Clasifiacion de Las Enzimas IUPAC

 

24-08-2009

Conceptos básicos 

Defi De fini nici ción ón de en enz zim imas as 

Fuen Fu ente tes s de en enzim zimas as



Cam Ca mpo pos s de ap aplic licac ación ión en enzim zimas as



Clas Cl asif ific icac ació ión n de la las s en enz zim imas as



Cinética Ciné tica enz enzimáti imática ca 

Sitio Sit io ac activ tivo o y ac activ tivida idad d en enzim zimát ática ica



Parámetros Parám etros cinético cinéticos s



Inhibición enzim enzimática ática

Enzimas

1

 

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Qué son la enzimas 

Las enz nzim ima as son proteínas qu que e cat ata ali liza zan n la las s rea eac ccio ione nes s



bioquímicas. Estru Es tructu ctura ra 3aria o 4aria



Las La s en enzim zimas as so son n CA CATA TALI LIZA ZADO DORE RES S OR ORGA GANI NICO COS S



Intervienen en una gran cantidad de reacciones del met etab abol olis ism mo de cé célu lula las, s, te tejjid idos os y ór órga gano nos s



Catalizan reacciones químicas necesarias para la sobrevivencia celular: metabolismo de los hidratos de carb ca rbon ono, o, pr prot oteí eína nas, s, aa, líp lípido idos, s, ác ácido idos s nu nucle cleico icos, s, et etc. c.



Las enzim ima as pueden actuar dentro de la célula la,, fuera de ésta y en el tubo de ensayo

Función Fun ción bioló biológica gica

Las enzimas catalizan la reacción bajando la energía requerida para pasar de sustrato a producto

REACCION NO CATALIZADA El agua no es capaz de pasar sobre la montaña

ENERGIA DE ACTIVACIÓN REACCION CATALIZADA: Las olas pasan sobre la montaña

2

2  

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Sin enzima Con enzima

E+S

•

•

E+P Tiempo de la reacción

La Ea de la hidrólisis de la urea baja de 30 a 11 kcal/mol con la acción de las enzimas, acel aceler eran ando do la re reac acci ción ón 1014 x El aumento de temperatura necesario para producir la reacció ión n no cataliz iza ada seria de

529ºC

Algunos aumentos de actividad producidos por el uso de enzimas

3  

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Enzima vs Catalizador  





Tanto la enzima como el catalizador cat alizador aceleran la velocidad de una reacción química. Una enzima puede transformar 1000 moléculas de sustrato/ segundo Las enzimas tienen 3 propiedades prop iedades que los catalizadores NO tienen: 

Especificidad por el sustrato



Se inactivan por desnaturación



Pueden ser reguladas

FUENTES DE ENZIMAS 

Las enzimas pueden ser de origen vegetal, animal y microbiana. 





Entre Entr e la las s en enzi zima mas s de tip ipo o ve vege geta tal, l, se en encu cuen entr tran an la las s pr prot otea eas sas as,, carb ca rboh ohid idra ras sas ( la las s cu cual ales es de des sco comp mpon onen en re res sid iduo uos s de az azúc úcar ares es de carbohid idrratos superio iorres, ami mila las sas y -ami mila las sa Entr tre e la las s enzima mas s de ti tip po ani nima mall está tán n la las s este tera ras sa ( Lip ipa asa se produce en la mu muc cosa gástrica, el páncreas, fo fos sfo fottasas: Se obtiene de tejidos animales óseo, muscular, tripsina y quimo qu imotr trips ipsin ina a se pr prod oduc uce e en el pá pánc ncre reas as ) Las enzimas del tipo microbiano provienen de bacterias, arqu ar quea eas s y de ho hong ngos os..

