Compte Rendu Du Tp de Microbiologie

Compte rendu du stage de Tp de Microbiologie

Année 2002-2003

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Préparation des milieux et du matériel

L’étude des bactéries a connu son plein développement à partir du moment où furent mises au point des méthodes permettant de les cultiver, les isoler, et de les identifier. Ces différentes opérations nécessitent l’emploi de milieux de culture. Principales caractéristiques d’un milieu de culture Les microorganismes doivent trouver dans le milieu de culture et son atmosphère tous les éléments chimiques les constituant, sous une forme appropriée. Un bon milieu doit :  Etre stérile  Etre nutritif : doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la croissance et l’entretien des microorganismes.  Contenir une quantité d’eau suffisante pour permettre le métabolisme bactérien.  Avoir un pH convenable. Rq : Un milieu contenant uniquement ce qui est nécessaire aux microorganismes est dit milieu minimum. Classification des milieux de culture Les milieux de culture sont classés en fonction de leur composition ou de leur utilisation. a) Classification selon la composition. 1. Milieux naturels ou empiriques Milieux complexes de composition mal définie. Leur origine est soit animale (extraits de viande, peptone), soit végétale (pomme de terre, levure). 2. Milieux synthétiques Milieux composés de substances chimiques exactement définies 3. Milieux semi synthétiques Milieux synthétiques additionnés d’un produit naturel b) Classification selon l’utilisation 1. Milieu usuels = milieu de base Milieu d’un emploi aussi général que possible. Il n’existe cependant pas de milieu de culture universel 2. Milieu d’isolement Les milieux d’isolement peuvent être :  Des milieux de base  Des milieux enrichis de produits biologiques  Des milieux électifs : Ce sont des milieux de culture permettant un développement particulièrement abondant de certains germes.  Des milieux sélectifs (ou d’enrichissement) : Ce sont des milieux dans lesquels on incorpore un inhibiteur chimique. Celui-ci, judicieusement choisi, entrave le développement de la plupart des bactéries excepté celui de l’espèce recherchée. Ces milieux permettent donc d’isoler une espèce bactérienne au milieu d’un mélange de germes. 3. Milieu d’identification Ces milieux permettent la mise en évidence des caractères biochimiques et donc de résoudre les problèmes d’identification différentielle qui se posent entre des espèces ou des genres voisins.

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c) Classification selon leur présentation 1. Milieux liquides Ce sont soit des bouillons nutritifs contenant des produits carnés ou protéiques, soit des solutions riches en produits synthétiques. Dans les deux cas la gélose est totalement absente. La croissance microbienne est réalisée dans des tubes, des ballons ou des erlenmeyers. Elle est suivie par turbidimétrie : un milieu limpide au départ devient de plus en plus trouble lorsqu’un microorganisme se développe. 2. Milieux solides Les milieux nutritifs solides peuvent être identiques aux précédents mais ils contiennent de la gélose. Si il y a plus de 1% d’agar on parle de milieu solide, si il y a moins de 1% d’agar on parle de milieu semi solide. Ces milieux peuvent être répartis en boîtes de pétri, dans des tubes à gélose molle prise en culot, etc. La croissance microbienne se déroule en surface ou en profondeur et est suivie par observation de l’augmentation de la taille des colonies respectivement aérobies et anaérobies. Une cellule initiale se multiplie et donne une descendance de plusieurs millions d’individus tous identiques, formant une colonie.

Préparation des milieux de culture Sachant que de la préparation des milieux de culture dépend les résultats de l’analyse microbiologique, un défaut de fabrication, une stérilisation mal conduite, risquent de perturber le travail. Il faudra donc apporter un grand soin à leur fabrication. Les milieux de culture existent aujourd’hui sous trois formes, soit, du plus coûteux au plus économique : - Le prêt à l’emploi - Le prêt à couler - En poudre Durant ce Tp nous avons essentiellement utiliser des milieux en poudre du fait de leur moindre coût, ce sont soit un mélange des constituants de base, soit un des éléments de base, dont le fabricant indique la dose à peser pour un volume final de milieu. Les différentes étapes de la préparation de ces milieux consistaient en : - La pesée - La dissolution des ingrédients - La mesure du pH - La répartition - La stérilisation des milieux (autoclave 121°C pendant 20 min) Rq : L’agar étant un composé insoluble à froid, il sera incorporé après la dissolution des ingrédients et la mesure du pH.

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Les milieux utilisés durant ce Tp, leur rôle et leur préparation Durant ce Tp nous avons utilisé : Un milieu empirique sous forme solide: Gélose nutritive (GN) Un milieu empirique sous forme liquide : Bouillon nutritif (BN) Deux milieux sélectifs : Milieu à l’éosine et bleu de méthylène (EMB), Milieu Malt agar (MA) De l’eau physiologique Gélose nutritive (GN): Relativement simplifiée, sa formulation apporte les éléments nutritifs nécessaires à la croissance d’une grande variété de germes non exigeants. Elle est utilisée pour la culture et la numération des microorganismes ne présentant pas d’exigences particulières. Elle est constituée : - extrait de levure - bouillon nutritif (nutrient broth) - glucose - agar Nous avons pesé 20g de BN, 3g d’extrait de levures, 5g de glucose, que nous avons placés dans un erlen de 2L et auxquels nous avons ajouté 1L d’eau déminéralisée et placé sous agitation avec un barreau aimanté afin de dissoudre les différents constituants. Nous avons alors vérifié que le pH se situait bien dans une gamme comprise entre 7 et 7.5. C’est donc après la dissolution des différents éléments du milieu et ajustage du pH que nous avons incorporé les 15g d’agar. Nous avons alors bouché l’encolure de l’erlen avec du coton cardé et placé une feuille d’aluminium autour avant de stériliser le milieu à l’autoclave à 121°c pendant 20 min. Bouillon nutritif (BN) : Le bouillon nutritif contient exactement les mêmes constituants que la gélose nutritive, excepté le fait qu’on n’ajoute pas d’agar puisque c’est un milieu liquide. Il est donc constitué de : - extrait de levure - bouillon nutritif (nutrient broth) - glucose Sa préparation est identique à celle de la gélose nutritive. Gélose EMB (éosine methylen bleu) : La gélose EMB est constituée d’éosine Y et de bleu de méthylène qui sont des agents faiblement sélectifs. Ils n’inhibent que partiellement le développement des microorganismes gram positifs tels que les Streptocoques fécaux. De plus ces colorants assurent la différenciation entre les germes lactose positifs et les germes lactose négatifs, lorsque le milieu est lactosé. Nous avons pesé 18.75g afin de préparer 500 mL de ce milieu, auxquels nous avons ajouté 500 mL d’eau déminéralisée. On a alors ajusté le pH à 6.8-7 à l’aide de KOH concentré et stérilisé à 121°c pendant 20 min suivant le même protocole que précédemment.

