritrocitelor; aproximativ 110 +/- 23 zile. Testul Hb A1c oferă o estimare a nivelului mediu de glucoză din sânge pe o perioadă de 30 - 90 de zile. Nivelul mediu normal al Hb A1c este < 6%. Valorile crescute ale Hb A1c se corelează cu dezvoltarea complicaţiilor diabetice şi pot reprezenta o modalitate eficientă în monitorizarea ulterioară a diabetului. În condiţii de hiperglicemie, şi alte proteine din ser în afară de hemoglobină sunt glicozilate. Măsurarea acestor proteine glicate poate fi o alternativă a HbA1c pentru evaluarea nivelului glicemic. La pacienţii cu diabet, testarea hemoglobinei glicozilate (HbA1c) este curent utilizată pentru a monitoriza controlul glicemic general al pacientului. 114

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

Asociaţia Americană de Diabet nu recomandă acest test pentru diagnostic, având în vedere că nu există un aşa numit “standard de aur” pentru Hb A1c şi pentru că multe ţări nu au acces la el. La pacienţii diabetici cu valoarea Hba1c < 7%, se consideră că metabolismul glucidic este relativ bine controlat, la cei la care Hba1c este ȋntre 7-9% controlul metabolismului glucidic este slab, iar valori > 9%, sugerează un dezechilibru, o decompensare a metabolismului glucidic la această categorie de pacienţi. Valorile protective ale HbA1c de complicaţiile cronice ale diabetului sunt considerate cele pană in 7% Studiile de specialitate ale cercetătorilor din ȋntreaga lume atrag atenţia asupra necesităţii evaluarii controlului metabolic la copil, ȋn momentul de faţă, atitudinea globală fiind departe de ȋndeplinirea acestor deziderate Studiile de specialitate efectuate ȋn ţările şi comunităţile care beneficiază de fonduri special destinate ameliorării diabetului şi complicaţiilor acestuia, au demonstrat că scăderea cu 10% a valorii HbA1c determină o reducere cu 35% a riscului de retinopatie, cu 25-44% a riscului de nefropatie şi cu 30% a celui de neuropatie. Testul Hb glicozilate nu se foloseşte niciodată ca test unic pentru diagnosticarea diabetului zaharat, ci alături de el se face ♠ testul glicemiei provocate, se cercetează şi dozează prezenţa ♠ glucozei in urină - glicozuria, cantitatea de ♠ corpi cetonici.

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

Asociaţia Americană de Diabet nu recomandă acest test pentru diagnostic, având în vedere că nu există un aşa numit “standard de aur” pentru Hb A1c şi pentru că multe ţări nu au acces la el. La pacienţii diabetici cu valoarea Hba1c < 7%, se consideră că metabolismul glucidic este relativ bine controlat, la cei la care Hba1c este ȋntre 7-9% controlul metabolismului glucidic este slab, iar valori > 9%, sugerează un dezechilibru, o decompensare a metabolismului glucidic la această categorie de pacienţi. Valorile protective ale HbA1c de complicaţiile cronice ale diabetului sunt considerate cele pană in 7% Studiile de specialitate ale cercetătorilor din ȋntreaga lume atrag atenţia asupra necesităţii evaluarii controlului metabolic la copil, ȋn momentul de faţă, atitudinea globală fiind departe de ȋndeplinirea acestor deziderate Studiile de specialitate efectuate ȋn ţările şi comunităţile care beneficiază de fonduri special destinate ameliorării diabetului şi complicaţiilor acestuia, au demonstrat că scăderea cu 10% a valorii HbA1c determină o reducere cu 35% a riscului de retinopatie, cu 25-44% a riscului de nefropatie şi cu 30% a celui de neuropatie. Testul Hb glicozilate nu se foloseşte niciodată ca test unic pentru diagnosticarea diabetului zaharat, ci alături de el se face ♠ testul glicemiei provocate, se cercetează şi dozează prezenţa ♠ glucozei in urină - glicozuria, cantitatea de ♠ corpi cetonici.

7. MCQ

7. MCQ

Hb gl 1 Care dintre următorii parametri sunt utili ȋn evaluarea metabolismului glucidic? A. Glicemia B. Testul de toleranţă orală la glucoză C. Prezenţa glucozei ȋn urină D. Eliminarea de fenilpiruvat în urină E. Corpii cetonici ȋn urină

Hb gl 1 Care dintre următorii parametri sunt utili ȋn evaluarea metabolismului glucidic? A. Glicemia B. Testul de toleranţă orală la glucoză C. Prezenţa glucozei ȋn urină D. Eliminarea de fenilpiruvat în urină E. Corpii cetonici ȋn urină

Hb gl 2 Valoarea normală a hemoglobinei glicozilate este: A. 1-3% B. 4-7% C. 7-9%

Hb gl 2 Valoarea normală a hemoglobinei glicozilate este: A. 1-3% B. 4-7% C. 7-9%

115

2010

115

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

D. 4-6% E. 1,3-1,7 g/l

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

D. 4-6% E. 1,3-1,7 g/l

Hb gl 3 În condiţii de hiperglicemie: A. O parte din glucoză se elimină obligatoriu prin urină B. Testul HbA1c este util ȋn monitorizarea bolnavului cu diabet C. Corpii cetonici se elimină ȋn urină D. Valoarea glicemiei depăşeşte pragul renal de eliminare a glucozei ȋn urină E. Pacientul prezintă asociat şi variaţii ale ureei

Hb gl 3 În condiţii de hiperglicemie: A. O parte din glucoză se elimină obligatoriu prin urină B. Testul HbA1c este util ȋn monitorizarea bolnavului cu diabet C. Corpii cetonici se elimină ȋn urină D. Valoarea glicemiei depăşeşte pragul renal de eliminare a glucozei ȋn urină E. Pacientul prezintă asociat şi variaţii ale ureei

Hb gl 4 Testul HbA1c: A. Este recomandat ȋn diagnosticul bolnavilor diabetici B. Înregistrează valori peste 7% la pacienţii cu diabet C. Prezintă valori sub 6g/l la indivizii normali D. Poate fi util, alături de alţi parametri, ȋn monitorizarea metabolismului glucidic la diabetici E. Este un test ce oferă date despre durata de viaţă a hematiilor

Hb gl 4 Testul HbA1c: A. Este recomandat ȋn diagnosticul bolnavilor diabetici B. Înregistrează valori peste 7% la pacienţii cu diabet C. Prezintă valori sub 6g/l la indivizii normali D. Poate fi util, alături de alţi parametri, ȋn monitorizarea metabolismului glucidic la diabetici E. Este un test ce oferă date despre durata de viaţă a hematiilor

Hb gl 5 Determinarea valorilor HbA1c: A. Se poate realiza prin metode electroforetice B. Poate fi realizată prin cromatografie prin schimb ionic, mai rar folosit C. Oferă indicaţii privind nivelul glicemiei al individului, din ultimele 3-4 luni D. Se recomandă ca test de diagnostic la pacienţii diabetici E. Poate înregistra rezultate false la pacienţii cu sicklemie (anemie falciformă)

Hb gl 5 Determinarea valorilor HbA1c: A. Se poate realiza prin metode electroforetice B. Poate fi realizată prin cromatografie prin schimb ionic, mai rar folosit C. Oferă indicaţii privind nivelul glicemiei al individului, din ultimele 3-4 luni D. Se recomandă ca test de diagnostic la pacienţii diabetici E. Poate înregistra rezultate false la pacienţii cu sicklemie (anemie falciformă)

Hb gl 6 Hemoglobina glicozilată A. Prezintă valori crescute la pacienţii cu anemie hemolitică B. Înregistrează valori scăzute la bolnavii cu insuficienţă renală cronică C. Este un test recomandat ȋn diagnosticul diabetului zaharat D. Poate ȋnregistra valori sub 4% la pacientii diabetici cu control slab al metabolismului glucidic E. Nici un răspuns corect

Hb gl 6 Hemoglobina glicozilată A. Prezintă valori crescute la pacienţii cu anemie hemolitică B. Înregistrează valori scăzute la bolnavii cu insuficienţă renală cronică C. Este un test recomandat ȋn diagnosticul diabetului zaharat D. Poate ȋnregistra valori sub 4% la pacientii diabetici cu control slab al metabolismului glucidic E. Nici un răspuns corect

Hb gl 7 Se recomandă determinarea valorilor hemoglobinei glicozilate, la următoarele categorii:

Hb gl 7 Se recomandă determinarea valorilor hemoglobinei glicozilate, la următoarele categorii:

116

116

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

A. Pacienţi cu diabet zaharat tip I B. Indivizi cu diabet tip II C. Gravide D. Pacienţii cu boli renale E. Nici un răspuns corect

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului glucidic

2010

A. Pacienţi cu diabet zaharat tip I B. Indivizi cu diabet tip II C. Gravide D. Pacienţii cu boli renale E. Nici un răspuns corect

Hb gl 8 Hemoglobina glicozilată: A. Reprezintă un procent mic din hemoglobina totală din sânge B. Reprezintă singura proteină glicozilată din sânge C. Deţine un procent ȋntre 4-6% din hemoglobina totală D. Se găseşte ȋn sânge ȋn proporţie echimoleculară cu Hb S E. Se formează prin glicozilarea anormală a hemoglobinei, proteina roşie din sânge

Hb gl 8 Hemoglobina glicozilată: A. Reprezintă un procent mic din hemoglobina totală din sânge B. Reprezintă singura proteină glicozilată din sânge C. Deţine un procent ȋntre 4-6% din hemoglobina totală D. Se găseşte ȋn sânge ȋn proporţie echimoleculară cu Hb S E. Se formează prin glicozilarea anormală a hemoglobinei, proteina roşie din sânge

Hb gl 9 Legarea resturilor glicozil la hemoglobină A. Se realizează doar ȋn condiţii patologice B. Are loc ȋn paralel cu glicozilarea ȋn cantităţi mult mai mari, ale altor proteine C. Conduce la formarea hemoglobinei glicozilate, care 1n mod fiziologic lipseşte din sângele indivizilor normali D. Este un proces catalizat de enzime specifice E. Nici un răspuns corect

Hb gl 9 Legarea resturilor glicozil la hemoglobină A. Se realizează doar ȋn condiţii patologice B. Are loc ȋn paralel cu glicozilarea ȋn cantităţi mult mai mari, ale altor proteine C. Conduce la formarea hemoglobinei glicozilate, care 1n mod fiziologic lipseşte din sângele indivizilor normali D. Este un proces catalizat de enzime specifice E. Nici un răspuns corect

Hb gl 10 Testul HbA1c: A. Se foloseşte ca test unic ȋn diagnosticul diabetului zaharat B. Prezintă nivele săzute la etanolici C. Înregistrează valori scăzute la pacienţii cu anemie feriprivă D. Este util ȋn evaluarea nivelului glicemic din perioada anterioară dozării E. Se recomandă ȋn evaluarea controlului metabolismului glucidic la pacienţii diabetici

Hb gl 10 Testul HbA1c: A. Se foloseşte ca test unic ȋn diagnosticul diabetului zaharat B. Prezintă nivele săzute la etanolici C. Înregistrează valori scăzute la pacienţii cu anemie feriprivă D. Este util ȋn evaluarea nivelului glicemic din perioada anterioară dozării E. Se recomandă ȋn evaluarea controlului metabolismului glucidic la pacienţii diabetici

117

117

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

CAPITOLUL 6 EXPLORAREA METABOLISMULUI LIPIDIC

6.1. DOZAREA TRIGLICERIDELOR (TG) 1. Consideraţii generale

 Trigliceridele – TG, sunt esteri ai glicerolului cu 3 acizi graşi.