4  

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Uso industrial de las enzimas Química fina y farmacéutica  Química de alimentos 



Química analítica



Descontaminación



Nuevas fuentes de energía

Enzimas en la industria de alimentos 

modificación química, selectiva, especifica  hidrólisis de almidón ---- jarabe de fructosa  

hidrólisis de lactosa en leche producción de quesos (hidról (hidrólisis isis de k-caseína )



hidrólisis de glicosil derivados ( aromas en vinos vi nos )



modificación de grasa y aceites ( interesterificacion ) mejora de procesos de extracción ( aceites )



aprovechamiento de residuos agrícolas



producción de aditivos alimentarios



liberación de productos de alto valor añadido ( glicosidasas ) análisis de de alimentos - biosens biosensores ores ( electrodos enzimáticos) enzimáticos)





5  

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Clasificación de las enzimas

Comisión de de Enzimas E nzimas (EC) (EC) de la IUPAC I UPAC  Se basa en el tipo de reacción que catalizan 



Comprende cuatro dígitos y un nombre complejo

6  

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 Nombre  Nomb re sistemático: sistemático:

Grupo transferido

ATP: hexosa fosfotransferasa fos fotransferasa  Donador

Aceptor 

Tipo de reacción reacción catalizada

 Número  Núm ero EC   EC   Enzyme Comission

EC 2.7.1.1 Grupo

 

Subgrupo

 Nombre común  Nombre común (sustrato+”asa”):

Hexokinasa

Clasificación de enzimas por Grupos

EC 1.x EC 2.x EC 3.x EC 4.x EC 5.x EC 6.x

Oxidorreductasas Transferas ransferasas as Hidrolasas Liasas Isomerasas Ligasas

7  

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Grupo 1: Oxidorreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción, en que átomos de oxigeno eno ó hidrogeno eno son traslad sladaados entre moléculas:

Ared + Box

Aox + Bred

AH2 + B

A + BH2

En las reacciones redox, siempre tienen que estar presentes a la vez el aceptor y el dador electrónico.

Grupo 2: Transferasas Catalizan reacciones de transferencia de átomos ó grupo de átomos entre moléculas:

A-X + B

A + B-X

Dador: Ace Aceptor ptor Grupo transferido - transferasa ATP: D-Hexosa Fosfotransferasa  Nombre  Nomb re común: hexoki hexokinasa nasa

EC 2.7.1.1

8  

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Grupo 3: Hidrolasas Catalizan reacciones de hidrólisis y también su reverso. Son las más comunes en el dominio de la tecnología enzimática:

A-B + H2O

A-OH + H-B

 No se suelen suelen ut util iliza izarr nomb nombres res sistem sistemáticos áticos en llas as hidrolas hidrolasas. as. Muchas de ellas conservan el nombre Primitivo. Ejemplo: Quimosina EC 3.4.23.4.

Grupo 4: Liasas Catalizan reacciones reversibles de remoción de grupo de átomos del sustrato (este grupo no incluye las hidrolasas):

A-B

A+ B

Ejemplo  Nombre sistemático: sistemático: Histidina amonio-liasa (EC 4.3.1.3)  Nombre común: común: Histidasa

9  

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Grupo 5: Isomerasas Catalizan reacciones de isomerización moleculares

A

B

Ejemplo: Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5)

Grupo 6: Ligasas Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensas de la hidrólisis de un nucleót nucleótido ido ttrifosfato rifosfato (A (ATP TP,, GTP GTP,, et etc.). c.).

A + B + ATP

A-B + ADP + Pi

Ejemplo: Glutationa sintasa (EC 6.2.2.3)  Nombre sistém sistémico: ico: G-L-glutamilo-L-cisteina:glicina ligase

10  

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Cinética de las reacciones enzimáticas

Cinética Enzimática 



Es el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los fact factor ores es qu que e in inte terv rvie iene nen n en la ac acti tivi vidad dad en enzi zimá mátic ticaa, que se evalúa lúa a través de la vel eloc ocid idad ad de la re reac acci ción ón ca cata tali liza zada da. Las La s va varia riable bles s más im impo port rtan ante tes s so son: n: •