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Gélose Malt agar : Elle est constituée : - extrait de malt - extrait de levure - glucose - agar Nous avions à notre disposition sous forme de poudre la base du milieu malt agar qui contenait tous les constituants sauf l’extrait de levure et le glucose. Le fabricant indiquait qu’il fallait peser 45g pour préparer un litre. Nous voulions préparer 500 mL, nous pesions par conséquent 22.5g sur une feuille d’aluminium. Nous avons également pesé 1.25g d’extrait de levure et 5g de glucose. Après avoir pesé tous les constituants nous les avons transférés dans un erlen d’un litre et ajouté 500 mL d’eau déminéralisée. Nous avons ensuite rajouté 0.25g de Cloramphénicol avant de stériliser à 121°C pendant 20 min. La sélection des levures se réalise par l’emploi du chloramphénicol L’eau physiologique : Elle est obtenue par dissolution de 9g de Chlorure de sodium (NaCl) par litre d’eau distillée. Elle constitue un milieu isotonique qui permettra la dissolution des microorganismes tout en maintenant la différence de pression osmotique de part et d’autre de la membrane plasmique évitant ainsi la lyse.

Après stérilisation nous avons procédé à l’étape de répartition des milieux. Nous avons coulé les géloses de façon stérile à proximité de la flamme du bec Bunzen.

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Familiarisation avec le monde microbien Les Techniques de préparations microscopiques L’observation microscopique des microorganismes peut se faire sans coloration ou après coloration. Dans le premier cas, on examine des individus vivants : on apprécie ainsi la mobilité, la taille, la forme des germes ; dans un second cas, on précise la forme et on détaille les structures invisibles, par coloration, après fixation et desséchage des préparations, opérations tuant les germes. Observation sans coloration : Etat frais L’observation de l’état frais se réalise à l’objectif x40, le conden seur descendu, et le diaphragme légèrement fermé. On observe ainsi sur un fond grisâtre des bactéries brillantes. On met à profit la propriété de réfringence des microorganismes pour les observer vivants. 1) Technique opératoire La technique opératoire consiste à préparer une lame propre dégraissée et sèche. Homogénéiser la suspension à observer : prélever aseptiquement à la Pipette Pasteur une goutte de culture : déposer cette goutte au centre de la lame. Rq : Si on part d’un produit solide comme une colonie sur une boite de pétri par exemple, on déposera d’abord une goutte d’eau au centre de la lame et on y suspendra une faible quantité de la colonie à l’aide de l’ose. On recouvrira ensuite la goutte d’une lamelle tout en évitant les bulles d’air et les débordements de liquide au-delà de la zone délimitée par la lamelle. On observera sur fond clair avec l’objectif 40.

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2) Interprétation Cette préparation permet d’apprécier :  Le nombre de bactéries contenues dans le prélèvement ; notion semi quantitative permettant de dire s’il y a beaucoup ou peu de germes (renseignement utile ultérieurement pour choisir la quantité d’inoculum convenable pour l’observation d’un bon isolement et d’une bonne culture).  La forme des bactéries

 Coques ou cocci : éléments arrondis, sphériques.

 Bacilles : bâtonnets : éléments allongés de taille variable.

Bacilles de taille moyenne

Bacilles grêles

Gros bacilles trapus

Bacilles courts et arrondis : coccobacilles

 Le mode d’assemblage de bactéries

Coques

Isolés Groupés par deux : diplocoques En grappe ( Staphylocoques) En chaînettes ( Streptocoques) En longue chaînes

Bacilles

Isolés En courtes chaînettes En chaînes En palissades

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 La mobilité Les cellules peuvent être mobiles : la présence de cils ( non visibles à l’état frais) favorise le déplacement qui ne doit pas être confondu avec le mouvement général du liquide ou avec le mouvement brownien si la température du liquide est trop élevée (du fait de l’éclairage continu). Un corps microbien est mobile lorsqu’un individu observé traverse le champ du microscope ou lorsque deux individus se croisent.

Il ne faut pas oublier que dans un échantillon, il y a le plus souvent plusieurs types de bactéries, l’état frais permet de savoir combien de types différents sont présents. Dans d’autres cas, cette observation permet de vérifier la pureté d’une culture. Il ne faut jamais oublier que les bactéries sont vivantes. L’observation de l’état frais est une étape indispensable et très importante, qui apporte de nombreux renseignements et oriente déjà le diagnostic et permet de passer à l’étape suivante : l’observation de préparations colorées.

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Observation après coloration Les observations après coloration se font à l’objectif 100 à l’immersion, le condenseur relevé à fond, et le diaphragme ouvert entièrement. Avant tout examen d’un frottis coloré, il faut dans un premier temps réaliser le frottis. 1) Préparation d’un frottis On dépose une goutte de culture microbienne ou on suspend une colonie dans une goutte d’eau au centre d’une lame. On étale la préparation avec l’oese de façon à obtenir une couche mince On sèche la lame. On fixe la préparation en écrasant la flamme du bec 2 à 3 fois avec la lame. 2) Colorations Les colorants simples que l’on emploie sont des colorants acides qui colorent uniformément les cellules, et des colorants basiques à affinité pour le cytoplasme (fushine, violet de gentiane) Durant ce Tp nous avons réalisé : Un examen après coloration différentielle d’un frottis, c’est la coloration de Gram. 2.1) Coloration de Gram C’est la coloration la plus utilisée en microbiologie car elle permet de distinguer deux grands groupes de microbes : les Gram + et les Gram -. La distinction est basée sur la différence de structure des parois mise en évidence par la double coloration. La lecture se fait avec l’objectif à immersion. La coloration de Gram permet de classer les bactéries en deux grandes catégories : - Les bactéries à Gram positif qui gardent la coloration violette après action de l’alcool - Les bactéries à Gram négatif qui sont décolorées par l’alcool et teintées en rose plus ou moins vif par la fushine. Cette distinction, base de toute la taxonomie bactérienne repose sur une variation dans la structure de la paroi des bactéries. En effet, la richesse en lipides de la paroi des bactéries à Gram négatif permet à l’alcool de traverser cette paroi et de dissoudre le composé coloré, fixé dans le cytoplasme, résultat de l’action co njointe du violet de gentiane et du lugol. Par contre, la paroi des Gram positifs, riche en peptidoglycane et pauvre en lipides est imperméable à l’alcool et par conséquent garde le complexe coloré violet.

