Colorimetria e Espectrofotometria 2012

Método colorimétrico Método que utiliza a intensidade da cor  para  para determinar a concentração de um analito

A concentração é determinada pela quantidade de luz absorvida

Métodos colorimétricos Reações colorimétricas: colorimétricas: são aquelas em que os produtos finais têm uma cor  e as intensidades das cores são medidas na faixa visível do espectro (380nm - 680nm)

Sensação fisiológica associada a um comprimento de onda

A luz se propaga em ondas cujo comprimento define a cor da luz, variando de 400nm a 700 nm a região do espectro visível

Nossos olhos são capazes de distinguir as diferentes ondas de comprimento da luz visível como cores diferentes.. A onda mais longa que conseguimos ver é o vermelho, as mais curtas são azul e violeta.

 As diferentes cores que formam a luz branca podem ser vistas quando um raio de luz é refratado por um prisma.

O prisma reflete os comprimentos de onda em diferentes quantidades, e as dispersa em um espectro que pode ser visto. A refração é maior na luz vermelha e menor na violeta.

As substâncias emitem cores diferentes daquelas que elas absorvem As cores absorvidas e refletidas são ditas complementares

Se uma solução absorve energia luminosa de comprimentos de onda situados entre 400nm e 480nm (azul) ela aparece com cor amarela ao olho humano. Portanto o amarelo é a cor complementar do azul

Tabela  – Cores e cores complementares na zona visível do espectro Comp. de Onda (nm) • • • • • • • •

650 - 780 595 - 650 560 - 595 500 - 560 490 - 500 480 - 490 435 - 480 380 - 435

Cor Absorvida

Vermelho Laranja Amarelo-verde Verde Verde azulado Azul esverdeado Azul Violeta

Cor Complementar (ou observada)

Azul esverdeada Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde

 A maioria das análises bioquímicas realizadas no laboratório clínico baseia-se no princípio da quantidade de luz absorvida ou refletida

Espectrofotometria Metodologia que utiliza a luz (radiação eletromagnética) para medir a concentração química de um analito.

Espectrofotometria Capacidade de uma substância ou produto derivado de uma reação bioquímica absorver ou emitir luz, em um determinado comprimento de onda, sob condições físico-químicas estabelecidas

Leis de Lambert e Beer Lei de Lambert: Quando a concentração de um analito é constante, a absorção depende do comprimento do caminho óptico

Lei de Beer: Quando o caminho óptico é constante e igual a 1, a concentração do analito é diretamente proporcional à quantidade de luz absorvida

A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada:

A solução 20g/l absorve o dobro da solução 10g/l.

A absorbância é diretamente proporcional à concentração do composto na solução

O dispositivo utilizado para quantificar a energia de luz absorvida ou transmitida é o ESPECTROFOTÔMETRO

O ESPECTROFOTÔMETRO é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca).

Mas …que luz monocromática é esta? •

 A cor da luz absorvida é complementar à cor observada

Então … Temos que escolher o comprimento de onda da cor complementar à cor observada no produto corado

Escolha do Comprimento de onda Uma solução VERMELHA absorve o VERDE com maior intensidade e portanto deve-se escolher o comprimento de onda correspondente ao verde para medida da solução vermelha

Deve-se utilizar uma faixa no espectro na qual a E0 radiante seja absorvida ao máximo

Tabela  – Cores e cores complementares na zona visível do espectro Comp. de Onda (nm) • • • • • • • •

650 - 780 595 - 650 560 - 595 500 - 560 490 - 500 480 - 490 435 - 480 380 - 435

Cor Absorvida

Vermelho Laranja Amarelo-verde Verde Verde azulado Azul esverdeado Azul Violeta

Cor Complementar (ou observada)

Azul esverdeada Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde

Espectrofotômetro - Componentes • •

• •

Selecionador de comprimento de onda Cubeta para conter a solução a ser analisada Luz emitente ou fonte luminosa Receptor ou sistema fotométrico

Esquema dos principais componentes de um espectrofotômetro Compartimento para amostra Fonte de luz

•

•

Monocromador

Detector e dispositivo para leitura

A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de vidro por ter uma melhor dispersão. Os detectores devem ser altamente sensíveis.

