Cocos Gram Positivos

MICROBIOLOGIA CLÍNICA

COCOS GRAM POSITIVO Maria Céu Lamas 2013/2014

COCOS GRAM POSITIVO MICROCOCCACEAE

STREPTOCOCCACEAE

Staphylococcus Micrococcus

Streptococcus Enterococcus

Metabolismo respiratório respiratório e  e fermentativo facultativo. Produtores da Produtores  da enzima catalase.. catalase

Metabolismo exclusivamente fermentativo.. fermentativo NÃO produtores produtores da  da enzima catalase.. catalase

Permite avaliar a capacidade da bactéria catalisar a conversão do H do H2O2 em O2 + H2O, protegendo a bactéria dos efeitos tóxicos.

COCOS GRAM POSITIVO MICROCOCCACEAE Staphylococcus Micrococcus spp

Staphylococcus

Descrição do Género 

Cocos Gram + (0.5 + (0.5 – 1.5 µm de diâmetro).



Disposição em cachos (preferencial), cachos (preferencial), isolados, aos pares, em tétradas, em pequenas cadeias.



Anaeróbios facultativos. facultativos.



São catalase positiva. positiva. Oxidase negativa



Imóveis. (principalmente nas espécies isoladas no Homem)



Não formam esporos.



Não apresentam cápsula (visível ao m.o.), mas alguns são capsulados.



Fermentam a glucose

Staphylococcus spp

Descrição do Género 

Cresce facilmente em: 

Meios ordinários (são (são nutricionalmente pouco exigentes), exigentes ),



Meios salgados (Manitol salgados (Manitol Salgado, Chapman). Capazes de crescer em concentrações de NaCl (7-10%)



Meios líquidos (2-4 horas)



Toleram temperaturas temperaturas de 18-40ºC (t.o. 35-37ºC).



pH óptimo de 7.5, tolerando grandes variações.

Staphylococcus spp

Habitat Este género existe abundantemente na natureza, encontrando-se principalmente na pele e mucosas dos mamíferos e mamíferos  e aves. No Homem, Homem, pode encontrar-se à superfície da pele e nas fossas nasais,, locais que estão na origem nasais de infeções endógenas e exógenas, tendo como veículo de transmissão as mãos.

Staphylococcus spp

Significado Clínico Do ponto de vista clínico apenas duas espécies são reconhecidas como agentes patogénicos primários:  

Staphylococcus aureus Staphylococcus saprophyticus saprophyticus

Existem outros classificados como oportunistas:   

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus hominis Staphylococcus haemolyticus

Todos os restante são ocasionalmente oportunistas e de potencialidade discutível para o Homem.

Algumas espécies de Staphylococcus são frequentemente agentes etiológicos de infeção.

Staphylococcus spp

Significado Clínico 

Neste género, a espécie S. aureus  é a causa mais frequente de S. infeção no Homem. Juntamente com o S. saprophyticus e epidermidis formam o conjunto das 3 espécies clinicamente mais importantes.



Os Staphylococcus  coagulase negativo, negativo, apesar de apresentarem baixa patogenicidade para o Homem, são cada vez mais valorizados como agentes oportunistas de infeção.

Coagulase

A presença desta enzima indica patogenicidade; na presença de plasma, os produtores produtores de coagulase (como o Staphylococcus aureus) vão desencadear os mecanismos da coagulação.

Staphylococcus aureus Fatores de Virulência TOXINAS α-lisina

β –lisina

γ –lisina δ -lisina

Leucocidina Toxina A e B Toxina TSST-1

MODO DE ACÇÃO Hemolisina, leucocidina e citotoxina. citotoxina. Danifica as membranas celulares, possivelmente por acção proteolítica. Hemolisina e leucocidina. leucocidina. A toxina é uma enzima que destrói um fosfolípideo dos GR e outras células. Hemolisina e leucocidina. leucocidina. Mecanismo de acção desconhecido. Hemolisina e leucocidina. leucocidina. Destruição das membranas celulares por acção semelhante a detergente. Atua sobre os leucócitos. leucócitos. Principalmente neutrófilos activos na activos na fagocitose. Também activa contra macrófagos macrófagos presentes  presentes nos tecidos. Especificidade de ação sobre a pele. pele. Responsável pelas lesões cutâneas bulhosas (síndrome da pele escaldada). Associada ao síndrome do choque tóxico. tóxico. Responsável Responsável pelos sintomas de intoxicação alimentar. alimentar.

Enterotoxinas

Várias toxinas: A, B, C, D, E, G, H…, resistentes ao calor e ác.