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2.2) La coloration des spores La coloration de spore permet de mettre en évidence les spores ou endospores, qui constituent les formes de résistances de deux classes de bactérie : - Les Bacillus (aérobie) - Les Clostridie (anaérobie) La spore est résistante à la chaleur, à la dessiccation, et aux radiations. Afin de la mettre en évidence il faut réaliser une coloration à chaud faisant intervenir du vert de Malachite, rincer à l’alcool, et faire une contre coloration à la safranine.

Endospore

Les spores seront colorées en vert et le cytoplasme des bactéries en rose.

2.3) Coloration à la nigrosine : La nigrosine est un colorant qui peut permettre la mise en évidence des cicatrices des bourgeonnements des levures. Sinon on l’utilise lors d’état frais pour augmenter le contraste de la préparation. 2.4) Coloration à l’encre de chine : L’encre de chine est obtenue à partir d’une suspension de particules de charbon. Du fait de la taille élevée des particules, celles -ci ne pénètrent pas dans la cellule. On observe donc des cellules non colorées sur un fond noir. Cette technique est une coloration négative, puisqu’on ne colore pas les cellules, ainsi on peut mettre en évidence la présence de capsules qui apparaissent blanchâtre autour de la cellule qui elle est réfringente. La technique consiste à placer sur une lamelle une goutte de la préparation et une goutte de colorant côte à côte.

Et de déposer dessus une lamelle. Les deux gouttes se mélangeront, et on observera au grossissement x40.

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Observation d’un mou de raisins Le mou de raisin est un mélange en solution aqueuse de raisins écrasés. Afin d’observer les différentes catégories de germes présents, nous avons réaliser des techniques microscopiques d’observation.

Technique s d’observation

Observations

Etat Frais (G x40)

Nigrosine (G x 40)

On observe des bactéries en forme de bâtonnet qui ne possèdent pas de mobilité. On observe également des levures

Coloration de spore (G x100)

Coloration à l’encre de chine (G x 40)

On observe des bactéries roses en forme de bâtonnet ne présentant pas de spores, et des levures roses.

On observe des bactéries et des levures. Les bactéries ne possèdent pas d’halo blanc caractérisant la présence de capsule.

On peut donc constater que le raisin possède plusieurs flores microbiennes : une d’origine bactérienne et l’autre de type levure. Ces deux flores sont nécessaires à la fabrication du vin.

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Observation d’un jus de radis Technique s d’observation

Etat Frais (G x40)

Observations

On observe des protozoaires. On observe des arthrospores. On observe également du pseudomycélium.

Nigrosine (G x 40)

Coloration de spore (G x100)

Coloration à l’encre de chine (G x 40) On observe quelques capsules.

Sélection des bactéries formants des endospores dans la suspension de radis Les spores sont des formes de résistances, afin de les mettre en évidence nous allons mettre dans des conditions de stress un aliquote de notre solution de jus de radis à 90°C pendant 20 min. Cette étape à pour but de tuer toutes les formes végétatives, et de sélectionner uniquement les formes sporulantes. Par étalement sur un milieu GN de notre aliquote chauffé et après incubation, on a obtenu des colonies correspondantes aux bactéries sporulées. Nous avons ainsi confirmé la présence de spores et isolé les bactéries sporulantes.

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Etude de 6 souches de collection

Gram

Coloration de spores

Coloratio n à l’encre de chine

oxydase

catalase

Mobilité

Bâtonnet à bouts carrés 1.5µ*4µ Mobilité + ou – par ciliature péritriche isolé

Bacille violet gram +

Exospores verte et spores déformantes subterminales

-

-

+

+/-

Petit coque, immobile

Petit coque, immobile

Coque gram + violet, isolé, par 2, en amas, ou en tétrade

-

-

+

-

Bacille 1µ*5µ Isolé Courte chaînette

Bacille 1µ*5µ Isolé Courte chaînette

Bacille a gram variable

-

-

-

-

Bâtonnet ovoïde, groupé par 2 ou isolé Taille : 1-3µ

Bâtonnet ovoïde, groupé par 2 ou isolé Taille : 1-3µ

Bacille rose Gram – Isolé ou par 2

-

-

+++

Petit bâtonnet ovoïde de forme coccobacille Isolé, par 2 Taille : 1µ

Petit bâtonnet ovoïde de forme coccobacille Isolé, par 2 Taille : 1µ

Coccobacille rose gramIsolé, par 2

-

-

-

Petit bâtonnet Isolé, par 2 Taille : 5µ

Petit bâtonnet Isolé, par 2 Taille : 5µ

Bacille rose Gram – Isolé, par 2

-

+

++

Nom de la souche

Aspect macroscopique

Coloration à la nigrosine

Etat frais

Bacillu s megaterium

Colonie blanche à bord crénelé de 0.5 cm de diamètre

Bâtonnet à bouts carrés 1.5µ*4µ Mobilité + ou – par ciliature péritriche isolé

Micrococcus flavus

Colonie blanche-jaune, ronde, lisse, brillante, diamètre 1mm

Waksmania sp

Serratia marcescens

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Petite colonie ronde, bombée pigmentée en rose Colonie lisse, 1.5 mm de diamètre, rondes, bombées, bord réguliers, luisantes, jaunâtres Grande colonie plates de 2 à 3 mm de diamètre, transparente, bords frangés, aspect irisé, nacré

