Clase 2 Ingeniería Bioquímica 2016.pdf

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, Decana de América)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA ESCUELA DE POSTGRADO

INGENIERÍA BIOQUÍMICA Crecimiento Microbiano Clase 2

CRECIMIENTO MICROBIANO

Aumento ordenado de todos los constituyentes químicos

de un organismo. Un aumento en el número de individuos en la población (organismos unicelulares)

Células

Energía CELULA información Nutrientes

Productos Calor

Métodos de Cuantificación Celular

Peso seco Biomasa

Turbidimetría Volumen de células empacada

DIRECTOS

Número

Recuento en microscopio Recuento en placa

Métodos de Cuantificación Celular

Consumo de nutriente

INDIRECTOS Estimación de la masa celular

Acumulación de producto

Compuesto celular Calor de fermentación Viscosidad

Variación de la composición macromolecular de Kluyveromyces aerogenes como una función de µ en un quimiostato limitado por nitrógeno.

Métodos para la cuantificación del crecimiento de poblaciones microbianas

Consideraciones LEYES DE VELOCIDAD

A  B  C  D Re acción Elemental v  k[ A].[B]

 DERIVADA DE UNA FUNCIÓN

dy dx

x0

BALANCE DE MASA EN REACTORES

X

Compuesto Ci

AcumulaciónC i  entrada  salida  formación  descomposición d (Ci V )  entrada  salida  formación  descomposición dt Velocidad neta de reacción

Crecimiento por lotes

Crecimiento de un organismo aeróbico [células]

+

[Fuente de carbono]

[CO2]

+

+

[Fuente de nitrógeno]

+

[H2O]

+

[Fuente de oxígeno]

[Productos]

+

+

[Más células]

[Fuente + de fosfáto] Condiciones del medio de cultivo (pH, T, fuerza iónica, etc)

A(CaHbOc )  B(O2 )  D(NH3 )  células1  M(C H O N )  N(C H O N )  P(CO2 )  Q(H2O)  células1 '

Biomasa

'

Producto

'

'

SUSTRATO LIMITANTE (estudio cinético)

Células  sustrato   más células  productos v  f (x , S , I ,T , pH ,.....etc) v   s ,I ,T ,pH ,.....  X

• Cinética de primer orden

• Reacción auto catalítica

v = velocidad de crecimiento de la célula (g/L.tiempo) X = concentración de biomasa (g/L) µ = velocidad específica de crecimiento, (tiempo -1 )

Balance de Masa en un Reactor por Lotes dX  X dt

(1)

1 dX d (lnX )   X dt dt

En la fase exponencial la velocidad de crecimiento es constante

Integrando la Ecuación (1)

 XX0

µ Constante

dX t   0 dt X

Constante

X ln  t  ln X  ln X 0  t X0  X  X 0 e t LnX

µ

t

32

tD

64

128

tD 

256

2 X0 ln X0

const

512



ln2

const

1024...



µ Constante

0.693

const

Tiempos de Duplicación Característicos Tipo de célula

TD (h)

Bacterias

0.3 – 2.5

Levaduras

1.0 – 4.0

Hongos filamentosos

1.5 – 7.0

Microalgas

18 – 35

Células animales in vitro

20 - 40

Fuente: Acevedo et al. (2002)

Crecimiento Balanceado Las células son capaces de modular los efectos de perturbaciones externas y mantienen la composición de la biomasa constante a pesar de los cambios en las condiciones ambientales.

vz   z Z: constituyente celular (proteína, ARN, polisacárido, etc) vz: velocidad de reacción Z: concentración de Z en el volumen del reactor.

o No puede ser alcanzado si los cambios ambientales afectan la

velocidad del crecimiento. o Ocurre al mismo tiempo que el crecimiento exponencial.

Influencia de los factores ambientales sobre µ µ es función del m.o y las condiciones ambientales o Concentración de sustrato o Temperatura o pH o Actividad de Agua o Inhibidores o Potencial Redox o Oxígeno disuelto o Otros factores

Efecto de la Concentración del Sustrato sobre µ Efecto cuantitativo fuente carbono y energía Ec. MONOD (1949)



M S KS  S

µM = velocidad específica de crecimiento máxima (tiempo -1) S = concentración de sustrato (g/L) Ks = constante de Monod (g/L)