Esquema dos principais componentes de um espectrofotômetro

Determinação da concentração de um analito

Reações colorimétricas: •

 Correspondem ao resultado da atuação de um ou mais reagentes sobre o analito para formar o produto corado.

Exemplo: Dosagem de glicose GLICOSE (soro) + Reagente de cor (KIT): tampão fosfato contendo p-Hidroxibenzoato, 4-Aminoantipirina (4-AAP), Glicose Oxidase e Peroxidase.

Processam-se as seguintes reações: •

Glicose + O2 + H2O GOD Ácido Glucônico + H2O2

•

2H2O2 + 4AAP POD 4-Antipirilquinonimina + 4 H2O

Produto formado é de coloração avermelhada

Mas … •

Como a intensidade da cor vai me dar a concentração da substância analisada?

Determinação da concentração de um analito A determinação é feita à partir da comparação da cor obtida no teste com uma SOLUÇÃO PADRÃO (da mesma substância) de concentração conhecida

Padrão de glicose Conc: 100mg/dl

Teste Conc glicose: ?

Determinação da concentração de um analito Padrão ou calibrador : substância de valor conhecido

Características da solução padrão • Ter estabilidade • Poder ser dissolvida em água e dessecada • Composição definida • Grau de pureza de 99% ou mais

Tabela 2 – Cores e cores complementares na zona visível do espectro Comp. de Onda (nm) • • • • • • • •

650 - 780 595 - 650 560 - 595 500 - 560 490 - 500 480 - 490 435 - 480 380 - 435

Cor Absorvida

Vermelho Laranja Amarelo-verde Verde Verde azulado Azul esverdeado Azul Violeta

Cor Complementar (ou observada)

Azul esverdeada Verde azulado Roxo Roxo-vermelho Vermelho Laranja Amarelo Amarelo-verde

A cor avermelhada (do produto formado) é medida no espectrofotômetro com absorção máxima no comprimento em 510nm

Determinação da concentração de um analito No espectrofotômetro eu obtenho a absorbância da solução padrão e do teste.  Abs Pa ---------------Concentração do Pa  Abs Teste ------------Concentração do Teste Conc Teste = Abs Teste x Conc Pa  Abs Pa

Determinação da concentração de um analito Cálculo do FATOR DE CALIBRAÇÃO (FC) Conc Teste = Abs Teste x Conc Pa  Abs Pa

FC = concentração Pa absorbância do Pa

Função do Fator de Calibração •

Obtendo-se o fator de calibração, multiplica-se seu valor pelas leituras de absorbâncias lidas pelo espectrofotômetro de cada amostra, chegando-se na medida em unidades ( mg/dL, g/L) do analito em questão.

EXEMPLO DOSAGEM DE GLICOSE EM PLASMA SANGUÍNEO PADRÃO: 100mg/dl Absorbância do padrão: 0,210 FATOR DE CALIBRAÇÃO: 100/0,210 = 833 ABSORBÂNCIA (ABS) DA AMOSTRA = 0,095

CONC. DA GLICOSE NA AMOSTRA = 0,095 x 833= 79mg/dl

Dosagem de glicose Passo a passo

Material necessário • • • • •

Espectrofotômetro Pipetas Tubos de vidro Suporte Kit de glicose

Metodologia

Identificação dos tubos •

•

•

Branco: usado para zerar o espectrofotômetro - normalmente água destilada ou o reagente puro (quando este tem cor) Padrão ou calibrador : substância de valor conhecido e estável Amostra teste: soro ou plasma do seu paciente

Leitura •  A

densidade ótica (DO) ou absorbância do padrão da glicose cuja concentração é 100 mg/dL foi: 0,347

•

Esta leitura será usada para extrair o cálculo do fator de calibração;

Leitura •  A

densidade ótica(DO) ou absorbância do teste de concentração desconhecida foi: 0,341