 







Aceştia sunt parţial sintetizaţi în ficat, mucoasa intestinală şi ţesutul adipos (TG endogene), iar o parte provin din alimentaţie (TG exogene). Trigiceridele din ţesutul adipos şi din celelalte ţesuturi reprezintă cel mai important depozit de rezerve energetice ale organismului. În ţesutul adipos sunt depozitate sub forma de glicerol, acizi graşi şi monogliceride, care sunt convertite în ficat în trigliceride ce intră în constituţia VLDL – lipoproteine cu densitate foarte mica, specializate in transportul prin sange a TG sintetizate la nivel hepatic - (80%) şi LDL (lipoproteine cu densitate mica, specializate in transportul de colesterol prin sange - (15%). Sinteza TG are loc în trei compartimente principale: o intestin (avand drept precursor un monoglicerid); o ficat şi ţesut adipos (precursorul de data aceasta este glicerol fosfatul, care poate proveni din diferite surse, glucoza pe de o parte, TG şi fosfolipidele alimentare pe de altă parte). Consecutiv sintezei, TG formate în intestin şi ficat sunt exportate către ţesuturile consumatoare, cuplat cu apoproteinele plasmatice, sub formă de lipoproteine plasmatice, de tip chilomicroni (cele cu origine intestinala) şi respectiv VLDL (lipoproteine cu densitate foarte mică – cele sintetizate la nivel hepatic). TG sintetizate ȋn ţesutul adipos nu mai sunt exportate ci servesc drept rezervă, fiind depozitate la acest nivel. Metabolismul TG presupune ulterior şi degradarea unei părţi a acestora, pe masură ce sunt transportate în sânge, sub acţiunea unei lipoprotein lipaze (LPL). Se generează în acest fel resturile de 118

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

chilomicroni, transportate apoi la ficat, precum şi forme intermediare ale lipoproteinelor, IDL şi apoi LDL.  Hipertrigliceridemia împreună cu hipercolesterolemia sunt factori de risc independenţi pentru boala aterosclerotică. Dintre parametrii serici, nivelul fracţiilor de colesterol este desemenea semnificativ ȋn acest sens, valoarea trigliceridelor fiind necesară pentru calcularea fracţiunii LDL a colesterolului (LDLc). O valoare ȋnsă mai mare a TG, care depăşeşte 400 mg/dl, conduce la erori in calcularea corectă a LDLc, aplicând formula Friedewald. Recomandări pentru determinarea trigliceridelor  investigarea metabolismului lipidic;  pacienţii cu istoric familial sugestiv de dereglări ale metabolismului lipidic sau cu suspiciune de ATS  afectări hepatice;  monitorizarea bolii diabetice (când este afectat nu doar metabolismul glucidic, ci şi cel lipidic, iar uneori şi cel proteic)  pacienţi care urmează un tratament medicamentos ce poate intefera cu profilul lipidic normal. 2. Principiul metodei Metoda foloseşte o lipoprotein lipază (LPL) pentru hidroliza rapidă şi completă a trigliceridelor la glicerol, urmată de oxidarea acestuia la dihidroxiaceton-fosfat şi apă oxigenată. Apa oxigenată astfel obţinută reacţionează cu 4 – aminofenazona si 4 – clorofenol sub acţiunea catalitică a peroxidazei pentru a forma un compus roşu care este dozat colorimetric. LPL Trigligeride + 3 H2O

Glicerol + 3 RCOOH

Glicerol K Glicerol + ATP

Glicerol-3-fosfat + ADP 2+

Mg

Glicerol P Oxidaza Glicerol-3-fosfat + O2

Fosfat de dihidroxiacetona

119

+ H2O2

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

Peroxidaza

+ 4-aminofenazona

(p-benzochinona-monoimino)-fenazona (rosu) + 2H2O + HCl

H 2O 2 + 4-clorofenol

3. Reactivi Reactiv 1 (R1): Tampon PIPES, pH=7,2 4-clorofenol

50 mmol/L 2 mmol/L

Reactiv 2 (R2): Lipoprotein lipaza Glicerolkinaza Glicerol fosfat oxidaza Peroxidaza 4-aminofenazona ATP Mg2+

150.000 U/L 800 U/L 3.000 U/L 350 U/L ≥0,13 mmol/L 30 mmol/L 40 mmol/L

Standard : Glicerină (echivalent de trioleină)

2,28 mmol/L

4. Modul de lucru: Proba : Ser / plasma heparinizată (nehemolizat) Se dizolvă conţinutul unui flacon de reactiv 2 (R2) în cantitatea corespunzătoare de reactiv 1 (R1), rezultând amestecul de reactivi. Se folosesc 3 eprubete: proba (P) standard (St) şi martor (M). Reactiv

P (µl)

St (µl)

M (µl)

Amestec reactivi Apă distilată Standard Proba

1000 10

1000 10 -

1000 10 -

După amestecare şi incubare timp de 6 minute la 37° C sau de 20 minute la temperatura camerei se citeşte valoarea absorbanţei (A) probei şi standardului la 505 nm (490-550nm), în cuve de 1 cm, faţă de martor. Mod de măsurare: cu punct final. 120

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

Calcul A Proba -------------- x C Standard = mg/dL trigliceride A Standard Probele cu o concentraţie mai mare de 600 mg/dL trebuiesc diluate 1:2 cu soluţie salină şi analizate din nou. Rezultatele obţinute vor ţine cont de diluţie. În cazul în care rezultatele trebuie să fie exprimate în unităţi SI se aplică formula de calcul: mg/dL x 0.0113 = mmol/L 5. Valori de referinţă :

35 - 160 mg/dL

Valori de ALERTĂ CLINICĂ !  > 500 mg/dL semnifică Hipertrigliceridemia extremă ȋn prezenţa pancreatitei diagnosticate  > 1000 mg/dL prezintă risc extrem pentru Pancreatită 6.

VARIAŢII FIZIOLOGICE ŞI PATOLOGICE  Variaţii fiziologice ale trigliceridelor o Valorile trigliceridelor în sânge sunt uşor mai mari la femei decât la bărbaţi, fiind corelate cu greutatea şi cu vârsta. o Nivelul acestora se modifică tranzitoriu în ▒sarcină, ▒consumul de alcool şi după unele ▒medicamente sau agenţi farmacologici (contraceptive orale, estrogeni, colestiramina, vitamina C, antiinflamatoare steroide/nesteroide, hipolipemiante).  Valori crescute

Valori de alertă clinică >500 mg/dl în prezenţa pancreatitei diagnosticate şi >1.000 mg/dl risc de pancreatită acută (mai ales dacă sunt însoţite de obezitate, diabet, consum de alcool). Valori crescute ale trigliceridelor >200 mg/dl sunt asociate cu un risc crescut de ♠ateroscleroză, ♠boală coronariana, ♠infarct de miocard. Nivelul ridicat al trigliceridelor poate apare într-o varietate mare de dereglări: 121

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

Afectare hepatică prin boli inflamatorii (hepatite) sau alcoolism, care determină consecutiv defect de LPL – nu mai are cine să degradeze lipidele circulante, cu creşterea valorii acestora ȋn sânge, sau  defect de formare a VLDL care ar trebui sa exporte TG din ficat, către ţesuturile extrahepatice – deci ele nu mai sunt transportate corespunzător, rămân ȋn circulaţie şi astfel creşte valoarea absolută a TG ȋn ser Obezitate (producţie crescută de TG); Ficat gras (♠fie prin producţie crescută şi consecutiv depozitare de TG ȋn ficat, datorat defectului de compusi precum Met, fosfat, AGN, necesari sintezei de fosfolipide, situaţie in care, digliceridele sunt predominant dirijate catre formarea de TG, in defavoarea formarii de PL-fosfolipide; ♠ fie prin defect de cuplare cu apoproteinele specifice, si deci defect de formare a lipoproteinei specifice – VLDL, specializată in exportul TG de origine hepatică) – consecinţa: ficatul va acumula o cantitate prea mare de grasime faţă de capacitatea lui de metabolizare sau export (ficatul ȋn mod normal nu face depozite de TG aşa cum face ţesutul adipos) Pancreatită Infarct miocardic Afectare renală (sindrom nefrotic) Analbuminemie (albumina este transportorul major pentru agenţii liposolubili în plasmă, deci ȋn defectul sau lipsa totală a acestei proteine cărăuş, nivelul lipidelor va creşte ȋn sânge) Hiperlipoproteinemia tip I (prin defect de LPL) Hiperlipoproteinemia tip II (prin defect de receptor al LDL), frecvent asociat cu ATS si boli coronariene Hiperlipoproteinemia tip III (cu creşteri ale nivelului de colesterol, chilomicroni şi VLDL) Hiperlipoproteinemia tip IV (caracterizată prin nivele crescute de TG şi VLDL). Dieta prea bogată în carbohidraţi şi săracă în proteine Afectare tiroidiană (Hipotiroidie) Guta, sindrom Down (afectare genetică)  Valori scăzute o Valorile extreme şi foarte reduse ale TG (mai putin de 10 mg/dl) reprezintă de asemeni o problemă pentru clinicianul practician. 122