Staphylococcus aureus Fatores de Virulência ENZIMAS Catalase Coagulase Livre e Conjugada (clumping factor)

Fibrinolisina Lipase Hialoronidase DNAse Β-lactamase

MODO DE ACÇÃO Enzima que catalisa a conversão do peróxido de hidrogénio em água e O2. Todos os Staph. a produzem, protegendo-se deste produto tóxico que se acumula durante o metabolismo bacteriano (libertado após a fagocitose). Causa a coagulação do plasma citratado, citratado, heparinizado ou oxalatado do Homem e do coelho em algumas horas. O S. aureus produz durante a fase exponencial de crescimento. (Estafiloquinase). Pode dissolver coágulos de fibrina. fibrina. Não está claro o seu contributo para a virulência. Acredita-se que seja necessária à invasão dos tecidos cutâneos e subcutâneos – catalisam a quebra de ác. gordos e lipídeos na pele, secreções sebáceas. Os S. aureus são geralmente produtores. produtores. Enzima termolábil que favorece a disseminação dos Staph. no tecido conjuntivo. conjuntivo. 90% são produtores. Enzima que destrói o DNA. DNA. Destrói a penicilina, penicilina, surgindo as bactérias meticilinoresistentes (MRSA) resistentes  (MRSA)

Staphylococcus aureus Fatores de Virulência OUTROS Cápsula Peptidoglicano

  r   a    l   u    l   e    C

MODO DE AÇÃO  Antifagocitose. É imunogénico. Possui toxicidade direta e capacidade de ativar o complemento por via alternativa. alternativa .

Característica do S. aureus. Possui grande afinidade para a Proteína A ligação ao receptor Fc das IgG1, IgG2 e IgG4.

 A sua produção depende das das condições de cultura. Os meios ricos em extracto de carne e desprovidos de sal são os mais favoráveis.   e    d Ácido teicóico É responsável pela carga electronegativa da superfície celular.   e   r   a Intervém na adsorção dos fagos. Parece pouco tóxico, mas    P desencadeia uma hipersensibilidade retardada. Medeia a fixação das bactérias à superficie das mucosas. Virulência. Atg p13 e p17

Adesinas

 Adesão a recetores específicos.

Staphylococcus aureus

Fatores de Virulência (Proteína A)

Staphylococcus aureus

Factores de Virulência (Resumo)

Doenças causadas por Staphylococcus aureus INFEÇÕES PIOGÉNICAS (Produtoras de PÚS) Furúnculos e foliculites Feridas e queimaduras infetadas

INFECÇÕES MEDIADAS POR TOXINAS Intoxicação alimentar (relacionada com carnes frias, sorvetes, etc.)

Abcessos Impétigo

Síndrome do choque tóxico

Pneumonia Osteomielite Bacteriemia Endocardite

Síndrome da pele escaldada (mais frequente em bébés e imunodeprimidos)

Doenças causadas por Staphylococcus S. Aureus 1.

As infecções mais frequentes são ligeiras e localizadas na pele e tecido celular subcutâneo, subcutâneo , onde o S. aureus provoca:     

Impetigo Furúnculo Celulite Abcessos Infeções de queimaduras e feridas

FURÚNCULO

FULICOLITE

O furúnculo (coleção de pus) que se forma sob a pele quando uma bactéria infeta um folículo piloso. Ao contrário da foliculite (infeção localizada e restrita ao folículo f olículo piloso), o furúnculo

IMPETIGO

Impetigo contagioso de pequenas vesículas

IMPETIGO BOLHOSO O impetigo bolhoso é bolhoso é causado por bactérias do tipo Staphylococcus aureus.

Caracteriza-se pelo aparecimento de bolhas grandes e frágeis com paredes muito finas que se rompem deixando uma base avermelhada, inflamada e húmida. Pode afetar diversas regiões do corpo, e tal como no impetigo comum não costuma causar dor. dor. No impetigo imp etigo bolhoso podem surgir sintomas como febre, mal-estar e perda de apetite.

Doenças causadas por Staphylococcus

S. aureus

2.

Ocasionalmente, Ocasionalmente, a partir desta infeções i nfeções ou de locais da pele ou mucosas colonizadas pela bactéria, pode ocorrer disseminação direta para tecidos vizinhos. vizinhos .

3.

Pode também ocorrer bacteriemia bacteriemia,, com possíveis localizações secundárias (qualquer local), surgindo por vezes infeções graves:      

Endocardites Osteomielites Artrites Pneumonias Septicemias Infeções relacionadas com cateteres e próteses

Staphylococcus aureus Doenças por ação das toxinas 1. INTOXICAÇÃO ALIMENTAR 

Várias enterotoxinas, em que a “A” parece ser a mais



Os sintomas iniciais surgem 4h após a ingestão de alimentos contaminados e desaparecem desaparecem nas primeiras 24h:

importante clinicamente.