•

Esta leitura será usada para calcular a concentração da amostra teste a partir da multiplicação pelo fator de calibração;

Cálculo •

•

•

Fator de calibração= 100 mg/dl  Abs do padrão Fator = 100 mg/dl 0,347 Fator = 288

Cálculo •

Concentração do teste: 288 x 0,341= 98,2

Porém como o valor de referência da glicose é: VR: 70 a 99 mg/dl A concentração do teste será: 98 mg/dl

 Automação • • • • • •

Múltiplos testes; Pipetagem automática Rapidez Precisão Exatidão Controle de qualidade

Colorimetria/Espectrofotometria Utilização nas dosagens bioquímicas: Ex: glicose, uréia, creatinina, colesterol, triglicérides, enzimas, ferro sérico, etc

•

•

Hematologia: dosagem de hemoglobina

•

Sorologia: leitura final do método de ELISA

Vantagens Rapidez e facilidade das medidas •  Adequadas sensibilidade e especificidade •  Aparelhos de baixo custo • Boa adaptação para automação, com execução em larga escala. •

CAUSAS DE VARIAÇÕES DOS RESULTADOS DOS EXAMES LABORATORIAIS

Interferentes: Todo e qualquer fator que provoque ou favoreça a ocorrência de alteração no resultado de um exame qualquer (drogas, alimentos, exercício, etc).

Ação dos Interferentes FISIOLÓGICA Surgem alterações metabólicas cujo resultado é um aumento do analito doseado, podendo causar consequentemente dúvidas em sua interpretação Estresse Glicose; Dieta rica em proteínas Uréia Exercício: Triglicérides

Ação dos Interferentes Química  Alguns interferentes podem atuar sobre o reativo, provocando uma alteração na reação de doseamento que aumente ou diminua a leitura espectrofotométrica, conduzindo a um resultado errôneo. • •

Ingestão de ácido ascórbico: Glicose (GOD). Ingestão etanol: triglicérides, colesterol

Ação dos Interferentes Física Muitas vezes a turvação de um soro lipêmico pode induzir a leituras espectrofotométricas elevadas e por conseguinte, resultados elevados. Pode-se contornar o problema usando-se um branco da amostra.

Classificação dos interferentes FASE PRÉ-ANALÍTICA •Paciente •Coleta

da amostra

•Separação •Armazenamento

FASE ANALÍTICA •Processamento

da

amostra •Leitura espectrofotométrica •Cálculos •Emissão de resultados

FASE PÓS-ANALÍTICA •Avaliação

de

resultados •Elaboração do laudo •Entrega do laudo ao paciente

Fase pré-analítica Interferentes relacionados com o paciente: • Gravidez •  Atividade física • Postura • Dieta • Idade • Uso de drogas (terapêuticas ou de abuso) • Infusão de fármacos • Lipemia e jejum

Fase pré-analítica Interferentes relacionados com a coleta da amostra • • • •

 Aplicação de torniquete  Anticoagulantes Hemólise Separação e preparo da amostra (trocas, plasma em contato com hemácias, exposição direta da luz, etc)

Coleta de sangue

A diferença entre soro e plasma é que o primeiro não contém fibrinogênio, o qual foi utilizado para a formação do coágulo (fibrina).

 Anticoagulantes Substâncias que impedem a coagulação do sangue “in vitro “ • Anticoagulantes: •

EDTA (sequestra o Ca)

• Heparina

( atua impedindo a ação da trombina)

• Oxalatos

(removem o Ca)

• Citratos • Fluoreto

(captação de Ca) (inibidor enzimático, impedem a glicólise)

Tubos adequados

Tubos á vácuo •

Padronização da cor da tampa Vermelha  – Púrpura clara  – Verde  –  Azul  – Cinza  –  Amarela  –

nenhum anticoagulante EDTA-K3 heparina citrato de sódio fluoreto de Na Sem anticoagulante com gel

Considerações •

•

O exame de laboratório, apesar das similaridades, não pode ser considerado como um processo fabril Cada material, cada amostra e cada teste têm particularidades que exigem cuidado, atenção e conhecimento específicos