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+

Réalisation d’une courbe de croissance La croissance est définie comme l’accroissement ordonné de tous les composants d’un organisme. Chez les micro-organismes unicellulaires comme les bactéries ou les levures, elle aboutit à une augmentation du nombre d’individus résultant d’une division cellulaire. Cet accroissement est donc synonyme de multiplication, puisque au bout d’un temps correspondant au temps de génération, une bactérie peut donner naissance à deux nouvelles bactéries. Parallèlement, cette croissance se traduit par un appauvrissement en divers métabolites, et par l’accumulation de déchets entraînant la mort des cellules. Afin d’étudier la croissance, nous avons évalué le nombre de cellules en mesurant le trouble. C’est le procédé le plus simple et le plus rapide. C’est une méthode optique générale, appelée turbidimétrie, fondée sur la propriété que présente toutes les solutions d’absorber une partie de l’intensité d’un faisceau de lumière qui la traverse. Cette propriété est basée sur la loi de Beer Lambert ou log (I0/I) =  .l.c. Il en découle que l’absorbance est proportionnelle à la concentration. Cependant cette loi n’est plus valable aux fortes concentrations, c’est pour cela que nous avons dilué nos échantillons lorsque la DO dépassait les 0.8. L’inconvénient de cette technique c’est qu’elle est incapable de différencier les cellules mortes des cellules vivantes et de mesurer des 6 concentrations microbiennes inférieurs à 10 bactéries/mL. C’est pour cela que nous avons réalisé une préculture en milieu BN 24h auparavant. Celle-ci avait pour but d’obtenir une culture jeune avec un fort inoculum, et aussi d’habituer la souche au milieu de culture, permettant ainsi de diminuer la phase de latence qui correspond au temps d’adaptation de la bactérie. Nous avons réalisé des courbes de croissance sur deux souches différentes : Un coque gram + : Micrococcus flavus Un bacille gram - : Escherichia coli Les courbes ont été obtenues en traçant l’évolution de la densité optique en fonction du temps, toutes les 30 minutes environ. La croissance est constituée de différentes phases, dont la phase exponentielle de croissance. Durant cette phase l’absorbance, donc le nombre de cellules, augmente de façon exponentielle et ln (nb cellules) est proportionnel au temps. Cette phase permet de déterminer deux paramètres : - Le temps de génération - Le taux de croissance népérien C’est ces paramètres que nous allons calculer ; ce sont des caractères propres à chaque espèce. Nous allons utiliser du papier semi-log ce qui permettra de reporter directement les valeurs de DO, tout en linéarisant la phase exponentielle de croissance.

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Explication des différentes phases de la croissance On a remarqué que si on représente la fonction ln N = f (t), on obtient une zone linéaire pendant la phase où N augmente (phase exponentielle de croissance).

Phase

Phase de latence

Description Elle est facultative. Quand elle existe, elle correspond à une phase d'adaptation des bactéries au milieu. Les bactéries ne se divisent pas (ou trop peu pour mesurer la variation). Elle est absente quand l'inoculum est jeune et que le milieu est le même que le précédent. Cette phase correspond au temps nécessaire aux bactéries pour synthétiser les enzymes nécessaires pour dégrader le milieu et pour ajuster certains paramètres comme le pH.

Phase Les bactéries se multiplient de plus en plus activement d'accélération Les bactéries se multiplient à leur rythme le plus élevé. Le ln de N est Phase directement proportionnel eu temps. C'est la phase physiologique (production exponentielle d'antibiotiques et de toxines. La représentation est une droite d'équation : de croissance Phase de Lorsque les nutriments se raréfient, la croissance ralentit, le phénomène ralentissement s'accentue plus les nutrime nts se raréfient. La biomasse est stable. Deux explications sont envisageables : - Les bactéries ne se divisent plus ; Phase - Il y a autant de bactéries qui se divisent que de bactéries qui meurent. stationnaire Elle peut être due à la disparition d'un ou plusieurs nutriments, à l'acidification du milieu et, ou surtout à l'accumulation de déchets toxiques. Phase de Les bactéries ne se divisent plus, certaines meurent et sont lysées. Leur nombre déclin N diminue.

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Valeur de µ x (vitesse spécifique de croissance) en h-1 µx = 0 (ln N = ln N o)

µx ↑ (G↓)

µx = µmax

µx ↓et tend vers 0

µx = 0

µx < 0

Temps de génération : Le temps de génération (en min) est le temps de doublement de la population bactérienne, c'est l'intervalle de temps compris entre 2 divisions bactériennes en phase exponentielle..

Taux de croissance :

1) Escherichia coli : 1.1)

Préculture :

Un jour avant de réaliser notre courbe de croissance, nous avons ensemencé 2 mL de bouillon BN à l’aide d’un clone de la bactérie. Nous avons mis le tube à incuber sous agitation au bain marie pendant la nuit à 30°C. 1.2)

Expérience :

Dans un premier temps nous avons étalonné le spectrophotomètre. Nous avons donc transféré dans une cuve 1mL du milieu BN restant contenu dans notre flacon, et nous avons étalonné le spectrophotomètre. Ensemencement Préalablement nous avons mesurer la Do à 600 nm afin d’avoir une estimation de la concentration de l’inoculum. On veut obtenir une absorbance inférieure à 0.1 dans notre Bouillon nutritif de 100 mL au temps t=0 initial. Préalablement j’ai dilué la culture au 1/20ème (50 L dans un volume final de 1000µL), ce qui a donné une DO de 0.395 pour 1mL soit une DO de 7.9 pour l’échantillon non dilué. 1 ml de la culture dans les 100 mL de bouillon nutritif donnerait donc une Do de 0.08. On a donc inoculé les 100 ml de milieu BN à l’aide de 1mL de la préculture. On a laissé la pipette cotonnée qui nous a servi à l’inoculation dans l’erlen en la callant avec le coton cardé. On agite la solution pour l’homogénéiser et on prélève 1 mL pour réaliser la mesure de l’absorbance au temps t=0. On replace alors l’erlen sous agitation au bain marie à 30°C, c’est le temps zéro de l’expérience. Mesure de la croissance : Toutes les 30 minutes, on prélève 1 mL de la culture en cours afin de suivre l’évolution de l’absorbance et tracer la courbe de croissance. Rq : On a toujours utilisé la même cuve pour faire les mesures qu’on a rincé entre temps à l’eau.