Concentració ión n de enzim ima a, sustra rattos y productos (incluye (inc luyendo ndo inhib inhibidor idores es y/o act activad ivadores ores))

•

pH

•

Temperatura

11  

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







Las enzimas se unen a los reactivos reacti vos (sustratos) (sustratos) Cada enzima tiene una forma única con un siti tio o o centr tro o activo en el que se une al sustrato Despué pués de la reacción, ón, enzim zimas y prod produc ucto toss se sepa separa ran. n. Las moléculas enzimáticas no han cambiado después de part pa rtic icip ipar ar en la reac reacci ción ón

La unión del sustrato es muy específica: 



Complementariedad geométrica Complementariedad de cargas, uniones iónicas

Modelos:  Llave  – cerradura. 

Encaj En cajee induci inducido do

12  

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Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica, de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.

Substrato

Enzima

Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración en su estructura por el hecho físico de la unión.

Substrato

Enzima

13  

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Enzima + sustratos

Una enzima puede unir más de un sustra ratto en su sit itio io activo

ADP COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO

Enzima + productos

Baja concentración de s ustrato ustrato

 ALTA LTA  A concentración de s ustrato ustrato ATUR UR A C IO ION  N   S AT

PEP

ATP

PIRUVATO

14  

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Medición de la velocidad de reacción enzimática

Sustrato(s)

v

[ ]

Enzima

Producto(p)

dp

ds

dt 

dt 

d[P] ,t v= dt

0

 p

s t 

15  

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Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hay un número limitado de sitios en la enzima para fijar substrato; una vez que están ocupados todos, por mucho que aumente la concentración de substrato, substrato, la velocidad permanecerá constante tendiendo a un valor asintótico

Mich Mi chael aelis is-M -Mente enten n y Esta Estado do estac estaciiona onari rio o

   )   v    (   n    ó    i   c   c   a   e   r   a    l

  e    d    d   a    d    i   c   o    l   e    V

Vmax

Vmax/2

Km

Concentración de Sustrato [S]

v=

Vmax * s K m + s

16  

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Significado de la constante K m 1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES (en condiciones de equilibrio rápido) 2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato (en condiciones de equilibrio rápido) 3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido) 4. Concentración de substrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad de la máxima (s0.5) 5. Se define para una pareja enzima-substrato 6. Se mide en unidades de concentración

Significado de la constante Vmax = k +2 e0

1. Velocidad asintótica para s 2. Directamente Directamente proporcional a la concentración de enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k +2) 3. Mide función función de transformación transformación catalítica

4. Se expresa en unidades de velocidad

17  

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   )   v    (   n    ó    i   c   c   a   e   r   a    l

  e    d    d   a    d    i   c   o    l   e    V

Vmax

Vmax/2

Km

Concentración de Sustrato [S]

 A mayor Km, Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato  A menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato

18  

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Representación directa

v

Vma max x

100

80

60

Vmx s

v

 Km

40

s

20

s 0 0

20

40

60

80

100

K m

Representación recíproca doble (Lineweaver - Burk) 0.04

1/v 0.03

1/Vmax -1/K m

0.02

0.01

1

 K m

v

Vmx s

0.00 -0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

1/s

1

1

V mx

19  

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linealización zación para determinación Métodos de lineali parámetros cinéticos

Método

Eje Y

Eje X

Intercepto

Intercepto

Eje Y

Eje x

Pendiente

LineweaverBurke

1/v

1/s

1/V

-1/K

K/V

Hanes

s/v

s

K/V

-K

1/V

v

v/s

V

V/K

-K

EadieHofstee

 Actividad Enzimática  Actividad Enzimática

a

vt 

0

dp dt 

t 

0

ds dt 

t 

0

20  

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

 Así esta actividad corresponde al máximo máximo potencial catalítico que las enzimas poseen para un determinado conjunto de condiciones condic iones ambientales. ambientales.