EFECTO DE KS EN LA EC. MONOD

dX M S  X dt K S  S

Si S>> Ks

Representa la curva: Fase exponencial, desaceleración y estacionaria

Sea el Rendimiento Yx/S X x  x0 Yx / s   S S0  S X  X0 S  So  ( ) Y

dX  M X dt

Otras formas de Cinéticas de Crecimiento

Ec. Blackman

  m , if S  2K s    m S , if S  2K s 2K s

Ec. Tessier

Ec. Moser

Ec. Contois

  m (1  e KS )  

m S n

Ks  S n

m S

 m (1  K s S  n )1

K sx X  S

Inhibición por sustrato

Inhibición por producto Fermentación alcohólica

S   m K s  S  S 2 / Ki

Kp S   m  Ks  S K p  P

Limitación por dos sustratos

S1 S2   m  K1  S1 K 2  S2

Limitación por dos sustratos Mankad y Bungay (1988)

 S1 S2  2 K1 K 2   m  1  K1  S1 K 2  S2  K1S2  K 2 S1 

J. Biotechnology 1988, 7: 161-166

Crecimiento diáuxico Fuente: Duan et al., 2003



S1 S2  m1  m 2 K1  S1 K 2  S2  S12 K i

Crecimiento diáuxico dX  ( 1  2 ) X dt

1  2 

max1S1 K1  S1

max 2 S2 K 2 [1  ( S1 / K i )]]  S 2

Fuente: Asenjo A. y Merchuk J.C. (1995)

Gahlawat and Srivastava, 2013. Bioresource Technology, 137: 98-105

Ec. Logística X   max (1  ) X max dX X  max X (1  ) dt X max Integrando : X 0e  t X X0 1 (1  e  X max max

max

t

)

Desviaciones de la curva de crecimiento microbiano  Crecimiento Diáuxico

 Medio complejo

Efecto de la Temperatura sobre µ

Efecto de la Temperatura sobre µ

Ec. Del tipo Arrhenius

  Ae  E

a / RT

Ea 1 ln   ln A  RT Ea: Energía de activación R: constante gases R= 1.98 cal/mol.K T: temperatura absoluta (K)

Efecto de la Temperatura sobre µ dX  (  kd' ) X dt dX ' (  Ed / RT )  ( Ae( E / RT )  Ae )X dt a

o Ea para el crecimiento 15-20 Kcal/mol o Ea para la muerte 60-70 Kcal/mol

Efecto del pH sobre µ Rango pH óptimo o Bacterias

6-7.5 o Levaduras 3.5 – 5.5 o Mohos 3 - 7

Oxígeno Disuelto

Factor limitante de la velocidad de crecimiento

Concentración de oxígeno crítica

La velocidad de transferencia de oxígeno del gas a la fase líquida es dada por:

VTO  kL a(C  CL ) *

kL: coeficiente de transferencia de oxígeno (cm/h)

a: área interfacial gas-líquido (cm2/cm3) kLa coeficiente de transferencia de oxígeno volumétrico (h-1) C*: Concentración de oxígeno disuelto saturado (mg/L)

CL: Concentración de oxígeno disuelto en el caldo (mg/L) VTO: Velocidad de transferencia de oxígeno (mg/L.h)

La velocidad de consumo de oxígeno es:

 X VCO  qO X  2

YX / O

2

qo2: velocidad expecífica de consumo de oxígeno (mg O2/g células secas.h) Yx/O2: coeficiente de rendimiento en oxígeno (g células peso seco/g O2) X concentración celular (células peso seco/L)

Sí la transferencia de oxígeno es la etapa limitante:

 X  k a(C*  C ) L L

YX /O

2

dX *  YX /O kL a(C  CL ) 2 dt •Aire enriquecido de oxígeno o oxigeno puro y operaciones bajo alta presión atmosférica (2 a 3 atm) •Transferencia de oxígeno tiene un gran impacto en el diseño de reactores.

Potencial Redox del medio de cultivo Indica su capacidad para aceptar o donar electrones (sus características oxidantes o reductoras). Un potencial más positivo, mayor afinidad de la especie para los electrones y

tendencia para ser reducido. Cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren

ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo.

Para un medio de fermentación: PO2: presión del oxígeno en atm. F: constante de Faraday

' 2.3RT Eh  E0 

RT log PO2  2.3 log( H  ) 4F F

T: temperatura en K -Se puede reducir mediante el paso de nitrógeno gaseoso o por la adición de agentes

reductores: cisteina HCl o Na2S. - Se puede incrementar pasando O2 gaseoso o adicionando agentes oxidantes

Fuerza Iónica Afecta el transporte de ciertos nutrientes in y out de las células, las funciones metabólicas de las células y la solubilidad de ciertos

nutrientes, tales como del oxígeno.