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Résultats :

Temps

Dilution

DO avec Dilution

DO

0 30

Aucune Aucune

0,122 0,125

0,122 0,125

60 90 120

Aucune Aucune Aucune

0,163 0,213 0,28

0,163 0,213 0,28

150 180

Aucune Aucune

0,364 0,516

0,364 0,516

210 240

Aucune ½

0,798 0.5

0,798 1

270 300

½ ½

0.595 0.715

1,19 1,43

On a dilué à partir du temps t=240 min, car le spectrophotomètre ne donne plus de réponse linéaire au-delà d’une absorbance de 0.8, ainsi que la loi de Beer Lambert qui n’est plus valable. 2) Calcul des différents paramètres de la croissance Nom de la souche

Temps de génération (min)

Taux de croissance (min-1)

Escherichia coli

75

0.009min-1 0.54 h-1

On a pu constater sur le graphique une augmentation de l’absorbance au temps t= 3h et ensuite une diminution au temps t= 3h30. Ce changement correspond à une élévation de température et un retour à la température initiale, on est passé de 28°C à 30°C puis on est retourné à 28°C. De ce fait on a pu voir que le temps de génération n’est une constante pour un germe donné que dans des conditions données. Le temps de génération est différent pour chaque microorganisme. On peut s’en servir pour obtenir un nombre de cellules à un temps donné.

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Etude microbiologique de produits L’étude microbiologique d’un produit à pour but de mettre en évidence et de dénombrer les microorganismes présents, comme les bactéries, les levures, ou les moisissures par l’utilisation de milieux sélectifs adéquats. Par la suite, l’étude des caractères biochimiques permettra éventuellement de caractériser ces microorganismes. Les microorganismes contenus à l’intérieur du produit à analyser doivent être extraits puis ensemencés en milieu solide ou liquide. Le choix des milieux et des conditions de culture (température) est important et l’utilisation de plusieurs milieux sélectifs permettra d’isoler l’ensemble de la flore microbienne. On utilisera donc pour la recherche des bactéries, le milieu GN. La recherche des entérobactéries se fera sur milieu sélectif au pH neutre : EMB La recherche des levures et moisissures se fera sur milieu complexe sélectif au pH acide : Ma+chloramphénicol. L’extraction des microorganismes du produit à analyser devra être adaptée au type de produit à analyser. Pour un produit solide comme la terre, un broyat en présence d’un solvant facilitant la dispersion des cellules (eau physiologique) a été réalisé. Pour le lait, milieu liquide, aucun traitement particulier n’a été nécessaire.

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1 Analyse microbiologique et dénombrement d’un échantillon de sol

Extraction et analyse microbiologique d’un échantillon de sol 1) Prélèvement Afin de déterminer la flore présente dans le sol, nous allons prélever de façon le plus stérilement possible, un échantillon de terre afin de limiter l’apport d’autres contaminants. On veillera à prélever une masse supérieure à 10g. Puisque par la suite nous aurons besoin de deux fois 5g de terre, une pour déterminer le poids sec, l’autre pour déterminer la flore présente. 2) Extraction A partir de cet échantillon, nous allons peser deux fois 5g de terre. Le contenu de la première pesée sera placé dans un bêcher et placé au four pasteur pendant 6h à 180°C afin de déterminer le poids sec. Le contenu de la deuxième pesée est placé dans un mortier en présence de 30 mL de solution d’extraction (eau physiologique). L’eau physiologique constitue un milieu isotonique qui empêche la lyse des cellules, en maintenant une pression constante de part et d’autre de la cellule. On broie alors à l’aide d’un pilon le produit, puis on transvase dans un tube gradué de 50mL. L’ensemble de l’étape d’extraction se réalise dans des conditions stériles autour du bec bunsen avec du matériel stérile. Le pilon et le mortier sont rincés avec la solution d’extraction afin de récupérer toute la terre présente. Puis le tube est complété à 50 mL avec la solution d’extraction. Nous étant trompé notre volume final était de 53 mL .L’échantillon est homogénéisé au vortex puis on laisse reposer pendant 15 min. 3) Calcul du poids sec Après avoir mis dans un bêcher un poids connu et précis de terre. On place celui ci au four pasteur pendant un temps minimum de 6h. Ainsi on s’affranchira du taux d’hydratation de la terre qui varie en fonction des conditions atmosphériques et du lieu de prélèvement. Ceci est nécessaire pour comparer des échantillons prélevés à des lieux différents, puisqu’on ne prend plus en compte que la masse de la terre sèche. Masse du bêcher 46.73g Masse terre humide = 4.97g Masse du bêcher + terre humide 51.70g Masse bêcher + terre sèche 47.99 Masse terre sèche = 51.7-47.99=3.71g On dispose donc de 3.71g de terre sèche. Il y avait donc ((4.97-3.71)/4.97)x100=25% d’humidité dans la terre. Pour la suite des calculs on considèrera que la masse de terre humide était de 5g. 4) Dilutions -1 -9 Les microorganismes en suspension sont dilués en cascade de 10 à 10 . Le transfert de 1mL de la er suspension préparée précédemment dans le 1 tube contenant 9 mL de solution de dilution -1 constitue la dilution 10 . On homogénéisera à l’aide d’un vortex et on procédera de la même -1 manière, en prélevant 1 mL dans le tube 10 pour le transférer dans le tube 2, on homogénéise, et ainsi de suite.

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5) Ensemencement A partir des dilutions, les microorganismes dilués sont étalés sur boîtes de milieu nutritifs et inoculés en milieu nutritif liquide. 6) Dénombrement Afin de déterminer le nombre de microorganismes contenus dans notre échantillon de terre, nous allons utiliser deux techniques de dénombrement : Une technique de comptage sur boite Une technique statistique : le test de Mac Grady faisant intervenir un paramètre : le MPN (most popular number) ou NPP (nombre le plus probable) 6.1) Comptage sur boite Afin de dénombrer des microorganismes sur milieu solide, il faut considérer que chaque colonie ou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de l’étalement. Vue que certains microorganismes peuvent être pluricellulaire, on ne peut considérer que chaque clone provient d’une seule cellule originelle. On utilise donc le terme d’UFC (unité formant colonie) pour rapporter le résultat obtenu On réalisera donc des étalements en surface de 0.1mL des différentes dilutions précédemment préparées, en inoculant 3 boîtes par dilution. Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une boîte n’étant pas statistiquement fiable, seules les boîtes contenant entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes. Le milieu MA va servir à la multiplication des champignons Le milieu GN va servir à une multiplication non sélective des bactéries Le milieu EMB va servir à la présélection de notre souche isolée d’entérobactérie Milieu MA Dilution

10-3

10-4

10-5

Boîte 1 Boîte 2

0 1

0 0

0 0

Boîte 3 Moyenne

3 1.33

0

0

Afin d’avoir un nombre statistiquement correct, on considère un nombre comptable entre 30 et 300 colonies. On prendra donc pour le calcul la dilution 10 -3 qui donne un nombre de 1.33 colonies. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : N = 1.33 x 10 3 x 10 = 1.33 x 104 UFC/mL dans le sol. Ces germes correspondraient aux levures. Milieu GN Dilution

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

Boîte 1 Boîte 2

1 1

0 0

0 0

0 0

0 0

Boîte 3 Moyenne

0 0.75

0

0

0

0

-5

La dilution 10 donne un nombre de 0.75 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : N = 0.75 x 10 5 x 10 = 7.5 x 105 bactéries/mL dans le sol. Il y aurait donc 7.5 x 105 bactéries, toutes flores confondues, dans un mL de suspension de terre.