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

De cele mai multe ori, aceste valori sunt sugestive pentru un  organism malnutrit, sau existenta unei  malabsorbţii. o Nivele reduse de TG se pot înregistra însă şi la pacienţi cu:  insuficienţă hepatică  hipertiroidism, hiperparatiroidism  infecţii cronice (nespecific)  neoplazii Colesterolul total şi TG sunt dozările folosite în prima etapă de evaluare a riscului aterogen, în evaluarea prevalenţei şi diagnosticului bolilor coronariene. Realizarea unui profil lipidic complet – lipidograma - se impune ca o necesitate în diagnosticul diferenţial al dislipidemiilor, dar şi pentru a aşeza managementul bolilor cardiovasculare pe raţionamente mai puţin empirice, alături de TG în aceste situaţii, fiind recomandată asociat, şi evaluarea colesterolului total (Colt), a LDL, VLDL, HDL 7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE Trigliceridele sunt esteri ai glicerolului cu 3 acizi graşi. Reprezintă cel mai important depozit de rezerve energetice ale organismului. Sunt parţial sintetizate în ficat, mucoasa intestinala şi ţesutul adipos (endogene) şi o parte provin din alimentaţie(exogene). Metabolismul TG presupune ulterior şi degradarea lor ȋn circulaţie (sânge) sub acţiunea unei lipoprotein lipaze (LPL). Această enzimă acţionează asupra TG cuprinse ȋn structura lipoproteinelor: VLDL şi chilomicroni. Se generează în acest fel resturile de chilomicroni, transportate apoi la ficat, precum şi forme intermediare ale lipoproteinelor, IDL şi apoi LDL. Hipertrigliceridemia este un factor de risc pentru boala aterosclerotică. 8. MCQ TG1 Trigliceridele: A. reprezintă cel mai important depozit de rezerve energetice al organismului B. sunt esteri ai glicerolului cu 2 acizi graşi 123

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

C. sunt parţial sintetizate în ficat, o altă parte provenind din alimentaţie D. se elimina la nivel renal E. scad ȋn sânge ȋn cursul pancreatitei TG2 Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la trigliceride NU este adevarată: A. hipotrigliceridemia este factor de risc independent pentru boala aterosclerotică B. administrarea de vitamina C poate interfera cu nivelul TG C. valoarea acestora creşte în pancreatite D. în ţesutul adipos sunt depozitate sub forma de glicerol, acizi graşi şi monogliceride E. pot avea valori crescute în sânge la pacienţii cu diabet zaharat decompensat TG3

Valoarea normală a trigliceridelor în ser variază între: A. 35 - 160 mg/dl B. >240 mg/dl C. >40 mg/dl D. 100 – 135 mg/dl E. nici o variantă corectă

TG4

Care din următoarele afirmaţii NU este adevărată: A. întâlnim valori scăzute ale trigliceridelor în hipertiroidism B. HDL-colesterolul reprezintă „fracţia bună a colesterolului” C. valoarea trigliceridelor nu variază în funcţie de alimentaţie D. LDL-colesterolul nu este fracţiunea de colesterol care oferă protecţie împotriva bolii aterosclerotice; E. în sarcină pot fi întâlnite valori elevate ale colesterolului şi trigliceridelor ȋn ser

TG5

Nivelul trigliceridelor ȋn sânge creşte în următoarele condiţii, CU EXCEPŢIA: A. boli hepatice B. alcoolism C. sindrom nefrotic D. malabsorbţie E. gută

TG6

Determinarea trigliceridelor este recomandată şi poate aduce indicaţii de diagnostic în: 124

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

A. B. C. D. E.

2010

afectări hepatice afecţiuni osoase afecţiuni renale afecţiuni endocrine afecţiuni musculare

TG7 Care din următoarele afirmaţii referitoare la trigliceride NU este falsă: A. circulă liber prin sânge B. dieta bogată în grăsimi conduce la scăderea nivelului trigliceridelor C. datorită conţinutului mare de energie sunt stocate la nivelul mitocondriilor D. sunt transportate în sânge legate de proteine transportoare E. sunt produsul direct de degradare al ADN-ului celular TG8 Nivelul trigliceridelor în sânge scade în următoarele condiţii, CU EXCEPŢIA: A. gută B. malabsorbţie C. sindrom nefrotic D. hiperparatiroidism E. boli cerebrale TG9 Nivelul crescut de trigliceride în plasmă poartă numele de: A. hiperglicemie B. hipotrigliceridemie C. hiperlipemie D. hipoglicemie E. hipertrigliceridemie TG10 Degradarea trigliceridelor sub acţiunea enzimei lipoprotein lipază conduce la formarea următorilor compuşi cu excepţia: A. resturi de chilomicroni B. HDL C. IDL D. Proteine E. Albumină

125

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

6.2. DOZAREA COLESTEROLULUI 1. Consideraţii generale  Colesterolul este un alcool policiclic (sterol) de care se leagă acizii graşi, devenind astfel o grăsime care se întâlneşte în aproape toate alimentele de origine animală. El este transportat prin sânge doar ȋn combinaţie cu proteinele, sub formă de lipoproteine.  Principalele roluri ale acestui sterol constau ȋn: o structura membranelor celulare (unde acţionează ca un agent stabilizator şi modulator al fluidităţii membranare), o precursor ȋn formarea de: acizi biliari, hormoni sexuali (sexosteroizi), vitamina D  Organismul îşi fabrică singur colesterolul necesar (ficat, mucoasa intestinală) şi nu are nevoie de nici un aport alimentar de acest fel. Dacă alimentele mâncate conţin o cantitate prea mare de grăsimi colesterolul se depune pe pereţii vaselor de sânge sub formă de plăcuţe numite ATEROAME. Prezenţa plăcuţelor de colesterol rigidizează peretele vaselor afectate şi ȋn acelaşi timp îngustează lumenul vascular, cu reducerea consecutivă a fluxului sanguin ȋn vasele afectate = ischemie şi consecutiv necroza teritoriilor irigate de vasele de sânge (= infarct) ce prezintă plăcuţe de colesterol (ateroame). De aceea această situaţie se numeşte ATEROSCLEROZĂ ATS (scleroza pereţilor arteriali ce prezintă ateroame), cu consecinţe uneori severe la nivelul diferitelor organe - infarct: inimă, rinichi, creier (ȋn funcţie de localizarea preferenţială a ateroamelor pe vasele care irigă aceste organe, de regulă, la nivelul ţesuturilor menţionate, pentru că acestea sunt ţesuturile mari consumatoare de oxigen).  Colesterolul crescut peste valorile normale este un factor de risc important care anunţă, uneori cu ani înainte, dezvoltarea unor boli cardiovasculare (cardiopatia ischemică) şi cerebrale (accidentul vascular cerebral - AVC).  Colesterolul este transportat la nivelul ţesuturilor, cuplat cu apoproteinele, sub formă de lipoproteine de tip: o ▓ HDL-colesterol (“colesterol bun” pentru că este cel responsabil de extragerea colesterolului din ţesuturi şi transportul acestuia la nivelul ficatului unde poate fi degradat 126

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic







o o o

2010

sau convertit ȋn alţi metaboliţi, cu reducerea deci a nivelului său plasmatic) şi o ▓ LDL-colesterol (“colesterol rău” pentru că este cel ce aprovizionează ţesuturile cu colesterol), riscul de apariţie al plăcilor de aterom depinzând mai ales de raportul dintre cele două forme de colesterol; Două plante folosite mult drept condimente au proprietatea de a scădea semnificativ colesterolul: usturoiul şi cimbrul. Dintre fructe, merele iar dintre animale, peştele este cel mai important aliment care scade riscul apariţiei plăcilor de aterom; Calea principală de excreţie a colesterolului este bila în care, alături de colesterol (cea mai mare parte neesterificat), se află şi acizi biliari (produşi de degradare ai colesterolului) Colesterolul se elimină sub forma de coprostanol şi alţi compuşi derivaţi (rezultaţi sub acţiunea enzimelor intestinale), sau, in procent mic, sub formă de acizi biliari secundari (doar aceia care scapă circuitului hepato-entero-hepatic). Recomandări pentru determinarea colesterolului screening-ul factorilor de risc ȋn boala coronariană screening-ul şi monitorizarea dislipidemiilor primare şi secundare evaluarea riscului de ATS

2. Principiul metodei A. Colesterol total Principiul are la bază o metodă enzimatică, colorimetrică. Esterii de colesterol sub acţiunea colesterol esterazei sunt clivaţi la colesterol liber şi acizi graşi. Colesterolul liber este apoi oxidat sub acţiunea catalitică a colesterol oxidazei la delta-4-colestenonă şi apă oxigenată, aceasta din urmă, în prezenţa fenolului şi a 4-aminofenazonei, formând sub acţiunea peroxidazei un compus colorat, care poate fi fotocolorimetrat.

Colesterol esterificat + H2O Colesterol +O2

Col esteraza

Col oxidaza Oxidaza 127

Colesterol + RCOOH Delta-4-colestenonă + H2O2

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

Peroxidaza

2 H2O2 + 4-AP + fenol

2010

Compus colorat + 4 H2O

B. LDL colesterol Detergent Esteri de colesterol-LDL

Colesterol + AGL Colesterol esteraza

LDL-Colesterol + O2

Colesterol oxidaza

Δ4-colestenona +H2O2

Peroxidaza

Compus colorat + H2O + H+

2 H2O2 + 4-aminoantipirina C. HDL colesterol

PEG-colesterol

Esteri de HDL-colesterol + H2O

esteraza

HDL-Col + RCOOH

PEG-colestererol oxidaza

Δ4-colestenona + H2O2

HDL-Colesterol + O2

2 H2O2+4-aminoantipirina+ HSDA+H2O + H+

Compus colorat+5H2O

3. Reactivi Colesterol total Reactiv1 (R1) Tampon PIPES, pH=6,9 Fenol

90 mmol/L 26 mmol/L

Reactiv2 (R2) Colesterol esterază Colesterol oxidază Peroxidază 4-aminoantipirina

300 U/L 300 U/L 1.250 U/L 0,4 mmol/L

Standard Colesterol

5,17 mmol/L

LDL-Colesterol Reactiv1 (R1) 128

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

Tampon MOPS,pH=6,5 HSDA Ascorbat oxidaza (Eupenicillium spp) Peroxidaza (horseradish) Conservant Reactiv2 (R2) Tampon MOPS,pH=6,8 MgSO4·7H2O 4-aminoantipirina Colesterol esteraza (Pseudomanas spp) Colesterol oxidaza (Brevibacterium spp) Peroxidaza (horseradish) Standard Colesterol liber şi esterificat

2010

20,1mmol/L 0,96mmol/L ≥50μkat/L ≥167μkat/L

20,1mmol/L 8,11mmol/L 2,46mmol/L ≥50μkat/L ≥33,3μkat/L ≥334μkat/L 1 mmol/L

HDL-Colesterol Reactiv1 (R1) MOPS 30 mmol/L Clorura de magneziu 2 mmol/L EMSE 0,3 g/L Reactiv2/a (R2/a) MOPS 30 mmol/L Reactiv2/b (R2/b) PEG-colesterol esteraza (Pseudomonas spp) 1 kU/L PEG-colesterol oxidaza (Streptomyces spp) 5,6 kU/L POD 30 kU/L 4-aminofenazona 0,5 g/L Standard de colesterol 4.Modul de lucru Proba : Ser sau plasmă heparinizată A. Colesterol total: Se realizează un amestec de reactivi, R1 + R2, prin dizolvarea flaconului de reactiv 2 (R2) în cantitatea corespunzătoare de reactiv 1 (R1). Se folosesc 3 eprubete: probă, standard şi martor.