Existen situaciones (sustratos heterogéneos) donde la velocidad inicial de reacción no es representativa del real pote po tenc ncia iall ca cata talí líti tico co de la en enzi zim ma.



Se asume que la velocidad inicial de reacción pr prop opor orcio ciona nall a la co conc ncen entra tració ción n de pr prot oteí eína na enzim enzimát ática ica..



Activ Ac tivida idad d en enzi zimát mática ica:: Es el número de moles de sustrato que reaccionan para formar   producto, por mol de enzima y por unidad de tiempo. Esto supone que la enzima está plena enamente satur turada con sustr tra ato y por por tanto la reacción se efectúa con su máxima rapidez



Índi Ín dice ce de re reccamb mbio io:: muestr tra a la eficiencia de la catá catálilisi sis s enz enzimát imátic ica a

es

21  

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Efecto del pH 1. Sobre la fijación del substrato al centro activo: - Grupos disociabl disociables es de la enzim enzimaa - Gru Grupos pos disoci disociable abless del sustrato sustrato 2. Sobre la transformación transformación catalítica del sustrato

3. Sobre la estructura de la proteína enzimática

Efecto del pH en la ENZIMA

Cada enzima tiene un pH óptimo para su actividad El pH afecta las interacciones iónicas

22  

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temperatura ra Efecto de la temperatu 1. Aceleración de la reacción según la ecuación de Arrhenius k = A exp (-Ea/RT)

2. Desnaturalización térmica de la proteína

Efecto de la temperatura en la ENZIMA Aumento de la velocidad

15º

Desnaturación por calor 

40º

75º

Temperatura Cada enzima tiene una temperatura óptima.

23  

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Coenzimas-Cofactores 

L szim oa rgsáncioce ansz, iqmuaessesounnepneqauleañean moal.éculas



Las coenzimas colaboran en la reacción enzimática recibiendo transitoriamente alg lgú ún grupo químico mico:: H+ , OH, CH3 .



La enzima sin la coenzima recibe el nomb no mbre re de APOE APOENZ NZIM IMA A

El NAD NAD es una coenzima aceptora de H

Sustrato oxidado

24  

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Algunas enzimas requieren metales para mejorar su actividad

Isoenzimas o Isozimas Son formas moleculares diferentes de una misma enzima 

Catalizan la misma misma reacción



Ejemplo: Ejem plo: Lactato deshidrogenasa



Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH



Se diferencian por su movilidad electroforética



Usadas en clínica: sueros normales y sueros con alguna patología

25  

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Inhibición enzimática

Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de in interaccione teraccioness con el centro activo u otro otross ccentros entros específ específicos icos (alostéricos). Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores: I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

26  

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Los inhibidores inhibidores isostéri isostéricos cos p pueden ueden ser de dos ttipos: ipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos: E+I

EI

ES + I

ESI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima: E+I

E’

Inhibición reversible (a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva (b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva (c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Anticompetitiva

27  

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Inhibidores Competitivos 

Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima



Se une solo a la enzima libre



V máx no se altera y K M cambia

S

E I

ES

E+P

Inhibición Competitiva

EI Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas; el complejo EI no es productivo

28  

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Inhibición Competitiva

S E

ES

E+P

[E] [I]

I

K i =

EI

[EI]

Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor:

Vmx s

v  K m

1

i  K i

  s

29  

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Inhibidor competitivo 

 Al aumentar la cantidad de SUSTRATO el inhibidor  com co mpe peti titi tivo vo es de desp spla laza zado do y se fo form rma a pr prod oduc ucto to

Inhibidor competitivo su estructura es similar a la del sustrato

No se forma producto

30  

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Características: Las fijacion onees de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas A muy altas con onccentraciones de substrato desaparece la inhibición Por lo general, el inhibidor compet itivo es un análogo quím qu ímic ico o de dell sub ubst strrat ato o. El inhi hibi bido dorr es ta tan n específico com como o el su subs bstra trato to •