20

Milieu EMB Dilution Boîte 1

10-2 84

10-3 6

10-4 0

Boîte 2 Boîte 3 Moyenne

111 105 100

13 10 10

0 1

Afin d’avoir un nombre statistiquement correct, on considère un nombre comptable entre 30 et -2 300 colonies. La dilution 10 donne un nombre de 100 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : 2 5 N = 100 x 10 x 10 = 1 x 10 bactéries/mL dans le sol. Ces germes correspondraient aux Entérobactéries. 6.2) Test de Mac Grady (NPP: technique du nombre le plus probable) Une utilisation de l’analyse statistique peut être faite pour obtenir des résultats plus précis en milieu liquide. Cette technique utilise trois essais par dilution. C’est la méthode du nombre le plus probable (NPP), dérivée des études de Mac Grady, qui consiste à interpréter les résultats en comparant les trois essais et leurs résultats. Il s’agit d’une interprétation probabiliste. Après incubation des tubes, on notera pour chaque essai si le résultat est positif ou négatif. Et, à chaque dilution, on affectera un chiffre égal au nombre de tubes positifs. On groupe ensuite en nombre de 3 chiffres la suite de chiffres obtenue, en commençant par le chiffre obtenu pour la plus faible dilution. Dilution

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

Tube 1 Tube 2

+ +

+ +

+ -

-

-

-

Tube 3 Nb de tube +

+ 3

2

1

0

0

0

Ici nous obtenons les nombres : 321 210 100 On choisi le nombre le plus grand possible et si possible inférieur à 330 (car cela correspond à une meilleure répartition dans les dilutions). Pour l’échantillon de sol le nombre significatif est 321 pour la dilution 10 -4. On lit la valeur correspondante n dans la table, on obtient un NPP de 15 La concentration de bactérie dans notre échantillon de sol est: -4

5

4

Nb bactérie = (n/10 )= 1.5 x 10 bactéries/mL de la dilution 10On départ on avait 53 mL dans lesquels on à prélevé 0.5 mL, ce qui correspond à : 5 7 (1.5 x 10 x 53)/0.5 = 1.59 10 bactéries/ml Dans nos 53ml de départ, il y avait 5g de terre humide soit 3.71g de terre sèche. Le nombre de bactérie par gramme de terre sèche est : 7 6 1.59 10 / 3.71 = 4.28 10 bactéries / gramme de terre sèche. 6 Notre échantillon de sol à une concentration en bactérie de 4.28 10 bactéries/ gramme de terre sèche.

21

2 Analyse microbiologique et dénombrement d’un échantillon de lait cru 1) Dilutions Nous avons préparé une gamme de dilution en NaCl 0.9% de 10 -1 à 10-4. Pour cela nous avons placé au préalable 4.5 mL de NaCl dans chaque tube. Nous avons homogénéiser l’échantillon de lait cru, prélever 0.5 mL et dilué dans le tube 1 (10 -1). Nous avons bien homogénéisé entre chaque prélèvement, et transvaser 0.5 mL du tube 1 vers le tube 2. Nous avons répété cette opération jusqu’au tube 4 (10-4) en réalisant une dilution en cascade de 10 en 10. 2) Enrichissement/sélection -2

-4

A partir des dilutions 10 à 10 , nous allons procéder à l’étape d’enrichissement sélection grâce à l’utilisation de milieux sélectifs. Pour cela nous allons inoculer 0.1 mL sur les milieux GN MA EMB, en utilisant trois boîtes par dilution. 3) Comptage sur boite Afin de dénombrer des microorganismes sur milieu solide, il faut considérer que chaque colonie ou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de l’étalement. Vue que certains microorganismes peuvent être pluricellulaire, on ne peut considérer que chaque clone provient d’une seule cellule originelle. On utilise donc le terme d’UFC (unité formant colonie) pour rapporter le résultat obtenu Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une boîte n’étant pas statistiquement fiable, seules les boîtes contenant entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes 4) Résultats Milieu MA (Sélection des champignons) Dilution

10-2

10-3

10-4

Boîte 1 Boîte 2 Boîte 3

164 180 198

20 8 11

0 0 12

Moyenne

181

13

4

Afin d’avoir un nombre statistiquement correct, on considère un nombre comptable entre 30 et 300 colonies. On prendra donc pour le calcul la dilution 10 -2 qui donne un nombre de 181 colonies. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : 2 4 N = 181 x 10 x 10 = 1.81 x 10 UFC/mL dans le lait cru. Ces germes correspondraient aux levures.

22

Milieu GN (développement non sélectif de la totalité de la flore) Dilution Boîte 1

10-2 inc

10-3 inc

10-4 276

Boîte 2 Boîte 3 Moyenne

inc inc inc

inc inc inc

262 300 280

-4

La dilution 10 donne un nombre de 280 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : 4 7 N = 280 x 10 x 10 = 2.8 x 10 bactéries/mL dans le lait cru. 7 Il y aurait donc 2.8 x 10 bactéries, toutes flores confondues, dans un mL de ce lait cru.

Milieu EMB (développement sélectif du genre Entérobactérie) Dilution Boîte 1

10-2 inc

10-3 444

10-4 Pb

Boîte 2 Boîte 3

inc inc

Pb Pb

Pb Pb

Moyenne

inc

444

Pb

-3

La dilution 10 donne un nombre de 444 UFC. Sachant que nous avons étalé 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par conséquent : 3 6 N = 444 x 10 x 10 = 4.44 x 10 bactéries/mL dans le lait cru. Ces germes correspondraient aux Entérobactéries.