129

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

Reactiv

P(µl)

St(µl)

M(µl)

Am. Reactivi Apă distilată Standard Proba

1000 10

1000 10 -

1000 10 -

După amestecare şi incubare timp de 10 minute la 37°C se citeşte valoarea absorbanţei probei şi a standardului la 505 nm (500-550nm), în cuve de 1 cm, faţă de martor. Mod de măsurare: cu punct final. Calcul: (Aprobă/Astandard) × Cst = mg/dl Colesterol Cst = 5,17mmol/L (200 mg/dl) = concentraţia standardului B. LDL-Colesterol -

într-o eprubetă de centrifugă se măsoară 1 ml reactiv R1 şi după 5 minute la rece se adaugă 50 µl ser; se incubează 30 minute la 2-8°C după care se centrifughează 5 minute la 4.000 rot/min; supernatantul se decantează şi peste precipitat se adaugă 500 µl de reactiv R2, determinarea se va face din soluţia astfel obţinută. Reactiv

P(µl)

St(µl)

M(µl)

Am. Reactivi Apă distilată Standard Proba

1000 100

1000 100 -

1000 100 -

După amestecare şi incubare timp de 5 minute la 37°C se citeşte valoarea absorbanţei la 500 nm, în cuve de 1 cm faţă de martor. Mod de măsurare: cu punct final. Calcul: (Aprobă/Astandard) × Cst = mg/dl LDL-colesterol Cst–concentraţia standardului = 1mmol/L (83,7 mg/dl) Rezultatul se va înmulţi cu 10 datorită diluării probei prin precipitare şi dizolvare. 130

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului lipidic

2010

C. HDL-Colesterol Se folosesc 3 eprubete: probă, standard (ȋn care se introduce calibratorul), martor. Reactiv Apă distilată Standard Proba R1 R2

P(µl)

St(µl)

3 3 300 300 Se amestecă şi se incubează 5 minute la 37°C 100 100 Se amestecă şi se incubează 5 minute la 37°C

M (µl) 3 300 100

Se citeşte valoarea absorbanţei faţă de martor la 600 nm. Mod de măsurare: cu punct final. Calcul: (Aprobă/Astandard) × Cst x Factor de diluţie = mg/dl HDL-colesterol Cst–concentraţia standardului 5. Valori de referinţă Colesterol total: 160 - 200 mg/dl Valori de alertă clinică >300mg/dL LDL-Col: < 120 mg/dL HDL-Col: valori diferite Bărbaţi: 40-70 mg/dL Femei: 40-85 mg/dL Valori de alertă clinică 50-60% din BT exprimă cel mai frecvent un icter posthepatic

 obstrucţia extrahepatica a ductelor biliare se datorează cel mai frecvent: o calculilor o stricturilor o tumorilor Există situaţii în care se produce obstrucţia totală a fluxului biliar, bilirubina nu se mai angajează în intestin şi deci nu mai are loc sinteza de stercobilinogen şi stercobilină, ca urmare materiile fecale apar decolorate, iar în urină urobilinogenul este deasemeni absent (urina decolorată). Limite şi interferenţe analitice o hemoliza o lipemia o postul de 48 de ore poate să crească valorile bilirubinei de aproximativ 2 ori

182

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului proteic

2010

o expunerea serului (vacutainerului) la lumina albă sau ultravioletă (pot determina false reduceri ale nivelului real al bilirubinei) o unele medicamente În condiţii normale aproximativ 95% din bilirubina plasmatică este reprezentată de cea indirectă, care nu se filtrează la nivel glomerular fiind legată de albumină, deci nu apare ȋn urina persoanelor sănatoase. Bilirubinuria reflectă întotdeauna creşterea plasmatică a bilirubinei directe şi este un semn patologic. De asemenea, afecţiunile hepatice nu sunt întotdeauna insoţite de creşterea bilirubinei serice (de exemplu in cirozele hepatice compensate). 6’. CLASIFICAREA ICTERELOR 1. Icter hemolitic (prehepatic)  Determinat de degradarea crescută a hemului-augmentat de eritopoieza ineficientă  Cauzele pot fimultiple cele care conduc la scurtarea duratei de viaţă a hematiilor, cu degradarea lor prematură şi deci cu degradarea consecutivă a hemoglobinei, hemului şi producţie de BI peste capacitatea de conjugare pe unitatea de timp a ficatului(de ex. defectul de glutation, defectul genetic de Glucoz-6-fosfat dehidrogenază, ş.a)  Caracteristici: o ↑ BI în sânge o Urobilinogen ↑ în urină şi stercobilinogen ↑ în materiile fecale (urini hipercrome şi scaune intens colorate) o Absenţa bilirubinei în urină 2. Icter hepato-celular - se mai numeşte icter BIFAZIC (datorită reacţiei cu reactiv diazo, prin reacţia directă determinându-se BD, iar prin cea indirectă BI). Are trei cauze principale: 1. Deficit de UDP glucuronil tranferaza-enzima necesară pentru conjugarea BI  Icter neonatal (fiziologic) - sistemul enzimatic hepatic este incapabil de prelucrare, conjugare şi secreţie a bilirubinei) 183

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului proteic

2010

 Sindrom Crigler Najjar tip I şi II - defect enzimatic ereditar  Boala Gilbert 2. Obstrucţia secreţiei BD din celula hepatică în canaliculii biliari (se asociază cu ↑↑ BD):  Sdr Rotor  Sdr Dubin Johnson 3. Disfuncţia toxică a ficatului – asociată cu o bilirubinemie toxică, determinată de agenţi toxici: cloroform, CCl4, toxine din ciuperci, virusuri hepatice 3. Icter obstructiv:  Prin defect de pasaj al BD din celula hepatică în intestin, se mai numeşte şi colestază  Obstrucţia poate fi 1. intra-hepatică( determinată frecvent de medicamentehalotan, steroizi) 2. extra-hepatică prin calculi, tumoră de cap de pancreas sau de ducte biliare  Caracteristici:

o ↑ BD în sânge o ↓ stercobilinogenului în materiile fecale (scaune acolice) o Absenţa completă a urobilinogenului în urină (urini decolorate) o Prezenţa BD şi a sărurilor biliare în urină o Nivel plasmatic ↑ de GGT si ALP ( enzime de colestază) 7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE Bilirubina reprezintă ȋn mod normal produsul de degradare al hemului, mai exact a nucleului de protoporfirina, proces care ȋncepe odată cu liza hematiilor ȋmbătrânite. Bilirubina formată la nivel prehepatic (sistemul reticulo histiocitar), numita şi BI – bilirubina indirecta (liposolubilă) circulă în sânge, fiind transportată la ficat unde se conjugă cu acid glucuronic, sub acţiunea UDP-glucuronil transferazei, 184

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului proteic

2010

formându-se ȋn acest fel BD - bilirubina directă (conjugată, hidrosolubilă). Bilirubina indirectă este cea mai toxică, întrucât atunci când atinge o concentraţie mult mai mare decât capacitatea de legare a albuminei poate traversa membrana celulară cu creşterea nivelului său intracelular. Conjugarea bilirubinei indirecte de către ficat reprezintă o modalitate de detoxifiere. Niciodată bilirubina directă, indiferent de valoarea ei, nu va determina kernicter, deoarece este hidrosolubila şi nu pătrunde în celulă. Bilirubina indirectă este intens susceptibilă la foto-oxidare, iar produşii rezultaţi din acest proces sunt hidrosolubili şi pot fi excretaţi de către ficat şi în absenţa conjugării. De aceea fototerapia (expunerea nou-născutului la lumina ultravioletă) este utilizată în tratamentul icterului neonatal ca metodă de reducere a bilirubinei indirecte. Bilirubina conjugată este transportată în canaliculele biliare, de unde este deversată împreună cu bila în căile biliare şi apoi în intestin, unde, sub acţiunea florei microbiene suferă o serie de reduceri succesive până la formarea de pigmenţi biliari (urobilinogen şi stercobilinogen). Stercobilinogenul şi o mică parte din urobilinogen sunt excretate prin materiile fecale, iar cea mai mare parte din urobilinogen este reabsorbită intestinal sau eliminată prin urină. Clinic hiperbilirubinemia se traduce prin icter - pigmentarea galbenă a tegumentelor şi sclerelor, care apare la valori ale bilirubinei de peste 2 mg/dl. 8. MCQ B1 Bilirubina: A. reprezintă produsul final de degradare al purinelor B. se formează în intestin C. este format în ficat, în urma degradării trigliceridelor D. reprezintă forma de oxidare a hemului E. se formează din eritrocitele imbătrânite în proportie de 80% 185

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului proteic

2010

B2 Care dintre următoarele afirmaţii referitoare la bilirubina NU este adevărată : A. hiperbilirubinemia se traduce clinic prin icter B. bilirubina indirectă circulă în sânge sub forma unui complex solubil bilirubină-albumină C. bilirubina directă este conjugată cu acid glucuronic formand bilirubina indirectă sau neconjugată D. bilirubina indirectă (neconjugată) poate produce afectări ireversibile ale neuronilor (kernicter) când atinge o concentraţie foarte mare E. stercobilinogenul este un pigment biliar care se elimină exclusiv prin urină B3 Valoarea normală a bilirubinei totale în sânge variază între: A. 0,1-1 mg/dL B. 0,1-1 g/L C. 0,25-0,35 mg/dL D. 8-12g/dL E. 100-125 mmol/L B4 Determinarea bilirubinei este recomandată în: A. hepatite şi ciroze B. anemii hemolitice C. icterul neonatal D. litiaza biliară E. diabetul zaharat de tip 2 B5 Bilirubina indirectă creşte în sânge în următoarele situaţii, CU EXCEPŢIA: A. obstrucţia extrahepatică a ductelor biliare prin calculi B. obstrucţie intrahepatică C. transfuzii incompatibile de sânge D. hematoame E. anemii hemolitice B6 Bilirubina directă creşte în sânge în următoarele situaţii, CU EXCEPŢIA: A. anemii megaloblastice (eritropoieză ineficientă) B. colestaza indusă de medicamente C. obstrucţia extrahepatică a ductelor biliare prin tumori D. obstrucţie intrahepatică datorată unor defecte familiale ale funcţiei excretorii hepatice 186

CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea metabolismului proteic

2010

E. transfuzii incompatibile de sânge B7 Mecanismele care duc la creşterea bilirubinei în sânge sunt următoarele, CU EXCEPŢIA: A. producţie crescută (care depăşeşte capacitatea de excreţie a ficatului) B. eliminare crescută din cauza unei afecţiuni la nivel renal C. defect de conjugare hepatică (defect de glucuronil transferază) D. creşterea activitătii enzimatice a glucuronil transferazei la nivel hepatic E. defect de excreţie de pigment conjugat din ficat şi bilă (prin leziuni intrahepatice sau extrahepatice obstructive) B8 Următoarele afirmatii NU sunt adevărate: A. bilirubina totală (BT) = bilirubina indirectă (BI) +bilirubina directă (BD) B. 95% din bilirubina plasmatică este reprezentată de cea indirectă C. bilirubina indirectă se filtrează la nivel glomerular, eliminându-se prin urină D. icterul la nou născuţi poate fi combătut prin fototerapie E. bilirubina directă este folosită ca marker de diagnostic în cancerul hepatic B9 Mecanismele care stau la baza creşterii bilirubinei indirecte sunt: A. turnover crescut al eritrocitelor – prin rată crescută de distrugere a acestora B. preluare hepatică alterată C. obstrucţia căilor biliare extrahepatice D. defect de conjugare a bilirubinei E. creşterea reabsorbţiei urobilinogenului la nivel intestinal B10 Următoarele afirmaţii sunt adevărate, CU EXCEPŢIA: A. bilirubina directă egală cu 20-40% din BT este expresia unui icter hepatic B. anemia hemolitică determină creşterea bilirubinei indirecte prin creşterea valorii hemoglobinei C. bilirubina directă este redusă la nivel intestinal cu formarea de acizi biliari D. bilirubina este formată în limfocite, prin degradarea protoporfirinei din hem E. bilirubina directă egală cu >50-60% din BT este expresia unui icter posthepatic 187

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

CAPITOLUL 8 EXPLORAREA HOMEOSTAZIEI MINERALE

8.1. DOZAREA CALCIULUI

1. Consideraţii generale

 Calciul este cel mai frecvent element mineral din organismul uman. Se găseşte în trei mari compartimente: schelet, ţesuturi moi şi lichidul extracelular.  În proporţie de 99% calciu este depozitat sub formă de hidroxiapatită în oase şi dinţi, iar restul de 1% este distribuit la ţesuturi şi în lichidul extracelular unde joacă un rol vital pentru diverse procese.  Principalele funcţii ale acestui mineral:  ȋn contracţia musculară  în coagularea sângelui,  în conducerea neuromusculară,  în excitabilitatea musculaturii scheletice şi cardiace,  activarea unor enzime,  integritatea si transportul prin membrană.  Calciul ionizat (aproximativ 50% din totalul calciului plasmatic) este fracţia biologic activă ce intervine ȋn procesele vitale de reglare a excitabilităţii neuromusculare şi hemostază.  Nivelul seric al calciului şi fosforului este controlat de hormonul paratiroidian – PTH (parathormon), calcitonină şi vitamina D. Orice perturbare a acestor modulatori va produce alterări ale concentraţiei de calciu.  Calcemia reprezintă nivelul sanguin al calciului  Calciuria reprezintă cantitatea de calciu din urină. Recomandări pentru determinarea calciului Acest test este indicat pentru a aprecia: 188

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

   

2010

funcţia paratiroidiană osteoporoza sau modificări radiologice ale oaselor afectarea renală prin calculi (uro- sau nefrolitiază) activitatea tumorală

2. Principiul metodei Ionii de calciu formează ȋn mediu neutru în prezenţa reactivului arsenazo III un compus colorat. Concentraţia ionilor de calciu este direct proporţională cu intensitatea coloraţiei, valoarea absorbanţei fiind necesar a fi citită la o lungime de undă de 660 nm. 3. Reactivi Reactiv (R) Arsenaza MES, pH=6,5 Standard Calciu standard

200 μmol/L 100 mmol/L 10 mg/dL

4. Mod de lucru Proba: Ser/ Plasma heparinizată/ Urină diluată cu apă distilată (în proporţie de 1:3, pH aproximativ 3-4, ajustat cu HCl 0,1 N). Se folosesc trei eprubete – probă, standard (etalon) şi martor (blank) P, S, M:  P-proba, se introduc: o Reactiv : 1000 µL o Probă 10 µL  St-standard; se introduc: o Reactiv 1: 1000 µL o Standard Calciu 10µL  M-martor; se introduc: o Reactiv 1: 1000 µL o Apă distilată: 10µL Reactiv Reactiv Proba Sol. Standard de calciu Apa distilata (AD)

P (µl) 1000 10 189

St (µl) 1000 10 -

M (µl) 1000 10

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

După amestecare şi incubare de 1 minut la 37°C (ȋn aparat) se citesc absorbanţele (A) pentru probă şi standard, la 660 nm, în cuve de 1 cm, faţă de martor. Mod de măsurare: cu punct final. Calcul : pentru calciul total (Cat) şi cel ionic (Ca2+) Cat (mg/dL) = (Aprobă / Astandard) x n n- concentraţia standardului (2,5 mmol/L, 10 mg/dL ) Calciul ionic se determină indirect prin formula: Ca2+ = (6xCa -PT/3):(PT+6)³ Ca = nivelul plasmatic al Cat PT = valoarea proteinelor totale plasmatice 5. Valori de referinţă Cat - total  Ser: 8,4 -10,2 mg/dL  Urină: 100-320 mg/24h 2+ Ca - ionizat  Ser: 4,65 – 5,28 mg/dL (1,16 – 1,32 mmol/L) 6. VARIAŢII PATOLOGICE ale calciului în ser şi urină Atenţie ! HIPERPARATIROIDISMUL SI CANCERUL sunt cauzele cele mai comune de hipercalcemie (creşterea nivelului seric al calciului peste limita superioară) Alertă clinică – valori de panică!  Cat (total) ˂ 6 mg/dL (1,5 mmol/L) – Tetanie, Convulsii  Cat ˃ 13 mg/dL (3,25 mmol/L)– Cardiotoxicitate, Aritmii, Coma (se impune corectarea urgentă a hipercalcemiei prin calcitonină) A) Calciul seric  valori crescute - HIPERCALCEMIA  Hiperparatiroidism primar (adenom) sau secundar (de exemplu cel din cadrul stărilor de uremie sau acidoză) se caracterizează prin spolierea calciului din oase, cu stimularea consecutivă a 190

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale



     

 

2010

paratiroidelor pentru secreţia suplimentară de PTH; acesta va acţiona asupra osului pentru a elibera mai mult calciu. Cancer, mai ales ȋn tumorile producătoare de PTH:  leucemie  limfom  mielom multiplu (cu liză osoasa majoră)  carcinom la nivelul plămânilor, capului sau gâtului  metastaze osoase (cancer secundar, când tumora primară are altă localizare - plamân, sân, tiroidă, rinichi, ficat, pancreas, prostată) Hipercalcemia familială hipocalciurică Intoxicaţia cu vitamina D Imobilizare prelungită Hipertiroidism Boala Paget Sarcoidoză şi alte boli granulomatoase (TBC de ex) - apare o producţie crescută a metabolitului activ al vitaminei D: 1,25dihidroxi-colecalciferol, numit şi calcitriol, responsabil de instalarea hipercalcemiei Sindromul Williams (hipercalcemia idiopatică a sugarului sensibilitate exagerată a organismului sugarului la doze fiziologice de vitamină D. Sindrom Burnett (sindrom lapte-alcaline, caracterizat prin calcificări aberante la persoanele care ingeră cantităţi excesive de calciu şi substanţe alcaline absorbabile precum laptele sau bicarbonatul de sodiu; netratat, poate conduce la calcificări metastatice şi insuficienţă renală)

 valori scăzute - HIPOCALCEMIA  Hipoparatiroidism chirurgical (ablaţia glandelor), postiradiere, idiopatic, infiltrarea paratiroidelor de diverse cauze (amiloidoza, hemocromatoza, tumori), congenital (sindromul DiGeorge)  Pseudohipoparatiroidism (rezistenţă periferică la acţiunea PTH)  Pancreatită acută (datorită fenomenelor de liză celulară intensă a celulelor pancreatice inflamate, cu eliberarea extracelulară a conţinutului lor de enzime hidrolitice, hidroliza excesivă a lipidelor şi formarea unor cantităţi mari de acizi graşi –AG, care vor precipita ionii de calciu, cu excreţia ulterioară a acestuia) 191

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

 Insuficienţa renală cronică (prin defect al enzimelor produse la nivel renal, cum este 1α Hidroxilaza, şi consecutiv scăderea conversiei 25-OH-D3 la forma activa 1,25 (OH)2 D3 = Calcitriol, hormon responsabil de menţinerea nivelului sanguin de calciu, ce acţionează prin hipercalcemie)  Hiperfosfatemie (de ex. ȋn insuficienţa renală cronică, consum crescut de laxative, tratament cu citotoxice)  Malabsorbţie (boala celiacă)  Malnutriţie (aport exogen scăzut de calciu, vitamina D)  Defect de vitamină D, Rahitism  Osteomalacie  Alcaloză (ionii de calciu devin legaţi cu proteinele) B) Calciul urinar: o o o o o o

o o o o o o

 valori crescute - HIPERCALCIURIA hiperparatiroidism aport exogen crescut de calciu intoxicaţie cu vitamina D leziuni osteolitice mielom multiplu în cazul administrării unor medicamente cum ar fi: diuretice, acetazolamida, calcitonina, săruri de calciu, corticosteroizi  valori scăzute - HIPOCALCIURIA hipoparatiroidism rahitism osteomalacie deficit de vitamina D malabsorbţie insuficienţă renală

7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE calciul se distribuie ȋn trei mari compartimente: *schelet, *ţesuturi moi, *lichid extracelular 99% din calciu este depozitat sub forma de hidroxiapatita in oase, dinţi calciul este implicat ȋn :  coagularea sângelui  conducerea neuromusculară 192

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

 excitabilitatea musculaturii scheletice şi cardiace  activarea enzimelor  păstrarea intergrităţii şi permeabilităţii membranei celulare  transportul prin membrane calciul ionizat este fracţia plasmatica biologic activă ȋn procesele de reglare a excitabilităţii neuromusculare şi hemostază nivelul seric al calciului (şi fosforului) este reglat de hormonul paratiroidian (PTH), calcitriol (forma activă a vitaminei D 3), calcitonină. 8. MCQ Ca1: Care dintre următoarele localizări fac parte din compartimentele majore ce constituie rezervoare de calciu? A. schelet B. ţesuturile moi C. lichidul intracelular D. urina E. lichidul extracelular Ca2: Calciul este implicat ȋn: A. coagularea sângelui B. metabolismul ADN-ului C. excitabilitatea musculaturii scheletice D. conducerea neuromusculară E. activarea unor enzime Ca3: Valori scazute ale calciului urinar se intalnesc in urmatoarele situaţii, cu EXCEPŢIA: A. insuficienţa renală B. mielom multiplu C. hipoparatiroidism D. hiperparatiroidism E. rahitism Ca4: Valoarea normala a calciului in ser este urmatoarea: A. 8,4-10,2 ml/dL B. 4,8-10,2 mg/dL C. 8-10 mg/dL D. 8,4 -10,2 mg/dL 193