   

Nauseas Vómitos intensos Dores abdominais Diarreia

Staphylococcus aureus Doenças por ação das toxinas 2.

SÍNDROME DA PELE ESCALDADA ou ESCALDADA ou Doença de Ritter 

Resulta da ação das exfoliatinas (toxinas A e B = epidermolíticas).



Inicialmente ocorre uma infeção estafilocócica cutânea ou respiratória superior. A partir de uma destas infeções dá-se a disseminação da toxina por via sanguínea.



Doença caracterizada por eritema eritema que  que rapidamente se estende por todo o corpo. Seguem-se as lesões bulhosas cutâneas de várias dimensões (contendo dimensões (contendo líquido límpido, livre de bactérias e leucócitos). Finalmente, ocorre a descamação da epiderme superficial.

SÍNDROME DA PELE ESCALDADA ou Doença de Ritter

Staphylococcus aureus Doenças por ação das toxinas 3.

SÍNDROME DO CHOQUE TÓXICO 

Resulta da acção da TSST-1 (Toxic Shock Syndrome

Toxin-1).



Inicia-se por erupção cutânea eritematosa macular, febre e hipotensão.



Após 1-2 semanas segue-se descamação de toda a superfície cutânea (incluindo palma das mãos e planta dos pés).



Paralelamente, existem efeitos sistémicos:      

Tubo digestivo Hepático Renal Hematológico Muscular SNC

OUTROS Staphylococcus Existem pelo menos 30 espécies 



 S. aureus

 S. Coagulase negativa           

S. epidermidis S. saprophyticus S. haemolyticus S. hominis S. capitis S. warneri S auricularis S. simulans S. cohni S. lugdunensis .....................

S. saprophyticus 

É um agente frequente de infeções do trato urinário em mulheres jovens, por via ascendente. (atividade sexual presumível fator predisponente)



Existe em nº reduzido na pele, mucosas e intestino.



Fatores de virulência:    



Capacidade de aderência as células epiteliais da bexiga. Estruturas que reconhecem e se ligam a recetores específicos das células vesicais. Atg proteico p51. Urease.

Laboratorialmente, observam-se no sedimento urinário numerosos cocos e piúria intensa. Por vezes hematúria.

S. saprophyticus 

É um agente frequente de infeções do trato urinário em mulheres jovens, jovens, por via ascendente. (atividade sexual presumível fator predisponente)



Existe em nº reduzido na pele, mucosas e intestino.



Fatores de virulência:   



Capacidade de aderência as células epiteliais da bexiga. Atg proteico p51. Urease.

Laboratorialmente, observam-se no sedimento urinário numerosos cocos e piúria intensa. Por vezes hematúria.

Facultative Facultative anaerobe Normal flora-opportunistic flora-opportunistic pathogen White, opaque Coagulase negative

S. epidermidis A Staphylococcus aureus biofilm found on the surface of a catheter



Agente patogénico importante, particularmente em contexto hospitalar.



Bactéria abundante na pele normal, podendo ser patogénico em situações de debilidade imunológica do hospedeiro. A disseminação pode ser por contacto direto, mas a flora do ind. i nd. constitui a principal fonte de infeção – quando o hospedeiro está debilitado.



O principal factor de virulência é virulência é a capacidade de aderência a materiais sintéticos, através da produção de slime que o protege do sistema imunológico (quimiotaxia e fagocitose) e da ação dos antibióticos. 

O slime apenas é produzido quando estão presentes corpos estranhos.

S. epidermidis O slime apenas é produzido quando estão presentes corpos estranhos.

A Staphylococcus aureus biofilm found on the surface of a catheter

S. epidermidis As doenças que ocorrem mais frequentemente frequentemente são as infeções relacionadas com a presença de corpos estranhos    

 

cateteres, próteses, enxertos vasculares e estados de imunossupressão.

Endocardites Sepsis

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial 

Colheita de produtos biológicos      

Direta do pús (evitar pús (evitar a zaragatoa, pois absorve muito pús, risco). Urina (jato médio) – para diagnosticar cistite ou pielonefrite. Sangue – na bacteriemia, endocardite, choque sético, etc. Fezes ou vómitos – intoxicação alimentar Expetoração – doença respiratória. Zaragatoas nasais – despite de portadores sãos.