1 I   Ci Zi2 2 Donde C es la concentración de un ión, Zi es su carga, y I es la fuerza iónica del medio.

Problema 1 Determinación de los parámetros cinéticos µM y Ks , Yxs en un reactor Batch

Tiempo (h) X (g/L) S (g/L) 0 1.5 48.5 8 2.9 45.2 15 5.5 38.8 23 11.4 24 27 16.3 11.8 30 19.2 4.5 34 20.9 0.3

m S dx  x dt K s  S ds 1 m S  . .x dt Yxs K s  S

Se utiliza el método de Euler explícito (el más simple)

dx  xi1  xi  f ( x , s ) i i t dt dS  si1  si  f ( x , s ) i i t dt 1

2

xi1  xi  t * f ( xi , si ) 1

si1  si  t * f ( xi , si ) 2

Problema 2 En un cultivo por lotes de Saccharomyces cerevisiae se forma etanol de glucosa y los siguientes datos se obtuvieron: Tiempo (h)

Glucosa (S), g/L

Biomasa (X), g/L

Etanol (P), g/L

0

100

0.5

0.0

2

95

1.0

2.5

5

85

2.1

7.5

10

58

4.8

20.0

15

30

7.7

34.0

20

12

9.6

43.0

25

5

10.4

47.5

30

2

10.7

49.0

a) Mediante ajuste de los datos de biomasa a la ec. logística, determine el coeficiente µmax y Xmax b) Determine el coeficiente de rendimiento Yp/s y Yx/s

Biomasa (g/L)

Glucosa (g/L)

Etanol (g/L)

120 100

g/L

80 60 40 20 0

0

5

10

15 20 Tiempo (h)

25

30

35

YP / S

P  S

YX / S

X  S

?

Problema 3

m S dX  X dt K s  S

(1)

X  X 0  Yx / s ( S0  S )

(2)

m (Yx/ s S0  X 0  X ) dX  X dt K sYx/ s  Yx / s S0  X 0  X K sYx / s K sYx / s X (  1) ln( )  ln{(Yx / s S0  X 0  X ) / Yx / s S0 }  mt Yx / s S0  X 0 X 0 Yx / s S0  X 0

Kato et al. 2015. Biochemical engineering: a textbook for engineers, chemists and biologists

Problema 4 A continuación se dan los datos experimentales de un cultivo continuo en estado estacionario para la producción de biomasa: Encuentre los parámetros cinéticos de este organismo suponiendo una cinética de Monod.

S (g/L) 0.04 0.06 0.11 0.16 0.29 0.89 1.07

µ (h-1) 0.026 0.035 0.054 0.077 0.114 0.161 0.172

Problema 5 A continuación se dan los datos experimentales de la velocidad específica de crecimiento de E. coli en diferentes condiciones de concentración de sustrato. Identifique qué tipo de cinética de crecimiento es y determine los parámetros cinéticos S

µ (h-1)

0

0

0.05

0.21

0.1

0.26

0.2

0.25

0.4

0.24

0.6

0.22

0.8

0.16

1

0.172

1.2

0.14

Clasificación de los m.o. según sus requerimientos de energía y nutricionales

Prototrofos Auxotrofos

no requieren factores esenciales requieren factores esenciales

Medios de cultivo

energía

calor

Fuente de energía

Movimiento Osmosis

ADP

Catabolismo

Anabolismo

ATP Calor Metabolitos terminales

Precursores

Metabolismo anaeróbico

GLUCOSA + 2Pi + 2ADP

2 LACTATO + 2ATP + 2H2O

Gºgluc-lac= -47 kcal/mol gluc

GºADP-ATP = 14,6 kcal/mol gluc

31% RECUPERACION

Metabolismo aeróbico

GLUCOSA + 6O2 + 36Pi + 36ADP

6CO2 + 36ATP + 42H2O

Gºgluc-CO2 = -686 kcal/mol gluc

GºADP-ATP = 263 kcal/mol gluc

38% RECUPERACION

92%

Materia orgánica C H O N P S

Iones Na+ K+ Mg2+ Ca2+ Cl-

Elementos trazas Mn Co Zn Al Mo Si Ni F

Fe Cu B V I Sn Cr Se

MEDIO DEFINIDO

Medio mínimo

Medio formado por una solo una fuente de cada elemento. Típicamente, está compuesto por glucosa, sulfato de amonio y otras sales minerales.