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

E. 7,4-10,2 μg/dL Ca5: Valoarea normală a calciului in urină este: A. 100-320 ml/24h B. 100-320 μg/24h C. 110-388 mg/24h D. 10-32 mg/24h E. 100-320 mg/24h Ca 6: Pancreatita acută este cel mai frecvent asociată cu: A. rahitism B. convulsii C. tetanie D. hipocalcemie E. hipercalcemie Ca 7 : Valori crescute ale calciului seric se ȋntâlnesc in următoarele, CU EXCEPŢIA: A. sindrom Burnett B. sindromul Williams C. pancreatita D. sindromul DiGeorge E. boala Paget Ca 8: Valori scăzute ale calciului seric se ȋntâlnesc in următoarele, CU EXCEPŢIA: A. hiperparatiroidism B. hipoparatiroidism C. hipertiroidism D. sarcoidoza E. sindromul lapte-alcaline Ca 9: Ȋn cazul administrării unor medicamente, valorile calciului ȋnregistrează o falsă creştere. Care dintre următorii agenţi farmacologici se ȋnscriu ȋn această categorie? A. diuretice B. paracetamol C. acetazolamida D. antidepresive E. corticosteroizi Ca10: Dintre următorii factori, care intervine major ȋn reglarea nivelului calciului seric? 194

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

A. B. C. D. E.

2010

Hormonul paratiroidian Alanina Metionina Cortizol Hormonii tiroidieni

8.2. DOZAREA MAGNEZIULUI 1. Consideraţii generale  Magneziul este ca frecvenţă, al patrulea cation din organism, fiind prezent în oase, în proporţie de 50% asociat cu calciu şi fosfat. Cea mai mare cantitate de magneziu este situată intracelular şi o mică cantitate extracelular.  Aproximativ 35% din cantitatea totală de magneziu circulă legat de o proteină, în principal albumină, de aceea variaţiile acestestor proteine conduc la afectarea nivelului magnezemiei (magneziul din sânge).  Intervine în diferite procese biochimice: în fosforilare şi utilizarea ATP-ului ca sursă de energie, în sinteza de proteine şi în metabolismul ADN-ului,  ȋn activarea unor enzime, contracţia musculară  Este implicat în conducerea neuromusculară şi exitabilitatea musculaturii scheletice şi cardiace (ȋmpreună cu ionii de Ca, Na, K)  Se absoarbe la nivel intestinal, dar controlează şi absorbţia intestinală a calciului;  Funcţia Mg este strâns legată de cea a Ca, defectul unuia dintre ioni, determina tulburări ȋn funcţionarea corectă a celuilalt;  Defectul ionilor de Mg poate antrena ieşirea calciului din oase, cu potenţial de calcificare aberantă la nivelul rinichilor şi aortei;  Rinichii controlează eficient homeostazia magneziului prin reabsorbţie tubulară, conservând cantitatea de ion atunci când aportul de magneziu este scăzut şi excretând în exces atunci când 195

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

consumul este crescut (alterarea funcţiei rinichilor poate conduce la creşteri ale Mg ȋn sânge, nemaiputând fi eliberat corespunzător) Recomandări pentru determinarea magneziului Acest test este indicat ȋn evaluarea: A. Funcţiei renale: o monitorizarea tratamentului cu tiazidice, diuretice, aminoglicozide o monitorizarea insuficienţei renale cronice B. Echilibrului hidroelectrolitic: o aritmii ventriculare, insuficienţă cardiacă, hipertrofie ventriculară stângă o monitorizarea tratamentului cu digitalice o hipokaliemii refractare (la administrarea de potasiu) C. Metabolismului magneziului o în hipocalcemie o iritabilitate neuromusculară o investigarea sindroamelor de malabsorbţie 2. Principiul metodei În mediu bazic, ionii de magneziu (Mg) cu albastru de xilină conduc la formarea unui complex colorat. Concentraţia ionilor de magneziu este direct proporţională cu intesitatea coloraţiei. Mg + Albastru de xilidină → Complex Mg- albastru de xilidină 3. Reactivi Reactiv 1(R1): Tampon TRIS , ph=11,3 Albastru de xilidină Reactiv 2(R2): Standard de magneziu

250 mmol/L 1 mmol/L 0,824 mmol/L

4. Modul de lucru Proba : Ser/ Plasma heparinizată, nehemolitică/ Urina diluată 1:10, pH 3-4 (corectat cu HCl 0,1N) Se folosesc trei eprubete – probă, standard (etalon) şi martor (blank) P, S, M: 196

2010

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

 P-proba, se amestecă: o Reactiv 1: o Proba  St-standard; se introduc: o Reactiv 1: o Standard de magneziu  M-martor; se introduc: o Reactiv 1: Reactiv

l000 µl 10 µl l000 µl 10 µl l000 µl

P (µl)

St (µl)

M (µl)

Reactiv 1

1000

1000

1000

Proba

10

-

-

Sol. Standard (Reactiv 2)

-

10

-

După amestecare şi incubare 5 minute la 37°C se citeşte absorbanţa (A) la 520 nm (490-550nm), în cuve de 1 cm, faţă de martor. Mod de măsurare: cu punct final. Calcul: mg/dL = (Aprobă / Astandard) x n n- concentraţia standardului (0,824 mmol/L; 2 mg/dL) În cazul urinei rezultatele se înmulţesc cu factorul de diluţie. 5. Valori de referinţă  Ser  Urină

1.70-2.55 mg/dL 60-210 mg/24h

6. VARIAŢII PATOLOGICE o o o o o o

 Valori crescute - HIPERMAGNEZIEMIA În insuficienţa renală când rata filtrării glomerulare este mult redusă Administrarea de antiacide care conţin magneziu Tratament excesiv cu săruri de magneziu Deshidratare (o falsa creştere, defapt volumul de lichid ȋn care circul ionii de Mg, este redus) Intoxicaţie cu carbonat de litiu Abuz de laxative 197

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

o Hipotiroidism o Acidoza diabetică Hipermagneziemia are un efect depresor asupra sistemului nervos central, provocând ameţeli, oboseală şi insuficienţă respiratorie.  Valori scăzute – HIPOMAGNEZIEMIA o Malabsorbţie o Pierderi lichidiene majore: diaree severă, lactaţie, diuretice ȋn exces o Alcoolism cronic (magneziul este eliberat ȋn exces, prin urină) o Glomerulonefrita cronică o Defect de reabsorbţie tubulară o Hemodializa o Hipoparatiroidism o Diabet zaharat cu acidoză o Mai scade în tetanie, convulsii şi aritmii cardiace 7. FUNDAMENTE BIOCHIMICE magneziul este al patrulea cation ca frecvenţă, din organism prezent in oase ȋn proporţie de 50%, asociat cu calciu si fosfat 35% din cantitatea totala de magneziu circula legată de albumina intervine ȋn: fosforilare, sinteza de proteine, activarea unor enzime, metabolismul ADN-ului, excitabilitatea neuromusculară determinarea nivelelor serice ale magneziului este utilă ȋn evaluarea: ♦funcţiei renale ♦echilibrului hidroelectrolitic ♦metabolismului magneziului hipermagneziemia are un efect depresor asupra sistemului nervos central, provocând ameţeli, stare de oboseală si insuficienta respiratorie (la valori de alertă clinică, mai mari de 5mg/dL); este reabsorbit prin tubii renali (95%) activitatea şi nivelul Mg sunt strâns corelate cu cele ale calciului

198

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

8. MCQ Mg1: Principalele cauze de hipermagneziemie sunt: A. administrare de săruri de magneziu B. tetanie C. diabet zaharat D. administrarea de antiacide care contin magneziu E. alcoolism cronic Mg2: Efectul depresor al magneziului asupra sistemului nervos central provoacă următoarele: A. accident vascular cerebral B. insuficienţă respiratorie C. amnezie D. convulsii E. stare de oboseală Mg3 : Magneziul intervine ȋn activarea următoarelor procese biochimice: A. metabolismul ARN B. metabolismul ADN C. metilare D. fosforilarea substratelor E. sinteza de proteine Mg4 : Hipomagneziemia apare in urmatoarele cazuri, EXCEPŢIE: A. hipertiroidism B. hipotiroidism C. hiperparatiroidism D. boala Addison E. hipoparadiroidism Mg5: Magneziul este prezent in proporţie de 50% ȋn oase impreună cu următoarele elemente, EXCEPŢIE: A. piridoxal-fosfat B. fosfat C. calciu D. albumina E. fier

199

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

Mg6: Următoarele situaţii se caracterizează prin valori scăzute ale magneziului, cu EXCEPTIA: A. hipertiroidism B. acidoza diabetica C. hipotiroidism D. insuficienta renala E. glomerulonefrita Mg7: Valoarea normală a magneziului in plasmă este: A. 1.71-2.66 mg/dL B. 1.50-2.50 mg/dL C. 1.90-2.90 mg/dL D. 1.75-2.99 mg/dL E. 1.70-2.55 mg/dL Mg8: Valoarea normală a magneziului ȋn urina din 24 ore variază ȋntre: A. 65-210 mg/24h B. 70-210 mg/24h C. 80-240 mg/24h D. 60-210 mg/24h E. 40-240 mg/24h Mg9: Determinarea magneziului este utilă ȋn următoarele circumstanţe: A. diagnosticul hiper/hipocalcemiei B. monitorizarea insuficienţei renale C. diagnosticul hiper/hipomagneziemiei D. tulburări cardio-vasculare E. tulburări gastrointestinale Mg10: Magneziul creşte ȋn următoarele afecţiuni, cu EXCEPŢIA: A. boala Addison B. aritmii cardiace C. hipotiroidism D. diabet zaharat E. convulsii