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial 

EXAME DIRETO 



Coloração de Gram

EXAME CULTURAL (pouco CULTURAL (pouco exigentes) Amostras provenientes de locais com flora mista devem ser  semeadas em meios seletivos:  



Manitol salgado ou Chapman Em gelose chocolate - Gelose com colistina e ác. nalidíxico (Columbia ANC)



Em gelose sangue, verifica-se por vezes hemólise vezes hemólise (conforme espécie).



Caldos: brain-heart infusion

Prova da Catalase

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial EXAME CULTURAL Meio de Manitol Salgado ou Meio de Chapman 

Manitol salgado o o o

Meio seletivo e diferencial Diferencia o S. aureus de outros Staphylococcus. Após crescimento, o  S. aureus apresenta colónias amarelas (fermentação do manitol) e os restantes apresentam colónias brancas.

Meio de Chapman

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial Meio de Manitol Salgado (Manitol Salt Agar) 

É uma formulação concebida por Chapman para a diferenciação de estafilococos



É utilizado para o isolamento de estafilococos provenientes de amostras clínicas,de cosméticos e nos testes de limite microbiano.



REAGENTES (Fórmula/ (Fórmula/ Litro de Água Purificada)        

Extrato de bovino 1,0 g Hidrolisado pancreático de caseína 5,0 g Hidrolisado péptico de tecido animal 5,0 g Cloreto de sódio 75,0 g D-Manitol 10,0 g Vermelho de Fenol 0,025 g Ágar 15,0 g pH 7,4 0,2

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial Contém: Peptonas e extrato de bovino • que fornecem nutrientes essenciais

Cloreto de sódio • a uma concentração de 7,5% resulta numa inibição parcial ou completa c ompleta de outros organismos

bacterianos que não os estafilococos.

Manitol • a fermentação do manitol, conforme indicada por uma alteração a lteração no indicador vermelho de fenol,

ajuda na diferenciação das espécies de estafilococos. Os estafilococos com resultados positivos para a coagulase (por exemplo, S. aureus) produzem colónias amarelas e um meio amarelo circundante enquanto que os estafilococos com resultados negativos para a coagulase produzem colónias brancas e nenhuma alteração na cor do indicador vermelho de fenol.

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial Meio de Manitol Salgado (Manitol Salt Agar) 

Procedimento do teste 

Semear (espalhar) a amostra imediatamente após esta ser recebida no laboratório. A placa para cultura é usada principalmente para isolar culturas puras a partir de amostras com flora mista.



Se o material biológico estiver a ser cultivado diretamente de uma zaragatoa, fazer rolar a zaragatoa sobre uma pequena área da superfície, na extremidade e espalhar a partir desta área inoculada.



Também deve ser inoculado um meio não seletivo, como é o caso do Agar de Columbia com sangue de ovino a 5%, para fornecer uma indicação dos outros organismos presentes na amostra.



Incubar as placas durante 24 a 48 h a uma temperatura de 35 atmosfera aeróbia.

2 C numa

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial Meio de Manitol Salgado (Manitol Salt Agar)

Várias espécies de Staphylococcus para além da S. aureus têm resultados positivos para o manitol e produzem colónias amarelas circundadas por zonas amarelas neste meio (p. ex., S. capitis, S. xylosus, S. cohnii, S. sciuri, S. simulans e outras espécies). Por este motivo, é necessário realizar outros testes bioquímicos para a identificação de S. aureus ou de outras espécies.

Em meio sólido, as colónias apresentam-se apresentam-se lisas, redondas, ligeiramente convexas, brilhantes e opacas. A maioria das estirpes produz um pigmento amarelo dourado dourado (amarelo citrino) não difusível no meio. Outras espécies apresentam colónias brancas.

Manitol (+)

Manitol (-)

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial EXAME CULTURAL Ágar Columbia CNA 

É um meio de cultura cul tura seletivo usado pra isolamento de cocos gram-positivos como Staphylococcus spp. e Streptococcus spp.



Contém peptonas obtidas por hidrólise enzimática a partir de caseína e soja. Neste meio desenvolvem-se várias bactérias e os antibióticos colistina e ácido nalidíxico impedem o crescimento de bacilos Gram negativo.

Amostra As amostras de secreções, quando não inoculadas imediatamente após recolha, devem ser transportadas em meios – Amies ou Stuart. As amostras devem ser colhidas seguindo cuidados específicos de forma a se obter representatividade do processo infeccioso, assepsia na recolha da amostra e sem interações medicamentosas. medicamentosas. Em casos extremos, em que não se pode realizar o inóculo imediato, a amostra deve ser conservada sob refrigeração. refrigeração.