RENDIMIENTO DE UN NUTRIENTE EN BIOMASA

X masa celular producida Yx s   S sustrato consumido

¿Cómo se determina el coeficiente de rendimiento experimental en cultivo por lote?

X  Yx/ s S0

Varios experimentos con diferente concentración de sustrato inicial

1

3

2 So1

xf

xf

xo

xo

So3

So2

xf

t

So4

xf xo

xo

t

6

.....

t

∆X

Yx/s S0

t

ESTIMACIÓN RENDIMIENTO DE UN NUTRIENTE EN BIOMASA

% elemento en sustrato Yx s  % elemento en biomasa ¿Cómo se obtiene este coeficiente? Se obtiene por balances de masa

EJEMPLO:

(NH4)2SO4

28 % elemento en sustrato  *100  21% 132 % elemento en sustrato 21 gcelula peso sec o Yx s    1.7 % elemento en biomasa 12 gsustrato

NH4Cl 14 % elemento en sustrato  *100  26.2% 53.5

% elemento en sustrato 26.2 gcelula peso sec o Yx s    2.2 % elemento en biomasa 12 gsustrato

Fuente de Carbono y Energía

% elemento en sustrato Yx s  .f % elemento en biomasa f=0.6 Caso Aerobio f=0.1 Caso Anaerobio Glucosa: C6H12O6

12*6 % elemento en nutriente  *100  40% 180 %Cc = 50

CASO AERÓBICO

% elemento en sustrato 40 Yx s  . f  *0.6 % elemento en biomasa 50 gcelula peso sec o Yx s  0.48 gsustrato CASO ANAERÓBICO

% elemento en sustrato 40 Yx s  . f  *0.1 % elemento en biomasa 50 gcelula peso sec o Yx s  0.08 gsustrato

¿Qué sucede si un elemento químico está en el sustrato y en el producto?

S E

C E

P E

No se puede usar el método de balance de masa porque no se tiene una relación constante del elemento que va a sustrato y lo que va a producto.

Optimización estadística: Superficie de Respuesta En Erlenmeyer ∆X = 2 g/L por limitación de oxígeno En fermentador de laboratorio ∆X = 3-8 g/L por limitación de oxígeno

Factor esencial

% factor esencial biomasa Factoresencial  X  100

¿Cómo se calcula el rendimiento de oxígeno YO2 ?

u=0 (ausencia de producto extracelular)

d’, e’, f’, g’: porcentaje de C, H, O y N en la biomasa

DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO ( XF  X0 ) S0  SF  YX S Ejercicio

Diseñe un medio de cultivo si se desea obtener una biomasa de 7 g/l a partir de un inóculo de 200 ml cuya concentración de biomasa es de 5 g/L. El volumen total del reactor es de 7 L. Los nutrientes usados son glucosa, sulfato de amonio y NaH2PO4. Además se sabe que estas células contienen 53 % de C; 8,5% de N; 1.5% de P y 0.5 % de S.

Diseño de medio de cultivo

Condiciones: Levadura creciendo aeróbicamente X = 6 g/L N es el elemento limitante No hay formación de productos extracelulares

Cálculo del rendimiento del nutriente limitante

(NH4)2SO4 N en nutriente : 21.2% N en célula : 7.5%

YX S 

%NS gcelula peso sec o  2.8 %N C gsustrato

Cálculo de la concentración de nutriente limitante

(NH4)2SO4 YX/S : 2.8 Sf : 0 X : 6 g/L

ΔX S0  Sf  YX S

S0 = 2.14 g/L

Elemento Ei

Ei en célula %

Nutriente

Ei en nutr. %

YX/S g cel/g nutr

Concentr. g/L x 1.5

C

48

C6H12O6

40.0

0.5

18

N

7.5

(NH4)2S04

21.2

2.8

2.14*

P

1.7

KH2PO4

22.8

13.4

0.67

K

2.5

KH2PO4

28.7

11.5

0.78

Mg

0.3

MgSO4·7H2O

9.7

32

0.28

S

0.13

(NH4)2S04

24.2

186

0.048

Fe

0.26

FeSO4·7H2O

20.0

77

0.12

Ca

0.20

CaCl2

36.2

181

0.05

Na

0.06

NaCl

39.3

655

0.014

Zn

0.02

ZnSO4·7H2O

22.8

1140

0.008

Mn

0.004

MnCl2·6H2O

27.7

6925

0.0013

Co

0.003

CoCl2·6H2O

24.8

8267

0.0011

Mo

0.0002

MoO3

66.6

333000

0.00003

Cinética de consumo del nutriente limitante Yx/ s  X S S   1 X Yx/ s

Considerando solo crecimiento exponencial, integrar la Ec. (1).