200

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

8.3.SIDEREMIA 1. Consideraţii generale  Necesarul de fier (Fe) al organismului în copilărie este de 0,5 1mg/kg/zi şi este asigurat prin aport exogen alimentar, cu excepţia sugarului în primele 4-6 luni de viaţă, care foloseşte Fe din rezerve, gradul de eficienţa al absorbţiei Fe fiind de aproximativ 10-20%.  Carenţa de fier, poate fi indusă de circumstanţe diverse: 1. Deficit de absorbţie (aclorhidrie, gastrită atrofică, intoleranţă la dizaharide, parazitoze intestinale, rezecţii intestinale) 2. Tulburări de transport - atransferinemia/hipotransferinemia congenitală/ dobândită (sindrom nefrotic), disproteinemii 3. Pierderi prin sângerări repetate - parazitoze intestinale, intoleranţa la proteinele laptelui de vacă, ulcer, hematurie, tulburări cronice de hemostază, după unele medicamente (pansamente gastrice, antimicotice) 4. Necesităţi crescute de Fe – la premature, la copii ȋn perioadele de creştere accelerată, la femeile gravide sau ȋn perioada de lactaţie 5. Deturnarea Fe prin captarea acestuia - ȋn infecţii, procese inflamatorii cornice, colagenoze, neoplazii  Carenţa de Fe se însoţeşte de tulburări metabolice şi funcţionale celulare complexe: hematologice, digestive, neuropsihice, cardiace, cutaneo-mucoase, imunologice şi osoase.  Secvenţa tulburărilor hematologice antrenate de carenţa de fier urmează firul următoarelor evenimente: o imobilizarea progresivă a rezervelor pentru a compensa deficitul, cu scăderea consecutivă a feritinei serice o epuizarea rezervelor cu scăderea Fe seric circulant o afectarea sintezei intracitoplasmatice de hemoglobină în eritroblaşti, fapt ce conduce la dimensiuni microcitare a celulelor - microcitoză o deteriorarea progresivă a procesului de formare al Hb, prin indisponibilitatea Fe şi apariţia hipocromiei (tulburări ȋn coloraţia eritrocitelor)

201

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

o reducerea duratei de viaţă a eritroblaştilor alteraţi, cu scăderea regenerării medulare şi răsunet tardiv asupra numărului de hematii. Cantitatea totală de fier din organism diferă în funcţie de vârstă şi sex. Depozitele de fier scad în timpul perioadei de creştere. După adolescenţă nevoia de fier scade, bărbaţii prezentând o creştere graduală a depozitelor de fier pe parcursul vieţii, ȋn timp ce femeile prezintă o pierdere continuă de fier până la menopauză. Fierul ingerat prin alimentaţie este sub formă bivalentă (Fe2+), este absorbit la nivelul celulelor mucoasei intestinale (predominant duoden) şi transportat cu ajutorul substanţelor cărăuş. Înainte de a ajunge ȋn circulaţie, fierul bivalent este oxidat ȋn Fe3+ cu legarea sa la transferină. Fierul circulant se află predominant legat de transferină. Cea mai mare parte a fierului din organism se găseşte în compuşii cu hem, în special hemoglobină şi mioglobină. O cantitate foarte mică este conţinută în enzimele care utilizează fierul în schimbul de electroni: peroxidaze, catalaze şi ribonucleotid reductaze. Cea mai mare parte a fierului non-hemic este depozitat sub formă de feritină (hemosiderină) în macrofage şi hepatocite. Numai o fracţiune foarte mică (~0.1%) circulă în plasmă sub formă de Fe3+ legată de o proteină de transport – transferina. Balanţa fierului este unică prin controlul absorbţiei predominant prin controlul excreţiei fierului. Fierul este absorbit din intestinul subţire proximal sub formă de fier hemic şi fier feros (Fe2+), absorbţia sa fiind influenţată de aciditatea gastrică (scade în aclorhidie sau gastrectomie) precum şi factori alimentari. Absorbţia este realizată prin intermediul unor proteine transportoare şi a unor enzime. Metabolismul fierului este dominat de implicarea sa în sinteza hemoglobinei, ȋn eritroblaşti. Fierul încorporat în hemoglobină este redat circulaţiei prin eritrocitele circulante. Transferina, proteina specifică ce leagă fierul din sânge, este o beta-1-globulină ce fixează în condiţii fiziologice 100µg fier/dl (fierul circulant). Spre deosebire de sideremie, care prezintă variaţii diurne mari, nivelul transferinei serice este mult mai constant. Capacitatea totală a transferinei de fixare a fierului este de 300 µg fier/dl (TIBC), saturaţia transferinei fiind în medie de 30%.

202

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

2. Rolul fierului în organism o participă la procese metabolice complexe o fierul din hemoglobină este important pentru transportul oxigenului la nivelul celulei, iar cel din mioglobină pentru producerea aerobă de energie necesară muşchiului. o enzimele şi alte componente care conţin fier (citocromii şi citocromul c), prin participarea la transportul activ şi transferul de electroni de la nivelul membranelor, sunt elemente esenţiale ale lanţului respirator, cu rol în producerea de energie la nivel celular. o creierul este cel mai important loc de concentrare a fierului în organismul uman; fierul este esenţial pentru funcţionarea creierului (aria cerebrală concentrează cea mai mare parte a fierului ȋn organismul uman) – este semnificativ implicat ȋn sinteza şi menţinerea mielinei având un rol însemnat în sistemele dopaminergice (deficitul de fier poate conduce la scăderea numărului şi sensibilităţii receptorilor dopaminergici, cu diminuarea consecutivă a transmiterii impulsurilor nervoase şi scăderea performanţelor mentale şi cognitive. o deficitul de fier contribuie de asemenea la scăderea rezistenţei la infecţii. 3. Principiul metodei Deoarece nivelele serice ale fierului pot varia semnificativ în timpul zilei, se recomandă prelevarea probei sangvine dimineaţa. Cu excepţia intoxicaţiei cu fier, nivelul sideremiei fără transferină/saturaţia transferinei şi feritină are valoare clinică limitată. Metoda de dozare: spectrofotometrică. Colorimetria cuprinde metodele optice în care se determină absorbţia luminii de către substanţa de analizat. Spectofotometria utilizează un monocromator capabil să selecteze fascicolul de raze monocromatice. Fascicolul de raze selectat este de circa 1mµ (de la 180-2000 nm) incluzând domeniile ultraviolet, vizibil, infraroşu. Există multiple metode fotometrice de analiză a fierului, toate bazându-se pe: - eliberarea fierului trivalent de pe transferină, cu ajutorul substanţelor acide sau detergenţi; - reducerea Fe3+ la Fe 2+ - reducerea ionilor ferici feroşi (Fe 2+) cu formarea unui complex colorat 203

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

Metoda aleasă de noi spre exemplificare, este cea care utilizează ferozina. Metoda cu ferozină are ca principiu eliberarea mai ȋntâi a ionilor de fier ȋn prezenţa acidului citric, şi clarificarea probelor eventual lipemice prin folosirea unor detergenţi. Acidul ascorbic (vitamina C) reduce apoi fierul eliberat (Fe3+) la fier feros (Fe 2+), acesta din urmă realizând cu ferozina un complex colorat care poate fi apoi fotocolorimetrat. Fe+3 complexat cu transferină —pH acid———> Fe+3 + transferină Fe+3 + agent reducător (acid ascorbic) ————> Fe+2 Fe+2 + ferozină ————> complex colorat 4. Reactivi R1: Acid citric 200 mmol/l – tiouree 115 mmol/l - detergent R2: Ascorbat de sodiu 150 mmol/l – ferozină 6 mmol/l – conservanţi. Reactivul R1 cu tiouree este TOXIC, se va utiliza IN VITRO. 5. Modul de lucru Proba: Ser nehemolizat Într-o eprubetă se introduc:  Reactiv 1: 100 µL  Reactiv 3 20 µL  Proba 8,5 µL După amestecare şi incubare 5 minute la 37°C, se citeşte absorbanţa la 570nm. 6. Valori de referinţă o Sideremie 50-150 µg/dl o Transferină 2 – 3,6 g/l o Saturaţia transferinei 16-45% 7. Variaţii patologice  Creşteri ale sideremiei  talasemie (modificări ȋn sinteza lanţurilor de globină)  anemii sideroblastice  anemii hemolitice  hemocromatoza  post-transfuzii multiple 204

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

 tratament necorespunzător cu fier - intoxicaţie acută cu fier (la copii)  dializa cronică  eritropoieza ineficientă cu distrucţie crescută a precursorilor eritroizi medulari  Scăderi ale sideremiei  aport alimentar insuficient  absorbţie scăzută de fier din cadrul aclorhidriei, gastrectomiei parţiale sau totale, boala celiacă  necesităţi crescute de fier: sarcină, lactaţie, perioada de creştere  boli cronice (ȋnsoţite de anemie)  boli inflamatorii  infecţii cronice  afecţiuni renale 8. FUNDAMENTE BIOCHIMICE Fierul adus prin alimentaţie este sub formă bivalentă (Fe 2+) şi este absorbit cam 1 mg/zi, la nivel intestinal după care ajunge ȋn torentul circulator, sub forma trivalentă, Fe3+ unde circulă legat de transferină. Spre deosebire de sideremie, care prezintă variaţii diurne mari, nivelul transferinei serice este mult mai constant. Cea mai mare parte a fierului din organism se găseşte în compuşii heminici (Hb, mioglobină, citocromi), o cantitate foarte mică fiind conţinută în enzimele care utilizează fierul în schimbul de electroni: peroxidaze, catalaze şi ribonucleotid reductaze. Un procent redus circulă în plasmă sub formă de Fe3+ legat de o proteină de transport – transferina. Dozarea fierului neheminic este utilă ȋn diagnosticul şi monitorizarea unor afecţiuni şi tulburări precum: - Anemia feriprivă (prin defect de fier) - Hemocromatoza (depunere aberantă ȋn ţesuturi a doi pigmenţi ce conţin fier: hemosiderina şi hemofuscina, cu pigmentarea acestor ţesuturi, vizibil la nivelul pielii) - Boli renale cronice 205

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

Determinarea nivelului seric al fierului se recomandă şi ȋn diagnosticul şi monitorizarea altor afecţiuni: - Anemia microcitară (determinată de deficienţe ȋn metabolismul fierului sau ȋn cursul diverselor hemoglobinopatii) - Anemia macrocitară (indusă prin defect de vitamina B12, sau de acid folic) - Anemiile normocitare (cu eritrocite de talie normală) induse ȋn condiţii ca: defect de eritropoietină, orice cauză de hemoliză şi care conduce deci la anemie hemolitică, defecte calitative sau cantitative ale hemoglobinei, disfuncţii ale măduvii osoase) fierul are multiple roluri: - transportul oxigenului (cel conţinut ȋn Hb) - producţia de energie necesară muşchiului (cel din mioglobină) - producerea de energie la nivel celular (prin fierul conţinut ȋn enzimele şi citocromii lanţului respirator) - buna desfăşurare a funcţiei cerebrale (rol ȋn menţinerea mielinei, funcţia sistemului dopaminergic). 9. MCQ Fe 1. Carenţa de fier poate apare în următoarele situaţii cu EXCEPŢIA: A. Tulburări de absorbţie B. Necesităţi crescute de fier C. Aport alimentar scăzut D. Administrare de medicamente ce conţin fier E. Sângerări repetate Fe 2. Cantitatea de fier din organism variază astfel: A. Depozitele de fier cresc odată cu vârsta B. La bărbaţi depozitele de fier cresc gradual cu vârsta după adolescenţă C. Copii prezintă depozite considerabile de fier D. La femei se observă o pierdere continuă de fier până la menopauză E. Nu există diferenţe semnificative între bărbaţi şi femei 206