23

Identification d’un bacille gram – oxydase – Réf : lait 2 Origine : lait Isolement à partir de EMB Vérification du genre Enterobacteriacea a) Négrosine La coloration à la nigrosine a pu mettre en évidence la forme bacillaire de la bactérie. b) Coloration de Gram On a observé des bacilles roses gram -. c) Encre de Chine La coloration à l’encre de chine n’a pas révélé la présence de capsule. d) Oxydase La bactérie ne possède pas l’oxydase. Tous ces tests confirment bien la présence d’une Entérobactérie Vérification du type fermentaire : Hugh et Leifson Les entérobactéries dégradent les oses, en particulier le glucose, par voie fermentaire en produisant des acides organiques. Pour mettre en évidence la fermentation d’un sucre, il suffit donc de rechercher la variation de pH du milieu grâce à un indicateur coloré. Grâce au milieu Hugh Leifson, nous allons étudier la voie d’attaque du glucose. Ce milieu, faiblement peptoné, contient du glucose à la concentration de 1% et du bleu de bromothymol comme indicateur de pH. Il est présenté en culot, du fait de sa consistance molle. Après régénération (élimination de l’O2 dissous par passage au bain marie) et refroidissement, on a ensemencé par piqûre centrale 2 tubes en parallèle : - un tube est recouvert d’huile minérale, il est dit fermé :F - l’autre est laissé au contact de l’air : il est dit ouvert :O Les résultats obtenus permettent de distinguer plusieurs catégories de bactéries. Bactéries acidifiant le milieu : - acidification dans les deux tubes : bactéries fermentatives. - acidification en surface dans le tube ouvert : bactéries oxydatives. Bactéries ne modifiant pas le pH du milieu : bactéries inactives.

«F»

«O »

Culture et virage au jaune en « O » et « F »

«F»

«O»

Culture et virage au jaune en surface dans « O » seul

24

«F»

«O»

Peu ou pas de culture en « F », culture en « O » mais pas de virage

Détermination de la sensibilité de la bactérie aux antibiotiques

1) Définition Antibiotique : C’est une substance chimique produite par un microorganisme qui est capable d’inhiber la croissance (bactériostase) ou de tuer (bactéricide) certaines bactéries. De nombreux antibiotiques sont susceptibles d’être obtenus par synthèse, de ce fait, la discrimination entre antiseptique et antibiotique repose essentiellement sur leur mode d’action : Un antibiotique est électif, dirigé uniquement contre les bactéries, agit rapidement et à faible dose. Alors qu’un antiseptique est global, détruisant à la fois les germes et les cellules vivantes. 2) Antibiotiques utilisés et leurs cibles Les agents antimicrobiens peuvent être classés en familles d’après leur origine, leur spectre d’action, leur mode d’action.

25

Durant ce Tp nous avons testé trois antibiotiques : - Tétracycline - Ampicilline - Pénicilline Ces trois antibiotiques ont des cibles différentes :  Antibiotiques inhibiteurs de la synthèse protéique : Différentes classes d'antibiotiques agissent en interférant avec la synthèse protéique bactérienne, et ce, au niveau de l'une des trois étapes principales de la traduction : - l'initiation - l'élongation - la terminaison Les ribosomes procaryotes présentent un coefficient de sédimentation de 70S (50S pour la sous-unité lourde et 30S pour la sous-unité légère). La sous-unité 50S comporte les ARN ribosomaux (ARNr) 5S et 23S alors que la sous-unité 30S intègre l'ARNr 16S (impliqué dans la reconnaissance de la séquence de Shine-Delgarno de l'ARN messager, aboutissant à l'initiation de la traduction). Les tétracyclines sont des antibiotiques isolés de souches de Streptomyces , et aujourd'hui obtenus par hémisynthèse. Les tétracyclines inhibent la synthèse protéique en empêchant la liaison de l'aminoacyl-ARNt à la sous unité 30 S du ribosome bactérien. Ce sont des composés bactériostatiques à très large spectre. Néanmoins, leur usage est aujourd'hui limité par l'émergence de résistances. Les tétracyclines doivent leur nom à leur structure tétracyclique commune (noyau naphtacène-carboxamide), sur laquelle viennent se greffer des substituants au niveau des positions indiquées par un astérisque dans la figure cidessous.

Tétracycline hydrochlorure (masse moléculaire : 480,9)

26

Les -Lactamines : Les -lactamines sont des inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne. Ces composés n'agissent donc que sur des bactéries se multipliant activement. Durant ce Tp, nous avons utilisé deux  lactamines : - La pénicilline - L’ampicilline

 La pénicilline appartient à la famille des lactamines. Lorsque les bactéries gram+ ou gramsont en croissance et traitées par des pénicillines, la synthèse de leur paroi est stoppée. On peut observer que les cellules s’accroissent mais que la paroi diminue progressivement. La pression osmotique augmente à l’intérieur de la cellule, qui finit par éclater. Au niveau du peptidoglycane les pénicillines empêchent l’incorporation des peptides dans les chaînes polysaccharidiques de la paroi. Il se forme alors un complexe non fonctionnel [peptidasepénicilline]. La pénicilline empêche la construction de la paroi en bloquant deux enzymes : Transpeptidases qui a pour rôle de faire rentrer les tétrapeptides Carboxypeptidase, qui décroche la 2ème D-Ala.

 L’ampicilline est aussi appelée aminopénicilline. Elle appartient également à la famille des  lactamines comme la pénicilline, et possède le même mode d’action. Elle arrête le processus de transpeptidation qui lie les peptidoglycannes de la paroi bactérienne. Les bêta lactamines se lient et inactivent des cibles enzymatiques situées sur la paroi interne de la membrane bactérienne: les protéines de liaison des pénicillines : transpeptidases, carboxypeptidases, endopeptidases. Les bêta lactamines inactivent également des inhibiteurs endogènes des autolysines bactériennes.