Dividiendo t , lim  t 0

?

dS   1 . dX Yx/ s dt dt dS 1   X ....(1) dt Yx/ s

S  S0 

X 0 t (e  1) Yx / s

v  qs X qs 

 Yx/ s

1 dS  X dt

qs: Velocidad específica de consumo de nutriente (h-1) =g sustrato/g biomasa.h)

µ, qs

µmax

qs, max

t

Análisis de la fuente de carbono y energía (heterótrofos)

ST  SC  SM  S P Si el Producto es asociado al metabolismo energético (etanol, ácido láctico), S  0 P

dS dS  dt T dt  qs X  

dS  dt C

X Yx0/ s

m

  mX

qs 

 0 x/ s

Y

m

m: coeficiente de mantención (g sustrato/g biomasa. h )

Análisis de la fuente de carbono y energía (heterótrofos)

 Yx/ S



 0 x/ s

Y

m

m: coeficiente de mantención (h-1)=g fuente C y energía/g biomasa. h) Yx/s=∆X/ ∆ST

1 1 m  0  Yx/ S Yx/ s 

Y0x/s=∆X/ ∆SC

1/Yx/s m

1/µ

Y0x/S > Yx/s

Cinética de Formación de Productos Tipo I

Relaciones específicas de velocidad

Formación del producto directamente

Ejemplo

Etanol

relacionado con la utilización del carbohidrato II

Formación del producto indirectamente

Ácido cítrico

relacionado con la utilización del carbohidrato III

Formación del producto aparentemente no relacionado con la utilización del carbohidrato

Penicilina

Metabolito primario: son los productos finales e intermediarios de las vías de estos productos finales utilizados para construir las macromoléculas o son convertidos en coenzimas. Metabolito secundario: producto de fermentación no necesario para el crecimiento del m.o.

Producto asociado al nutriente limitante  P Y p/ s  S



Pf  P0

v  Yp/s

S0  S f

P  Y p/ s S Dividiendo t , lim  t 0

 Yx /s

X

v  qP X

dP  Y .( dS )  Y (  X ) p/s p/s YX / S dt dt dP  ( Yp/ s  ) X dt YX / S

dP  q X dt p

qp 

1 X

dP dt

qp: velocidad específica de formación de producto= g producto/g biomasa.h =h-1

En general para los tres tipos de producto: Tipo I, Tipo II y Tipo III

q p  Y p / s qs

Cuando un producto es un catabolito de la fuente de carbono

dS dS dS   dt T dt C dt m dS X   0  mX dt T Yx / s Yp / s ( 

Y dS )  0p / s X  mYp / s X dt T Yx / s

Yp / s dP  ( 0  mYp / s ) X dt Yx / s

qp 

Yp / s 0 x/s

Y

  Yp / s m

Formación de producto parcialmente asociado al crecimiento El modelo de Luedeking-Piret

q p     Asociado al crecimiento

No asociado al crecimiento

Análisis de la fuente de carbono y energía

Si el producto es un metabolito secundario ST  SC  SM  S P dS dS  dt T dt qs X 

X Yx0/ s

dS  dt C

 mX 

qs 

dS  dt m

qp X Yp0/ s

 Yx0/ s

m

p

Yp / s 

qp Yp0/ s

P S

, Yp0/ s 

P S p

Yp / s  Yp0/ s

Análisis de la fuente de carbono y energía

Si el producto es un metabolito secundario qp 1 1 1  0  (m  0 ) Yx / S Yx / s  Yp / s

 qs 

0 x/ s

Y

1

 1

m Yp / s



Yp0/ s



Yp0/ s

1 1 m1   0 Yx / S Yx / s   Yx / S

qs    1  Yxo/ s

Yp / s

m



Yx0/ s   mYx0/ s  

dS dS  dt T dt

 C

dS dt

 m

dS dt

P

qp dS X   0  mX  0 X dt T Yx / s Yp / s Y Y dS Yp / s (  )  0p / s X  mYp / s X  p0/ s q p X dt T Yx / s Yp / s Yp / s Yp / s dP  ( 0  mYp / s  0 q p ) X dt Yx / s Yp / s dP  qp X dt