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

Fe 3. Fierul ingerat prin alimentaţie este transportat astfel: A. Sub formă de Fe2+ B. Sub formă de fier oxidat (Fe3+) liber C. Sub formă de fier bivalent legat de transferină D. Sub formă de fier oxidat legat de transferină E. Nici un răspuns corect Fe 4. Absorbţia fierului este influenţată de: A. Aciditatea gastrică B. Diferiţi factori alimentari C. Administrarea de medicamente ce conţin Fe D. Administrarea de antibiotice E. Vârstă Fe 5. Una din următoarele roluri nu este atribuită Fe în organism: A. Participă la procese metabolice complexe B. Rol în transportul oxigenului (cel conţinut ȋn Hb) C. Rol în prevenirea osteoporozei D. Producerea de energie la nivel celular E. Buna desfăşurare a funcţiei cerebrale Fe 6. Valoarea sideremiei este: A. 10-40 μg/dl B. 200-270 μg/dl C. 50-150 μg/dl D. 2-3,6 g/dl E. 16-45 μg/dl Fe 7. Creşteri ale sideremiei apar în următoarele situaţii cu o excepţie: A. Post-transfuzii multiple B. Tratament necorespunzător cu fier C. Talasemie D. Boli inflamatorii E. Dializă cronică Fe 8. Afecţiunile însoţite de scăderea sideremiei sunt: A. Ulcer gastric B. Parazitoze intestinale C. Anemia sideroblastică D. Afecţiuni renale E. Colagenoze

207

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

Fe 9. Dozarea nivelului seric al fierului se recomandă în diagnosticul şi monitorizarea următoarelor afecţiuni: A. Anemia feriprivă B. Boli renale cronice C. Pancreatite D. Parazitoze intestinale E. Nici un răspuns corect Fe10. Cel mai important loc de concentrare al fierului din organism este: A. Ficatul B. Muşchiul C. Creierul D. Intestinul E. Inima

8.4. DOZAREA IONILOR DE SODIU, POTASIU, CLOR

1. Consideraţii generale SODIU  Sodiul se găseşte în fluidele din organism, sub formă ionizată (Na+);  Din punct de vedere al distribuţiei în organism o cantitate relativ mare de sodiu se găseşte în cartilaje şi ceva mai mică în oase.  Sodiul de la nivelul scheletului reprezintă 15-30 % din cantitatea totală a organismului, o cantitate de până la 15-30 % din acesta putând fi schimbată cu cel din lichidele extracelulare.  Principalul rol al sodiului în organism este acela de a determina deplasările de apă, fiind componentul principal al forţei osmotice a fluidelor  Toate mişcările sodiului produc deplasarea unei cantităţi variabile de apă.Volumul lichidului din compartimentul extracelular este direct dependent de cantitatea totală de sodiu din organism.

208

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

 Concentratia sodiului plasmatic este identică cu cea din lichidul interstiţial.  Fiind un metal alcalin şi în deplasările sale antrenând anionul bicarbonic, Na+ intervine în menţinerea echilibrului acido-bazic.  De asemenea, Na+ intervine în excitabilitatea neuromusculară şi în dinamica fenomenelor de polarizare şi depolarizare ale membranei celulare opunându-se efectelor potasiului. POTASIU  Potasiul este principalul electrolit (cation) şi constituent al sistemului tampon din lichidul intracelular.  90% din potasiu este concentrat în interiorul celulei, doar mici cantităţi fiind prezente în oase şi sânge. Lezarea celulelor duce la eliberarea potasiului în sânge.  Absorbţia potasiului se face la nivelul intestinului iar excreţia acestui cation se face în mod normal în proporţie de 80-90% din cantitatea totală prin urină, iar restul prin transpiraţie şi scaun.  Potasiul din alimente este eliminat renal în decurs de 24 ore. Chiar şi atunci când nu există aport de potasiu (în condiţii de post), 40-50 mEq sunt excretaţi zilnic în urină.  Pentru a menţine balanţa potasică în limite normale este necesar un aport alimentar de 80-200 mEq/zi. Rinichii nu conservă potasiul şi atunci când există un aport alimentar inadecvat se va produce o deficienţă severă.  Marea majoritate a potasiului (90%) se află sub formă ionică (K+), restul fiind legat de proteine.  Principalele roluri ale potasiului:  este indispensabil unei desfăşurări normale a fenomenelor electrice de membrană  în conducerea nervoasă  ȋn contracţia musculară  echilibrul acido-bazic  presiunea osmotică  anabolismul proteic şi formarea glicogenului.  Procesele anabolice se însoţesc de fixarea K+ în celulă, iar cele catabolice de eliberarea lui. Potasiul se concentrează cu predilecţie în muşchii striaţi, miocard şi ficat. Împreună cu calciul şi magneziul, K+ controlează contracţia şi debitul cardiac. 209

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

 Ionii de potasiu şi sodiu sunt importanţi în reglarea renală a echilibrului acido-bazic, ionii de hidrogen fiind substituiţi pentru ionii de Na+ şi K+ în tubul renal. Bicarbonatul de potasiu este principalul tampon anorganic intracelular.  În deficitul de potasiu se produce acidoză intracelulară, la care centrii respiratori răspund prin hiperventilaţie conducând astfel la scăderea pCO2. CLOR  Clorul este principalul anion al lichidelor extracelulare, şi se găseşte cu predilecţie în fluidele organismului: suc gastric, pancreatic şi intestinal, lichidul cecal, transpiraţie, LCR (lichidul cefalo-rahidian).  Clorul este responsabil, împreună cu sodiul, de volumul lichidului extracelular şi de osmolaritatea plasmatică.  Clorul menţine integritatea celulară prin influenţa sa asupra presiunii osmotice şi a echilibrului acido-bazic. Ionul de clor însoţeşte sodiul în deplasările sale aproape pasiv, în scopul menţinerii neutralităţii electrice, fiind supus influenţelor exercitate de mecanismele neuroumorale responsabile de homeostazia volumului. Astfel comportamentul concentraţiei plasmatice a clorului este în general paralel cu cel al sodiului. Recomandări pentru determinarea Na+ Determinarea nivelurilor serice ale Na+ se recomandă ȋn: - Investigarea echilibrului hidro-electrolitic şi acido-bazic în diverse condiţii patologice:  deshidratare  diabet insipid  intoxicaţie cu apă  sindroame diareice severe  edeme  insuficienţă renală  hipertensiune  insuficienţă cardiacă  ciroza hepatică  hipotiroidism  deficit sau exces de mineralocorticoizi  febră cu hiperventilaţie  leziuni cerebrale cu hiperventilaţie 210

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

Recomandări pentru determinarea potasiului ( K+ ) Determinarea nivelurilor serice de potasiu se recomandă în: - Investigarea echilibrului hidro-electrolitic şi acido-bazic în:  boală Addison  insuficienţă renală acută şi cronică  comă uremică  cetoacidoză diabetică  obstrucţie intestinală  pierderi gastrointestinale  hipertensiune  aritmii  alcoolism cu delirium tremens  administrarea de diuretice, preparate cortizonice şi digitalice  monitorizarea pacienţilor care necesită terapie intensivă  monitorizarea tratamentului acidozei Recomandări pentru determinarea clorului (Cl-) - Investigarea echilibrului hidro-electrolitic şi acido-bazic în anumite condiţii patologice:  insuficienţă suprarenaliană  mucoviscidoză  sindroame diareice şi vărsături  diabet zaharat  hiperparatiroidism  abuzuri de medicamente În condiţii de urgenţă este cel mai puţin important electrolit, dar este în mod special important în corectarea alcalozei hipopotasemice. 2. Principiul determinării - Na+, K+, ClSe foloseşte metoda potenţiometrică ISE (ion selective electrode) de determinare a sodiului, potasiului şi clorului în ser, metodă prin care, activitatea unui anumit ion dizolvat ȋntr-o soluţie printr-o membrană este convertită intr-un potenţial electric ce poate fi măsurat de un voltmetru sau pH-metru. Modificarea de potenţial este masurată faţă de un electrod de referinţă extern cu potenţial constant. Diferenţa de potenţial dintre cei doi electrozi depinde de activitatea ionului ȋn soluţie, care este legată de concentraţia ionului respectiv, permiţând ȋn final măsurarea sa analitică. 211

CORELAŢII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI – Explorarea homeostaziei minerale

2010

3. Valori de referinţă Na+ : 120 – 160 mmol/l Valorile 1.022)  proteinurie  nefroze  diabet  pierderi excesive de apă : transpiraţii abundente, stări febrile, vărsături, diaree  insuficienţa cardiacă congestivă

 Valori crescute (>1.022)  proteinurie  nefroze  diabet  pierderi excesive de apă : transpiraţii abundente, stări febrile, vărsături, diaree  insuficienţa cardiacă congestivă

 Valori scăzute (200mg/dL E. Nici un răspuns corect

235

235

2010

Liliana FOIA – CORELATII CLINICE IN INTERPRETAREA PARAMETRILOR BIOCHIMICI

Parametru

Acid uric

CAPITOLUL 10

CAPITOLUL 10

PRINCIPALII PARAMETRI BIOCHIMICI - VALORI DE REFERINTA -

PRINCIPALII PARAMETRI BIOCHIMICI - VALORI DE REFERINTA -

Specim en

Ser, Plasmă

Interval biologic de referinţă

Albumina

α-Amilaza

Ser, Plasmă

Ser

Ser, Plasmă

Bilirubina directa

Ser, Plasmă

Ser

Interval biologic de referinţă (Unităţi Internaţionale)

2.5 – 6.0 mg/dL 3.5 – 7.2 mg/dL 2.0 – 5.5 mg/dL

x 0.059

0.15 – 0.35 mmol/L 0.21–0.419 mmol/L 0.12 – 0.32 mmol/L

Copii

250 -750 mg/24h

x 0.0059

1.48– 4.43 mmol/24h

Adulţi Femei Bărbaţi Copii

5 – 31 U/L 5 – 41 U/L 13 – 45 U/L

Adulţi Copii >14ani 14ani