27

3) Antibiogramme par la méthode des disques L’antibiogramme est l’examen de pratique courante qui permet d’étudier commodément sur une souche bactérienne l’activité bactériostatique d’antibiotique choisi en fonction de leur spectre d’activité et d’apprécier les résistances acquises. Principe : La culture bactérienne est réalisée à la surface d’une gélose GN. Des disques préimprégnés d’une dose connue d’antibiotique sont déposés à la surface de la gélose. L’antibiotique diffuse horizontalement et verticalement à partir du disque en créant un gradient de concentration minima inhibitrice. Les caractères de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en seront déduits. La mesure du diamètre de la zone d’inhibition de la bactérie peut être reliée à la concentration de l’antibiotique à ce niveau : cette concentration est la concentration minima inhibitrice ou CMI de la souche pour cet antibiotique. Technique de l’antibiogramme : Les différentes étapes de la réalisation de l’antibiogramme sont standardisées ; Il y a l’ensemencement : on verse 0.2 mL à la surface du milieu qu’on réparti a l’aide d’un râteau ou de billes de verre. On laisse sécher les boîtes Ensuite nous appliquons les disques : Les disques ne doivent pas être trop près les uns des autres, et ils ne doivent pas être déplacés une fois posés. On veillera à ne pas les chauffer avec la pince flambée. Il faut en dernier lieu qu’il y ait prédiffusion avant d’incuber la boîte : on laisse les boîtes à température ambiante, puis on les incubent 18h à l’étuve à 37°C. Lectures et interprétation : Aux diamètres mesurés autour du disque, permettant l’estimation de la CMI, on peut associer les diamètres critiques eux-mêmes correspondant à deux concentrations critiques, concentration critique supérieure et concentration critique inférieure. La comparaison de la CMI aux deux concentrations critiques permet de déterminer le caractère sensible (S), intermédiaire (I) ou résistant R de la souche. La comparaison des diamètres permettra la même opération : - diamètre d’inhibition (correspondant à la CMI) > diamètre de la concentration critique inférieure  souche sensible S - diamètre d’inhibition < diamètre de la concentration critique supérieure : souche résistante - diamètre d’inhibition compris entre les deux diamètres des concentrations critiques : souche intermédiaire.  mm

CMI mg/L

Concentration critique inférieure

S

Concentration critique supérieure

28

I

R

Résultats :

Sigle de l’ATB

Nom de l’antibiotique

TE AM

Tétracycline Ampicilline

Diamètre d’inhibition (mm) 20 Pas de halo

P

Pénicilline

Pas de halo

Schéma explicatif pour la tétracycline :

19

17  mm

S

I

R CMI mg/L

4

8

29

Interprétation Par rapport au diamètre > 19

Interprétation CMI CMI < 4mg/L

Résultat S R R

4) Détermination de la CMI, méthode en tubes 4.1) Définition de la CMI La CMI est la concentration minimale inhibitrice. C’est, pour un temps donné d’application de l’antibiotique, la concentration la plus faible en antibiotique pour laquelle on n’observe aucune croissance (µ x= 0). 4.2) Principe de la détermination de la CMI Il consiste à placer dans un même inoculum de la souche à étudier (présentée en tubes), des concentrations croissantes d’antibiotiques selon une progression d’ordre 2 et en présence d’un témoin sans antibiotique. Les tubes sont incubés à 37 °C pendant 24 H la concentration du premier tube ne présentant pas de culture correspond à la CMI. 4.3) Schéma montrant la préparation de la galerie de dilution et l’ensemencement de dilution et l’ensemencement de la gamme Afin de déterminer la CMI (concentration minima inhibitrice), nous allons réaliser une gamme de dilution de l’antibiotique. On va donc préparer 10 tubes -

tube 2 à 9 contenant 5 mL de milieu BN Tube 1 contenant 10 mL de milieu BN Rien dans le tube 10

Dans le tube 1, nous allons rajouter de la tétracycline afin d’avoir une concentration finale de 150 µg/mL. Pour cela, on dispose d’une solution initiale à 10 mg/ml. CiVi = CfVf  Vi = (CfVf)/Vi Ci : concentration initiale en ATB : 10 mg/mL Cf : concentration finale en ATB 150 µg/mL Vf : volume du tube : 10 mL Vi : volume de solution mère à prélever -6

-3

Vi = (150.10 x 10) / (10.10 )= 0.15 mL soit 150 µL Il faudra donc introduire 150 µL de la solution mère d’antibiotique dans le tube 1 afin d’obtenir une concentration de150 µg/mL. Ensuite, il sera réalisé une dilution géométrique de raison 2 de l’antibiotique. Nous prélèverons après homogénéisation 5 mL du tube 1 que nous transvaserons dans le tube 2. Cette étape sera répétée jusqu’au tube 10.

30

Ce n’est qu’après dilution de l’antibiotique que nous allons incorporer la bactérie. Tube [ATB] µg/mL Résultat

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

150

75

37.5

18.75

9.375

4.6875

2.34375

1.171875

0.5859375

0.5859375

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

Absence de culture : Présence d’une culture : + La présence ou l’absence de culture se traduit par la présence ou non d’un trouble due à un développement bactérien.

-1

4.4) Lecture de la galerie (représentation, détermination de la CMI en µg.mL )

Témoin

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

Le tube contenant 18.75 µg/mL est le premier ne présentant pas de culture, pour notre souche la concentration minimale inhibitrice est de 18.75 µg/mL.

31

5) DETERMINATION DE LA CMB 5.1) Définition de la CMB La CMB est la concentration minimale bactéricide. C’est pour un temps donné la plus faible concentration pour laquelle le nombre de bactéries survivante est inférieur à 1/10 000 (ou 0,01%). 5.2) Schéma de la technique de détermination de la CMB Afin de déterminer la CMB : concentration minima bactéricide, nous allons étaler une goutte de nos tubes 1 à 6 qui ont servi à réaliser le test de la CMI. Afin de vérifier que lorsque il n’y a plus de trouble, cela signifie qu’il n’y a plus de culture et donc qu’on à atteint la CMB.

Incubation : 37 °C, 24 h. 5.3) Lecture : schéma de l’observation de la gélose

6 5 4 3 2 1

On observe une décroissance du nombre de bactérie d’un demi de 6 à 1, correspondant aux dilutions de l’antibiotique, mais en aucun cas il y a inhibition de la croissance traduisant un effet bactéricide de la part de l’antibiotique.

32

5.4) Résultat de la CMB La concentration minimale CMB est supérieure à 150 UI.mL -1. 6) Conclusion des deux résultats CMI et CMB trouvés La CMI est très inférieure à la CMB (CMI