Yp / s Yp / s m Yx0/ s qp   Yp / s Yp / s (1  0 ) (1  0 ) Yp / s Yp / s

1 Yp / s 1 qp    Yp / s m 0  Yx / s 

q p    

Ejemplo para determinar el rendimiento máximo

Producto no asociado al crecimiento • qp

es independiente de la velocidad de crecimiento

(formación de penicilina) • qp varía con la velocidad específica de crecimiento de una

manera compleja en algunos casos Ejemplo :

q p  q max  k p • Formación

de melanina por Aspergillus niger

• La formación de ciclodextrinas de almidón por Bacillus macerans

Velocidad de Producción

1 dP qp  x dt

Velocidad específica de formación de producto g/g células.h Es independiente de la concentración de masa celular y describe la efectividad de las células en la síntesis de productos o la utilización del material (qs). Es útil para comparar resultados entre fermentaciones a ensayar.

dP P P2  P1 Qp    dt t t2  t1 X Qx  t

La velocidad volumétrica o productividad volumétrica (g/L.h) es dependiente de la concentración de la masa celular, describe la velocidad de síntesis de producto o demanda de material (S) por unidad de volumen del fermentador

El tiempo total de fermentación puede ser calculado:

t

Qx 

QP 

1

m

ln

xf x0

 tT  t L  t D

X

1 ln x f  t  t  t m x0 T L D P 1 ln x f  t  t  t m x0 T L D

Ejercicios 1) Un microorganismo produce un metabolito extracelular de acuerdo a qp=0.64 μ. El

microorganismo crece a una velocidad específica de 0.35 h-1, sus rendimientos máximos de sustratos en biomasa y producto son 0.51 y 0.65 g/g respectivamente y m= 0.09 g/g*h. Las concentraciones de biomasa inicial y final son 0.4 y 11 g/L

respectivamente e inicialmente la concentración de producto es 0.8 g/L .¿Cuánto producto se produce, que porcentaje de carbono se consume para crecimiento, mantención y producción? ¿Cuáles son los rendimientos globales de célula y

producto?

2) Para el cultivo aerobio de una bacteria metilotrófica, auxótrofa en ácido pantoténico, se utiliza un medio de cultivo que contiene 15 g/L de CH3OH (metanol); 1.8 g/L de (NH2)2CO (urea); 0.57 g/L de KH2PO4 y 2.1 mg/L de ácido pantoténico y demás nutrientes en exceso en cantidades apropiadas. Suponiendo ausencia de productos extracelulares, determine: •¿Cuál de los cuatro nutrientes señalados es el limitante? •¿Cuál de los cuatro nutrientes señalados es el tercer limitante y en qué porcentaje de exceso se encuentra? •Si por error se cambia el nutriente y se utiliza 0.57 g/L de K2HPO4.2H2O ¿Cuáles serían sus respuestas a los puntos a y b? ¿cambiarían? Datos:

Elemento C N K P Ac. Pantoténico

Peso Molecular 12 14 39 31

Contenido Celular % b.S. 52 12 3,1 2,8 3,6*10-4

3) En un experimento de laboratorio se cultivó E. coli en un medio mínimo, primero a 37 °C hasta consumir la mitad de sustrato limitante y después a 24°C hasta alcanzar la fase estacionaria. Se ha determinado que la cepa utilizada tiene un tD de 49 minutos a 37°C y su Ea es de 16200 cal/mol. Calcular el tiempo en el que se realiza el cambio de temperatura y el tiempo total de cultivo si se inoculan matraces que contienen 80 ml de medio estéril con 1 ml de cultivo a una concentración celular de 4 g/L . Datos: ∆X= 7 g/l, Yx/s= 50; So= 0.14 g/L

4. Para realizar el proceso de fermentación en una empresa cervecera, los

fermentadores de volumen útil de 2.7 m3 se inocularon con 30 litros. El inóculo se propagó según el siguiente protocolo: - Primero se inoculó con un loop de levadura seleccionada a 700 mL de medio de cultivo. - Luego de 5 horas se obtuvo una concentración celular de 2 g/L. - Posteriormente, los 700 mL se inocularon en 29.3 litros de medio y después de 10 horas de fermentación, se obtuvo una concentración celular de 4 g/L. Calcule: a) Velocidad específica de crecimiento b) Tiempo de duplicación c) Diseñe el medio de cultivo con glucosa, fosfato de potasio, cloruro de amonio, sulfato de amonio, cloruro de calcio y cloruro de potasio. Considere al nitrógeno como limitante para lograr una concentración de 5 g/L en el reactor. %C

%N

%P

%K

%S

% Mg

% Ca

52

10

2

1

0.1

0.1

0.01