•

•

•

Por tanto, en la inhibición competitiva,

aumento de la 1. K  El efecto cinéticomultiplicada del inhibidorpor es el el factor , que aparece (1 +aparente i/K ) m

i

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor  3. Cuanto más pequeño sea el valor de K i mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

31  

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Inhibidor competitivo Sin inhibidor 

Con inhibidor  El inhibidor competitivo aumenta la Km

Km Sin

Km con

inhibidor inhibidor 

Inhibición Inhi bición competitiva competitiva - Represen Representación tación recíproca doble doble 0.07

1/v

0.06

0.05

0.04

1/Vmax 0.03

0.02

-1/K m 0.01

1/s 0.00 -0.3

-0.2

-0.1

0.0

0 .1

0 .2

-1/(K m(1 + i/K i))

0 .3

0 .4

0.5

0 .6

32  

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Inhibidor No Competitivo 

Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima



Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato



Por acción del inhibidor disminuye la V máx pero el valor de KM no se altera

S

E

ES I

I

Inhibición No Competitiva

S

EI

E+P

ESI

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

33  

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Inhibidor NO competitivo El inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un sitio diferente del sitio activo

ncompetitivo o Inhibidor IIncompetitiv 

Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima



Se une sólo al complejo enzima-sustrato



Los efectos que tiene: disminuye el valor de KM y también el de V máx

34  

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S E

I

ES

E+P Inhibición Anticompetitiva

ESI El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES; el complejo ESI no es productivo

Inhibidores Irreversibles 

Producen inactivación inactivación permanente de la actividad enzimática



Se interfiere con el normal desarrollo de una reacción o vía metabólica m etabólica



Ejemplos: p-cloromercur p-cloromercuribenzoa ibenzoato, to, yodoacetato, yodoace tato, diisopropilfluor diisopropilfluorfosfato fosfato

35  

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Inhibición Irreversible - Los in inhibidores hibidores irreve irreversibles rsibles reacci reaccionan onan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente - Su acci acción ón no se descri describe be por una constante de equil equilibrio ibrio K i, sino por una constante de velocidad k i:

E+I

E’

- A diferencia de la iinhibició nhibición n reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor. - Los in inhibidores hibidores irreversibl irreversibles es son, por lo general general,, altamente tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfóricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

36  

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Enzimas Alostéricas 

Son enzimas cuya estructura proteica está form fo rmad ada a de vari varias as subu subuni nida dade des s



No se rigen por la cinética de M - M



 Además del sitio o centro activo tienen sitios alos alosté téri rico cos s o de re regu gula laci ción ón



Sitio activo/su activo/sustra stratos; tos;



Sitio Siti o alosté alostéri rico/ co/mod modulado uladores res o regul regulad adore ores s



La relación entre la velocidad de reacción y la concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea

Enzimas alostéricas 







Las enzimas alostéricas presentan estructura cuaternaria. Tienen diferentes sitios activos, unen mas de una molé olécu cula la de su sust stra rato to La unión del sustrato es cooperativa la curva de velocidad presenta una forma sigmoidal

37  

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RESUMEN 

Las enzimas son proteínas que catalizan las la s re reac acci cion ones es bi biol ológ ógic icas as



Pres Pr esen enta tan n es espe peci cifi fici cida dad d po porr su su sust stra rato to



Cada enzima presenta dos parámetros importantes Vmax (saturación de la enzima) y la Km (medida de la afinidad por el su sust strrato to))

38  

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

La actividad enzimática puede ser   inhibida, por inhibidores competitivos (similares al sustrato) o por inhibidores no competitivos.



La temperatura y el pH afectan a la enzim ima a en su ac acti tiv vid ida ad ca cata talí líti tica ca..

 Algunas enzi enzimas mas requiere requieren n de coenz coenzimas imas y/o co cofa fact cto ores para su act ctiv ivid ida ad.