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial EXAME CULTURAL (pouco CULTURAL (pouco exigentes) 

Em gelose chocolate

Meio rico e não seletivo.

Permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá suporte também ao crescimento dos microaerófilos.

À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que os eritrócitos sejam lisados, libertando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos. Pode-se observar halos esverdeados com colónias alfahemolíticas

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial EXAME CULTURAL (pouco CULTURAL (pouco exigentes) 

Em gelose sangue, verifica-se por vezes hemólise. vezes hemólise.

S. aureus 

Caldos: brain-heart infusion

S. epidermidis

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial Estudo do Poder Patogénico: 

Prova da coagulase: Em tubo (coagulase livre)

Em lâmina (coagulase conjugada)

Clumping factor 

componente da parede celular dos Staphylococcus aureus

que permite a ligação ao fibrinogénio e formar agregados que dificultam

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial 

Teste da Desoxirribonuclease (DNase) Deteta a degradação do DNA, presente no meio de cultura, pela enzima desoxirribonuclease produzida pelo S. aureus. Tem a vantagem de poder inocular várias espécies numa única placa. Existem três versões comerciais do meio. Dnase Test Agar Positivo: área Positivo: área clara ao redor da colónia após a adição de HCl 1N. Negativo: não Negativo: não há formação de área clara e um precipitado forma-se ao redor da colónia. DNase Test Agar com Verde de Metila Positivo: formação de uma zona clara ao redor da colónia em contraste com a cor do meio. Negativo: a Negativo: a cor do meio mantém-se inalterada. Dnase Test Agar com Azul de Toluidina Positivo: formação de um halo cor-de-rosa ao redor da colónia. Negativo: o Negativo: o meio ao redor da colónia mantém-se inalterada.

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial 

Pesquisa de hemolisinas Sementeira em Gelose de sangue: β-hemólise



Proteína A Ex: Staphaurex

Diagnóstico Laboratorial dos Staphylococcus coagulase negativo 

Teste de suscetibilidade à Novobiocina

S. epidermidis (+)

Propriedades que ajudam a distinguir as espécies de Staphylococcus

*Coagulase has a prothrombin-like activity which,through the conversion of

fibrinogen to fibrin, results in the clotting of blood plasma.

Diferenciação espécies Staphylococcus S. aureus

S. epidermidis

S. saprophyticus

Amarelabranca +

Branca

Branca

+/-

-

Crescimento anaeróbio Coagulase

+

+

+/-

+

-

-

Fermentação glicose Fermentação manitol Endonuclease (DNASE) Proteína A

+

+

+

-

-

+

-

-

+

-

-

suscetível

suscetível

resistente

Cor colónia Hemólise

Novobiocina

Staphylococcus Diagnóstico Laboratorial 

Sistemas de Identificação da espécie (provas bioquímicas).



Antibiograma



Ativos: Penicilinas, cefalosporinas e carbapenemos aminoglicosídeos, tetraciclinas, macrólidos, lincosamidas, fluoroquinolonas, rifampicina, trimetropim, cloranfenicol, vancomicina…



Inativos: Polimixinas, Inativos: Polimixinas, nitrofuranos, nitroimidazóis, 1ª quinilonas, temocilina, Aztreoname e meciliname.

Antimicrobianos Antimicrobianos de Eleição 

Hospitais sem MRSA 



Hospitais com MRSA 



Penicilinas resistentes às β-lactamases

Vancomicina ou teicoplanina

Estado portador nasal 

Mupirocina tópica

Mecanismos de resistência 

Alteração das PBP2 (proteínas de ligação à penicilina) MRSA

–



alteração gene mecA



resistentes a todos os β-lactâmicos disponíveis, mesmo os resistentes às β-lactamases



normalmente só suscetíveis à vancomicina e à teicoplanina

Controlo de surtos MRSA+

Afastamento do pessoal

Controlo de surtos MRSA+ Isolamento dos doentes

Afastamento do pessoal

Descontaminação do pessoal

COCOS GRAM POSITIVO MICROCOCCACEAE Staphylococcus Micrococcus

Micrococcus 

São agentes da população microbiana normal da pele, mucosa e orofaringe.



Mecanismos de virulência não são conhecidos, portanto, são aparentemente inofensivos inofensivos e raramente implicados em doença; doença; quando são isolados temos de saber se devemos ou não valorizar, valorizar , o que depende do contexto clínico. clínico .



São microrganismos que existem na vida livre, no ambiente, ao contrário dos Staphylococcus.



As colónias são muito coloridas – amarelas, laranjas ou vermelhas – têm muito pigmento, o que não acontece com os Staphylococcus